CN104946720A - 一种11α-羟基-16α,17α-环氧黄体酮的生产方法 - Google Patents

一种11α-羟基-16α,17α-环氧黄体酮的生产方法 Download PDF

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张道森
柏挺
吴庆安
周秋火
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Abstract

本发明属于微生物转化技术领域，具体涉及一种11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的生产方法。所述方法通过发酵赭曲霉、羟化16α,17α-环氧黄体酮得到16α,17α-环氧黄体酮C11-α-羟化物，所述发酵赭曲霉为二级发酵，所述16α,17α-环氧黄体酮C11-α-羟化物是在二级发酵罐中流加入底物16α,17α-环氧黄体酮经羟化得到的，其流加时间59～86h，维持发酵pH6.0～7.0。本发明的工艺方法，底物流加时，在发酵罐中流加59～86h，16α,17α-环氧黄体酮转化90%以上，且具有操作简便，生产周期短，底物溶剂可回收以实现循环利用，具有降低生产成本，经济环保等优点。

Description

一种11α-羟基-16α,17α-环氧黄体酮的生产方法
技术领域
本发明属于微生物转化技术领域，具体涉及一种11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的生产方法。
背景技术
16α,17α-环氧黄体酮全称16α,17α-环氧-孕甾-4-烯-3,20-二酮，俗称沃氏氧化物，其C11-α-羟化物是激素药物生产中重要中间体。目前国内16α,17α-环氧黄体酮的C11-α-羟化物主要利用黑根霉进行微生物羟化来完成，产率一般在45%-75%之间，且底物投料浓度低（1g/L），发酵条件及操作要求较高，副产物种类较多。
以下为16α,17α-环氧黄体酮的C11-α-羟化反应式：
发明内容
本发明的目的，在于提供一种11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的生产方法，利用赭曲霉进行微生物羟化，采用流加的方法增加底物投量，提高16α,17α-环氧黄体酮C11-α-羟化的转化率，且底物溶剂可以回收循环利用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的生产方法，所述方法通过发酵赭曲霉、羟化16α,17α-环氧黄体酮得到16α,17α-环氧黄体酮C11-α-羟化物。
根据本发明，所述发酵赭曲霉为二级发酵，所述一级发酵和二级发酵的培养基均为葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0.2%、泡敌0.02%配制而成的，均在121℃灭菌30min。
根据本发明，所述16α,17α-环氧黄体酮C11-α-羟化物是在二级发酵罐中流加入底物16α,17α-环氧黄体酮经羟化得到的。
根据本发明，所述底物16α,17α-环氧黄体酮1%与N,N-二甲基甲酰胺2%、吐温-800.3%混合加热至130℃溶清，流加入二级发酵罐。
根据本发明，流加时间59～86h，维持发酵pH6.0～7.0，转速200rpm。
根据本发明，所述赭曲霉的一级发酵为初始pH5.0，温度为28℃时接入赭曲霉种子，维持罐压0.04～0.06MP，培养12h。
根据本发明，所述赭曲霉种子是由赭曲霉菌接种到小米培养基中获得的，于27℃培养箱中培养8天，接种前用无菌水洗脱。
根据本发明，所述赭曲霉的二级发酵为初始pH5.0，温度为28℃时，以10%的接种量移入一级发酵的种子液，维持罐压0.04～0.06MP，发酵4～10h，进行底物流加。
采用本发明的发酵工艺，其底物转化90%以上。
本发明的有益效果是，本发明提供的工艺方法提高了底物投量及转化率，且底物溶剂可以回收循环利用，降低生产成本，减少环境污染。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的生产方法作进一步详细说明。
本发明所述的赭曲霉，购自中科院北京微生物研究所，菌号CGMCC3.06281。
实施例1：
步骤1、制备斜面种子：将赭曲霉菌株接入灭菌好的小米培养基，于27℃培养箱中培养8天，接种前用无菌水洗脱；
步骤2、一级种子发酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0.2%、泡敌0.02%配制一级种子培养基3L，121℃灭菌30min，降温至28℃，初始pH5.0时接入步骤1中的斜面种子，培养12h；
步骤3、发酵罐发酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0.2%、泡敌0.02%配制二级发酵培养基10L，121℃灭菌30min，降温至28℃，初始pH5.0，转速200rpm，以10%接种量移入步骤2的一级种子，培养6h，菌量达40%～50%；
步骤4、底物流加：将16α,17α-环氧黄体酮100g、N,N-二甲基甲酰胺200g、吐温-8030g混合加热至130℃溶清后，流加入发酵液中，维持pH6.0，转速200rpm，流加59h，16α,17α-环氧黄体酮转化率为90.4%。
实施例2：
步骤1、制备斜面种子：将赭曲霉菌株接入灭菌好的小米培养基，于27℃培养箱中培养8天，接种前用无菌水洗脱；
步骤2、一级种子发酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0.2%、泡敌0.02%配制一级种子培养基3L，121℃灭菌30min，降温至28℃，初始pH5.0时接入步骤1中的斜面种子，培养12h；
步骤3、发酵罐发酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0.2%、泡敌0.02%配制二级发酵培养基18L，121℃灭菌30min，降温至28℃，初始pH5.0，转速200rpm，以10%接种量移入步骤2的一级种子，培养4h，菌量达20%左右；
步骤4、底物流加：将16α,17α-环氧黄体酮180g、N,N-二甲基甲酰胺360g、吐温-8054g混合加热至130℃溶清后，流加入发酵液中，维持pH6.0，转速200rpm，流加78h，16α,17α-环氧黄体酮转化率为90.72%。
实施例3：
步骤1、制备斜面种子：将赭曲霉菌株接入灭菌好的小米培养基，于27℃培养箱中培养8天，接种前用无菌水洗脱；
步骤2、一级种子发酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0.2%、泡敌0.02%配制一级种子培养基3L，121℃灭菌30min，降温至28℃，初始pH5.0时接入步骤1中培养好的斜面种子，培养12h；
步骤3、发酵罐发酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0.2%、泡敌0.02%配制二级发酵培养基18L，121℃灭菌30min，降温至28℃，初始pH5.0，转速200rpm，以10%接种量移入步骤2的一级种子，培养10h，菌量达40%～50%；
步骤4、底物流加：将16α,17α-环氧黄体酮180g、N,N-二甲基甲酰胺360g、吐温-8054g混合加热至130℃溶清后，流加入发酵液中，维持pH7.0，转速200rpm，流加86h，16α,17α-环氧黄体酮转化率为91.14%。

Claims (6)

1.一种11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的生产方法，其特征在于，所述方法通过发酵赭曲霉、羟化16α,17α-环氧黄体酮得到16α,17α-环氧黄体酮C11-α-羟化物。
2.如权利要求1所述的11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的生产方法，其特征在于，所述发酵赭曲霉为二级发酵。
3.如权利要求1所述的11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的生产方法，其特征在于，所述16α,17α-环氧黄体酮C11-α-羟化物是在二级发酵罐中流加入底物16α,17α-环氧黄体酮经羟化得到的。
4.如权利要求1所述的11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的生产方法，其特征在于，所述底物16α,17α-环氧黄体酮1%与N,N-二甲基甲酰胺2%、吐温-800.3%混合加热至130℃溶清，流加入二级发酵罐。
5.如权利要求4所述的11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的生产方法，其特征在于，流加时间为59～86h，维持发酵pH6.0～7.0，转速200rpm。
6.如权利要求2所述的11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的生产方法，其特征在于，所述赭曲霉的一级发酵为初始pH5.0，温度为28℃时接入赭曲霉种子，维持罐压0.04～0.06MP，培养12h。
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