CN104955476A - 多价的糖结合疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及表达内置的多个表位的结合抗原和包含其的多价糖结合疫苗和制剂。此外，本发明涉及这些疫苗特别地用于保护人类群体和特别地用于保护儿科群体免受下列感染的用途：因肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌引起的肺部和全身性感染，或由伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌和大肠杆菌引起的肠道感染。本发明还涉及用于保护免受白色念珠菌和大肠杆菌全身性和泌尿生殖感染或用于保护免受兽医医学中的牛分枝杆菌感染的多价糖结合疫苗。
Description
本发明涉及表达内置的多个表位的新型结合抗原和包含其的多价糖结合疫苗和制剂。此外，本发明涉及这些疫苗特别地用于保护人类群体和特别地用于保护儿科群体免受下列感染的用途：因肺炎链球菌(S.pneumoniae)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)引起的肺部和全身性感染，或由伤寒沙门氏菌(S.typhi)、霍乱弧菌(V.cholerae)和大肠杆菌(E.coli)引起的肠道感染。本发明还涉及用于保护免受白色念珠菌(C.albicans)和大肠杆菌全身性和泌尿生殖感染或用于保护免受兽医医学中的牛分枝杆菌(M.bovis)感染的新型多价糖结合疫苗。
结合疫苗是衡量现今临床免疫学成功的金标准。自九十年代初，用于预防流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌的结合疫苗的问世已经大大改善了西方世界中儿科群体的生活质量。这样的突出的成就目前因WHO发起的扩大免疫规划和通过几个国家的预先市场承诺(AMC)在近期实施的国家免疫规划而正扩展至发展中国家。
例如，疫苗如“Prevnar”(其自2000年起出现于西方市场，先前其为7-价制剂，目前其为13-价制剂，这两种制剂均含有共价结合至载体蛋白CRM197的肺炎链球菌的单一型特异性多糖(PS))现今由WHO推荐至世界上所有国家用于空前的免疫接种活动以保护儿科群体免受肺炎链球菌的全身性感染(侵袭性肺炎球菌病或IPD)，所述感染可最终诱发急性细菌性脑膜炎。事实上，正因为治疗的时间间隔被减少到从症状开始后的几个小时，此病理学被广泛记录为具有高死亡率，所以应遵循的合理策略是预防而非治疗疾病。
由于显著代表人中肺炎链球菌感染的细菌种的量很多(现今已知的超过90个种中的多至23个细菌种)并且当疫苗制剂包含几种结合抗原(例如如果包括由WHO鉴定为药物抗性的流行病学最重要的血清型时，13或15或更多种，其包括细菌血清型(根据Danish命名法)1、2、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F)时使用结合至蛋白载体的单一型特异性Ps的策略需要显著剂量的载体蛋白。减少整个结合制剂中载体蛋白的量的可能性正成为一个优先的问题。
事实上，必须考虑到用流感嗜血杆菌(一种b型Ps的型特异性结合物)、脑膜炎奈瑟菌(A、C、W135和Y群Ps的4种群特异性结合物)和肺炎链球菌(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F型PS的多至13种型特异性结合物)的结合疫苗进行免疫接种用于预防广谱IPD的儿童将要注射18种结合抗原，其具有载体蛋白的18倍单一型特异性剂量的相应负荷。此外，考虑到给2岁前的儿童赋予完全保护需要3至4次剂量的疫苗的事实，该剂量必须乘以3至4倍。将所有考虑在内，注射入儿童的载体蛋白的总量可容易地达到约0.20mg的剂量，至少在蛋白CRM197的情况下是如此，这显然造成了免疫系统的压力，然而到目前为止免疫系统似乎良好地耐受这样量的用于赋予宿主辅助T细胞依赖性的蛋白载体。然而，通过连续升级多价疫苗的制剂如用于预防肺炎链球菌感染的制剂，血清型Ps的量因而载体蛋白的量注定会随时间上升。
在这方面，本发明人已发现结合抗原的新类型，其特征在于表达多种糖特异性、预定和内置的分子构建体，其使用一摩尔(或微摩尔或纳摩尔或皮摩尔，均代表其分数)的蛋白载体来携带至少3种不同的型(或群)特异性糖抗原的每一种的至少一摩尔(或微摩尔或纳摩尔或皮摩尔，均代表其分数)，因此结合物表达至少总共四种不同的抗原相关血清学特异性。
以这种方式，包含多达18种型特异性结合抗原的疫苗制剂(作为例子)将通过仅使用目前可获得的单抗原联合制剂中所需的载体蛋白的量的三分之一(或33％)来合成，从而使得宿主的免疫系统上的免疫原性负荷将显著降低从而更安全。
事实上，由于以重复剂量施用的蛋白抗原(例如作为结合实体)的量使得免疫系统不堪重负而下调，尤其当预先存在的载体蛋白特异性的记忆IgG抗体的显著血清滴度存在于治疗的宿主中时，存在着免疫学公知的被定义为“载体蛋白依赖性免疫抑制和免疫干扰”的现象(Dagan R.等人,Vaccine 28(34):5513-5523,2010)。然而，根据先前指出哺乳动物针对糖结合抗原的回忆IgG免疫应答受限于蛋白-糖表位的杂合连接区域，其中免疫应答的特异性限于共价连接的糖结构的一些单糖残基的实验工作，本发明的分子模型导致的蛋白载体剂量的显著减少保证了辅助T依赖性的完全表达(Arndt and Porro,Immunobiology of Proteins and Peptides,Edited by M.Z.Atassi,Plenum Press,New York and London,Vol.303,pages 129-148,1991)。
上文提及的论文研究结合至载体蛋白CRM197的肺炎链球菌Ps的不同化学策略和不同MW，用于在使用单官能活化的糖抗原时获得最优的结合物结构；该论文还通过合成的结合物的分子图谱研究了结合构建体中用于负责哺乳动物中的辅助T依赖性(通过分析IgG同种型多克隆抗体)的最可能的分子区域。
以相同申请人名义的US 4,711,779公开了三价糖蛋白的分子模型，其在哺乳动物中表达针对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的免疫原性。该文献涉及分子构建体，其使用通过在低温度下于化学水解后显现的末端还原基团上引入的接头衍生物共价偶联至载体蛋白的低MW寡糖；该结合物的特征在于最多3种不同的特异性(针对蛋白CRM197，针对6A型Ps，针对C群Ps)；其使用单官能性的寡糖；所述分子构建体引发针对载体蛋白和针对所携带的两种糖结构的每一种的血清学特异性。
同样以相同申请人名义的US 5,306,492公开了寡糖结合疫苗和用于产生所述基于寡糖的结合疫苗的改进方法。该方法涉及在经由接头分子共价偶联至载体蛋白之前在高温和在所显现的末端还原基团上活化寡糖半抗原；表达二价特异性的典型结合物(针对蛋白CRM 197和针对型(或群)-PS)；其使用单官能性的寡糖；所述分子构建体引发针对载体蛋白和针对所携带的单一糖结构的血清学特异性。
以相同申请人名义的EP 1501542公开了以高产率产生HMW多分散的、交联的、基于多糖的结合抗原的新方法；表达针对蛋白质破伤风类毒素和针对所携带的型(或群)-PS的特异性的典型结合物；其使用偶联至多官能蛋白载体的多官能多糖；所述分子构建体引发针对载体蛋白和针对所携带的单一糖结构的血清学特异性。
此外，Porro M.等人(Medecine Tropicale,43:129-132,1983)首次介绍了脑膜炎球菌B群寡糖(预先在受控的酸性条件下进行了水解)在其末端还原基团上通过氨和经由在低温(25-37℃)下的还原胺化的活化化学；这样的具有单官能氨基的寡糖随后被己二酸的双-琥珀酰亚胺酯活化，并随后结合至载体蛋白CRM197的赖氨酸残基的氨基。活化的寡糖抗原在结合过程中是单官能性的并且结合在没有载体蛋白CRM 197的预先活化的情况下发生。此外，Porro M.等人(MolecularImmunology,22：907-919(1985))首次公开了肺炎球菌6A型寡糖(预先在受控的酸性条件下进行了水解)在其末端还原基团上通过氨和经由还原胺化的活化化学，其论文题为“Specific antibodies todiphtheria toxin and type 6A pneumococcal capsular polysaccharideinduced by a model of semi-synthetic glycoconjugate antigen”。这样的具有单官能氨基的寡糖随后被己二酸的双-琥珀酰亚胺酯活化，并随后结合至载体蛋白CRM197的赖氨酸残基的氨基。活化的寡糖抗原在结合过程中并且在没有载体蛋白的预先活化的情况下是单官能性的。
在之后的一篇文章(Molecular Immunology,23：385-391，(1986))中，相同的作者表征了两种荚膜寡糖(分别来源于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌)与相同蛋白载体CRM197使用在前述文章中所公开的活化化学和结合化学的两步结合方法。两种活化的寡糖抗原在结合过程中并且在没有载体蛋白的预先活化的情况下是单官能性的。
已观察到在该文章中公开的结合物牵涉不同的端点活化的低MW荚膜寡糖(即肺炎链球菌6A型Ps和脑膜炎奈瑟菌的C群Ps)。这样的端点活化的使用提供低的偶联产率从而导致与所携带的两种寡糖结构的最大量不成比例的巨大量的载体蛋白(相对于4.8μg的6A Ps和3μg的C型Ps，约31.2μg的CRM197，参见上文引用的1986年的文献的第387页左栏)。
最后，在之后的一篇文献(Porro M.由R.Bell和G.Torrigiani(World Health Organization)编辑,第279-306页；John Wiley&SonsPublishers,New York 1987)中，本发明人概述了上文对于包含蛋白载体和最多两种不同的糖结构的结合抗原所引用的概念和技术方法。
在上述现有技术的发展中，本发明的基本分子构建体的优选(非限制性)实施方案包括多价的、优选四价的半合成糖蛋白，其特征在于内置的多个表位并且将其辅助T依赖性免疫原性特异性“体内”表达至蛋白CRM197以及所携带的3种型特异性Ps，例如肺炎链球菌的Ps。作为例子，肺炎链球菌的1、2、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型Ps的任何三元组，例如由3、6A、7F型Ps组成的三元组可结合至载体蛋白。作为例子，术语“四价”是指载体蛋白抗原(自身用作抗原而不是仅仅作为载体)加上三种携带的Ps抗原。
因此，所述新的新型分子构建体诱导针对载体蛋白和针对所携带的三种糖结构的每一种的血清学特异性。
此半合成的四价抗原可以被认为是新一代表达多种特异性的结合抗原的新的新型前体，其用于获得具有针对多种细菌病原体的始终广谱的保护的疫苗同时显著减少载体蛋白的量，以获得在下列方面的合理改善：
A)生产疫苗的费用；
B)其在允许合成具有三种(或更多)Ps抗原的糖蛋白(特征还在于高MW)的偶联产率的改善方面上的生产效率；
C)它们在从血清学观点上通过使用本申请中记载的特异性抑制-ELISA测定对共价连接的Ps的量的定量测定方面的生产准确性，用于准确地定量存在于所公开的分子构建体中的多种糖抗原，其基于免疫化学而非所引用的现有技术的化学定量(参见Porro等人，1986)，尤其是在其中高度显著的相似性存在于种特异性糖结构之间的各种情况下；
D)其与施加于目标群体的免疫系统的蛋白剂量的较低量相关的安全性。事实上，所述蛋白剂量是存在于Porro等人，1986的文献的具有两种Ps的CRM197结合物中的蛋白剂量的约30％(前述2μg蛋白/三元组/剂量的整个15-价制剂的剂量中的约10μg的蛋白)。基于文献中报道的可用的化学计量的其中免疫接种剂量包括至少31.2μg的CRM197的这样的量，该蛋白剂量的减少对于本领域技术人员是不可预测的；因此，对于包含13或15种结合抗原的多价组合物，即使假定制备的可能性，根据先前的化学过程，本发明详述的多种四价分子模型，制剂中的蛋白CRM197的量会是31.2x 15/3＝156.0μg，相对于本发明的10μg的多价结合物；以及最后
E)这样的结合疫苗的公共实用性。
本发明在临床免疫学和疫苗学领域中开辟了新的途径。实际上，所公开的分子构建体的内置的多种抗原性(特异于不同的细菌抗原)在多药理学的创新领域中实际上相当于优先设计用于同时到达具有药理学相关性的多个受体的药物的合成，因此允许减少以联合形式施用的药物的数量(Besnard J.等人,Nature,492:215-220,2012)。
因此，本发明的一个目的是由基本单元组成的抗原性多价分子构建体，所述基本单元包括共价连接至最少三种具有不同血清学特异性的糖结构的辅助T依赖性载体蛋白，其中每个糖结构包含至少一个重复基本抗原表位，所述表位其由最少5至12个单糖残基，优选最少8至12个单糖残基组成，如通过分子量测定和NMR光谱所评估的(取决于同源或异源序列等价于不同数量的基本重复单元)，所述重复基本抗原表位通过测定其各自在抑制其同源多糖-抗体参照系统中的MIC50值由与型特异性或群特异性多克隆或单克隆抗体的反应性来评价。根据本发明，术语“糖结构”意欲包含寡糖(天然的或合成的)或多糖(例如荚膜多糖)。
根据本发明的抗原性多价分子构建体的T辅助依赖性载体蛋白共价连接至最少三种(例如三或四或五种)具有不同血清学特异性的糖结构直至参与偶联反应的载体蛋白结构中存在的结构氨基酸(主要是Lys但还可为例如具有Arg和Hys的基本结构的氨基酸)的亲核氨基的反应性的限制。
根据本发明的优选实施方案，共价连接至最少三种具有不同血清学特异性的不同糖结构的辅助-T依赖性载体蛋白选自：天然白喉突变蛋白CRM 197(PRF 1007216A)，白喉类毒素(CAE11230.1的同源毒素)，破伤风类毒素(ID No.AAK72964.2的同源毒素)，来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的蛋白质D(AAA24998.1)；肺炎球菌表面蛋白(PSPA EMBL CBW33751.1和PSPC EMBLACF56456.1)；肺炎球菌毒素(肺炎球菌溶血素EMBL ACF56060.1)或其变体和衍生物。特别地，当采用破伤风类毒素时，优选采用通过己二酸二酰肼间隔剂化学衍生的类毒素(破伤风类毒素-ADH)。
根据本发明的最优选实施方案，载体蛋白质是天然白喉突变蛋白CRM 197。
这种蛋白首先由Uchida和Pappenheimer(Uchida T.等人,J.Biol.Chem.248,3838-3844,1973)在七十年代中期报道，其可能用作针对白喉毒素的新型免疫原(如与白喉类毒素免疫原性相关)的用途已由本申请人报道(Porro M.等人,J.Infect.Dis.,142(5),716-724,1980)。此后，本申请人使用CRM 197作为理想的辅助-T依赖性载体蛋白用于糖抗原，这在理解了后一组抗原在牵涉免疫系统的成熟的特定年龄(从约2个月到约2岁的年龄)的人受试者中的特殊免疫原性特征的原因后发生。
蛋白CRM 197包含535个氨基酸的序列，正如白喉毒素(GianniniG.等人,Nucl.Acid Res.,12,4063-4069,1984)，但在位置52的氨基酸上显示点突变，其中Glu取代Gly。其抗原性已被报道为主要涉及该序列的四个区域，当使用单克隆抗体时，即为AA序列1-156，157-193，293-345及465-535(Zucker D.and Murphy J.R.,Mol.Immunol.21,785-793,1984)。该蛋白质的特征还在于39个赖氨酸残基和一个氨基末端基团，从而总共40个反应性氨基，其可目的性地用于牵涉各种结合策略的化学反应。
本发明的结合物的载体蛋白CRM 197通常使用白喉杆菌(C.diphtheriae)C7(β197)tox-的克隆来制备，但它也可以通过除其它以外荧光假单胞菌(P.fluorescens)的克隆获得。
根据本发明的抗原性多价分子构建体的优选实施方案，所携带的糖结构选自但不限于：肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的Ps(1,2,3,4,5,6A,6B,6C,6D,7F,8,9N,9V,10A,11A,11B,11C,11F,12F,14,15A,15B,15C,17F,18C,19A,19F,20,22F,23A,23F,33F,35B型)，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)(A、C、W135和Y群)、流感嗜血杆菌(b型)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(即K1-K20抗原)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)(Vi型)、大肠杆菌(EscherichiaColi)(K1型)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)或其组合的Ps。优选地，Ps的这样的组合在属于引起全身性和肺部疾病的一种或多种感染原(肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟菌，流感嗜血杆菌，结核分枝杆菌，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和肺炎克雷伯菌)的Ps以及属于引起肠道疾病的一种或多种感染原(伤寒沙门氏菌(Vi型)，大肠杆菌(K1型)，霍乱弧菌)的Ps或属于其它感染原如引起全身和泌尿生殖感染的白色念珠菌(Candida albicans)的Ps之间进行。
根据上述实施方案，还可以制备杂合分子构建体，其中载体蛋白同时用作用于肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌的抗原以及其它抗原的辅助T依赖性载体。这些杂合分子构建体不存在于自然界中，因为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抗原表面在它们之间在细菌细胞的分子结构和它们通过其诱导哺乳动物宿主的保护性免疫的生物学机制方面显著不同。例如，尽管针对革兰氏阴性细菌脑膜炎奈瑟菌的荚膜Ps诱导的保护性免疫牵涉补体依赖性杀菌活性，但革兰氏阳性细菌肺炎链球菌诱导的保护性免疫牵涉调理吞噬细胞活性，其也是补体依赖性的。在合成抗原的这种杂合类别的情况下，两条途径均被特异性诱导(PorroM.等人,Molecular Immunol.,23:385-391(1986))，这是所显示的与各单一天然抗原的性质的重要区别。
本发明还涉及根据本发明的抗原性多价分子构建体与被定义为类内毒素的基于LPS的疫苗种类的联合。类内毒素是LPS与SAEP(合成的抗内毒素肽)的无毒络合物，其已被显示为可用于将LPS作为免疫原施用至哺乳动物(Rustici A.等人,Science,259:361-365,1993)。
这样的联合可包括单独、同时或相继使用或施用抗原性多价分子构建体和革兰氏阴性细菌的类内毒素。类内毒素可选自类内毒素B(B群脑膜炎奈瑟菌)，大肠杆菌、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、百日咳博德特氏菌(B.pertussis)的类内毒素。
根据所述分子构建体的杂合分子还可以包括结核分枝杆菌的荚膜多糖，结核分枝杆菌是在世界各地持续扩张的病原体，并且针对其的“消除性”疫苗(在宿主的血液和肺中起保护作用的疫苗)仍不存在。结核分枝杆菌的多糖荚膜主要由与胞质糖原显示结构相似性的具有α-(1→6)分支的α-D-(1→4)-葡聚糖聚合物组成。分枝杆菌的α-葡聚糖具有约1.3x107的分子量并且在体外和体内表达(Schwebach,J.R.,等人2002.Infect.Immun.70:2566-2575)；同时，伴随抗原如糖脂LAM(脂阿拉伯甘露聚糖)和PIM(磷脂酰肌醇甘露糖苷)可能与多糖荚膜联合。存在于荚膜层中的这些糖抗原的一种或全部可随后结合至载体蛋白如CRM197(作为一个例子)并成为本发明的分子构建体的一部分。
还可预见这样的抗原性多价分子构建体，其中所携带的糖结构是属于牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的糖结构用于预防影响非人的牛、猪、家猫、马科动物或羊牛(sheep cattle)的感染。
本发明的多价分子构建体在新疫苗的合理组成设计方面具有显著优势的另一种情况与真菌白色念珠菌的病原特性有关。共生真菌白色念珠菌在免疫功能低下的患者中引起粘膜念珠菌病，其包括口咽、食道、胃肠道和阴道感染。外阴阴道念珠菌病(VVC)和抗真菌难治性复发性VVC也是健康的生育妇女中常见的问题。这些粘膜感染均可影响生活质量，从而抗念珠菌感染的新疫苗的发现会是预防粘膜念珠菌病的新的重要工具并且对于许多患者会是有益的。在这样的慢性、复发性的感染的预防中仍然不存在有效的全身性和局部性疫苗。白色念珠菌的抗原库包括，除其它以外，几种具有糖性质的抗原，即1,3-β-葡聚糖(Bromuro等人,2010)和L-甘露聚糖如β-1,2-甘露三糖(Han等人,2010；Xin等人,2008)。这样的结构上不同的糖抗原可全部结合至所选择的载体蛋白用于制备多价实体如本文所公开的多价实体，其在一定程度上可以模仿病原体的完全的、基于糖的抗原结构，其在泌尿生殖感染的情况下，还可合理地与大肠杆菌的基于糖的抗原以结合形式联合。
此外，本发明的多价分子构建体在新疫苗的合理配方设计方面具有显著优势的另一种情况与金黄色葡萄球菌的病原特性有关。该病原体由O’Riordan and Lee Clin.Microbiol.Rev.,17:218-234,2004报道并如下文所述进行合成，其是条件细菌病原体并引起多样范围的人和动物疾病。葡萄球菌还是伤口感染的主要病因，并且具有诱发骨髓炎、心内膜炎和菌血症的侵袭性潜能，从而导致任何主要器官系统中的继发性感染。当皮肤或粘膜屏障被破坏，随后侵入异物时，以及在免疫系统受损的宿主中，葡萄球菌感染最经常发生。由于抗生素抗性菌株的流行和最近出现的抗万古霉素的临床分离株，金黄色葡萄球菌的控制已变得越来越困难。葡萄球菌在医院感染中扮演着主要角色，并且最近已被认为是社区获得性感染的重要原因。社区获得性金黄色葡萄球菌感染常发生在缺乏预期的金黄色葡萄球菌感染的风险因素的在其它方面健康的人中，例如近期住院或手术、居住在长期护理设施中、或使用注射药物的人。除其它抗原以外，主要影响金黄色葡萄球菌感染的发病机制的细菌组分包括荚膜多糖，其允许葡萄球菌附着至真核生物膜、抵御调理吞噬作用、裂解真核细胞、并引发宿主免疫调节分子的级联的产生。已描述了来自至少18种金黄色葡萄球菌菌株的荚膜并描述了其中至少4种的特征。每一种均包含氨基己糖醛酸。已对一些纯化的多糖进行了生化表征。菌株M表达具有以下结构的1型荚膜：(→4)-α-d-GalNAcA-(1→4)-α-d-GalNAcA-(1→3)-α-d-FucNAc-(1→)n；牛磺酸残基被酰胺连接至每个第四d-GalNAcA残基。其它两种菌株(D和SA1类黏蛋白)产生与菌株M所产生的荚膜在血清学和生物化学上相似的荚膜。血清型2的荚膜具有结构：(→4)-β-d-GlcNAcA-(1→4)-β-dGlcNAcA-(l-内氨酰)-(1→)n。5和8型荚膜多糖(分别地CP5和CP8)彼此在结构上非常相似，并且与菌株T产生的荚膜在结构上相似。5型具有结构(→4)-3-O-Ac-β-d-ManNAcA-(1→4)-α-l-FucNAc-(1→3)-β-d-FucNAc-(1→)n，并且8型具有结构(→3)-4-O-Ac-β-d-ManNAcA-(1→3)-α-l-FucNAc-(1→3)-β-d-FucNAc-(1→)n。5和8型多糖的区别仅在于糖之间的连接和氨基甘露醇醛酸残基的O-乙酰化位点，而它们仍是血清学上不同的。
最近(Nanra等人,Human Vaccines and Immunotherapeutics,9:3,480-487,2013)已报道了金黄色葡萄球菌的荚膜PS在存在可变量的补体但不存在特异于Ps的抗体的情况下防止非特异性OPA(调理吞噬作用)杀伤中的作用；与此相反，当存在特异于Ps的抗体(通过5和8型的CRM 197-Ps结合物在恒河猴中产生)时，OPA杀伤对于金黄色葡萄球菌非常有效，从而凸显Ps荚膜的抗体用于引发针对荚膜形式的此病原体的免疫防御的重要作用。
因此，本申请的主题还是针对金黄色葡萄球菌的疫苗的创新制剂，其包括糖结合物形式的分子构建体，所述糖结合物在所选择的载体蛋白最优选CRM 197上携带金黄色葡萄球菌的至少三种不同的型特异性Ps抗原。
根据一个优选实施方案，根据本发明的具体实施方案选择的所携带的肺炎链球菌抗原的糖结构是3、6A、7F型多糖。
3型多糖对应于下列结构(Reeves R.E.and Goebels W.F.,J.Biol.Chem.,139:511-519,1941)：
该结构的特征是一对-OH基团/基本重复单元(BRU)，这意味着可以使用在上述专利EP 1501542中由本申请人公开的方法以不同的程度激活它。
6A型多糖对应于下列结构(Rebers P.A.and Heidelberger M.,J.Am.Chem.Soc.,83:3056-3059,1961)：
该结构的特征是一对-OH基团/基本重复单元(BRU)，这意味着存在很大可能性来通过使用在专利EP 1501542中由本申请人公开的方法以不同的程度激活它。
7F型多糖对应于下列结构(Moreau M.等人,Carbohydrate Res.,182(1):79-99,1988)：
该结构的特征是恰好5对-OH基团/基本重复单元(BRU)，这意味着存在巨大的可能性来使用EP 1501542中公开的方法以不同的程度来激活它。
其中蛋白CRM 197(或任何其它免疫原性蛋白)用作为肺炎链球菌多糖的辅助T依赖性载体的其它可能的多价结合物(除CRM197-3,6A,7F以外或替代CRM197-3,6A,7F)选自下列非限制性的三元组配置：CRM197-4,5,9V；CRM197-1,6B,14；CRM197-18C,19A,23F；CRM197-6C,19F,22F；CRM197-12F,15B,33F。
显而易见，可包括肺炎链球菌的1,2,3,4,5,6A,6B,6C,7F,8,9N,9V,10A,11A,12F,14,15B,17F,18C,19A,19F,20,22F,23F,33F型Ps中的任意组合(三元组或四元组或更多的)。
根据另一示例的实施方案，本发明的多价结合物可涉及下列的Ps三元组：CRM197-3,6A,7F；CRM197-5,9V,19F；CRM197-1,14,19A；CRM197-22F,23F,33F；CRM197-4,6B,18C。
本发明的抗原性多价分子构建体可以是单体或多聚体的形式。
本发明还涉及用于保护受试者(优选属于人类儿科群体)免受感染的疫苗中的一种或多于一种如上文所定义的抗原性多价分子构建体，所述感染因选自肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的至少一种感染原引起。优选地，本发明的抗原性多价分子构建体的组合将通过选择携带下列Ps的抗原性多价分子构建体来进行：属于引起全身性和肺部疾病的一种或多种感染原(例如肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟菌，流感嗜血杆菌，分枝杆菌结核病，金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌)的Ps以及属于引起肠道疾病的一种或多种感染原(伤寒沙门氏菌(Vi型)，大肠杆菌(K1型)，霍乱弧菌)的Ps或来源于其它感染原如引起泌尿生殖感染并与病原体大肠杆菌联合的共生真菌白色念珠菌的Ps。
事实上，可预见包含一种或多种抗原性多价分子构建体的抗白色念珠菌和大肠杆菌感染的疫苗(优选用于雌性群体的免疫接种)，所述构建体中所携带的糖结构是属于白色念珠菌和大肠杆菌的糖结构。
本发明的另一个方面涉及抗牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)感染的疫苗，其用于牛、猪、家猫、马科动物或羊牛的免疫接种。
此外，本发明表征了包含生理学可接受的媒介物中任选与药学可接受的佐剂和/或赋形剂一起的根据本发明的具有不同抗原特异性的一种或多种分子构建体的疫苗制剂。
本发明还涉及如上所定义的广谱的多价疫苗制剂，其在人类医学领域中用于保护受试者免受感染，所述感染因选自肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌和白色念珠菌的至少一种感染原而引起。优选地，所述受试者属于儿科群体。
此外，在本申请中公开的分子模型是用于预防型特异性肺炎链球菌细菌感染的广谱多价疫苗的基础，所述多价疫苗包括最少7种类型(例如9,12,15,18,21,24)和1,2,3,4,5,6A,6B,6C,7F,8,9N,9V,10A,11A,12F,14,15B,17F,18C,19A,19F,20,22F,23F,33F型的多至25种不同的糖结构。
还可预见当本领域技术人员意欲获得的糖结构的最终数量不是3的倍数时，疫苗包括本发明的一种或多种四价抗原分子构建体(携带3种Ps)与一种二价或三价抗原性构建体(携带一种或两种PS)或可选择地与一种五价抗原构建体(携带4种Ps)的组合。
当考虑每摩尔(或其分数)载体蛋白携带3摩尔(或其分数)结构上不同的糖抗原的基本结合物时，载体蛋白的量可以减少至目前可获得的用于儿科群体的任何肺炎球菌结合制剂(例如：专利EP1868645公开的Prevnar和Synflorix)中存在的载体蛋白量的约30％。
用于预防因肺炎链球菌引起的IPD(侵袭性肺炎球菌病)的基于本申请中公开的抗原性多价分子构建体的疫苗的广谱(例如：18-价)制剂的实际实例是至少三种、四种、五种或优选所有下列多价结合物的联合，其中蛋白CRM 197(或任何其它免疫原性蛋白)用作辅助T依赖性载体：CRM197-3,6A,7F；CRM197-4,5,9V；CRM197-1,6B,14；CRM197-18C,19A,23F；CRM197-6C,19F,22F；CRM197-12F,15B,33F。
在这样的实例中，仅六种多价结合物即覆盖了所选择的广谱血清型。
与之形成鲜明对比的是，目前可获得的制剂将需要联合18种结合物。
显而易见，可包括肺炎链球菌的1,2,3,4,5,6A,6B,6C,7F,8,9N,9V,10A,11A,12F,14,15B,17F,18C,19A,19F,20,22F,23F,33F型Ps中的任何组合(三元组或四元组)。
用于预防因肺炎链球菌引起的IPD(侵袭性肺炎球菌病)的疫苗的广谱(例如：15-价)制剂的另一优选实例包括涉及下列Ps三元组的本发明的多价结合物：CRM197-3,6A,7F；CRM197-5,9V,19F；CRM197-1,14,19A；CRM197-22F,23F,33F；CRM197-4,6B,18C。
因此前面制剂中蛋白载体的注入量为后面制剂中存在的载体蛋白量的约30％(按重量计)，非常显著地减少其至少70％(按重量计)。
为了进行比较，存在于目前的13-价“Prevnar”疫苗(专利EP1868645公开的包括13种联合的单价抗原的制剂)中的载体蛋白的总量为约32μg，以约2μg蛋白/约2μg的各结合的Ps抗原的临床剂量，总共31μg的Ps抗原[蛋白/Ps(w/w)平均比率(R)＝1.03]；在大致相同的蛋白/型特异性Ps比率(如上文公开的多价结合物CRM197-3，6A，7F所显示的)下，示例的18-价制剂中载体蛋白的总量仅为12μg或“Prevnar”的13-价制剂中存在的载体蛋白的37.5％(关于“Prevnar”疫苗和“Synflorix”疫苗的组成的数据来自美国FDA和EMA发布的可公共获得的文件)。
疫苗制剂的其它实例基于根据本发明的用于预防群特异性脑膜炎奈瑟菌细菌感染(A,C,W135,Y群)的抗原性多价分子构建体。
相对于上文公开的用于3、6A和7F型肺炎链球菌的多价抗原性分子构建体的结合过程和控制的相同策略可用于其它的糖结构如脑膜炎奈瑟菌的糖结构。
在这种情况下，仅一种含有群特异性糖结构(A、C、W135和Y多糖)的多价抗原可构成疫苗制剂。
因此，本发明的另一个目的是用于预防因脑膜炎奈瑟菌引起的感染的广谱疫苗制剂，其包含含有群特异性糖结构A、C、W135和Y的抗原性多价分子构建体。
根据优选的实施方案，本发明涉及用于预防肺部感染(优选儿科群体中的)的广谱疫苗制剂，所述感染因选自肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌的多于一种感染原引起，所述制剂包含含有所述感染原特异性糖结构的多于一种抗原性多价分子构建体。可选择地，本发明涉及用于预防肠道感染(优选儿科或成年人类群体中的)的广谱疫苗制剂，所述感染因选自伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和霍乱弧菌的多于一种感染原引起。
另一实施方案预见了用于预防因病原体如共生真菌白色念珠菌和大肠杆菌引起的全身性或生殖泌尿感染的广谱疫苗制剂，所述疫苗包括含有所述感染原特异性糖结构的多于一种抗原性多价分子构建体。
根据本发明的具体实施方案，上述疫苗制剂可以与革兰氏阴性细菌的类内毒素抗原单独地、同时地或相继地施用，所述类内毒素选自B群脑膜炎奈瑟菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、百日咳博德特氏菌的类内毒素。
当考虑携带四种结构上不同的糖抗原的基本结合构建体时，载体蛋白的量可以减少至目前可获得的任何联合结合制剂(例如：“Menactra”和“Menveo”，它们的组成和配方可根据由美国FDA和EMA发布的可公共获得的文件(分别总共48和47μg/白喉类毒素和CRM 197的剂量))中存在的载体蛋白量的至少25％。
在本申请中公开的分子构建体的多价制剂的免疫原性剂量是指所携带的每种糖结构的剂量。在这方面，婴儿和儿童中的剂量可以是0.1至10μg优选1μg的每种结合糖抗原。临床领域的专家将帮助找到目标群体中的最佳剂量。
优选地，所述疫苗制剂还包含矿物的或化学合成的或生物学的佐剂。矿物的或化学合成的或生物学的佐剂可与本申请所公开的分子构建体一起使用，以受益于可有效地降低人类中的最佳免疫原性剂量的任何免疫促升，以进一步减少载体蛋白的总量。具体地，根据本发明的用于在人类中使用的疫苗制剂中的优选无机佐剂选自磷酸铝(AlPO4)和氢氧化铝；优选的有机佐剂选自基于角鲨烯的佐剂如MF59、QF 21、Addavax；优选的细菌抗原选自单磷酰-脂质A、二霉菌酸海藻糖酯(trehalose dicorynomycolate)(Ribi’s佐剂)。在用于兽医领域的疫苗制剂中，弗氏佐剂(完全的或不完全的)是优选的。佐剂的剂量可以是0.1-1mg/剂量，优选为0.5mg/剂量。
更优选地，这样的制剂适于通过皮下或肌内或皮内或经皮途径施用。方便的是，这样的施用可以通过常规的注射器注射或无针工具进行。
根据本发明的疫苗制剂可根据要求单次或多次给药的方案根据医师、儿科医生或兽医的指示来施用。
本发明还涉及用于制备抗原性多价分子构建体的结合方法，其采用专利EP 1501542中公开的化学过程，其中至少三种糖结构的每一种通过经由氧化的O-脱氢解偶联和利用烷基二胺间隔剂形成亚胺还原键的还原性胺化来化学活化至单官能性或多官能性，随后被衍生至活性酯，这样的酯衍生糖结构最后通过形成酰胺键同时偶联至或逐步偶联至多官能载体蛋白的氨基。
优选地，所述糖结构在其相应的二胺丁酸衍生物中被化学活化并且活性酯是琥珀酰亚胺酯。
作为例子，根据本申请人在EP 1501542的权利要求1中公开的方法进行了肺炎链球菌的3,6A,7F(或其它优选的三元组4,5,9V；1,6B,14；18C,19A,23F；6C,19F,22F；12F,15B,33F；5,9V,19F；1,14,19A；22F,23F,33F；4,6B,18C)型多糖三元组至同源Ps-DAB(二胺丁酸衍生物)的化学活化，并且多官能性载体蛋白是CRM 197。
可选择地，用于制备抗原性多价分子构建体的结合方法采用在EP1501542的权利要求8中公开的化学过程，其包括多官能载体蛋白的氨基与至少三种不同糖结构的同时偶联或逐步偶联，经由形成亚胺还原键的还原胺化，这样的糖结构通过经由氧化作用的O-脱氢解偶联在使用或不使用间隔剂的情况下被预先活化至单官能性或多官能性。如可推断的，上述公开的分子模型可以进一步发展为包含多于三种(例如四种或五种)不同糖结构/一摩尔(或其分数)蛋白载体，这种可能性取决于分子构建体的三个主要参数：
a)载体蛋白的物理化学特性，其结构应表征赖氨酸残基的最高可能的量(反应性–NH2基团的来源)；
b)不同糖结构的“特别”选择的多分散MW，其表征最佳活化率同时限制偶联反应中位阻现象的负面效应，和
c)用于不同糖结构的活化和用于分子构建体的合成的化学过程的效率(用于糖结构的最佳活化中的高效率的优选化学过程是在使用或不使用间隔剂的情况下经由氧化的O-脱氢解偶联，而用于结合反应中的高效率的优选化学过程是经由活性酯通过糖结构与载体蛋白之间的的酰胺键形成；还优选用于结合反应的是利用亚胺还原键在使用或不使用间隔剂的情况下在O-脱氢解偶联氧化的糖结构以及载体蛋白质之间经由直接的还原性胺化来形成的化学过程)。
根据本发明采用的结合方法预见了(至少三种)多糖的多步活化(其因此可无关紧要地尽管均一地具有低或高MW)以改善与载体蛋白的偶联产率。这与现有技术的结合方法(参见Porro等人MolecularImmunology,Vol.23,pages 385-391,1986)是不同的，所述现有技术方法牵涉所采用的低MW Ps在低温下的端点活化从而导致低偶联产率而不牵涉结合物的分子交联。
与先前模型的另一个不同之处在于先前构建体的化学计量特征(蛋白/Ps w/w比率)以及所采用的Ps的测定，所述测定相对于现有技术使用的化学方法在本发明中通过免疫化学来进行。这使得本发明有可能定量测定当存在于相同的分子构建体中具有非常相似的结构的Ps的量。
最后，本发明涉及可通过上述公开的结合方法获得的抗原性多价分子构建体。
本发明将根据优选的实施方案具体地关于所附的附图来进一步地说明，其中：
图1显示Ps 3和Ps 3-DAB衍生物的天然Ps 3(灰色)和活化的Ps 3-DAB 50％Ox(黑色)的1H-NMR波谱之间的比较。
图2显示在扩散滤波情况下Ps 3-DAB 50％Ox的1H-NMR波谱。黑色60％GRAD的波谱、灰色2％GRAD的波谱评价衍生物中游离DAB的不存在。
图3显示DAB活化的Ps 3-DAB衍生物、50％Ox、1H-NMR波谱和量化(按摩尔计2％)。
图4显示天然Ps6A(灰色)和活化的Ps6A-DAB衍生物50％Ox(黑色)的1H-NMR波谱之间的比较。
图5显示在扩散滤波情况下Ps6A-DAB 50％Ox的1H-NMR波谱。黑色60％GRAD的波谱、灰色2％GRAD的波谱评价衍生物中游离DAB的不存在。
图6显示DAB活化的Ps6A-DAB衍生物、50％Ox、1H-NMR波谱和量化(按摩尔计2.3％)。
图7显示天然Ps7F(灰色)和活化的Ps7F-DAB衍生物10％Ox(黑色)的1H-NMR波谱之间的比较。仅存在于天然Ps中的1.92ppm上的信号是因游离的乙酸盐离子产生的。2.24ppm上的OAc信号在DAB活化后保持不变。
图8显示在扩散滤波情况下Ps7F-DAB 10％Ox的1H-NMR波谱。黑色60％GRAD的波谱、灰色2％GRAD的波谱评价衍生物中游离DAB的不存在。
图9显示DAB活化的Ps7F-DAB衍生物10％Ox、1H-NMR波谱和量化(按摩尔计1.7％)。箭头表示用于DAB活化的量化的5.65ppm上的参照信号(葡萄糖或半乳糖的α-质子)。
图10显示抗原性多价分子构建体CRM197-3,6A,7F的GPC分析。
图11显示仅混合在一起的四种组分(CRM197+Ps 3-DAB+Ps6A-DAB+Ps 7F-DAB)的GPC分析以显示单一抗原之间任何显著量的复合物形成的不存在。
图12显示多价抗原在Sepharose 4B-CL上的纯化之后的SEC-HPLC分析，具体地关于载体蛋白CRM197的分布。
图13显示CRM197作为天然蛋白当与Ps 3-DAB、Ps 6A-DAB和Ps 7F-DAB进行混合时的SEC-HPLC分析。
图14显示了显示纯化的多价抗原CRM197-3,6A,7F的带型的SDS-PAGE分析(9％甘氨酸缓冲液)。装载的样品的图例：1：CRM197作为参照；2：纯化的多价结合抗原CRM197-3,6A,7F的多分散MW；3：CRM197+Ps3-DAB+Ps6A-DAB+Ps7F-DAB的混合物作为参照。
图15显示由型特异性血清多克隆抗体定性显示的多价抗原的免疫印迹分析(Western印迹)。装载的样品的图例：1：多价结合物CRM197-3,6A,7(来自上述图14的第2泳道)；2：CRM197+Ps3-DAB+Ps6A-DAB+Ps7F-DAB的混合物作为参照。
图16显示天然的CRM197和以CRM197-Ps,3,6A,7F的结合形式的CRM197的％抑制(表达为MIC50)之间的比较。
图17显示参考图16的图的S形曲线(对数标尺)。
图18显示Ps 3-DAB和CRM-3,6A,7F相对于天然Ps 3的％抑制(表达为MIC50)之间的比较，显示Ps 3在DAB活化或结合后的1型抗原性或抗原性质。
图19显示参考图18的图的S形曲线(对数标尺)。
图20显示Ps6A-DAB和CRM-3,6A,7F相对于天然Ps6A的％抑制(表达为MIC50)之间的比较，显示Ps6A在DAB活化或结合后的1型抗原性或抗原性质。
图21显示参考图20的图的S形曲线(对数标尺)。
图22显示Ps7F-DAB和CRM-3,6A,7F相对于天然Ps7F的％抑制(表达为MIC50)MIC50之间的比较，显示Ps7F在DAB活化或结合后的1型抗原性或抗原性质。
图23显示参考图22的图的S形曲线(对数标尺)。
在下面的实验部分本发明将根据优选实施方案进行更详细的公开，其不应当被认为限制保护范围而应被认为仅用于举例说明的目的。
实施例
实施例1：包含肺炎链球菌的多糖3,6A,7F和载体蛋白CRM197的四价结合抗原的合成
Ps 3,6A,7F至同源Ps-DAB(二胺丁酸衍生物)的化学活化
此步骤根据本申请人在上文提及的专利EP1501542的权利要求1(步骤A1)中公开的方法来进行，所述专利作为参考资料包括在本文中。
这样的活化的具体控制以及所获得的活化Ps结构的特征在下文使用1H-NMR光谱学来报告。
Ps3-DAB,Ps6A-DAB,Ps7F-DAB的
1
H-NMR分析
1.用于NMR分析的Ps和Ps-DAB衍生物的溶液
将3-4mg的多糖样品(PS)或PS-DAB溶解于0.7ml的D2O-磷酸盐缓冲液中并转移至5mm NMR管。在D2O中制备的磷酸盐缓冲液的浓度是100mM,pH＝7。三甲基甲硅烷基丙酸钠盐(TSPA)、(CH3)3Si(CD2)2COONa用作为内部参照。TSPA的浓度为1mM。
2.NMR设备
使用高场NMR光谱仪(600MHz)。采用能够以至少55G·cm-1的强度在z-方向(平行于磁场)上产生梯度的具有z-梯度线圈的高分辨率5mm探头。
3.NMR设备的设置
在将样品引入磁体内后，进行所有的常规程序：调谐和匹配，匀场，90度脉冲校准。将预饱和用于压制残留的HDO信号。对于良好的预饱和，光谱的中央(O1)必需准确地设置在HDO信号上(约4.80ppm)，并且良好的匀场也是期望的。
在调节用于预饱和的参数后，核查扩散梯度实验的参数。使用利用具有纵向涡流延迟的双极梯度的受激回波脉冲序列。
4.DAB-活化的指纹分析
3.08ppm处的基团–CH2-NH2
3.17ppm处的基团–CH2-NH-CH2-
5.Ps上DAB活化的百分比
范围值为0.5–5.0％摩尔DAB/摩尔BRU(群特异性Ps的基本重复单元)，最佳摩尔范围是1.5-3.0％。
Ps3-DAB,Ps6A-DAB,Ps7F-DAB衍生至其同源活化酯作为
Ps-DAB-MSE衍生物
此步骤根据本申请人在欧洲专利EP1501542的权利要求8中公开的方法来进行，所述专利作为参考资料包括在本文中。
三种活化(多官能)的Ps至(多官能)载体蛋白CRM197的同
时偶联
结合物的化学合成(也称作为偶联反应)根据本申请人在欧洲专利EP1501542的权利要求8中公开的方法来进行，所述专利作为参考资料包括在本文中。
然而此步骤可被认为是创新性的，因为3个偶联反应同时进行，而非那时的在一个偶联反应中进行(或逐步过程)。
此步骤可优于每种Ps活化抗原的逐步偶联，因为缩短了反应时间，从而改善反应的效率，前提是所述三种活化的Ps处于在平衡状态下相当地竞争偶联反应的条件下(此特征包括可比较的平均MW，可比较的Ps-DAB活化范围和蛋白的反应基团与活化的Ps的反应基团之间可比较的化学计量比)。
反应的合适化学计量考虑相对于三种活化的Ps抗原和可用的载体蛋白的氨基，琥珀酰亚胺酯的总量。为了使蛋白最佳地保留其抗原库，化学计量优先被设置为考虑CRM197(作为例子)的结构中可用的氨基的不超过20％(或40个中的8个)的反应性。
基于实验数据，偶联反应与下列化学计量是一致的：
CRM197+4个Ps-DAB-衍生物→CRM197-(Ps)3+Ps-DAB-衍生物
其中实体Ps-DAB-衍生物是指产生对于总共3摩尔的所携带的型特异性Ps平均有1摩尔蛋白的结合物的反应中的三种型特异性糖结构的每一种的全部等分，加上应当过量的Ps-DAB-衍生物，如通过以下平衡常数支配的：
所述化学方程证实CRM197载体蛋白的完全糖基化。该方程还显示结合反应依赖于亲核体(CRM197通过其Lys残基的ε-NH2基团)和亲电体(Ps-DAB-衍生物的酯基团的羰基部分)这两种试剂的浓度，从而被定义为SN2反应。
上述考虑与下述实验观察是一致的：糖基化反应中用CRM197作为载体蛋白所获得的最高产率是反应中存在的载体蛋白的100％和Ps-DAB-衍生物的80％(w/w)，其中它们的剩余部分是用于将平衡推向右侧所必需的少量的未偶联的Ps-衍生物。
在此类型的反应中，溶剂影响反应的速率，因为溶剂可以或可以不围绕亲核体，从而阻碍或不阻碍其靠近碳原子。极性非质子溶剂相比于极性质子溶剂通常是用于此反应的更好溶剂，因为极性质子溶剂将通过溶剂对亲核体的氢键合而成为溶剂合物，从而阻碍其冲击具有离去基团的碳。具有低介电常数或被阻碍的偶极末端的极性非质子溶剂将促进SN2方式的亲核取代反应(优选的实例是：DMSO、DMF、四氢呋喃等)。然而，在本文使用CRM197作为载体蛋白的情况下，极性质子溶剂和极性非质子溶剂当在实验上相互比较时均非常好地起作用。
影响Keq的反应温度与所选择的溶剂的使用是最低相容的，当考虑反应是自发的反应(从而是放热的)并因此通常设置在4℃和20℃的温度之间时。
除了上文详述的结合化学以外，可使用其它化学过程来实现多价结合抗原的合成；在这些之中的是，蛋白(经由还原性胺化)与氧化的Ps(经由O-脱氢解偶联)的直接偶联或使用可用于活化Ps和蛋白的异源和化学互补的接头。
并且，除了使用导致经由蛋白的多官能性和Ps组分的多官能性获得多价交联的蛋白-Ps结合物的化学过程的策略以外，还可考虑如基于在其末端还原基团上被活化的寡糖随后偶联至载体蛋白来合成本文公开的抗原性多价分子构建体，如先前在上文提及的文献(Porro M.等人，Molecular Immunology,23:385-391,1986，将其作为参考资料附于本文)中本申请人在另一种结合抗原模型中所显示的。
最后，所公开的分子构建体可被认为是通过酶促糖基化在细菌或酵母细胞或其它工程改造的活细胞中使用“特定的”DNA重组技术制备的。
实施例2：抗原性多价分子构建体CRM197-3,6A,7F的物理化学分析
采用了GPC(凝胶渗透色谱)分析来进行实施例1的抗原性多价分子构建体的物理分析。图10显示多价抗原在获自结合反应于纯化之前的GPC分析。色谱图来自在pH＝7.50下缓冲的0.14M NaCl中平衡的Sepharose 4B-CL。多价抗原的纯化只需通过收集和混合来自Kd＝0.00至Kd＝0.30的洗脱级分来获得。
SEC-MALLS技术帮助定义所获得的分子系统的分散度其通过使用方程来计算，其中Mm是质量平均分子量(mass-average molar mass)，Mn是数均分子量，并且还允许测定上述分子系统的一些固有性质，因为光散射角的强度携带关于分子量的信息，同时角相关性携带关于高分子的大小的信息。事实上，如果给定的具有质量M的高分子由元素mi组成，那么基本光散射方程显示为：
其中ri是元素mi与具有总质量M的分子的质心之间的距离。根据此方程，定义了所测量的质量、大小与量之间的关系。
下表1显示了通过SEC-MALLS分析的上述纯化的多价抗原(范围Kd＝0.00-0.30中的级分)的分散分子量的表征。
表1
通过SEC-MALLS收集的实验数据显示抗原性多价分子构建体的分散质量包括对于约7％质量色散的基本单元[CRM197-3,6A,7F]n＝1，和约27％质量色散的具有组成[CRM197-3,6A,7F]n＝3.6的所述基本单元的聚合物，以及剩余质量色散的多至[CRM197-3,6A,7F]n＝22，其代表了所述分子构建体在反应产物方面的主要形式(66％)。由于Ps抗原的多官能性(按摩尔计约2％的DAB活化，如通过1H-NMR光谱学显示的)和载体蛋白的多官能性(40个反应性氨基/摩尔，作为39个赖氨酸残基+1个氨基末端aa存在于具有全部535个aa的序列的结构内)，分子构建体的基本单元的聚合物被获得为交联的分子实体。
图11显示仅混合在一起以显示单一抗原之间任何显著量的复合物形成的不存在的四种组分(CRM197+Ps 3-DAB+Ps 6A-DAB+Ps7F-DAB)在相同的凝胶Sepharose 4B-CL上的GPC分析(作为例子)。用于滴定所述三种Ps结构的化学方法包括按照WHO指南的要求的糖醛酸(3型)、磷(6A型)和己糖胺(7F型)的分析。
下表2显示了用于参照的通过SEC-MALLS分析的三种混合的型特异性Ps-DAB衍生物的分散分子量的表征。
表2
图12显示多价抗原在于Sepharose 4B-CL上纯化后的SEC-HPLC分析，具体地关于载体蛋白CRM197的分布。
以下实验条件用于SEC-HPLC分析：
柱子：Phenomenex,Biosep-SEC-S3000,300x7.80mm(Vo 6.92min.；Vt 12.5min.)
MW分筛范围：700K–5K
洗脱液：NaCl 0.14M+NaH2PO40.05M pH 6.80
流速：1ml/min
检测器：280nm(检测蛋白CRM197)
图13显示CRM197作为天然蛋白当与Ps 3-DAB、Ps 6A-DAB和Ps 7F-DAB进行混合时的SEC-HPLC分析。实验条件与上述在图12中进行的分析相同。
根据上文，进行分析的结合物是多分散的、单体至多聚体的分子实体，其含有报告于化学方程[CRM197-(Ps)3]中的分子构建体的基本单元，当考虑多官能DAB-活化的Ps结构的平均MW(约0.7x105)(由SEC-MALLS评价)和具有535个aa的CRM197的平均MW(5.85x104)时，具有约2.7x 105的计算平均MW；因此，这样的基本结构的几个交联单元达到如通过SEC-MALLS评价的约6x106的MW。载体蛋白与所述三种型特异性Ps的每一种之间的w/w比率是约1.0；此w/w比率产生1.0的蛋白/型特异性Ps平均摩尔比(R)，对应于一摩尔蛋白/摩尔型特异性Ps的平均比率，正如由所述化学方程所显示的。
因此，实验获得的交联的分子实体对应于恰好由携带总共三摩尔的型特异性Ps(每种型特异性Ps为一摩尔)的一摩尔载体蛋白组成的基本单元的几个多聚体单元所构成的分子模型。
实施例3：抗原性多价分子构建体CRM197-3,6A,7F的免疫化学分析
抗原性多价分子构建体CRM197-3,6A,7F的免疫化学分析通过SDS-PAGE使用根据Laemmli U.K.,Nature 227,680-685(1970)(作为参考资料附于本文)的分析条件进行。
图14显示了显示纯化的多价抗原的带型的SDS-PAGE分析(9％甘氨酸缓冲液)。
图15显示由型特异性血清多克隆抗体定性显示的多价抗原的免疫印迹分析(Western印迹)。采用的分析条件按照Towbin H.等人,PNAS 76:4350-4354(1979)。银染色法按照Porro M.等人,Anal.Biochem.118:301-306(1981)。
血清多克隆Ps特异性抗体描述于下文涉及抑制-ELISA法的部分中。
基于抑制-ELISA使用多克隆(或单克隆)抗体对各种抗原性Ps
组分的定性和定量测定
如从免疫化学(更宽领域的免疫学的分支)在上世纪三十年代诞生后即广为人知的，荚膜Ps抗原包括基本重复单元(BRU)，所述BRU可由同源单糖(例如脑膜炎球菌Ps)以及由更复杂的涉及二/三/四/戊/esa/epta-糖残基(例如肺炎球菌Ps)的杂多糖序列构成。5(优选8)至12个单糖残基的平均序列形成(Ps)糖抗原的基本结构表位，其将相应的免疫特异性赋予每种(Ps)结构。这样的大小是人ABO系统内的单一表位或复杂的细菌荚膜Ps内的表位重复结构的序列的典型特征，其与抗体的结合位点的大小是一致的(Kabat E.A.,“Thenature of an antigenic determinant”J.Immunol.97:1-11,1966)，并且基于这些，通过使用不同MW的Ps多分散系统抑制系统Ps-Ab的结合反应，可以描述Ps结构针对特定的多克隆抗体群的反应性，以记录存在于含有重复BRU(从而形成具有相同抗原性的重复表位)的Ps结构的抗原性与同源多克隆抗血清针对其的特异性之间的关系(Porro M.等人,Mol.Immunol.22:907-919,1985)；通过比较给定Ps的多分散性的不同MW的MIC50，随后可以确定多克隆(或单克隆)抗体群针对这样的MW的相对特异性并最终计算不同Ps结构的相对浓度用于定量测定其。
通过进行可靠的免疫化学方法用于对存在于这样的分子构建体中的Ps结构进行作图和滴定，测定这样的结合物模型的定性和定量特征相对于化学方法具有实际的优势，特别是在对于其序列具有非常紧密的结构特征的Ps的情况下，如在6A和6B型或19A和19F型的情况下或在其中Ps抗原间的结构相似性存在为属于给定参考组的型特异性Ps的情况的任何情况下(例如：6群包括型特异性Ps 6A,6B,6C,6D；19群包括型特异性Ps 19A,19B,19C,19F；23群包括型特异性Ps23A,23B,23F)。事实上，不同于化学方法，抗体的敏锐的特异性可在短时间内容易地明确区分这样的结构相似性。
最近针对肺炎链球菌的Ps抗原的单克隆抗体的开发(Pride M.W.等人,Clin.And Vaccine Immunol.19(8):1131-1141,2012)会进一步增加此强有力的分析方法的潜力。
糖抗原的化学滴定和免疫化学滴定之间对于测试其定量等价性的比较通过使用抑制-ELISA通过实验测定的参数MIC50(所选择的糖抗原用作同源参照Ps-Ab反应的抑制剂的最小抑制浓度)来进行以评估免疫化学方法相对于化学方法在这种类型的分子构建体的分析控制中的准确性和精确度。
抑制-ELISA方案
应用下述ELISA方案以测定三种Ps-DAB衍生物的每一种和蛋白CRM197或多价结合物CRM197-3,6A,7F作为同源参照反应型特异性多糖-抗体(Ps-Ab)或蛋白-抗体(Prot-Ab)的MIC50值。
参照型特异性Ps-衍生物(Ps-DAB)和多价结合物CRM197-3,6A,7F按照上文提及的Porro M.在专利EP1501542的权利要求8中报道的方法来制备。
用于滴定所述三种Ps结构的化学方法包括按照WHO指南的要求的糖醛酸(3型)、磷(6A型)和己糖胺(7F型)的分析。抑制反应基于具有给定分子量的给定糖结构按照以下免疫化学方程抑制同源参照反应系统的原理：
因此参照反应和被抑制反应之间的反应性的差异代表了抗体群针对抑制剂的不同或相同的特异性。通过使用具有不同分子量的糖结构，可以描述该特定反应所典型的S曲线并计算抑制剂的MIC50用于随后将其与参照的糖结构进行比较并建立抑制剂的抗原性(定性基础)和抗体的特异性(定量基础)的参数。所有这些概念和相关的实际应用报道于下列出版物中，其作为参考资料并入本文：Berzofsky J.A.和Schechter A.N.Mol.Immunol.,18:751-763(1981)；Porro M.等人Mol.Immunol.,22:907-919(1985)。
分析方法(示例性的)
储备液：
●PBS pH 7.2-7.4中1mg/ml的Ps-DAB或CRM197
○ PBS 1x(1L)
●8.0g NaCl
●0.31g KH2PO4
●2.06g Na2HPO4.7H2O
●0.16g KCl
●不调节pH
●TBS-Brij 0,1％(v/v)
○ TBS 10x(1l)
●80g NaCl
●1.6g KCl
●0.94g Tris
●14.56g Tris-HCl
●33ml Brij-35(30％v/v)
●在r.t.稳定12个月
●稀释50ml缓冲液至500ml MilliQuf水
●PBS-Tween200,05％(v/v)
●过氧化物酶标记的山羊抗-小鼠IgG或IgM
●磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液0.05M pH 5.0
●H2O230％(v/v)
●磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液0.05M pH 5.0中1mg/ml的O-苯二胺
●H2SO43M
程序：
1.涂覆板(GREINER 65001聚苯乙烯板SIGMA cod.M4436)
-20μg/ml Ps于PBS pH 7.4中，37℃2h+o.n.4℃
-10μg/ml CRM197于PBS pH 7.4中，o.n.4℃
-涂覆100μl/孔
2.用TBS-Brij 0,1％(v/v)洗涤5x(第一次洗涤20秒)
3.PBS-Tween 0.05％(v/v)中的来自Statens Serum Institute,Copenhagen,DK(www.ssi.dk)的肺炎球菌参照多克隆抗血清，2h37℃。最终稀释度(作为例子)：
a.兔抗血清对3群1:100,000v/v(阳性～1.0OD490nm)
b.兔抗血清对6A群1:25,000v/v(阳性～1.0OD490nm)
c.兔抗血清对7F群1:800,000v/v(阳性～1.0OD490nm)
4.未知的样品：将未知的样品相对于通过参照反应获得的参照S回归曲线进行插值。
5.鼠血清抗-CRM197，最终稀释度1:100,000v/v(阳性～1.0OD490nm)。
表3
6.温育x抑制时间：15分钟
7.用TBS-Brij 0.1％(v/v)洗涤5x(第一次洗涤20秒)
8.PBS-Tween 0.05％(v/v)中的过氧化物酶标记的山羊抗-兔或抗小鼠IgG，2h 37℃
9.用TBS-Brij 0.1％(v/v)洗涤5x(第一次洗涤20秒)
10.磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液0.05M pH 5.0,H2O20.03％(v/v)中1mg/ml的O-苯二胺
11.5’后用H2SO43M 50μl/孔终止反应
12.在OD 490nm读数
13.将未知的值针对通过参照反应获得的参照S回归曲线进行插值：
％抑制的计算：
被已知的OD值-空白OD值
------------------------------x 100＝(％)
阳性OD值-空白OD值
因此，％抑制＝100-(％)
MIC
50
的计算：
此抑制浓度在回归函数或相关的S曲线的50％处测定。方法的SD在平均值的20％内。
结果
天然的CRM197及其作为CRM197-Ps,3,6A,7F的结合形式的MIC50的结果显示结合反应不影响CRM197的抗原特性(1型抗原性质)，如可从图16-17所示的图的分析推断的。图17显示了S曲线的非线性回归函数。
所述三种结合Ps-DAB衍生物各自的MIC50的结果显示于图18-23所示的图中。图19、21和23显示了S曲线的非线性回归函数。
实施例4：活化或多价结合形式的糖抗原的浓度的测定：化学滴定相对免疫化学滴定的比较
免疫化学滴度根据上文涉及抑制-ELISA方法的实施例3中描述的方法获得；化学滴度根据上文实施例2中描述的方法获得；活化或结合形式的三种糖特异性抗原各自的未知样品的免疫化学滴度通过在使用已知的化学滴定的糖抗原量由抑制-ELISA建立的参照标准曲线的线性部分上的插值来测定。所报告的值是几个独立测定的平均值。对所述两种方法的定量等价性的测定的结果总结于下表4中。
表4
备注：蛋白CRM197的物理化学测定通过福林试剂和/或使用疏水反相HPLC以在酸水解后分离荧光素标记的氨基酸的氨基酸分析(通过微孔的Pico-Tag法)来进行。物理化学测定的SD在平均值的10％之内；免疫化学测定的SD在平均值的20％之内，这是在ELISA方法的逐日变化的估计SD之内的并且与《欧洲药典》第5版(2008)对于肺炎球菌多糖结合疫苗的指南是一致的。
随后将对于上述各种分子构建体的定性和定量免疫化学分析所描述的相同方法学用于表征含有联合的几种(4或5或6或更多)分子构建体的多价疫苗的最终组成以获得示例的12-价或15-价或18-价疫苗的完整表征。
实施例5：作为实例，抗原性多价分子构建体在鼠模型中的免疫化学分析
疫苗组成
蛋白/各型特异性Ps的平均比率：1.1±0.1(w/w)。
分子构建体CRM197-3,6A,7F的剂量
注射的剂量是0.01μg和0.1μg的各型特异性结合Ps，具有或不具有0.5mg/剂量的固定剂量的AlPO4(等价于约0.120mg的白矾)作为佐剂。多价分子构建体对矿物佐剂的吸附以≥80％(按重量计，如通过ELISA评估的)发生。
根据多价结合物的化学计量学，CRM197的总剂量在最低剂量的各型特异性结合Ps的情况下是约0.01μg并且在最高剂量的各型特异性结合Ps的情况下是约0.1μg。
值得注意的是，0.01μg型特异性Ps的注射剂量在小鼠中免疫原性是最低的，这对于目前已获许可的肺炎球菌结合疫苗得到了US-FDA和EMEA的认可，该疫苗使用磷酸铝作为佐剂。
动物
每组动物包括10只雌性Balb/c小鼠(或者CD1)和6只雌性新西兰白兔。
途径
i.p.(小鼠)和s.c.(兔)
免疫接种方案
0、2、4周；在第0、2、4、6周采血(小鼠)。
0、4周；在第0、4、6周采血(兔)。
使用简单Ps抗原的对照免疫接种被省略，这是基于高度纯化的Ps抗原在哺乳动物中不是显著免疫原性的并且在重复注射其后不“促升”IgG同种型抗体的历史认知。
ELISA滴度
对于各型特异性Ps和CRM197或DT(白喉类毒素)，滴度表达为相对于对照反应显示O.D.≥2.0的终点反应，所述DT是与CRM197免疫原性相同并且具有统计学相关性的抗原(Porro M.等人J.Infect.Dis.,142(5),716-724,1980)。血清库稀释从稀释度1/200开始以2倍方式连续进行。
MOPA(功能性测定)
为了测试在用多价分子构建体免疫接种后产生的鼠和兔多克隆抗体的调理素活性，使用HL60细胞进行了MOPA-4测试(4倍多重调理吞噬杀伤测定)，如WHO指南所推荐的。滴度表达为各血清库在各剂量显示≥50％杀伤活性的终点稀释度的几何平均值，如参照平行建立的用于通过线性插值计算不同样品的滴度值的标准曲线。
免疫结果
0.01μg Ps/型特异性结合Ps的剂量。鼠血清库中IgG或IgM对型特异性Ps或对CRM197的几何平均滴度由ELISA测定。SD在所报告的几何平均值的±25％之内。由测定程序中的线性插值计算的MOPA滴度报告在括号内。除非另有所指，否则血清滴度间的统计显著性(通过t-检验测定)为<0.01。结果总结于下表5中。
表5
0.10μg/型特异性结合Ps的剂量。鼠血清库中IgG或IgM对型特异性Ps或对DT的几何平均滴度由ELISA测定。SD在所报告的几何平均值的±25％之内。由测定程序中的线性插值计算的MOPA滴度报告在括号内。结果总结于下表6中。
表6
上述表5和表6显示了针对多价分子构建体的四种组分的每一种的生物功能性IgG同种型抗体的回忆诱导。
特别地，针对载体蛋白观察到的对免疫系统的任何促升活性同时针对每种携带的Ps抗原也观察到，这是辅助T-依赖性抗原的典型性和公知的行为。
矿物佐剂的效应在这样低剂量的多价抗原下是特别显著的，这是辅助T依赖性抗原如产生较强免疫应答的蛋白的另一个特性从而进一步获得抗原在宿主体内随时间缓释的优势。
此外，糖基化对载体蛋白CRM197的效应，如糖基化所通常已知的，可有益于此蛋白对蛋白水解酶的改善的抗性，因为CRM197当暴露于哺乳动物中广泛存在的丝氨酸蛋白酶时是脆性的蛋白(Porro M.等人,J.Infect.Dis.,142(5),716-724,1980)。
针对CRM197所获得的促升效应还强烈地支持了多价分子构建体具有在人中用作抗原用于预防因白喉毒素引起的毒性的潜能的事实，这是CRM197在动物模型中被良好记载的性质(参见上文的文献参考)，在这种情况下多价抗原还可替代白喉类毒素疫苗(存在于DTP疫苗中)用于婴儿和年幼儿童的免疫接种以使得使用的儿科疫苗的免疫原性负荷可被进一步地减少。最后，根据辅助T依赖性抗原的免疫特性，IgM同种型抗体不被多价分子构建体的载体蛋白或所携带的Ps显著诱导或促升。
兔血清被特别地用于评价在分子构建体的第一次促升剂量之后IgG同种型抗体ELISA滴度对型特异性Ps的4倍增加，其中OPA滴度平行增加。收集了下述结果，表达为在免疫引发剂量后获得的血清GMT相对于所检测的滴度的倍数增加并报告于下表7中。
表7
| Ps型 | IgG Ab对Ps | OPA对Ps |
| (倍数增加) | (倍数增加) | |
| 3 | 12 | 40 |
| 6A | 18 | 48 |
| 7F | 28 | 52 |
实施例6：四价脑膜炎球菌结合疫苗(QMCV)和多至25-价肺炎球菌多价结合疫苗(PPCV)的疫苗组成
QMCV的成分/组成可被限制于一个单一的分子构建体，其中一摩尔(或其分数)的载体蛋白携带四种不同糖结构的每一种的至少一摩尔(或其分数)。多价抗原的相关估计量取决于所选择的活化的糖结构的MW，所述糖结构可不同地是从由一些(8-12)单糖残基或包含各自的基本表位的BRU(基本重复单元)构成的LMW半抗原[PorroM.等人Molecular Immunology,22:907-919(1985)；Porro M.等人Molecular Immunology,23:385-391(1986)]以及包含200或更多的BRU以含有基本表位的重复结构的多至HMW的糖结构。
在这样的情况下每人剂量的载体蛋白的量可减少至使用联合的单一群特异性结合物的制剂中存在的量的至少25％。
PPCV的成分取决于其多价组成。例如，对于包含所选择的15种血清型的15-价疫苗或对于包含所选择的18种血清型的18-价疫苗(如上文所考虑的)，多价抗原性分子构建体的仅5至6个实体将是必要的，因为在其每一个中，一摩尔(或其分数)的载体蛋白将携带三种不同型特异性糖结构的每一种的平均一摩尔(或其分数)。多价抗原的相关估计量取决于所选择的活化的糖结构的MW，所述糖结构可不同地是从由一些包含各自表位的BRU(基本重复单元)构成的LMW半抗原(Arndt B.and Porro M.in:Immunobiology of Proteins andPeptides,Edited by M.Z.Atassi,Plenum Press,New York andLondon,pg.129-148,1991)以及包含200或更多的BRU以含有基本表位的重复结构的多至HMW的糖结构。在许多情况下每人剂量的载体蛋白的量可减少至使用联合的单一型特异性结合物的制剂中存在的量的至少30％。
根据对流行病学和抗生素耐药性的公共可获得的数据，肺炎链球菌的新出现的血清型是6C、6D型(Satzke C.等人,J.Clin.Microbiol.,48(11):4298,2010；Yao KH等人,Diag.Microbiol.Infect.Dis.,70(3):291-8,2011)；血清群11(11A,11B,11C,11F型)(Richter S.等人,Clin.Infect.Dis.,48:23-33,2009)；Calix J.J.等人J.Bacteriol.193:5271-5278,2011)；血清群15(15B型和15C型)；23A型、血清群33(33F)和35(35B型)(Swanson D.,IDSA meeting,Boston,2011)；这样的抗原Ps有可能包含在根据本申请中公开的分子构建体制备的进一步更新的广谱疫苗制剂中。
虽然目前批准的13-价疫苗覆盖了小于5岁的儿童中IPD的约61％，但包含来自肺炎链球菌的新出现类型的更新的制剂可良好地将覆盖率增加至75-80％；事实上，已估计包含目前存在于基于多糖的疫苗中的Ps的23-价类型的制剂负责88％的肺炎球菌菌血症疾病，其随后可与导致额外的8％的因肺炎链球菌引起的疾病的Ps类型交叉反应(来源是美国疾病控制中心：www.cdc.gov.)。这样类型的更新的非常广谱的制剂可通过使用本发明的分子构建体安全地制备，其允许用于携带这样的增加量的Ps抗原的蛋白载体的减少使用。例如，当考虑2μg的CRM197(类似于Prevnar组合物)/分子构建体的剂量时，携带18种Ps抗原的6个分子构建体会包含12μg的蛋白总量，其是包含各型特异性Ps抗原的单一结合物的13-价Prevnar疫苗中存在的蛋白量的约40％。
如特别参考PPCV的示例性制剂，所述制剂包含含有肺炎链球菌的目前最普遍的流行病学显著的型特异性荚膜多糖的15-价制剂，根据上文在实施例1、2和3针对分子构建体CRM197-3,6A,7F报告的方法合成并分析了下列分子构建体以作为优选实施方案的延伸例证。在根据本申请描述的方法制备和配制并通过所得的各自表达内置的多重表位的五种分子构建体的化学计量所确定的此示例性15-价疫苗中示例的载体蛋白的总量，与下列关于包含约1ug的CRM197载体蛋白(MW＝58.5K)和约1ug的三种选择的DAB-活化的型特异性多糖抗原的每一种(平均MW＝70.0K，基于两种不同的分析标准，其为通过在校准的过滤膜上的分子过滤评估大小和通过SEC-MALLS评估大小，在所有的情况下使用参照糖分子如具有不同MW的葡聚糖)的各分子构建体的剂量的摩尔组成是一致的。
表8
在示例的分子构建体中，蛋白/型特异性Ps比率(w/w)的平均值是1.07±0.097(9.1％)对应于(mol/mol)比率的平均值1.27±0.12。
当选择的载体蛋白是CRM197并且各Ps抗原的平均MW是上述值的两倍或140K时，蛋白对各Ps的摩尔比率增加至2.5的平均值；相反，当各Ps抗原的平均MW是上述值的一半或35K时，蛋白对各Ps的摩尔比率降至0.64的平均值。
在摩尔基础上计算和比较结合抗原的特性的概念是基础性的，因为免疫系统在摩尔基础上加工抗原，如在物质转化的每个化学或生化反应中天然进行的，因此适用于抗原的MW。因此，取决于各型特异性Ps抗原的平均MW和蛋白载体的平均MW，结合抗原的摩尔比率通过其抗原成分的选择而经历变化。最优选载体蛋白和各型特异性Ps抗原之间的摩尔比率等于或高于1.0用于辅助T依赖性的可能最优的表达。除了此摩尔参数以外，还重要的是考虑蛋白和各型特异性糖抗原之间插入的共价键的平均量，其相应于型特异性多糖的活化率，因为此杂合分子区域被实验地显示为负责结合分子的获得性辅助T依赖性质(Arndt and Porro,1991)。
根据上述考虑，改变化学计量和因此分子构建体的成分(载体蛋白和所携带的各糖抗原)之间的摩尔比率而不改变所选择的Ps抗原的平均MW的另一种方式参照下列示例的分子模型。此模型借助上文描述的化学反应的试剂中经修改的化学计量学来合成，其支持以上述化学方程中报告的反应的逆转比率(w/w)与各Ps活化的抗原存在于反应中的蛋白成分，以显示还可导致显示载体蛋白和所携带的Ps抗原之间支持前一组分的摩尔比率的产物的这样的化学反应的灵活性。当提及与此示例的分子构建体的化学计量学相关的疫苗剂量时，其仍包含约1.0ug的CRM197载体蛋白(MW＝58.5K)但仅包含约0.3ug的所选择的三种DAB活化的型特异性多糖抗原(平均MW＝70.0K)的每一种。
表9
在示例的分子构建体中，蛋白/型特异性Ps比率(w/w)的平均值是3.08±0.24(7.8％)对应于比率(mol/mol)的平均值3.69±0.29。
上述实施例显示合成的不同化学计量学(如通过参与上述化学方程中报告的化学平衡的试剂的量显示的)可导致不同化学计量的分子构建体，其中分子构建体中的辅助T依赖性载体蛋白的量可根据这样的分子构建体在不同年龄组的人类群体中的免疫原性的最佳表达来最佳选择。在两种上文示例的包含5种各自携带3种型特异性Ps分子构建体的15-价制剂中，载体蛋白CRM197的总量是约5μg，而结合的型特异性Ps的量分别是约1.0和约0.3μg。因此，在与Prevnar疫苗中针对结合的各型特异性Ps所存在的CRM197剂量等价的CRM197剂量(约2μg/剂量)下，本文示例的在15-价制剂中的CRM197的总量会是约10μg或存在于13-价Prevnar疫苗的剂量中的总量的约33％。即使在假设的结合疫苗23-价制剂(其会使用本文报告的分子模型)中，在蛋白/剂量的可比较的量下，载体蛋白的总量会显著低于(约50％)存在于目前报道的通过单独的单一型特异性结合抗原的联合配制的13-价或15-价疫苗中的量。
因此，上述实施方案的目的是提供下列事实的证据：本文公开的具有内置表位的多价抗原性分子构建体可在广泛范围的化学计量参数下合成以随后恰当地确定哺乳动物宿主中构建体的最佳剂量，即使当考虑将通过广谱疫苗制剂免疫接种不同的年龄组时。此处可重要的是，之前的临床研究已显示在成人和幼儿中，免疫系统在免疫原性方面不能区分结合至蛋白载体CRM197的Ps的不同大小以及结合物的多点(交联的)或单点(非交联的)模型(Eby R.等人,in:ModernApproaches to New Vaccines,CSH Ed.,119-123,1994)，虽然这样的研究对于2-24个月年龄的婴儿不是可公共获得的。
实施例7：基于载体蛋白破伤风类毒素的具有内置表位的多价分子构建体
除了载体蛋白CRM197之外，其它良好建立的辅助T依赖性载体蛋白可用于涉及本申请中公开的分子构建体的多价制剂。作为例子，本申请人此处考虑将破伤风类毒素(TT)用作载体蛋白，其是自从数十年前起在儿科免疫中安全使用的通用免疫原。与载体蛋白CRM197相反，TT从未被配制在13或15-价结合疫苗中，以使得这样的潜在高剂量蛋白疫苗在人类中的安全性仍待最终确定。因此，公开的多价分子构建体用于蛋白如TT的用途代表了用于限制在基于这样的辅助T依赖性载体蛋白的13或15-价(或更多)的可能制剂中的载体蛋白量的合理方法。
TT是同源毒素被化学处理以使得所述毒素被目的性地解毒以用于该免疫原的人类使用的衍生物。纯化的类毒素的MW与所述毒素的MW是高度可比较的，其是1.51x105，包含1375个氨基酸。然而，除其它特性以外，类毒素和毒素之间的显著差异在于在化学解毒后类毒素结构中保留的来自赖氨酸残基的剩余初始氨基的量。在类毒素中将检测到平均50个活性氨基或原始存在于毒素的结构中的活性氨基的约50％，所述活性氨基用作与活化的细菌Ps的偶联反应中的亲核基团。当将TT的结构与CRM197的结构在于偶联反应中竞争作为亲核试剂的能力方面进行比较，可测定TT具有约50个氨基/摩尔(对于1375个aa MW＝1.51x105)而CRM197具有40个氨基/摩尔(对于535个aa MW＝58.5x104)，因此其摩尔密度(本文定义为“摩尔亲核活性”)为TT中的3.6％和CRM197中的7.5％，这显示出后一蛋白在给定偶联反应中用作亲核试剂的远更高的能力。然而，考虑到两种蛋白的MW的显著差异(基本上偏向TT的因子＝2.6)，当希望限制多价制剂中载体蛋白/剂量的量时，蛋白载体对于分子构建体中选择的所携带的糖抗原的每一种的摩尔比率可导致TT为有利的。事实上，在两种载体蛋白的可比较的重量剂量下，在摩尔基础上CRM197是TT的2.6倍。相比之下，必需注意的事实是，其MW可限制获得具有值≥1.0的TT/型特异性Ps摩尔比率的可能性以用于T辅助依赖性在宿主免疫系统中的最佳诱导。
在下文中，本申请人报告了这样的使用TT作为载体蛋白的分子构建体的物理化学特性，所述分子构建体根据上文针对基于CRM197的分子构建体所使用的方法利用允许载体蛋白的完全糖基化的试剂化学计量学来合成。这样的分子构建体可被认为是基于TT载体蛋白的多价制剂的基本组分：
表10
在脑膜炎奈瑟菌Ps和流感嗜血杆菌Ps的多价结合物的情况下(作为另外的例子)，下文是载体蛋白CRM197和TT之间的比较，其凸显了载体蛋白在不同构建体(根据如上述一般化学方程所允许的不同化学计量合成)中的相关性，如相关于其在摩尔比率(蛋白/Ps)定义中的MW，当考虑蛋白和Ps在上述表8-9中MW值时：
表11
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Claims (29)
1.由基本单元组成的抗原性多价分子构建体，所述基本单元包括共价结合至最少三种具有不同血清学特异性的糖结构的辅助-T依赖性载体蛋白，其中每种糖结构包括至少一个由通过分子量测定和NMR光谱学评估的最少五至十二个单糖残基组成的重复基本表位，所述重复基本表位经由测定其各自在抑制其同源多糖-抗体参照系统中的MIC50值通过与型特异性或群特异性多克隆或单克隆抗体的反应性来抗原性评价。
2.根据权利要求1的抗原性多价分子构建体，其中所述糖结构是寡糖或多糖。
3.根据权利要求1-2中任一项的抗原性多价分子构建体，其中所述重复基本表位由最少八至十二个单糖残基组成。
4.根据权利要求1-3中任一项的抗原性多价分子构建体，其中所述辅助-T依赖性载体蛋白选自天然白喉突变体蛋白CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、流感嗜血杆菌蛋白D、肺炎球菌表面蛋白、肺炎球菌毒素、以及它们的变体或衍生物，例如通过己二酸二酰肼间隔剂化学衍生的破伤风类毒素。
5.根据前述权利要求1-4中任一项的抗原性多价分子构建体，其中所携带的具有不同血清学特异性的糖抗原选自肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、结核分支杆菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、白色念珠菌、牛分枝杆菌的糖抗原或其组合。
6.根据权利要求5的抗原性多价分子构建体，其中所携带的糖抗原是选自下列的至少3种荚膜多糖：肺炎链球菌的1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7F、8、9N、9V、10A、11A、11B、11C、11F、12F、14、15A、15B、15C、17F、18C、19A、19F、20、22F、23A、23F、33F、35B型和/或脑膜炎奈瑟菌的A、C、W135和Y群多糖和/或流感嗜血杆菌的b型多糖、和/或肺炎克雷伯菌的K多糖抗原和/或金黄色葡萄球菌的多糖抗原和/或结核分枝杆菌的多糖抗原和/或伤寒沙门氏菌的多糖抗原和/或大肠杆菌的多糖抗原和/或霍乱弧菌的多糖抗原和/或白色念珠菌和/或牛分枝杆菌的多糖抗原、或其组合。
7.根据权利要求6的抗原性多价分子构建体，其中所述构建体包含载体蛋白CRM197和肺炎链球菌的三种荚膜多糖，所述三种荚膜多糖选自下列三元组：3、6A、7F；4、5、9V；1、6B、14；18C、19A、23F；6C、19F、22F；12F、15B、33F；5、9V、19F；1、14、19A；22F、23F、33F；4、6B、18C。
8.根据权利要求6的抗原性多价分子构建体，其中所述构建体包含载体蛋白CRM197和肺炎链球菌的三种荚膜多糖，其选自下列三元组：CRM197-3、6A、7F；CRM197-5、9V、19F；CRM197-1、14、19A；CRM197-22F、23F、33F；CRM197-4、6B、18C。
9.根据前述权利要求中任一项的抗原性多价分子构建体，其是单体或多聚体形式。
10.根据前述权利要求中任一项的抗原性多价分子构建体，其用于保护受试者免受至少一种病原体感染的疫苗，所述至少一种病原体选自：肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟菌，流感嗜血杆菌，肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌，伤寒沙门氏菌，大肠杆菌，霍乱弧菌，结核分枝杆菌，牛分枝杆菌和白色念珠菌。
11.疫苗制剂，其包含生理上可接受的媒介物中的至少一种根据权利要求1-9中任一项所定义的抗原性多价分子构建体，和任选药学上可接受的佐剂或赋形剂。
12.根据权利要求11的疫苗制剂，其中所携带的每种型或群特异性糖抗原的剂量范围介于0.1至10μg之间，优选为1.0μg。
13.根据权利要求11或12的疫苗制剂，其中所述佐剂在下列佐剂之间选择：选自磷酸铝，氢氧化铝的矿物佐剂；选自基于角鲨烯的佐剂例如MF59，QF21，Addavax的有机佐剂以及选自单磷酰-脂质A和二霉菌酸海藻糖酯的生物佐剂。
14.根据任何权利要求11-13中任一项的疫苗制剂，其中所述佐剂的量介于0.1-1mg/剂量之间，优选为0.5mg/剂量。
15.根据权利要求11-14中任一项的疫苗制剂，所述制剂适合用于通过皮下、肌内、皮内或经皮途径的施用。
16.根据前述权利要求11-15中任一项的广谱多价疫苗制剂，其在人类医疗或兽医领域中用于保护受试者免受至少一种细菌病原体的感染，所述至少一种细菌病原体选自：肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟菌，流感嗜血杆菌，肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌，结核分枝杆菌，伤寒沙门氏菌，大肠杆菌，霍乱弧菌，白色念珠菌和牛分枝杆菌或其组合。
17.根据权利要求16的广谱多价疫苗制剂，其中所述受试者属于儿科群体。
18.根据权利要求16-17的广谱多价疫苗制剂，其用于预防由肺炎链球菌引起的侵袭性肺炎球菌病，所述制剂包含选自CRM197-3、6A、7F；CRM197-4、5、9V；CRM197-1、6B、14；CRM197-18C、19A、23F；CRM197-6C、19F、22F；CRM197-12F、15B、33F或选自CRM197-3、6A、7F；CRM197-5、9V、19F；CRM197-1、14、19A；CRM197-22F、23F、33F；CRM197-4、6B、18C的一种或多种抗原性多价分子构建体。
19.根据权利要求16-17的广谱疫苗制剂，其用于预防由脑膜炎奈瑟菌引起的感染，所述制剂包含含有群特异性糖结构A、C、W135和Y的抗原性多价分子构建体。
20.根据权利要求16-19的广谱疫苗制剂，其用于预防由选自肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌的多于一种感染原引起的全身性和肺部感染，所述制剂包含多于一种含有所述感染原特异性的糖结构的抗原性多价分子构建体。
21.根据权利要求16-19的广谱疫苗制剂，其用于预防由选自伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和霍乱弧菌的多于一种感染原引起的肠道感染，所述制剂包含多于一种含有所述感染原特异性的糖结构的抗原性多价分子构建体。
22.根据权利要求16-19的广谱疫苗制剂，其用于预防由白色念珠菌和大肠杆菌引起的全身性和泌尿生殖感染，所述制剂包含多于一种含有感染原特异性的糖结构的抗原性多价分子构建体。
23.根据权利要求11-22中任一项的疫苗制剂，其用于与革兰氏阴性细菌的类内毒素单独、同时或相继地施用，所述类内毒素选自B群脑膜炎奈瑟菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、百日咳杆菌的类内毒素。
24.用于制备根据权利要求1-9中任一项的抗原性多价分子构建体的结合方法，其包括以下步骤：
a)通过经由氧化的O-脱氢解偶联和利用烷基二胺间隔剂形成亚胺还原键的还原性胺化将至少三种抗原性不同的糖结构化学活化至单官能性或多官能性，随后衍生至活性酯；
b)将所述至少三种酯-衍生的糖结构与多官能性载体蛋白的氨基通过形成酰胺键来同时偶联或逐步偶联。
25.根据权利要求24的方法，其中所述糖结构在其相应的二胺丁酸衍生物中进行化学活化并且所述活性酯是琥珀酰亚胺酯。
26.根据权利要求24-25中任一项的结合方法，其中所述多官能性载体蛋白是CRM197。
27.根据权利要求23-26中任一项的结合方法，其中所述至少三种糖结构选自来自肺炎链球菌的下列多糖三元组：3、6A，7F；4、5、9V；1、6B、14；18C、19A、23F；6C、19F、22F；12F、15B、33F；5、9V、19F；1、14、19A；22F、23F、33F；4、6B、18C。
28.用于制备根据权利要求1-9中任一项的抗原性多价分子构建体的结合方法，其包括将多官能性载体蛋白的氨基与至少三种抗原性不同的糖结构同时偶联或逐步偶联，经由形成亚胺还原键的还原性胺化，这样的糖结构通过经由氧化的O-脱氢解偶联在使用或不使用间隔剂的情况下被预先活化至单官能性或多官能性。
29.可通过根据权利要求24-28中任一项的结合方法获得的抗原性多价分子构建体。
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