CN104958301A - 一种抑制剂ly294002的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制剂LY294002的用途，用于抑制羊种布鲁氏菌16M的存活。所述抑制剂LY294002的最佳剂量为20μmol/L。本发明将PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002与细胞共同孵育，同时将其腹腔注射小鼠，然后羊种布鲁氏菌16M感染巨噬细胞和小鼠，首次发现抑制剂LY294002可调控巨噬细胞和小鼠体内羊种布鲁氏菌16M的存活，抑制剂LY294002显著提高了羊种布鲁氏菌16M介导的TNF-α，提高宿主抵抗羊种布鲁氏菌16M感染的能力。表明PI3K/Akt信号通路在羊种布鲁氏菌16M致病过程中发挥重要作用，PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002可调控巨噬细胞和小鼠体内羊种布鲁氏菌16M的存活，为抗羊种布鲁氏菌16M的药物研发和其致病机制提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，具体是一种抑制剂LY294002的用途。
背景技术
布鲁氏菌病是一种严重危害公共卫生安全的人兽共患传染病。布鲁氏菌既是一种革兰氏阴性菌，也是兼性胞内寄生菌。布鲁氏菌病急性期的症状主要为恶寒、发热和关节等；人感染布鲁氏菌后主要表现出神经-精神症状，一般病程较长，容易复发反复感染。动物布鲁氏菌病后导致胎膜及其它多种器官组织发炎、坏死和肉芽肿的形成，导致怀孕母畜流产、公畜患睾丸炎及关节炎等症状。布鲁氏菌病严重危害人类健康和畜牧业的发展。然而，目前无有效的疫苗控制该病的发生，主要原因之一为其致病机制还不清楚。
PI3K/Akt信号通路细胞生存对细胞的生存至关重要，在细胞生长活动和抑制细胞凋亡方面起核心作用。PI3K/Akt信号通路主要与肿瘤的发展密切相关，还与一些病毒的生存繁殖有关，然而，PI3K/Akt信号通路与布鲁氏菌的生存关系如何，目前还尚无相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制剂LY294002的用途,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种抑制剂LY294002的用途，用于抑制羊种布鲁氏菌16M的存活。
作为本发明进一步的方案：所述抑制剂LY294002的最佳剂量为20μmol/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明将PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002与细胞共同孵育，同时将其腹腔注射小鼠，然后羊种布鲁氏菌16M感染巨噬细胞和小鼠，首次发现抑制剂LY294002可调控巨噬细胞和小鼠体内羊种布鲁氏菌16M的存活，抑制剂LY294002显著提高了布鲁氏菌介导的TNF-α，提高宿主抵抗羊种布鲁氏菌16M感染的能力。表明PI3K/Akt信号通路在布鲁氏菌致病过程中发挥重要作用，PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002可调控巨噬细胞和小鼠体内羊种布鲁氏菌16M的存活，为抗布鲁氏菌药物研发和其致病机制提供科学依据。
附图说明
图1是抑制剂LY294002对细胞活性的影响结果示意图；
图2是抑制剂LY294002抑制16M在巨噬细胞内的繁殖结果示意图，注：“*”表示胞内细菌数量在16M组与16M+LY组中的差异显著(P<0.05)；
图3是抑制剂LY294002降低16M在小鼠脾脏和肝脏的存活结果示意图，注：“*”表示脾脏和肝脏中细菌数量在16M组与16M+LY组中的差异显著(P<0.05)；
图4是抑制剂LY294002提高16M介导的巨噬细胞中TNF-α的含量结果示意图，注：“*”表示TNF-α含量在16M组与16M+LY组中的差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、细胞与质粒
羊种布鲁氏菌16M来自石河子大学人畜共患病实验室、大肠杆菌DH5a来自铜仁学院细胞生物学实验室。
1.1.2 主要试剂
胎牛血清购自海克隆公司；酵母提取物、蛋白胨、NaCl购自上海生工公司；Triton X-100细胞裂解液、MTT和DMSO购自索莱宝公司；抑制剂LY294002 购自碧云天公司；小鼠TNF-αELISA试剂盒均购自上海依科赛生物制品有限公司。
1.1.3 主要仪器
生物安全柜；CO2培养箱；低温高速离心机；酶标检测仪，电子天平。
1.2 方法
1.2.1 MTT试验
将抑制剂LY294002（20μmol/L）与巨噬细胞共同孵育，0.1%DMSO处理的细胞作对照。置37℃、5%CO2培养箱使细胞贴壁，培养6-24h。加入适当浓度的受试化合物，继续培养适当时间。小心吸取上清，加入90μL新鲜培养液，再加入10μL MTT溶液，继续培养4h。弃去上清，每孔加入110μL Formazan溶解液，置摇床上低速振荡10min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔，对照孔，每组设定3复孔。
1.2.2 布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7
抑制剂LY294002(20μmol/L)与巨噬细胞作用1h，16M侵染巨噬细胞，细菌：细胞按50:1的个数比进行侵染细胞，并将侵染的RAW264.7细胞继续置于37℃、5%CO2培养箱中分别培养4h、12h和24h。用Triton X-100细胞裂解液裂解细胞，梯度稀释裂解混合液，将其涂于固体培养基板，然后将其放入5%CO2培养箱2-3d，对其菌落个数进行统计。实验重复三次。
1.2.3 小鼠感染羊种布鲁氏菌16M
对布鲁氏菌固体培养基上分别挑取羊种布鲁氏菌16M的单个菌落于液体培养基中培养，收集菌液，将菌液稀释成1.0×106CFU/0.2mL，空白对照组每只注射0.2mLPBS，每组10只小鼠。先给小鼠腹腔注射抑制剂LY294002(20mg/kg/day)，5d后感染16M。在感染的第5d将小鼠处死，取脾脏，用组织匀浆器碾碎脾脏，然后加入2mL的PBS制成匀浆混合液，取混合液100μL进行10倍梯度稀释，取合适稀释度的混合液各80μL涂布无抗板，置于37℃恒温培养箱，3-4d，记录平皿中细菌的数量。实验重复三次。
1.2.4 ELISA检测细胞因子
小鼠ELISA检测标准曲线的制作见操作步骤。抑制剂LY294002(20μmol/L)与巨噬细胞作用1h，16M侵染巨噬细胞，将细菌：细胞按50:1的比例进行感染细胞，并将感染的细胞继续置于37℃、5%CO2培养箱中分别培养12h和24h。仅用16M感染的细胞作为对照组。在12h和24h收集细胞培养液上清，进行TNF-α的ELISA检测。实验重复三次。
1.2.5 统计学分析
使用SPSS17.0验数据统计软件对实验数据进行统计学分析。
2 结果与分析
2.1 抑制剂LY294002对巨噬细胞活性的影响
抑制剂LY294002和DMSO分别与巨噬细胞作用48h，MTT法检测结果：当抑制剂LY294002的浓度为20μmol/L不影响细胞的活性(图1)。对照组加DMSO不影响细胞的活性。加DMSO后的细胞形态为小圆球形，与正常细胞形态相同，加入抑制剂LY294002的浓度为20μmol/L时细胞形态也为小圆球型，与正常细胞形态相同。结果表明，本研究发现采用抑制剂LY294002的浓度20μmol/L不影响巨噬细胞的活性，可以进行后续实验。
2.2 抑制剂LY294002对16M的胞内繁殖的影响
抑制剂LY294002与巨噬细胞作用1h，然后，用16M侵染巨噬细胞，没经抑制剂LY294002处理的细胞作为对照组，分别在4h、12h和24h检测布鲁氏菌的CFU，结果显示，在4h、12h和24h时，抑制剂LY294002处理细胞中16M的LogCFU的值分别为3.63±0.043、4.16±0.121和4.48±0.133；而未经抑制剂LY294002处理细胞中16M的LogCFU的值分别为4.31±0.095、5.22±0.180和5.84±0.157。经统计学分析，在4h、12h和24h时，抑制剂LY294002处理细胞组16M的LogCFU显著低于未经抑制剂LY294002处理细胞（P<0.05）（图2）。结果表明，抑制剂LY294002抑制了巨噬细胞内16M的存活。
2.3 抑制剂LY294002对16M在小鼠体内存活的影响
取出小鼠的脾脏，称量脾脏和小鼠的重量，然后计算出脾脏指数=脾脏重量/体重。结果显示，在第5d，16M+LY组小鼠的脾脏指数显著低于对照16M组小鼠（P<0.05）。结果表明，16M在抑制剂LY294002处理小鼠脾脏中引起的炎症比未用抑制剂LY294002处理的小鼠减轻。取小鼠脾脏和肝脏，计算脾脏和肝脏内的菌数。结果发现，在第5d，16M+LY组小鼠的脾脏和肝脏中细菌数量都显著低于对照16M小鼠（P<0.05）（图3）。结果表明，抑制剂LY294002可降低16M在小鼠脾脏和肝脏中的存活。
2.4 抑制剂LY294002对16M介导的TNF-α水平的影响
抑制剂LY294002与巨噬细胞作用1h，然后，用16M侵染巨噬细胞，没经抑制剂LY294002处理的细胞作为对照组，分别在12h和24h收集细胞上清液，采用ELISA的方法检测细胞因子TNF-α的含量。由结果可知，抑制剂LY294002处理组诱导产生的TNF-α的含量较对照组16M组显著升高（P<0.01）。结果表明，抑制剂LY294002诱导16M介导的TNF-α的产生，从而提高了细胞免疫（图 4）。
3 讨论
PI3K/Akt信号通路参与调控物质代谢、细胞增殖与存活等活动，与许多疾病有关。Akt作为PI3K下游分子具有丝氨酸/苏氨酸残基，可被PI3K激活。在PI3K/Akt信号通路中，当上游信号作用于细胞膜表面时，能在细胞膜内表面产生PI3K结合位点，然后激活Akt信号分子，Akt被激活后可调节细胞生长，同时还可增加抗凋亡基因的表达而起到抗凋亡作用。 (PI3 Kinase Inhibitor) 体内是一种特异性抑制剂。它可以特异地抑制PI3 kinase的活性，但是不影响其他蛋白激酶活性。研究表明抑制剂LY294002可以抑制PI3K-依赖的Akt磷酸化和激酶活性，它通过和ATP竞争PI3K催化结构域的结合位点发挥作用，从而抑制其下游分子Akt的磷酸化，此抑制剂已被广泛应用与信号传导通路的作用研究中。本研究使用PI3K的特异性抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt通路依赖于抑制LY的剂量，其最佳剂量为20μmol/L。因此，这为后续实验提供了侵染模型和材料。为其他信号通路与布鲁氏菌的研究提供依据。
TNF-α具有多种功能：可激活炎症细胞直接杀灭病原体，还可参与许多炎症反应和免疫应答过程。TNF-α的缺乏可降低巨噬细胞早期杀菌的活性和NK细胞的活性，NK细胞毒作用也受到抑制。TNF-α是炎症反应的关键，在抵抗病原菌过程中发挥重要作用TNF-α缺乏将有利于布鲁氏菌在宿主细胞的生存繁殖，对TNF-α的分泌抑制是布鲁氏菌重要的生存策略。已有研究表明，抑制剂阻断TSC-mTOR信号通路后，脂多糖（LPS）诱导分泌的TNF-α水平显著增加，这与TSC-mTOR信号通路对NF-κB活性进行负调控相关。而本研究也发现，抑制剂LY294002可显著提高TNF-α水平，抑制剂LY294002抑制PI3K/Akt信号通路，而PI3K/Akt信号通路又是TSC-mTOR信号通路的上游，从而也对NF-κB活性进行负调控，最终提高了TNF-α水平，从而抵抗胞内布鲁氏菌的繁殖。
对的布鲁氏菌在宿主细胞中的存活受到各种因素的影响。为了在宿主细胞中存活，布鲁氏菌主要通过抑制宿主细胞凋亡和诱导细胞自噬。已有研究表明，某些病毒为了更加有效地进行复制，通过激活PI3K/Akt信号通路抑制宿主细胞的早期凋亡、促进细胞自噬和抑制细胞免疫以延长在胞内的复制时间，甲型流感病毒的NS1蛋白可与PI3K的p85β亚基结合而激活PI3K/Akt信号通路。本研究发现抑制剂LY294002可显著降低16M在巨噬细胞内和小鼠体内的存活，由于PI3K/Akt信号通路与细胞凋亡和细胞自噬关系密切，因此，我们推测抑制剂LY294002主要通过抑制PI3K/Akt信号通路调控布鲁氏菌介导的细胞凋亡和细胞自噬，从而调控了布鲁氏菌在宿主体内外的存活，我们的研究表明PI3K/Akt信号通路调控布鲁氏菌在胞内的生存繁殖发挥重要作用，为揭示布鲁氏菌致病机制奠定基础。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
Claims (2)
1.一种抑制剂LY294002的用途，其特征在于，用于抑制巨噬细胞或小鼠体内羊种布鲁氏菌16M存活。
2.根据权利要求1所述的抑制剂LY294002的用途，其特征在于，所述抑制剂LY294002的最佳剂量为20μmol/L。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113667711A (zh) * | 2020-05-14 | 2021-11-19 | 复旦大学 | 一种基于自噬-外泌通路调节巨噬细胞极化的方法及其用途 |
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2015
- 2015-06-18 CN CN201510339728.1A patent/CN104958301A/zh active Pending
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| JUNBO ZHANG ET AL.: "Activation of the PI3K/Akt Pathway is Essential for the Survival of Brucella melitensis 16M In Vitro and In Vivo", 《PAKISTAN VETERINARY JOURNAL》 * |
| 印双红等: "PI3K/Akt信号通路对布鲁氏菌介导的细胞凋亡基因表达的影响", 《安徽农业科学》 * |
| 印双红等: "抑制剂LY294002调控胞内布鲁氏菌的存活", 《生物技术》 * |
| 张俊波: "《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》", 15 January 2016 * |
| 张俊波等: "PI3K/Akt信号通路在胞内布鲁氏菌存活中的作用", 《江苏农业科学》 * |
| 张俊波等: "羊种布鲁氏杆菌16M对PI3K/Akt信号通路的激活", 《黑龙江畜牧兽医科技版》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113667711A (zh) * | 2020-05-14 | 2021-11-19 | 复旦大学 | 一种基于自噬-外泌通路调节巨噬细胞极化的方法及其用途 |
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