CN104955830A

CN104955830A - 对映异构体纯的7-(2’-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱的全化学合成的方法

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Publication number: CN104955830A
Application number: CN201380067730.7A
Authority: CN
Inventors: X·陈; F·H·豪歇尔; A·马拉霍夫; H·科夏特
Original assignee: BioNumerik Pharmaceuticals Inc
Current assignee: BioNumerik Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-11-13
Filing date: 2013-11-07
Publication date: 2015-09-30
Also published as: WO2014078168A1; US20140135499A1; US8722886B1; EP2920191A1; EP2920191A4; JP2016501187A; EP2920191B1

Abstract

本发明公开且要求保护对映异构体纯(即99％)的7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱(BNP1350；卡仑尼替星；Cositecan)的全合成的五(5)种新的、高效合成路线。这些前述合成方案首先公开了使用高度新的直接、非线性和收敛的合成策略全合成7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱，其包括使载有关键C7-(三甲基甲硅烷基)乙基侧链的A环关键合成子退火成对映异构体纯的三环吡啶酮；而不是通过在全合成喜树碱母体化合物上引入C7-(三甲基甲硅烷基)乙基侧链作为最终合成步骤的常规方法。本文报道的目前新合成方法因为利用了期望官能化的预装三甲硅烷基乙基侧链的A-环，前述合成方法具有通过代替期望官能化的硝基或保护的氨基苯基羧基A-环作为起始原料制备宽范围的药学相应的A-环取代的BNP1350类似物的更宽范围。

Description

对映异构体纯的7-(2’-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱的全化学合成的方法

技术领域

本发明涉及对映异构体纯的7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱(BNP1350；卡仑尼替星(Karenitecin)；Cositecan)的全化学合成的全合成的新化学策略。

背景技术

I.喜树碱(CPT)和初期临床试验

喜树碱(CPT；IUPAC命名：(S)-4-乙基-4-羟基-1H-吡喃[3’,4’:6,7]吲哚嗪并(indolizino)[1，2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮)及一些其类似物已经显示出具有不同程度的抗肿瘤活性。目前，美国的食品药品管理局(FDA)和全球一些其他区域的其它管理机构已经批准了两种CPT类似物(伊立替康和拓扑替康，如下所讨论的)用于治疗用途，用于各种形式的实体肿瘤。

最初在1966年由Wall等从喜树(Camptotheca accuminata)(蓝果树科，Nyssaceae family)分离出CPT，喜树是一种中国红豆杉。参见，Wall,M.E.等,Plant chemotherapeutic agents.I.The Isolation andStructure of Camptothecin,a Novel Alkaloidal Leukemia and TumorInhibitor from Camptotheca Acuminata.J.Am.Chem.Soc.88:3888-3890(1966))。

最初分离的喜树碱(CPT)的结构显示如下：

喜树碱(CPT)

到了19世纪70年代早期，CPT已经达到了I期和II期临床试验，尽管发现其具有抗肿瘤活性，但存在着许多与其使用相关的有害生理学副作用。副作用包括，但不限于，严重且不可预测的骨髓抑制、胃肠道毒性、出血性膀胱炎、脱发、腹泻、恶心、呕吐等。这些在早期临床研究期间中发现的毒性使得药物在该时间段中是“难以控制的”。参见Muggia,F.M.；et al.,Phase I Clinical Trial of Weekly and DailyTreatment With Camptothecin(NSC-100880):Correlation WithPreclinical Studies.Cancer Chemother.Rep.56:515-521(1972)；Schaeppi,U.等,Toxicity of Camptothecin(NSC-100880).CancerChemother.Rep.5:25-36(1974)。

为了证实本发明的实用性和新颖性，将有益地参与简述涉及用非肠道方式给药进行人临床试验的公开文献。CPT的物理化学研究发现闭合E-环内酯形式的CPT在水中具有非常差的溶解度(即，溶于1ml水中的约0.1μg药物)。另外，在两种CPT对映异构体中，发现天然存在的(S)-异构体比(R)-异构体更有效。参见，例如Motwani,M.V.等,Flavopiridol(Flavo)Potentiates the SN-38-Induced Apoptosis inAssociation with Downregulation of Cyclin Dependent KinaseInhibitor p21waf1/cip1 in HCT116 Cells.Proc.Am.Assoc.Cancer Res.41:32-43(2000)。这些各种类似物的不同性质是由CPT的核心结构上的不同化学取代基所引起的。

因此，由于其非常差的水溶性，为了在人临床试验中通过常规给药途径方案给药CPT，最初使用氢氧化钠来配制成其羧酸钠形式(开放内酯形式)。重要的是要注意所有这些使用氢氧化钠CPT制剂的早期临床研究是为了显著提高分子的水溶性(即，亲水性)，以使得能将足量的药剂非肠道给药至患者，并且在某些情况下口服给药至患者。CPT的氢氧化钠制剂形成了水溶性更大的CPT物质，允许临床医师使用较小药物体积的施予来给药更大浓度的CPT，从而使得可以将足够高剂量的药物给药至经受I期和II期临床试验的癌症受试者。然而，随后确定了该制剂导致喜树碱分析的内酯E-环的水解，因而形成CPT的水溶性羧酸盐形式，其只具有最初非水解内酯形式的CPT的约十分之一或更少的抗肿瘤功效。由于经常观察到显著的全身毒性和缺乏抗肿瘤活性，因此使用氢氧化钠配制的CPT进行的临床试验是非常令人失望的。随后确定了药物相对低的亲水性是这些副作用最重要的原因。这种内酯形式的CPT的低水溶性极大程度上限制了药物的实际临床实用性，因为为了提供有效剂量的药物，必须将过大体积的流体给药至患者。由于CPT内酯形式及其许多类似物在水中有效的抗肿瘤活性和差的水溶性，许多努力都针对产生具有更大水溶性的新CPT内酯类似物。为了具有活性，不应当大量存在开放E-环形式的水溶性CPT类似物，但是可选地，应当主要以闭环内酯形式存在。因此，其中平衡有利于闭环内酯形式的CPT类似物是给药所需要的。

II.CPT的药理学活性

尽管这些较早的令人失望的副作用，作为其作用机制(即，拓扑异构酶I抑制)揭示的结果，在20世纪80年代期间引起了对CPT日益递增的临床关注。这种关于CPT类似物作用机理的新信息用来复燃对研发用作抗肿瘤药物的新Topo I抑制剂的兴趣，并且随后几个研究组开始尝试研发用于癌症治疗的新CPT类似物。参见，Hsiang,Y.H.等,Camptothecin Induces Protein-Linked DNA Breaks ViaMammalian DNA Topoisomerase I.J.Biol.Chem.260:14873-14878(1985)；Hsiang,Y.H.；Liu,L.F.,Identification of Mammalian DNATopoisomerase I as an Intracellular Target of the Anticancer DrugCamptothecin.Cancer Res.48:1722-1726(1988)；Hsiang,Y.H.等,Arrest of Replication Forks by Drug-Stabilized Topoisomerase I DNACleavable Complexes as a Mechanism of Cell Killing by Camptothecin.Cancer Res.49:5077-5082(1989)。

几种临床上重要的抗癌药物通过影响DNA拓扑异构酶来杀死肿瘤细胞。拓扑异构酶是在DNA复制和通常在复制、转录和或许的其他DNA过程中引起的三级结构改变(例如，过旋、欠旋和链状排列)中起作用的基本核酶。所有真核细胞中普遍存在的两种主要拓扑异构酶：(i)拓扑异构酶I(Topo I)，其裂解单链DNA和(ii)拓扑异构酶II(TopoII)，其裂解双链DNA。拓扑异构酶I涉及DNA复制；其消除了移动复制叉前面引入的扭转应变。

拓扑异构酶I(Topo I)是含有765个氨基酸的单体100kDal多肽，由位于染色体20q12-13.2上的基因编码。参见，例如，Creemers,G.J.等,Topoisomerase I Inhibitors:Topotecan and Irinotecan.CancerTreat.Rev.20:73-96(1994)；Takimoto,C.H.；Arbuck,S.G.TheCamptothecins.Cancer Chemother and Biother.2nd edition(B.L.Chabner,D.L.Longo(eds)),463-384(1996)。它是DNA复制和RNA转录中必需的酶，并且存在于所有真核(包括肿瘤)细胞。由于正常的DNA是超螺旋的，并且紧紧置于染色体中，因此DNA复制叉不能合成这种拓扑限定的DNA之外的新DNA。Topo I以ATP非依赖性方式起作用，通过结合超螺旋的DNA和裂解磷酸二酯键，导致单链断裂。同时，Topo I在Topo I的位置723的酪氨酸残基和单链DNA分子的3’端之间形成共价可逆加合物，称为可裂解复合物。DNA分子能够围绕完整DNA单链自由旋转，并且产生DNA的松弛。在裂解再连接之后，Topo I与DNA分离。可裂解复合物通常只存在较短的时间，正好允许未裂解的单链DNA解旋。

特别地，发现CPT形成包括：Topo I-CPT-DNA的可逆共价复合物。简而言之，CPT的主要作用机理是通过阻断Topo I的裂解/再连接反应的再连接步骤抑制Topo I，因此导致共价反应中间体(即，可裂解复合物)的累积。基于CPT的细胞凋亡是通过前进中的复制叉和Topo I DNA复合物之间的潜在致命碰撞的S-期特异性杀死。已经鉴定了两种涉及Topo I共价修饰的Topo I介导的DNA损伤的修复应答。第一种涉及泛素/26S蛋白酶体途径的激活，导致Topo I的降解(CPT诱导的Topo I下调)。第二种涉及小泛素样调节剂(SUMO)与Topo I缀合。这些用于Topo I介导的DNA损伤的修复机制在测定肿瘤细胞中的CPT敏感性/抗性中起着重要作用。

从人结肠癌细胞或小牛胸腺纯化的Topo I已经显示出受到CPT的抑制。CPT，伊立替康(CPT-11)和另外的Topo I抑制剂拓扑替康已经用于临床试验中来治疗特定类型的人类癌症。为了本发明的目的，CPT类似物包括：7-乙基-10-[4-(1-哌啶子基)-1-哌啶子基]羰基氧喜树碱(伊立替康或CPT-11)，10-羟基-7-乙基喜树碱(HECPT)，9-氨基喜树碱，10,11亚甲基二氧喜树碱和9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱(拓扑替康)。这些CPT类似物使用相同的机理来抑制Topo I；它们稳定酶和链裂解的DNA的共价复合物，其是催化机理中的中间产物。这些类似物对于分离的DNA或Topo I没有结合亲和性，但是以可测量的亲和性结合酶-DNA复合物。由CPT和类似物稳定的Topo I“可裂解复合物”是易于可逆的。

拓扑异构酶II(Topo II)以与Topo I类似的方式工作，差异在于前一种酶是在DNA松弛中ATP-依赖性地起作用，以引起可逆的双链DNA裂解。CPT与Topo II的直接干涉还没有得到描述。然而，已经报道了在24和48小时之后通过提高Topo II mRNA表达，伊立替康(CPT-11)治疗使小鼠中的一些肿瘤异种移植物对Topo II抑制剂变得敏感。这表明靶向用于人实体瘤的化疗的Topo I和Topo II的联合治疗可能是有价值的。通过选择性地诱导在酶介导裂解的5’-端带有鸟嘌呤残基的Topo I位点的可裂解复合物的稳定，CPT类似物抑制Topo I的再连接反应。参见，例如，Svejstrup,J.Q.等,Technique forUncoupling the Cleavage and Religation Reactions of EukaryoticTopoisomerase I.The Mode of Action of Camptothecin at a SpecificRecognition Site.J.Mol.Biol.222:669-678(1991)；Jaxel,C.等,Effectof Local DNA Sequence on Topoisomerase I Cleavage in the Presenceor Absence of Camptothecin.J.Biol.Chem.266:20418-20423(1991)；Tanizawa,A.等,Induction of Cleavage in Topoisomerase I c-DNA byTopoisomerase I Enzymes From Calf Thymus and Wheat Germ in thePresence and Absence of Camptothecin.Nucl.Acids Res.21:5157-5166(1994)。尽管这种稳定自身是可逆的，当复制叉遇到可裂解复合物时，产生了不可逆的双链断裂。Topo I的水平越高，可裂解复合物的频率越高，越多数量的DNA断裂。这些断裂导致细胞周期停止于S/G2-期，细胞凋亡途径的激活，并最终导致细胞死亡。参见，例如，Hsiang,Y.H.等,Arrest of Replication Forks by Drug-StabilizedTopoisomerase I DNA Cleavable Complexes as a Mechanism of CellKilling by Camptothecin.Cancer Res.49:5077-5082(1989)。作为这种情况的结果，Topo I抑制剂只在正在进行中的DNA复制或RNA转录存在下才是致命的。参见，例如，D'Arpa,P.等,Involvement ofNucleic Acid Synthesis in Cell Killing Mechanisms of Topoisomerase IPoisons.Cancer Res.50:6919-6924(1990)。与G1-或G2/M-细胞相比较，S-期同步化的细胞似乎对Topo I抑制剂敏感得多，表明对这种类型的药物的S-期特异性细胞毒性。参见，例如Takimoto,C.H.等,Phase I and Pharmacologic Study of Irinotecan Administered as a96-Hour Infusion Weekly to Adult Cancer Patients.J.Clin.Oncol.18:659-667(2000)。在结肠、前列腺、卵巢和食道肿瘤中，已经发现了升高水平的Topo I，而在肾脏肿瘤和非霍奇金淋巴瘤中，情况不是这样。参见，例如Van der Zee,A.等,P-glycoprotein Expression andDNA Topoisomerase I and II Activity in Benign Tumors of the Ovaryand in Malignant Tumors of the Ovary,Before and AfterPlatinum/Cyclophosphamide Chemotherapy.Cancer Res.51:5915-5920(1991)。最近的研究已经表明伊立替康和拓扑替康也是血管生成的抑制剂，这是一种可能有助于它们的化疗活性的性质。新血管形成与各种人类肿瘤提高的入侵和转移成正相关。在小鼠角膜模型中，研究了包括伊立替康(CPT-11)的一些CPT的抗血管生成作用。血管生成是通过成纤维细胞生长因子诱导的，而通过递增伊立替康CPT-11的剂量，肿瘤中血管生成的区域将减少，遵循负的、几乎是指数的曲线。在210mg/kg的剂量水平，观察到新血管形成的显著降低。

尽管CPT和前述的CPT类似物对Topo II不具有可辨别的直接作用，但认为这些CPT类似物能以类似于其中表鬼臼毒素糖苷和各种蒽环类抗生素抑制Topo II的方式来稳定“可裂解复合物”。

CPT和类似物对Topo I的抑制诱导了蛋白相关的DNA单链断裂。事实上，所有在用CPT处理的体外细胞中观察到的DNA链断裂是蛋白相关的。然而，在用CPT处理的L1210细胞中可以检测到无法解释的蛋白无关断裂的增加。类似物似乎在末端标记的线性DNA中产生了相同的DNA分裂模式。还没有证明CPT或CPT类似物在不存在Topo I酶下裂解DNA。

III.喜树碱的细胞周期特异性活性

CPT的活性是细胞周期特异性的。在暴露于CPT的细胞中观察到的最大定量生化作用是S-期过程中发生的DNA单链断裂。因为S-期是细胞周期中相对短的时期，较长时间暴露于药物导致提高的细胞杀灭。肿瘤细胞简短暴露于药物产生很少或没有细胞杀死，而休眠细胞是顽固的。这些上述的结果很可能是由于以下的两个因素：

(i)这类药物可逆地抑制Topo I的正常活性。尽管它们可以在DNA复制期间潜在地产生致命的DNA结构修饰，但在药物清除之后可以修复DNA链断裂；和

(ii)用Topo I抑制剂比如CPT处理的细胞趋于停止于细胞周期的G₀，直至除去药物，并且修复了裂解的DNA。这些酶的抑制剂可以影响细胞代谢的许多方面，包括复制、转录、重组和染色体分离。

IV.卡仑尼替星/BNP1350

高度亲脂性喜树碱衍生物(HLCDs)，特别是含有基于硅的基团的那些，是有效的抗癌药物。最有名的含HLCD之一是(也称为BNP1350,Cositecan；7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱；IUPAC命名：(4S)-4-乙基-4-羟基-11-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-1H-吡喃[3’，4’：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮，其在美国和世界上目前处于3期人类临床试验。卡仑尼替星具有如下所示通式结构式∶

其中，R₁、R₂、R₃＝甲基(–CH₃)官能团共价结合至卡仑尼替星分子的含硅侧链(结合B环上的C7)。

在本发明中以非限制性方式公开和要求保护的卡仑尼替星及其各种类似物代表一个新类型的化疗化合物，其针对常见类型的癌症显示出有效的抗肿瘤活性，所述癌症包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌以及黑素瘤。虽然卡仑尼替星(及其类似物)具有与其他喜树碱衍生物相似的拓扑异构酶I抑制活性，但是其还具有合理地设计用于更优生物利用度和组织渗透性的新结构修饰，同时避免了在人类及其它哺乳动物癌症中常见的麻烦的代谢和耐药性机制。

可以由药理学和生物化学数据确定许多以前合成的喜树碱类似物具有许多固有限制，其显著地降低了它们作为抗癌剂的有用性。相反，卡仑尼替星是一种以实质性内酯稳定性和长血浆半衰期为特征的高度亲脂性喜树碱衍生物。在一组超过二十(20)个人类癌细胞系中进行的体外试验表明卡仑尼替星是比托泊替康或SN-38(依立替康的活性代谢物)显著更有效的抗肿瘤剂。用人血浆的平衡渗析研究证实卡仑尼替星是98至99％的蛋白质结合的。血浆中的游离药物浓度一般被认为在临床药理学中是药理学活性形式。

卡仑尼替星具有比之前公开的喜树碱衍生物可能显著更低毒性。而且，卡仑尼替星没有进行A-环或B环葡萄糖醛酸化(和隐含的去葡萄糖醛酸化)。缺乏葡萄糖醛酸化减少了有害的生理学副作用(例如，腹泻、白血球减少)，并且也可以减轻游离代谢物及其葡糖苷酸共轭物的药物水平方面的患者间实质的可变性。卡仑尼替星及其也是前药，需要代谢活化。

因此，卡仑尼替星∶(i)具有在体外抑制人类和动物肿瘤细胞生长的有效的抗肿瘤活性(即，以纳摩尔或纳摩尔下的浓度)；(ii)有效地抑制拓扑异构酶I；(iii)缺少对MDR/MRP耐药性的敏感性；(iv)不需要任何代谢性药物活化；(v)缺少A-环或B-环的葡萄糖醛酸化；(vi)降低对血浆蛋白的药物-结合亲和性；(vii)保持内酯稳定性；(viii)保持药物功效；和(ix)具有低分子量(例如，MW<600)。

发明内容

本文公开和主张要求的本发明具有许多特征和实施方案，包括但不限于在简述中列出或描述或提及的那些。其不意味着包括一切，本文描述和主张要求的本发明不限于简述中鉴定的特征或实施方案，将其包括仅仅用于示例而不是限制。

在一个实施方案中，本发明公开了卡仑尼替星(也称为BNP1350,Cositecan；7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱；IUPAC命名：(4S)-4-乙基-4-羟基-11-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-1H-吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4H，12H)-二酮))的全合成方法。在该实施方案中，起始原料为市售可获得的、成本有效的2-硝基苯甲醛。全合成方法的第一步包括向前述起始原料中Grignard加入2-(三甲基甲硅烷基)乙烯基溴化镁，接着氧化该中间体，得到乙烯基芳基酮。在Pd/C的存在下工业规模的氢化得到关键的A-环中间体1-(2-氨基-苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮。1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮与市售可获得的对映异构体纯的CDE环中间体(三环吡啶酮)进行Friedlander缩合，得到期望的BNP1350产物。

在另一个实施方案中，本发明公开了一种卡仑尼替星(也称为BNP1350,Cositecan)的全化学合成方法。在该实施方案中，起始试剂为市售可获得的、成本有效的N-Boc-苯胺。合成方法包括首先用叔丁基锂处理N-Boc-苯胺，接着加入甲氧基甲基(3-三甲基甲硅烷基)丙酰胺，得到作为A环关键中间体的2-(3’-三甲基甲硅烷基丙酰基)-N-Boc-苯胺。(7-三甲基甲硅烷基丙酰基)-N-Boc-苯胺与市售可获得的手性CDE环中间体进行Friedlander缩合，得到期望的BNP1350产物。

在仍然另一个实施方案中，本发明公开了一种卡仑尼替星(也称为BNP1350,Cositecan)的全化学合成方法。在该实施方案中，起始试剂为市售可获得的、成本有效的N-Boc-2-碘苯胺。合成方法包括首先偶联N-Boc-2-碘苯胺与乙炔基三甲基硅烷，接着在Pd/C存在下氢化以产生2-(3’-三甲基甲硅烷基丙酰基)-N-Boc-苯胺，得到A环关键中间体。2-(3'-三甲基甲硅烷基丙酰基)-N-Boc-苯胺与市售可获得的手性CDE环部分进行Friedlander缩合，得到期望的BNP1350(卡仑尼替星；Cositecan)产物。

在仍然另一个实施方案中，本发明公开了一种卡仑尼替星(也称为BNP1350,Cositecan)的全化学合成方法。在该实施方案中，所述起始试剂为市售可获得的，成本有效的乙炔基三甲基硅烷，向其中加入正丁基锂和邻-硝基苯甲醛，形成1-(2-硝基苯基)-3-三甲基甲硅烷基-2-丙炔-1-醇。用二氧化锰氧化丙炔-1-醇，得到2-(3’-三甲基甲硅烷基丙炔酰基)-硝基苯，在Pd/C的存在下氢化，使其转化成关键的A-环中间体1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮。1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮与市售可获得的手性CDE环部分进行Friedlander缩合，得到期望的BNP1350产物。

在一个进一步的实施方案中，本发明公开了一种卡仑尼替星(也称为BNP1350,Cositecan)的全化学合成方法。在该实施方案中，起始试剂为市售可获得的、成本有效的2-硝基苯甲酸。合成方法首先包括将2-硝基苯甲酸活化为更有活性的2-硝基苯甲酰氯，接着该粗酰基氯与双(三甲基甲硅烷基)乙炔进行Friedel-Craft炔基化，得到1-苯基-3-三甲基甲硅烷基-丙炔酮。接着，在Pd/C的存在下前述中间体氢化，得到关键的A-环中间体合成子1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮，其在1N HCl的存在下结晶，得到1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮盐。1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮盐与市售可获得的手性CDE环部分进行Friedlander缩合，得到期望的BNP1350产物。

附图说明

图1图解了基于HPLC的手性分析的结果。

图A显示使用美国专利No.7,030,243中列出的前述方案合成的(R)-BNP1350和(S)-BNP1350的HPLC峰。

图B显示使用本专利申请中公开的合成方案1合成得到的(S)-BNP1350的HPLC峰。如人们可确定的，天然(S)-BNP1350的值(图A；15.012分钟)和合成的(S)-BNP1350的值(图B；14.699分钟)是非常接近的。

图2图解了由天然产物制备的BNP1350和经由本发明的全合成方案制备的BNP1350的平均IC₅₀值的概述。

发明详述

本文描述的实施方案不是打算穷举的，或用来将本发明限制在所公开的精确形式。选择它们来最好地说明本发明的原理、及其应用和实际使用，以能够最佳地使本领域其他技术人员遵循其教导。

如之前公开的，喜树碱是从其天然来源喜树(蓝果树科，Nyssaceaefamily)分离的，喜树是一种中国的红豆杉(参见Wall,M.E.等,Plantchemotherapeutic agents.I.The Isolation and Structure ofCamptothecin,a Novel Alkaloidal Leukemia and Tumor Inhibitorfrom Camptotheca Acuminata.J.Am.Chem.Soc.88:3888-3890(1966))。由于这一中国红豆杉种类仅生长在中国的一个东南部的省份，任何实质的或长期的气候变化和/或昆虫、霉菌或真菌寄生都可引起可存活的树的数量显著减少，能够被收获的喜树碱的量同时相应地减少。最近来自印度的两种其他植物种类Nothapodytes nimmoniana和Nothapodytes foetida被鉴定为分离喜树碱(CPT)的可替代天然来源，喜树碱是单萜吲哚生物碱的成员。还值得注意的是喜树碱及其同种物含量在前述树种类的不同部分中不同，所述部分包括分离的部分如根、树皮、叶和种子。

然而，迄今为止，可以以高产率、收敛的半合成方法由天然存在的喜树碱(这样的天然存在的喜树碱的大量可靠来源)开始合成BNP1350(卡仑尼替星；Cositecan)是制药工业中持续关注的。因此，在不依赖于分离天然存在的喜树碱，用于全合成BNP1350的强效的、成本有效的且工业可规模化合成路线具有巨大的价值。

尽管文献中存在一些喜树碱全合成的合成方案，但是它们一般限于学术应用/兴趣，且对于用于制药工业中具有极其有限的价值，因为这些前述合成路线不可规模化和/或包括在合成中使用昂贵的试剂或中间体。

本发明公开且要求保护用于全化学合成对映异构体纯的(即，99％)BNP1350(卡仑尼替星；Cositecan)的五(5)种新的、高效的合成路线。这些前述合成方法首先公开了使用高度新的直接的和收敛的非线性合成策略全合成BNP1350，其包括使载有关键C7-(三甲基甲硅烷基)乙基侧链的关键A环合成子退火成对映异构体纯的市售可获得的三环吡啶酮；而不是通过在全合成喜树碱母体化合物上引入C7-(三甲基甲硅烷基)乙基侧链作为最终合成步骤的常规工艺。本文报道的目前新合成方法因为利用了期望官能化的预装三甲硅烷基乙基侧链的A-环，前述合成方法具有通过代替期望官能化的硝基或保护的氨基苯基羧基A-环作为起始原料制备宽范围的药学相应的A-环取代的BNP1350类似物的更宽范围。

用于全合成BNP1350(卡仑尼替星)的方案的具体实例

一般方法∶所有反应都在干燥氩气或氮气的惰性气氛下进行。使用市售试剂而无需进一步纯化。除非另有说明，否则¹H和¹³C NMR光谱是使用Varian Gemini 300MHz光谱仪且使用氚化氯仿作为溶剂获得的。化学位移用来自四乙基硅烷的百万分率(ppm)低磁场报告。

HPLC方法：用Waters 2695 HPLC仪器监测反应混合物和化合物的纯度。其采用XTerra C18反相柱(4.6×250mm)与Waters 474扫描荧光检测器(λ_ex 370nm；λ_em430nm)，使用在0.05％甲酸中10-90％的乙腈的梯度，流速1mL/min。

1.合成方案一

方案1图解用于合成BNP1350的本发明的第一种方法。如所示的，起始试剂为市售可获得的、成本有效的2-硝基苯甲醛(1)。所述方法包括首先加入2-(三甲基甲硅烷基)乙烯基溴化镁，接着氧化该粗物质，得到乙烯基芳基酮(2)。在Pd/C的存在下氢化，得到关键的A-环部分1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮(3)，该中间体(3)是足够纯的，直接用于下一步而无需纯化。1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮与市售可获得的CDE环部分(4)进行Friedlander缩合，得到期望的BNP1350(卡仑尼替星；Cositecan)产物，产率90％。

1-(2-硝基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙烯酮(2)

向2-溴乙烯基三甲基硅烷(0.5g)和镁屑(0.1g)在四氢呋喃(THF；2.5mL)中的混合物中加入一块碘。将该混合物回流1小时，并用2.5mL的THF稀释。然后，将反应冷却至室温，得到所需的2-(三甲基甲硅烷基)乙烯基溴化镁溶液。在-30℃下，将得到的Grignard加入到2-硝基苯甲醛(281mg)在THF(2.5mL)中的溶液中。在-30℃下搅拌反应混合物1小时。然后，加入4％氯化铵溶液。用5mL的乙酸乙酯萃取水相共3次(EtOAc,3×5mL)。将合并的有机相过滤，并在减压下蒸发滤液，得到褐色油状物。

将来自前述步骤的粗产物溶于二氯甲烷(CH₂Cl₂；8mL)中。加入2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO,2mg)、溴化钠(96mg)和水(4mL)。向该混合物中慢慢地加入次氯酸钠(4.81％的水溶液，2.2g)和碳酸氢钠(104mg)在水(4mL)中的溶液。在室温下，搅拌反应物1小时。然后，加入另一份在水(5mL)中的次氯酸钠(4.81％的水溶液，4.3g)和碳酸氢钠(372mg)。该反应再持续两小时。用10mL的二氯甲烷萃取水相总共3次(3×10mL)。将合并的有机相过滤，并在减压下蒸发滤液。使粗产物进行硅胶色谱(在己烷中的10％乙酸乙酯；SiO₂)，得到期望的1-(2-硝基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙烯酮(2)(121mg；产率56％)。

¹H NMR(300Hz,CDCl₃)δ8.13(dd,1H,J＝8.0,1.2Hz),7.77-7.71(m,1H),7.66-7.61(m,1H),7.44(dd,1H,J＝7.5,1.5Hz),6.71(dd,2H,J＝26.25,19.2Hz),0.125(s,9H).

1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮 (3)

在室温下，在氢气球压力下搅拌1-(2-硝基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙烯酮(2)(98mg)和钯炭(5％；49mg)在乙酸乙酯(4mL)中的混合物16小时。在过滤通过硅藻土之后，在减压下蒸干滤液，得到呈浅黄色油状物的1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮(3)，其是足够纯的，用于下一个合成步骤中而无需进一步纯化：

1H NMR(300Hz,CDCl₃)δ7.74(dd,1H,J＝8.4,1.2Hz),7.29-7.24(m,1H),6.69-6.63(m,2H),2.94-2.88(m,2H),0.93-0.87(m,2H),0.058(s,9H)。

(4S)-4-乙基-4-羟基-11-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-1H-吡喃[3':4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮(BNP1350)

向1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮(3)(34mg)和CDE环部分(4)(24mg)在乙酸(0.5mL)和甲苯(1mL)中的溶液中加入对甲苯磺酸(1mg)。在100℃下，搅拌该反应溶液20小时。在冷却至室温之后，在减压下浓缩反应溶液，并用己烷(10mL)、水(10mL)及丙酮(5mL)和己烷(5mL)的混合物洗涤残余物。在真空中蒸干黄色固体，得到39mg(产率98％)的BNP1350(Karenitecin；Cositecan；7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱；IUPAC命名：(4S)-4-乙基-4-羟基-11-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-1H-吡喃[3':4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮)。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.24(d,1H,J＝8.4Hz),8.05(d,1H,J＝7.5Hz),7.82(t,1H,J＝7.2Hz),7.71-7.66(m,2H),5.77(d,1H,J＝16.2Hz),5.33(d,1H,J＝16.2Hz),5.26(s,2H),3.73(s,1H),3.15-3.09(m,2H),1.96-1.86(m,2H),1.03(t,3H,J＝7.5Hz),0.91-0.98(m,2H),0.19(s,9H)。

¹³C NMR(300MHz,CDCl₃)δ174.15,157.91,152.17,150.41,149.75,147.34,147.24,130.98,130.20,127.84,126.83,126.28,123.49,118.67,98.21,73.01,66.59,49.48,31.86,24.32,18.00,8.04,-1.65。

MS:449(M+1)；手性纯度∶100％ee。

¹H和¹³C NMR分析

为了确定合成方案1制备的BNP1350相对于如发明名称“Preparation of Camptothecin Derivatives”美国专利No.7,030,243(其与本专利申请具有相同的受让人)列出的使用从天然来源分离的喜树碱制备的BNP1350的任何差异，进行¹H和¹³C NMR分析。

经由合成方案1制备的BNP1350的¹H NMR和¹³C NMR光谱与使用天然来源的喜树碱制备的BNP1350的一致。

来自天然来源的喜树碱的BNP1350的NMR分析

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.23(d,1H,J＝8.4Hz),8.04(d,1H,J＝8.4Hz),7.80(t,1H,J＝7.2Hz),7.69-7.64(m,2H),5.76(d,1H,J＝16.5Hz),5.33(d,1H,J＝16.5Hz),5.24(s,2H),3.14-3.08(m,2H),1.96-1.82(m,2H),1.04(t,3H,J＝7.4Hz),0.90-0.96(m,2H),0.18(s,9H)。

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ174.07,157.82,151.96,150.31,149.47,147.39,147.11,130.77,130.26,127.84,126.75,126.24,123.45,118.68,98.35,72.99,66.54,49.47,31.80,24.35,17.99,8.08,-1.63。

来自合成方案1的BNP1350的NMR分析

基于HPLC的BNP1350手性分析

为了确定合成方案1制备的BNP1350相对于如发明名称"Preparation of Camptothecin Derivatives"美国专利No.7,030,243(其与本专利申请具有相同的受让人)列出的使用从天然来源分离的喜树碱制备的BNP1350在手性方面的任何差异。用于基于HPLC的手性分析的条件如下：

用于手性检测的HPLC条件：(022812)

(1)柱∶Chiral-AGP柱(ChromTech,4.0x 100mm)

(2)流动相∶11％的乙腈和89％的10nM乙酸铵

(3)流速∶1.0mL/min

(4)柱温∶30℃

(5)检测：PDA254nm

(6)使用WATERS(2695)HPLC-(2996)UV系统(GMP认证的分析仪器，022712)进行分离

图1图解了基于HPLC的手性分析的结果。图A显示使用美国专利No.7,030,243中列出的前述方案合成的(R)-BNP1350和(S)-BNP1350的HPLC峰。图B显示使用本专利申请中公开的合成方案1合成得到的(S)-BNP1350的HPLC峰。如人们可确定的，天然(S)-BNP1350的值(图A；15.012分钟)和合成的(S)-BNP1350的值(图B；14.699分钟)是非常接近的。

2.合成方案二

合成方案2图解了用于合成BNP1350的本发明的第二种方法。如所示的，起始试剂为市售可获得的、成本有效的N-Boc-苯胺(5)。合成方法包括首先用叔丁基锂处理N-Boc-苯胺(5)，接着加入新制备的甲氧基甲基(3-三甲基甲硅烷基)丙酰胺(6)，得到2-(3'-三甲基甲硅烷基丙酰基)-N-Boc-苯胺(7)。2-(3'-三甲基甲硅烷基丙酰基)-N-Boc-苯胺(7)与市售可获得的CDE环部分(4)进行Friedlander缩合，得到期望的BNP1350(卡仑尼替星；Cositecan)产物，产率优良。

甲氧基甲基(3-三甲基甲硅烷基)丙酰胺(6)

给圆底烧瓶中装入3-三甲基甲硅烷基丙酸(500mg)。加入草酰氯(1.45mL)，并在室温下搅拌反应混合物1.5小时。在减压下除去过量的草酰氯。使用该酰基氯而无需进一步纯化。将酰基氯和N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(433mg)溶于无水二氯甲烷中。将该溶液冷却至0℃，并加入吡啶(830μL)。在环境温度下，搅拌该混合物2小时，并在真空中蒸发。将残余物分配在盐水和二氯甲烷之间。经硫酸钠干燥有机层，并在真空中浓缩。通过硅胶柱纯化粗酰胺，得到612mg(94％)的产率。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.69(3H,s),3.19(3H,s),2.42–2.35(2H,m),0.86–0.81(2H,m),0.024(9H,s)。

¹³C NMR(75.4MHz,CDCl₃)δ179.45,61.40,26.67,19.91,11.39,-1.67。

2-(3’-三甲基甲硅烷基丙酰基)-N-Boc-苯胺(7)

将N-Boc-苯胺(100mg)在无水乙醚中的溶液冷却至-20℃，用2.5当量的叔丁基锂(在戊烷中1.7M；1.3mM)处理，在-10℃下搅拌2小时，然后在0℃下搅拌1小时。在将该混合物冷却至-76℃之后，加入1.1当量的Weinreb酰胺(6)(109mg)的醚溶液，并使得到的混合物慢慢地升温至室温，搅拌过夜，并用0.1N盐酸淬灭。然后，用二氯甲烷萃取该混合物。经硫酸钠干燥有机溶液，并在真空下蒸发。通过硅胶色谱纯化粗物质，得到103mg(62％)的总收率。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.49-8.46(1H,m),7.89–7.86(1H,m),7.54–7.48(1H,m),7.06–7.00(1H,m),2.99–2.94(2H,s),1.53(9H,s),0.93–0.87(2H,m),0.065(9H,s).

¹³C NMR(75.4MHz,CDCl₃)δ205.64,153.41,142.04,134.78,130.81,121.19,121.11119.59,80.63,34.74,28.52,11.61,-1.59.

BNP1350

将A-环(7)(20mg)和CDE-环(4)(16mg)溶于乙酸和甲苯(1mL；1:1v/v)的混合物中。加入甲苯磺酸(1mg)，并在100℃下搅拌反应混合物24小时。使反应混合物冷却至室温，并在减压下浓缩，然后，用己烷(2×10mL)洗涤残余物2次，并在真空下干燥。通过硅胶柱纯化粗物质，收率27mg(96％)。光谱数据证实与市售BNP1350(卡仑尼替星；Cositecan)的一致。

3.合成方案三

合成方案3图解了用于合成BNP1350的本发明的第三种方法。如所示的，起始试剂为市售可获得的、成本有效的N-Boc-2-碘苯胺(8)。该方法包括首先偶联N-Boc-2-碘苯胺(8)与乙炔基三甲基硅烷，接着在Pd/C存在下氢化，得到2-(3’-三甲基甲硅烷基丙酰基)-N-Boc-苯胺(7)。2-(3'-三甲基甲硅烷基丙酰基)-N-Boc-苯胺(7)与市售可获得的CDE环部分(4)进行Friedlander缩合，得到期望的BNP1350(卡仑尼替星；Cositecan)产物。

1-(2-N-Boc-氨基)-3-三甲基甲硅烷基丙酮(propynone)(9)

向圆底烧瓶中放入：N-Boc-2-碘苯胺(50mg)、乙炔基三甲基硅烷(27μL)、三(双亚苄基丙酮)双钯(15mg),、1,1'-双(二苯膦基)二茂铁(8.9mg)、三乙胺(45μL)和四氢呋喃(THF)。在一氧化碳(CO)气氛(100psi)下，将该烧瓶放入“Parr Instrument”反应器中。在室温下，搅拌反应混合物48小时。一氧化碳(CO)压力释放，并将反应混合物倾倒入含有二氯甲烷和0.1N盐酸的分液漏斗中。用二氯甲烷萃取水相，经硫酸钠干燥合并的有机相，并在减压下蒸发。通过硅胶色谱纯化粗物质，得到17mg(33％)的收率。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ10.69(1H,s),8.48–8.45(1H,m),8.28–8.26(1H,m),7.59–7.53(1H,m),7.11–7.05(1H,m),1.53(9H,s),0.33(9H,s)。

¹³C NMR(75.4MHz,CDCl₃)δ180.66,153.15,143.04,136.13,135.02,121.31118.84,101.93,101.03,81.03,28.47,-0.50。

2-(3’-三甲基甲硅烷基丙酰基)-N-Boc-苯胺(7)

1-(2-N-Boc-氨基)-3-三甲基甲硅烷基丙炔酮(50mg)溶于乙酸乙酯(3mL)中。加入钯碳(5mg)，并将反应混合物置于气球提供的氢气氛下。在室温下，搅拌反应混合物6小时。在反应完成之后，使用硅藻土垫过滤掉钯碳，并在真空下浓缩溶液。通过硅胶柱纯化粗物质，得到46mg(92％)的收率。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.49-8.46(1H,m),7.89–7.86(1H,m),7.54–7.48(1H,m),7.06–7.00(1H,m),2.99–2.94(2H,s),1.53(9H,s),0.93–0.87(2H,m),0.065(9H,s)。

¹³C NMR(75.4MHz,CDCl₃)δ205.64,153.41,142.04,134.78,130.81,121.11,119.59,80.63,34.74,28.52,11.61,-1.59。

BNP1350

将A-环(20mg，0.062mM)和CDE-环(16mg，0.062mM)溶于乙酸和甲苯(1mL；1:1v/v)的混合物中。加入甲苯磺酸(1mg)，并在100℃下搅拌反应混合物24小时。将反应混合物冷却至室温，并在减压下浓缩。用己烷(2×10mL)冲洗残余物2次，并在真空下干燥。通过硅胶柱纯化粗物质，得到27mg(96％)的收率。光谱数据显示与市售可获得的BNP1350得到的数据一致。

4.合成方案四

方案4图解用于合成BNP1350的本发明的第四种方法。起始试剂为市售可获得的成本有效的乙炔基三甲基硅烷，向其中加入正丁基锂和邻-硝基苯甲醛，形成1-(2-硝基苯基)-3-三甲基甲硅烷基-2-丙炔-1-醇(10)。用二氧化锰氧化丙炔-1-醇(10)，得到2-(3'-三甲基甲硅烷基丙炔酰)-硝基苯(11)，在Pd/C的存在下，通过氢化将其转化成关键的A-环部分1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮(3)。1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮(3)与市售可获得的CDE环部分(4)进行Friedlander缩合，得到期望的BNP1350产物。

1-(2-硝基苯基)-3-三甲基甲硅烷基-2-丙炔-1-醇(10)

向圆底烧瓶中放入乙炔基三甲基硅烷(4.90mL)和四氢呋喃(THF)，并冷却至-76℃。滴加2.0M的正-丁基锂在己烷(15.8mL)中的溶液。在-76℃下搅拌反应混合物30分钟，并加入邻-硝基苯甲醛(3.0g)在无水THF中的溶液。在-76℃下搅拌该反应混合物60分钟，并用水淬灭。使反应混合物升温至室温，并在真空下除去THF。用乙酸乙酯萃取水相。经硫酸钠干燥合并的有机相，并蒸干。通过硅胶色谱纯化粗物质，得到4.3克(87％)的收率。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.97-7.92(2H,m),7.71–7.65(1H,m),7.54–7.49(1H,m),5.97(1H,s),0.19(9H,s)。

¹³C NMR(75.4MHz,CDCl₃)δ135.24,133.94,129.81,129.58,125.26,102.54,62.04,-0.11。

2-(3’-三甲基甲硅烷基丙炔酰基)-硝基苯(11)

将1-(2-硝基苯基)-3-三甲基甲硅烷基-2-丙炔-1-醇(5.0g)溶于二氯甲烷(30mL)中。向该溶液中加入二氧化锰(8.7g)。然后，在室温下搅拌反应混合物24小时。在反应完成之后，使用硅藻土垫过滤掉二氧化锰，并蒸干溶液。在真空下干燥粗物质，得到4.5g(91％)的收益。光谱数据显示得到的化合物是足够纯的，用于下一个合成步骤中而无需另外的纯化。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.92-7.88(1H,m),7.85–7.82(1H,m),7.74–7.67(2H,m),0.26(9H,s)。

¹³C NMR(75.4MHz,CDCl₃)δ175.57,133.74,133.09,132.77,130.41,124.30,103.12,100.30,-0.71。

2-(3’-三甲基甲硅烷基丙酰基)-苯胺(3)

将2-(3’-三甲基甲硅烷基丙炔酰基)-硝基苯(11)(500mg)溶于无水甲苯(8mL)中。加入钯碳(30mg)，并将反应混合物置于气球提供的氢气氛下。在室温下，搅拌反应混合物24小时。在反应完成之后，使用硅藻土垫过滤掉钯碳，并在真空下浓缩溶液。通过硅胶柱纯化粗物质，得到380mg(86％)的收率。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.93-7.90(1H,m),7.47–7.41(1H,m),6.86–6.81(1H,m),6.45(2H,brs),3.12–3.06(2H,m),1.11–1.05(2H,m),0.23(9H,s)。

¹³C NMR(75.4MHz,CDCl₃)δ204.12,150.58,134.28,131.26,117.60,115.93,33.96,11.82,-1.54。

BNP1350.

将A-环(3)(16.8mg)和CDE-环(4)(20mg)溶于乙酸和甲苯(1mL；1:1v/v)的混合物中。加入对-甲苯磺酸(1mg)，并在100℃下搅拌反应混合物24小时。将反应混合物冷却至室温，并在减压下浓缩。用己烷(2×10mL)冲洗残余物2次，并在真空下干燥。通过硅胶柱纯化粗物质，得到32mg(94％)的BNP1350(卡仑尼替星；Cositecan)产物。光谱数据显示与市售可获得的BNP1350得到的数据一致。

5.合成方案五

方案5图解用于合成BNP1350的本发明的第五种方法。如所示的，起始试剂为市售可获得的、成本有效的2-硝基苯甲酸(12)。所述方法包括首先将2-硝基苯甲酸(12)转化成活性更强的2-硝基苯甲酰氯(13)，并且在用双(三甲基甲硅烷基)乙炔对粗酰基氯(13)进行Friedel-Craft炔基化之后，得到1-苯基-3-三甲基甲硅烷基-丙炔酮(11)。在Pd/C的存在下氢化粗(11)，得到关键的A-环部分1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮(3)，并且在1N HCl的存在下使粗(3)结晶，得到1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮盐(14)。1-(2-氨基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮盐(14)与市售可获得的CDE环部分(4)进行Friedlander缩合，得到期望的BNP1350(卡仑尼替星；Cositecan)产物，产率优良。

2-硝基苯甲酰氯(13)

在室温下，经30分钟间隔，向2-硝基苯甲酸(200g)和催化量的二甲基甲酰胺(DMF；5mL)在DCM(2.5L)中的悬浮液中慢慢地加入草酰二氯(304g)。在加入之后，在室温下，继续搅拌反应约1小时，悬浮液转变成澄清溶液。通过TLC监测反应完成(一般～1小时)。然后，在35℃下浓缩反应混合物至干，得到225g呈浅黄色油状物或固体(mp∶17℃，lit)的粗产物(13)，其直接用于下一步而无需进一步纯化。

1-(2-硝基苯基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-酮(11)

将2-硝基苯甲酰氯(13)(225g；1.2moles)和1,2-双(三甲基甲硅烷基)乙炔(205g；1.2mol)在二氯甲烷(3L)中的溶液冷却至0℃。在0℃下，经10分钟慢慢地加入氯化铝(159.2克，1.2mol)，同时保持内反应温度低于10℃。在加入之后，在5-10℃下搅拌反应混合物1小时。在搅拌同时，将黑色反应混合物倾倒入冰水混合物(2kg的冰和1kg的水)中。过滤得到的悬浮液，并用二氯甲烷(200mL)洗涤滤饼。分离合并的滤液的有机相。用二氯甲烷(2x 2L)萃取水相2次。用水(2L)洗涤合并的有机相，过滤通过硅藻土垫料(200g)，经硫酸钠(120g)干燥，并在低于30℃(电解质温度)的温度下浓缩至干，得到294g(产率99％)的期望产物，HPLC纯度95％。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.92-7.89(dd,J＝7.49,1.29Hz,1H),7.86-7.83(dd,J＝7.50,1.56Hz,1H),7.76-7.66(m,2H),0.27(s,9H).

1-(2-氨基苯基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙-1-酮(3)

在N₂下，向1-(2-硝基苯基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-酮(11)(294g；1.19mole)在甲苯(4.5L)中的溶液中加入Pd/C(10％wt；30g)。在真空下使得到的悬浮液脱气，并用H₂回填3次。在室温下，在0.3MPa的氢气下氢化该混合物72小时。通过HPLC监测反应进程。当HPLC分析指示化合物(11)消失时，将催化剂过滤通过硅藻土垫料。在真空下浓缩滤液，得到呈黑色液体的粗产物。HPLC分析显示纯度90％。将粗产物溶于乙酸乙酯(7.5L)中，并用4N盐酸(600mL)处理。在相分离之后，HPLC分析显示纯度92.8％。用4N盐酸(600mL)再次洗涤有机相。进一步用4N盐酸(500mL)再洗涤有机相一次。经硫酸钠(200g)干燥有机相，浓缩，得到粗产物(3)(220g；产率84％)。

HPLC纯度∶92.2％；

LC-MS:m/z 222(MH⁺)；

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.76-7.73(d,J＝7.49Hz,1H),7.30-7.24(t,J＝7.61Hz,1H),6.69-6.64(t,J＝6.96Hz,2H),6.27(brs,2H),2.94-2.89(m,2H),0.94-0.88(m,2H),0.07(s,9H)。

1-(2-氨基苯基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙-1-酮盐酸盐(14)

在室温下，经30分钟，向粗(3)(220克，HPLC纯度92.2％)在乙醚(450毫升)中的溶液中滴加饱和的盐酸/乙醚溶液。过滤沉淀的固体，用混合溶剂(乙醚∶正己烷1:1v/v；400mL)洗涤滤饼，并在室温在高真空下干燥2小时，得到呈浅褐色固体的期望产物(14)(160g；产率∶62.4％)。HPLC纯度∶98％；LC-MS:m/z 222(MH⁺)；

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.9(brs,3H),8.05-8.03(d,J＝7.56Hz,1H),7.30-7.24(d,J＝7.56Hz,1H),7.69-7.64(t,J＝7.47Hz,1H),7.53-7.48(t,J＝7.47Hz,1H),3.06-2.97(m,2H),0.92-0.87(m,2H),0.06(s,9H)。

BNP1350

向1-(2-氨基苯基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙-1-酮HCl盐(14)(1165.5mg)和(4)(700mg)在乙酸(29mL)和甲苯(29mL)中的溶液中加入对甲苯磺酸(58.5mg)，得到浅黄色溶液。在100℃下，搅拌得到的溶液24小时。在冷却至室温之后，将该溶液浓缩至干。将残余物在异丙醇(12mL)中浆液化，并在室温下搅拌30分钟。通过真空过滤收集固体产物。用异丙醇(3×1mL)洗涤湿滤饼3次，得到黄白色固体，将其在真空中干燥，得到820mg(产率58.8％)的期望BNP1350(卡仑尼替星；Cositecan)产物，纯度99.2％。¹H-NMR分析与BNP1350的结构一致。

合成1-(2-硝基苯基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-酮(11)的另一种方法

也可以使用第二种合成方法生成关键中间体1-(2-硝基苯基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-酮(11)，其用于全化学合成BNP1350的前述合成方案5中。如所示的，用正丁基锂和氯化锌(II)处理市售可获得的乙炔基三甲基硅烷(15)，形成((三甲基甲硅烷基)乙炔基)氯化锌(II)(16)，然后将其加入2-硝基苯甲酰氯(13)中，得到期望的中间产物1-(2-硝基苯基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-酮(11)。

(三甲基甲硅烷基)乙炔基)氯化锌(II)(16)

在-78℃下，在N₂气氛下，向三甲基甲硅烷基乙炔(500mg)在THF(10mL)中的溶液中滴加正-丁基锂(在己烷中2.5M；2.45mL)，并且在-78℃下继续搅拌1小时。然后滴加氯化锌(II)(1.18g)在无水THF中的溶液，并在低于-60℃下再继续搅拌1小时。将该反应混合物与中间体(13)直接用于下一个偶联反应。

1-(2-硝基苯基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-酮(11)

使上述(三甲基甲硅烷基)乙炔基)氯化锌(II)(16)在THF中的溶液升温至0℃，并在N₂气氛下，在0℃下加入到2-硝基苯甲酰氯(0.94g)和四(三苯基膦)钯(0)(176mg)在四氢呋喃中的混合物中。将反应混合物保持在0℃下30分钟。加入氯化铵水溶液以淬灭反应。然后，将其用EtOAc(3x 100mL)萃取3次，经硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过制备型TLC纯化残余物，得到300mg的期望产物(11)。

¹H-NMR(300MHz,CDCl3)δ7.92-7.89(dd,1H,J＝7.49Hz,J＝1.29Hz),7.86-7.83(dd,1H,J＝7.50Hz,J＝1.56Hz),7.76-7.66(m,2H),0.27(s,9H)。

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细胞毒性试验

进行由天然分离的喜树碱合成的BNP1350相对于经由本文阐述的全合成方案合成的BNP1350的细胞毒素效价的比较。

材料和方法

在补充有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养野生型人卵巢癌细胞(A2780/WT)和多柔比星抗性人卵巢癌细胞(A2780/DX5)，并在含有5％CO₂的37℃培养箱中生长。将由喜树碱天然产物合成的BNP1350(购自APAC)和经由BioNumerikPharmaceuticals,Inc.的合成方案合成的BNP1350溶于DMSO中进行细胞毒性实验，其中使用SRB测定来测量细胞生长的抑制。简而言之，将细胞接种(450个细胞/孔，100μL体积)在96孔微量滴定板中，并使其结合24小时，之后用天然产物BNP1350或全合成BNP1350处理2小时。在2小时处理之后，除去BNP1350，用不含药物的培养基(200μL)洗涤细胞，然后将不含药物的培养基(200μL)加入到细胞中，使其在37℃与5％CO₂下继续生长，之后进行SRB测定(从最初接种时间计全部实验时间为5天，期间发生5次细胞倍增)。

结果

由天然产物制备的BNP1350或经由全合成制备的BNP1350的IC50值非常类似(参见，表1；图2)，两个BNP1350制品都显示是A2780/WT和A2780/DX5细胞生长的有效抑制剂，具有纳摩尔的IC₅₀值。两种BNP1350试验制品也在野生型和多柔比星抗性卵巢癌细胞中都显示出效力(参见表1、表2、图2)，抗性因子比(resistance factorratio)小于2.0(参见表2)。

表1:在人卵巢癌细胞中IC₅₀测定的概述

表2:抗性因子比的概述

本文参考或提及的所有专利、出版物、科学论文、网页以及其他文件和材料表示本发明所属领域的技术人员的水平，并且每篇这样的参考文献和材料在此引入作为参考，如同以其整体单独引入作为参考或在此以其整体列出的程度一样。申请人保留来自任何这样的专利、出版物、科学论文、网页、电子可获得的信息以及其他参考材料或文献的任何和所有材料和信息从实体上引入本说明书的权利。

该专利的书面描述部分包括所有权利要求。而且，所有权利要求，包括所有原始的权利要求以及来自任何和全部优先权文件的权利要求，在此以其整体引入说明书的书面描述部分作为参考，并且申请人保留将任何和全部这样的权利要求在实体上引入申请中的书面描述部分或任何其他部分中的权利。因此，例如，在任何情况下都是将专利解释为提供对权利要求的书面描述，权利要求的精确措词以这样的表述列在专利的说明书部分中。

应当根据法律来解释权利要求。然而，尽管所宣称的或所知的解释任何权利要求或其部分的容易或困难，但是决不可以在一个或多个申请起诉期间对权利要求或其任何部分进行任何调整或修正，导致本专利被解释为对没有形成现有技术的一部分的任何或所有等同方案具有失效的任何权利。

可以以任何组合结合本说明书中公开的所有特征。因此，除非另外明确地指出，否则所公开的每个特征只是一系列等同或相似特征的实例。

应当理解尽管已经结合详细说明描述了本发明，但是之前的描述是为了说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求来限定。因此，从前述内容，应当理解，尽管在此为了说明的目的已经描述了本发明的特定实施方案，但是在没有背离本发明的精神和范围下可以进行各种修饰。其他方面，优点和修饰在下述权利要求的范围内，并且除了如受附加权利要求的限制之外，本发明不受限制。

本文所述的特定方法和组合物表示优选的实施方案并且是示例性的，而不旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员在考虑本说明书时会产生其他目的、方面和实施方案，并且涵盖在由权利要求的范围限定的本发明的精神内。对本领域技术人员显而易见的是在不背离本发明的范围和精神下，可以对本文公开的本发明进行各种置换和修饰。本文说明性地描述的本发明可以在不存在任何一种或多种要素或一种或多种限制下合适地实施，按照需要本文没有特别地公开。因此，例如，在本文的每种情况中，在本发明的实施方案或实施例中，术语“包含”，“包括”，“含有”等可开放性地理解而没有限制。可以以不同的步骤顺序来合适地实施本文说明性地描述的方法和过程，并且不必将其限于本文或权利要求中所示的步骤顺序。

已经使用的术语和表述用作描述的术语而不是限制，并且在使用这样的术语和表述中没有意图来排除所示和所述的特征或其部分的任何同等物，但是认为在所要求发明范围内的各种修饰是可能的。因此，应当理解尽管通过各种实施方案和/或优选的实施方案和任选特征具体地公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用的本文公开的概念的任何和全部修饰和改变被认为是在附加权利要求限定的本发明的范围之内。

本文已经广泛且概括地描述了本发明。落入一般公开内的任一较窄类别和亚组也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，条件或不利限制从该种类中除去了任何主题，与本文是否特别地列举排除的主题无关。

还可以理解除非上下文另有清楚的规定，否则如本文和附加权利要求中使用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指代物，名词后的术语“X和/或Y”表示“X”或“Y”或“X”和“Y”两者，名词后的字母“s”表示名词的复数和单数两种形式。另外，在根据马库什基团描述本发明的特征或方面的情况中，预期并且本领域技术人员应当认识到本发明包括并且也因此根据马库什基团的任何单个成员和任何亚组成员描述，而且申请人保留修正申请或权利要求来具体表示马库什基团的任何单个成员或任何亚组成员的权利。

其他实施方案在权利要求之内。本专利不可以解释为限于在本文特别地和/或明确地公开的特定实施例或实施方案或方法。在任何情况下，都没有将本专利解释为受到由专利商标局的任何审查员或任何其他官员或雇员进行的任何陈述的限制，除非这样的陈述由申请人在书面答复中特别地并且没有条件或保留的明确采纳了。

Claims

1.7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱(卡仑尼替星)的全化学合成的方法，其中所述方法为合成方案1中所列的，其包括下述步骤∶

步骤1)中间体1-(2-硝基苯基)-3-三甲基硅烷基-丙烯酮的合成；

步骤2)中间体1-(2-氨基-苯基)-3-三甲基硅烷基-丙-1-酮的合成，和

步骤3)产物7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱(卡仑尼替星)的合成。

2.7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱(卡仑尼替星)的全化学合成的方法，其中所述方法为合成方案2中所列的，其包括下述步骤∶

步骤1)中间体甲氧基甲基(3-三甲基甲硅烷基)丙酰胺的合成；

步骤2)中间体2-(3'-三甲基甲硅烷基丙酰基)-N-Boc-苯胺的合成；和

3.7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱(卡仑尼替星)的全化学合成的方法，其中所述方法为合成方案3中所列的，其包括下述步骤∶

步骤1)中间体1-(2-N-Boc-氨基)-3-三甲基甲硅烷基丙炔酮的合成；

4.7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱(卡仑尼替星)的全化学合成的方法，其中所述方法为合成方案4中所列的，其包括下述步骤∶

步骤1)中间体1-(2-硝基苯基)-3-三甲基甲硅烷基-2-丙炔-1-醇的合成；

步骤2)中间体2-(3'-三甲基甲硅烷基丙炔酰基)-硝基苯的合成；和

步骤3)中间体2-(3'-三甲基甲硅烷基丙酰基)-苯胺的合成；和

步骤4)产物7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱(卡仑尼替星)的合成。

5.7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱(卡仑尼替星)的全化学合成的方法，其中所述方法为合成方案5中所列的，其包括下述步骤∶

步骤1)中间体2-硝基苯甲酰氯的合成；

步骤2)中间体1-(2-硝基苯基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-酮的合成；

步骤3)中间体1-(2-氨基苯基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙-1-酮的合成；

步骤4)中间体1-(2-氨基苯基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙-1-酮盐酸盐的合成；和

步骤5)产物7-(2'-三甲基甲硅烷基)乙基喜树碱(卡仑尼替星)的合成。