CN1049522A

CN1049522A - 福菇肽的发酵提取工艺及其测定方法

Info

Publication number: CN1049522A
Application number: CN 90100035
Authority: CN
Inventors: 刘华珍; 刘锜英; 陈伟
Original assignee: Fujian Institute of Microbiology
Current assignee: Fujian Institute of Microbiology
Priority date: 1989-12-06
Filing date: 1989-12-06
Publication date: 1991-02-27

Abstract

本发明涉及一种利用福菇肽生产菌生产福菇肽 (酸性蛋白酶抑制剂)的发酵提取工艺及其测定方法。经过：砂土管菌种、斜面菌种、种子瓶、种子罐(一级发酵罐)、发酵罐(或二级发酵罐)等发酵工序，并采用大孔树脂吸附低级醇洗脱的方法提取发酵液中的福菇肽，而后采用抑酶显影法测定福菇肽的含量。本发明具有发酵时间短，提取工艺简单独特，提取率高达90％以上，测定方法简便，测定现象清晰，测定结果准确可靠，适用于工业化生产需要的优点。

Description

本发明涉及一种利用福菇肽生产菌生产福菇肽的发酵提取工艺及其测定方法。

本发明所用的福菇肽生产菌是从福建省福州市东门土壤中分离出的一株链霉菌，编号S-038。其代谢产物中含有生理活性物质，对酸性蛋白酶具有强的抑制作用。其特征为：在葡萄糖硫酸铵培养基上，用光学显微镜观察，孢子丝呈紧螺旋状，3～7圈（图1）。用电子显微镜观察，孢子呈椭圆形。每一孢子链有30个以上孢子，外壁呈刺状（图2）。在无机盐淀粉培养基上，气生菌丝体为荷花白-淡紫色，基内菌丝体为略黄-李紫色，基丝的色素在0.05N的HCL或NaOH的溶液中无指示剂性质。在有机培养基麦片上，气生菌丝体为粉白-粉红色，基内菌丝体为青蛤壳紫色，无可溶性色素。其生理生化特征为：牛奶胨化，不液化明胶，纤维素上不生长，硝酸盐还原，不产生黑色素和硫化氢。能利用葡萄糖、D-果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、乳糖和肌醇;不能利用L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-木糖、棉子糖及甘露醇。生长最适PH为6～9，生长最适温度为28℃，在20℃以下和37℃以上生长较差。福菇肽产生菌与其相似种的比较：链霉菌S-038菌株与紫色链霉菌（S.violaceus）、淡绛红链霉菌（S.Purpurascens）、略紫链霉菌（s.violaceus）等近似种的比较见表2。从表2可见S-038菌株与其近似种明显不同，在合成培养基上气生菌丝体为荷花白-淡紫色，无可溶性色素，而紫色链霉菌等为红或紫色，都有可溶性色素;S-038菌株不能利用L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-木糖、棉子糖和甘露醇，而其近似种均能利用;S-038菌株不液化明胶、在纤维素上不生长，而紫色链霉菌和淡绛红链霉菌液化明胶并在纤维素上生长;S-038菌株无抗菌作用，而其近似种都有抗菌作用。由此可见链霉菌S-038与其相似种比较，在培养特征和生理生化特性方面有明显区别。因此，认为链霉菌S-038菌株是紫色链霉菌类群中的一个新种，命名为福东链霉菌Streptomyces fudongus.n.sp.。

所谓的福菇肽是由福东链霉菌产生的一种酸性旦白酶抑制剂。国内至今尚无生产该物质或类似物的工艺和测定方法的报道。国外的相似物为胃旦白酶抑制剂（Pepstatin），它是利用Streptomyces argenteolus银样链霉菌等菌株在下列物质：1%葡萄糖、1%淀粉、0.75%旦白胨、0.75%肉膏、0.3%NaCL、0.1%MgSO₄·7H₂O、0.1% KH₂PO₄、0.0007%CuSO₄·5H₂O、0.0002%ZnSO₄·7H₂O、0.0001%FeSO₄·7H₂O、0.0008%MnCL₂·4H₂O组成的培养基上，在发酵温度为28℃的条件下，经过60～70小时的发酵，得到产物Pepstatin（具体详见：J.Anf.Vo23.No.5、1970 P.259-265）。

本发明的目的在于利用一种新种福东链霉菌，在较短的发酵时间内，以简便而独特的提取方法，生产一种酸性旦白酶抑制剂（即福菇肽）。

一、发酵工艺：

本发明利用福东链霉菌经过砂土管菌种、斜面菌种、种子瓶、种子罐（或发酵罐）、二级发酵罐等发酵工序，获得活力高的福菇肽发酵液，其具体发酵工艺如下。

选用经选育得到的活性高的福东链霉菌菌株作为福菇肽生产菌，并将该菌转入砂土管保存，供随时取用，将保存于砂土管中的生产菌移入斜面培养基中，在26～32℃保温培养6～15天后移入种子瓶中。

在种子瓶中装入占种子瓶体积8～20%的培养基，摇瓶发酵，发酵温度26～32℃，发酵32～48小时后，移入种子罐或发酵罐中。

种子罐体积一般有200立升和500立升，发酵罐体积为500立升1.5吨或5吨罐。培养基装置为罐体积的1/2～2/3，按0.01～0.1%用量（以培养基的量为100%）加入消泡剂，经低压消毒后，并按1～5%（以培养基的量为100%）的用量接种，发酵温度为26～32℃。种子罐的发酵时间为20～30小时，而后进入发酵罐，发酵罐的发酵时间为48～50小时即达高峰期。

各阶段培养基成份如下：

1、斜面菌种培养基：

旦白胨2克、肉膏4克、乳糖6克、葡萄糖2克、KNO₃1克、K₂HPO₄1克、MgSO₄1克、H₂O1升、琼脂24克、PH 7.0高压消毒20～30分钟后排成斜面。

2、种子瓶培养基：

葡萄糖10克、淀粉15克、肉膏5克、旦白胨5克、NaCL1克、K₂HPO₄0.2克，微量盐1毫升（CuSO₄·5H₂O 0.0007克/升、MnCL₂·4H₂O 0.0008克/升、ZnSO₄·7H₂O 0.0002克/升）CaCO₃3克，H₂O 1升，PH 7.0，低压消毒30分钟。

3、种子罐（或发酵罐），

培养基成分与种子瓶相同，但200立升种子罐应加30毫升消泡剂，500立升种子罐（或发酵罐）应加80毫升消泡剂。种子罐与发酵罐的发酵条件见表1

表1

发酵条件种子罐发酵时间发酵罐发酵时间接种量发酵温度搅拌速度空气流量罐压

技术参数20～36小时48～50小时1～5％26～32℃120～250转／分0.10.3～0.4千克／厘米²

由上可见，本发明与现有技术相比有下列三个不同点：

1、所采用的微生物菌种不同，

2、产生抑制剂的活力高峰期不同：本发明为48～50小时，现有技术为60～70小时。

3、发酵条件与培养基成分也有所不同。

二、提取工艺，

国外在提取Pepstatin及其类似物时是采用活性炭吸附或正丁醇萃取;然后进行硅胶柱层析，最后经减压浓缩得产品。该工艺复杂、生产周期长，需要花费大量有机溶剂，成本较高。

本发明的目的在于提供一种工艺简单，生产周期短，可节约大量有机溶剂，提取率高，成本低的福菇肽提取工艺。

本发明的提取工艺如下：从发酵罐中放出的发酵液经离心或板框压滤后所得的无菌丝体的发酵清液，用酸调节PH呈酸性后搅拌均匀，除去大分子沉淀物后，再将所得的清液回调PH至中性，然后上大孔树脂床进行吸附，流速为200～400毫升/分。待穿透后用蒸馏水淋洗至流出液无色，最后改用低级醇洗脱，洗脱液经减压浓缩后即得产品。

由上可见，本发明直接采用大孔树脂吸附，一步即可完成提取过程，具有工艺简单，生产周期短，可节约大量有机溶剂，提取率高达90%以上，成本低等优点。

三、测定方法

在国外对于Pepstatin及其类似物的测定都是采用紫外检测法，该法是选择光波在λ＝280^nm处，通过光密度值的变化来测定其含量，该测定方法要求待测定的样品中不得含有会吸收λ＝280^nm光波的其它物质，对待测样品的纯度要求高，否则就会干扰测定的准确性。如用该方法测定本发明的福菇肽含量，其误差可能大到100%。

本发明的目的在于提供一种方法简便，测定现象清晰，准确可靠，适用于工业化生产需要的测定方法。

本发明的测定方法为抑酶显影法，是根据福菇肽对酸性旦白酶呈专一性抑制的特点。抑制剂与旦白酶的结合呈定量关系，借助特制的平板和酶催化水解显影的方法进行测定，福菇肽的浓度不同、抑制酶水解反应的程度也不同，从而在平板上显示出直径大小不同的圆斑，借以判断福菇肽的含量。

本发明的测定方法如下：

（一）制备测定平板：

量取0.4%～0.6%酪旦白10毫升，加入2%～4%水琼脂10毫升，混合均匀后冷却至45℃，然后加入1毫克/毫升的胃旦白酶1毫升，混合均匀后倒板，待其凝固后即可供测定用。

（二）配制测定试样与标准液：

1、将待测液按实际需要用PH＝2的KCL-HCL缓冲液稀释成一系列浓度不同的测定试样。

2、将标准品准确称量至0.1毫克，然后用KCL-HCL缓冲液配制成1微克/毫升和4微克/毫升两种标准液。

（三）测定

用微量吸液器分别吸取5

的一系列测定试样和标准液，滴在预先准备好的直径相同的圆纸片上，然后依次贴在预先制备好的测定平板上，将此平板放在37℃恒温箱中保温3～4小时，然后将该测定平板上的测定组与标准组进行比较，确定大小相当于标准样的相应圆斑，然后计算出活力单位。稀释倍数×标准液单位＝样品活力单位。

Claims

1、一种利用链霉菌经发酵提取生产酸性旦白酶抑制剂(即福菇肽)的福菇肽的发酵提取工艺，其特征在于：它利用了一种被命名为福东链霉菌(Streplomyces fudongusn.sp.)的新种，经过砂土管菌种、斜面菌种、种子瓶、种子罐(一级发酵罐)、发酵罐(二级发酵罐)等发酵工序，获得富含福菇肽的发酵液，再经过离心或板框压滤、大孔树脂床吸附、低级醇洗脱、减压浓缩的提取工序即得产品。

2、根据权利要求1所述的发酵提取工艺，其特征在于：

a、选用经选充得到的活性高的福东链霉菌作为福菇肽生产菌，并将该菌转入砂土管保存，供随时取用，

b、将保存于砂土管中的生产菌移入斜面培养基中，在26～32℃下保温培养6～15天后移入种子瓶中，

c、在种子瓶中装入占种子瓶体积8～20%的培养基，摇瓶，在26～32℃下发酵32～48小时后，移入种子罐或发酵罐中，

d、种子罐体积一般为200立升和500立升，相应的发酵罐体积则为500立升1.5吨或5吨罐，培养基装量为罐体积的1/2～2/3，按培养基量的0.01%～0.1%加入消泡剂，经低压消毒后，并按培养基量的1%～5%接种，在空气流量为0.1，罐压为0.3～0.4千克/厘米，搅拌速度为120～250转/分，温度为26～32℃的条件下发酵，种子罐的发酵时间为20～30小时，发酵罐的发酵时间为48～50小时即可达活力高峰期，

e、各阶段培养基成分如下：

（1）斜面菌种培养基：

旦白胨2克、肉膏4克、乳糖6克、葡萄糖2克、KNO₃1克、K₂HPO₄1克、MgSO₄1克、H₂O 1升、琼脂24克、PH 7.0，

（2）种子瓶培养基：

葡萄糖10克、淀粉15克、肉膏5克、旦白胨5克、NaCL 1克、K₂HPO₄0.2克、微量盐1毫升（CuSO₄·5H₂O 0.0007克/升、MnCL₂·4H₂O 0.0008克/升、ZnSO₄·7H₂O 0.0002克/升）CaCO₃3克、H₂O 1升、PH 7.0，

（3）种子罐（或发酵罐）

培养基成分与种子瓶相同，但200立升种子罐应加30毫升消泡剂，500立升种子罐（或发酵罐）应加80毫升消泡剂。

f、从发酵罐中放出的发酵液，经过滤除去菌丝体，得到发酵清液，用酸调节PH呈酸性后搅拌，除去大分子沉淀物后，再将所得清液回调PH至中性，然后上树脂床进行吸附，其流速为200毫升/分～400毫升/分，待穿透后用蒸馏水淋洗树脂床至流出液无色，最后用低级醇洗脱，洗脱液经减压浓缩后即得福菇肽产品。

3、一种测定福菇肽（酸性旦白酶抑制剂）含量的抑酶显影测试法：其特征在于：

a、制备测定平板：

量取0.4～0.6%酪旦白10毫升，加入2%～4%水琼脂10毫升，混合均匀冷却至45℃，然后加入1毫克/毫升的胃旦白酶1毫升，混合均匀后倒板，待其凝固后即可供测定用。

b、配制测定试样与标准液

ⅰ、将待测液按实际需要用PH＝2的KCL-HCL缓冲液稀释成一系列浓度不同的测定试样。

ⅱ、将标准品准确称量至10^-1毫克，然后用KCL-HCL缓冲液配制成1微克/毫升和4微克/毫升两种标准液。

c、测定

用微量吸液器分别吸取5微升的一系列测定试样和标准液，滴在预先准备好的直径相同的圆纸片上，然后依次贴在预先制备好的测定平板上，将此平板放在37℃恒温箱中保温3～4小时，然后将该测定平板上的测定组与标准组进行比较，确定大小相当于标准样的相应圆斑，然后计算出活力单位。稀释倍数×标准液单位＝样品活力单位。