CN104945486A - 放射性金属元素标记的小分子环肽、组合物及其应用 - Google Patents

放射性金属元素标记的小分子环肽、组合物及其应用 Download PDF

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刘庆华
杨敏
张大志
程超
潘栋辉
左长京
张桉榆
王立振
徐宇平
杨润琳
陈飞
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Abstract

本发明提供了一种放射性金属元素标记的小分子环肽，其特征在于，为式（I）所示的化合物：c(X1HWGFTLX2)-Y-Z（I），其中，c(X1HWGFTLX2)为8-10个氨基酸的结合所形成的环肽，X1和X2均为至少一个氨基酸基团；Y为螯合配体；Z为68Ga，与Y螯合，其中，环肽上含有游离氨基，游离氨基与Y配合。本发明还提供了含有该小分子环肽的组合物及该小分子环肽作为肿瘤显像剂的应用。根据本发明提供的c(X1HWGFTLX2)-Y-Z，分子量小，血液廓清快，组织摄取量高，穿透性好，灵敏度高，放化合成过程简单，具有较好的临床应用前景，能够为医药工作者的后续研究或临床诊断提供了较好的依据。

Description

放射性金属元素标记的小分子环肽、组合物及其应用
技术领域
本发明属于医药学领域，具体涉及一种放射性金属元素标记的小分子环肽、含有该小分子环肽的组合物及该小分子环肽作为肿瘤显像剂的应用。
背景技术
肿瘤的侵袭转移严重影响患者的预后，如何进行早期诊断是临床亟待解决的关键问题。
基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)是一组含Zn+的、参与细胞外基质(extra-cellularmatrix，ECM)降解的最重要的一类蛋白酶。由于MMPs能够对基底膜和细胞外基质进行分解，造成肿瘤的侵袭和转移，并且，MMPs还可以调节肿瘤微环境中的许多组分，进而促进肿瘤的发生和发展[1]，因此，以MMPs为靶点制备分子探针进行诊断是目前研究中的热点。
明胶酶（MMP-2、9）是MMPs家族中重要的亚型，大量研究发现，其在卵巢癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌及肾癌等多种肿瘤中均有高表达[2]。
在MMPs肿瘤核素显像方面，最初，Watkins[3]用99mTc标记MT1-MMP底物,发现标记后的底物在乳癌肿瘤细胞中有较多聚集。其后，一些学者通过标记抗体进行MMPs靶向性研究，如Temma[4]用99mTc标记的MT1-MMP抗体对乳癌动物模型进行研究。但抗体具有分子量大，血液廓清慢的缺点。
由于MMPs抑制剂分子量小，特异性好，越来越多地被用作核素的标记物。但目前核素标记的MMPs抑制剂存在体内稳定性差、合成过程繁琐、活体动物肿瘤显像受限等不足。如68Ga-marimastat[5]的放化合成过程繁琐，特别是由于Marimastat对MMPs广谱抑制，不能反映特定MMPs亚型（如明胶酶MMP2、9）的表达。CTT虽是MMP2、9抑制剂，125I-CTT、64Cu-DOTA-CTT和111In-DTPA-CTT的肿瘤亲合力及稳定性差[6-8]。
小分子环肽类化合物因其靶向性好、体内稳定性佳，作为特异性的明胶酶抑制剂吸引了众多医药研究人员的注意。目前有研究报道[3,4]采用Cy5.5对环肽c(KAHWGFTLD)NH2进行标记，并采用标记物对多种活体肿瘤模型进行光学成像，但该标记物的荧光成像距离短，组织穿透性差，灵敏度不高，难以对深部组织定位表达，只能作为简单的动物模型进行基础研究，缺乏临床应用前景。
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发明内容
本发明的目的是提供一种放射性金属元素标记的小分子环肽、含有该放射性金属元素标记的小分子环肽的组合物以及该放射性金属元素标记的小分子环肽作为肿瘤显像剂的应用，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种放射性金属元素标记的小分子环肽，其特征在于，为式（I）所示的化合物：
c(X1HWGFTLX2)-Y-Z   （I）
其中，c(X1HWGFTLX2)为8-10个氨基酸的结合所形成的环肽，X1和X2均为至少一个氨基酸基团；Y为螯合配体；Z为68Ga，与Y螯合，其中，环肽上含有游离氨基，游离氨基与Y配合。
另外，本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽还可以具有这样的特征：其中，c(X1HWGFTLX2)为c(KAHWGFTLD)NH2，即为C6，其结构为：
即为C6。
另外，本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽还可以具有这样的特征：其中，Y为1,4,7-三氮环壬烷-1,4,7-三乙酸（NOTA）或1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)。
并且，本发明还提供了一种组合物，其特征在于，包括上述放射性金属元素标记的小分子环肽以及医学上可接受的载体。
并且，本发明还提供了上述放射性金属元素标记的小分子环肽作为肿瘤显像剂的应用。
发明的作用与效果
本发明提供的c(X1HWGFTLX2)-Y-Z，分子量小，血液廓清快，活体成像时摄取量高，组织穿透性好，灵敏度高，放化合成过程简单，具有较好的临床应用前景，能够为医药工作者的后续研究或疾病的诊断提供了较好的依据。
由于c(X1HWGFTLX2)能够特异性的作用于MMP-2，从而使放射性金属元素标记的小分子环肽能够靶向的到达肿瘤细胞，并作为肿瘤细胞的显像剂对肿瘤细胞进行显像。
另外，由于具有正电子元素68Ga，因此能够用正电子发射断层摄影法（PET）对放射性金属元素标记的小分子环肽在生物体内的分布情况进行扫描成像，不仅灵敏度高，结果准确，也可以无创、动态地检测。并且，能够对深部组织进行定位表达，显像轮廓清晰。
另外，由于具有螯合配体Y，使得c(X1HWGFTLX2)-Y-Z的热力学和动力学稳定性高，在体内可保持完整，能够更好的显像。
附图说明
图1是本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽在实施例中的HPLC图；
图2是实施例中放射性金属元素标记的小分子环肽在荷SKOV-3人卵巢癌裸鼠体内的microPET显像图；
图3是实施例中放射性金属元素标记的小分子环肽在荷PC-3人前列腺癌裸鼠体内的microPET显像图；
图4是实施例中放射性金属元素标记的小分子环肽在荷MDA-MB231人乳腺癌裸鼠体内的microPET显像图；
图5是本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽在实施例中的SKOV-3卵巢癌的免疫组化染色图；
图6是本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽在实施例中的PC-3人前列腺癌的免疫组化染色图；以及
图7是本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽在实施例中的MDA-MB231人乳腺癌的免疫组化染色图。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽、含有该小分子环肽的组合物及应用做详细描述。
<实施例>
选取c(KAHWGFTLD)NH2（即C6）作为小分子环肽，NOTA为螯合配体，68Ga作为放射性金属元素进行标记。
1.c(KAHWGFTLD)NH2-NOTA-68Ga（C6-NOTA-68Ga）的制备
步骤一：向c(KAHWGFTLD)NH2-NOTA（C6-NOTA）中加入灭菌注射用水溶解，配制成1mg/ml的溶液；
步骤二：取20μl步骤一中得到的C6-NOTA溶液，加入100μl2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸缓冲液和500μl新鲜淋洗的68Ga（1.5mCi），100℃反应15min；
步骤三：加入15ml水稀释，过C18柱，10ml注射用水冲洗C18，去除杂质，用0.3ml10mM氯化氢乙醇溶液淋洗C18柱，收集含有标记物的淋洗液，得0.945mCi的标记物。
采用HPLC法对标记物进行测定。色谱分析柱为C18柱（4.6×250mm），流动相A为水（体积分数0.1%三氟乙酸（TFA）），流动相B为乙腈（体积分数0.1%TFA）。分析条件：流速为1ml/min；0～2minA/B=95/5，32minA/B=35/65，检测波长为254和218nm，放射性检测应用放射性检测器进行。
图1是本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽在实施例中的HPLC图。
如图1所示，C6-NOTA-68Ga的放射性出峰时间为19min，放射化学纯度>95%，标记率为63.3%。
2.体外稳定性测定
取标记物用生理盐水稀释，分别测定室温放置2h和4h的放化纯，结果显示，C6-NOTA-68Ga在生理盐水中稳定，放置4h放化纯仍大于95%。
3.microPET显像
取荷SKOV-3卵巢癌鼠、PC-3人前列腺癌裸鼠、荷MDA-MB231人乳腺癌裸鼠各2只，置于MicroPET扫描仪(Inveon;Siemens)上。麻醉后，尾静脉注射0.2ml50μCi的68Ga-NOTA-C6，在注射后30min，60min和120min时分别进行PET/CT全身静态显像10min，使用感兴趣区技术（ROI）分析组织摄取值。
图2是实施例中放射性金属元素标记的小分子环肽在荷SKOV-3人卵巢癌裸鼠体内的microPET显像图。
图3是实施例中放射性金属元素标记的小分子环肽在荷PC-3人前列腺癌裸鼠体内的microPET显像图。
图4是实施例中放射性金属元素标记的小分子环肽在荷MDA-MB231人乳腺癌裸鼠体内的microPET显像图。
如图2、3、4所示，对于荷SKOV-3人卵巢癌裸鼠、荷PC-3人前列腺癌裸鼠、荷MDA-MB231人乳腺癌裸鼠三种不同的肿瘤模型，应用C6-NOTA-68Ga进行显像，均可显示肿瘤。120min时三种肿瘤模型体内的显像剂基本廓清。
4.体内分布实验
取0.2ml标记物，加入50ml容量瓶中，加水定容，得到标记物水溶液。取0.1ml标记物水溶液加入计数管中测量活度，作为标准。
取SKOV荷瘤鼠18只，异氟烷吸入麻醉，分别尾静脉注射0.74MBq标记物，分别在注射后30min、60min、以及120min时进行小鼠解剖（每个时间点6只荷瘤鼠），取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、肠、胃、脑进行称重并测量计数，经放射性衰变校正后，计算各组织摄取放射性药物剂量（%ID/g）。
表1不同时间点肿瘤组织及各脏器对C6-NOTA-68Ga的摄取量
组织器官 30min(%ID/g) 1h(%ID/g) 2h(%ID/g)
血 0.150565±0.067319 0.218816±0.090145 0.143903±0.033816
脑 0.025925±0.012511 0.019934±0.011529 0.013729±0.003859
心 0.154706±0.081344 0.05634±0.032142 0.036313±0.013083
肝 0.475159±0.167599 0.648706±0.142294 0.586183±0.187714
脾 0.432367±0.076781 0.827245±0.170489 1.10672±0.260249
肺 0.294366±0.058723 0.133939±0.076539 0.092772±0.020861
肾 2.841146±0.369594 2.525551±0.255119 2.687734±0.570607
胃 0.09254±0.016082 0.046869±0.020744 0.041384±0.008099
肠 0.169763±0.044876 0.045322±0.006635 0.027998±0.013001
肌肉 0.151489±0.066025 0.204952±0.085531 0.052538±0.020748
胰 0.292646±0.064636 0.048851±0.018666 0.024355±0.010468
性腺 0.181977±0.014819 0.171199±0.067184 0.039313±0.016122
甲状腺 0.289226±0.126133 0.274289±0.166744 0.183584±0.107595
脂肪 0.147407±0.04062 0.052764±0.022996 0.041953±0.02862
骨 0.191772±0.077906 0.081388±0.054471 0.134312±0.051563
肿瘤 0.385205±0.102721 0.817571±0.226338 0.049058±0.032573
如表1所示，SKOV-3荷瘤鼠的肿瘤组织摄取高峰在60min，120min时肿瘤组织中的标记物含量显著减少，说明该标记物代谢较快。60min时肿瘤/血、肿瘤/肌肉分别为3.74、3.99，显示本实施例所提供的C6-NOTA-68Ga靶向性的到达肿瘤。肾脏的C6-NOTA-68Ga摄取量较高显示本实施例所提供的C6-NOTA-68Ga主要通过肾脏代谢。
5.组织病理学测试和MMP-2免疫组化试验
取microPET/CT显像完毕后解剖得到的肿瘤组织，进行病理及MMP-2免疫组化检测。
图5是本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽在实施例中的SKOV-3卵巢癌的免疫组化染色图。
图6是本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽在实施例中的PC-3人前列腺癌的免疫组化染色图。
图7是本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽在实施例中的MDA-MB231人乳腺癌的免疫组化染色图。
如图5，6，7所示，MMP-2在肿瘤组织中呈现高表达。说明C6-NOTA-68Ga靶向高表达MMP-2的肿瘤组织。
实施例的作用与效果
本实施例所提供的C6-NOTA-68Ga，分子量小，血液廓清快，活体成像时肿瘤可显示肿瘤，组织穿透性好，灵敏度高，放化合成过程简单。具有较好的临床应用前景，能够为医药工作者的后续研究或癌症的诊断提供了较好的依据。
由于C6能够特异性的作用于MMP-2，从而使放射性金属元素标记的小分子环肽能够靶向的到达肿瘤细胞。
另外，由于具有68Ga，因此能够用正电子发射断层摄影法（PET）对C6-NOTA-68Ga在生物体内的分布情况进行扫描成像。采用PET进行成像，不仅灵敏度高，结果准确，也可以无创、动态地检测。并且，能够对深部组织进行定位表达，显像轮廓清晰。
另外，由于具有螯合配体NOTA，使得C6-NOTA-68Ga的热力学和动力学稳定性高，在体内可保持完整，能够更好的显像，同时也使放射性元素更易于标记。
当然，本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽并不仅仅局限于上述实施例中的内容。以上内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
另外，上述实施例中采用的小分子环肽为c(KAHWGFTLD)NH2，本发明所涉及的c(X1HWGFTLX2)还可以为c(KTAHWGFTLD)NH2。
另外，上述实施例采用NOTA作为螯合配体，本发明所涉及的螯合配体还可以为DOTA。
另外，本发明所涉及的放射性金属元素标记的小分子环肽，还可以为c(X1HWGFTLX2)NH-Y-Z的医学上可以接受的盐。
另外，上述实施例中放射性金属元素标记的小分子环肽采用生理盐水为载体，进行生物体显像，本发明所涉及的放射性卤素标记的小分子环肽还可以选自其它医学上可以接受的载体，载体可以为药用辅料，也可以为药用溶剂。
另外，本发明所提供的放射性金属元素标记的小分子环肽，除了能够用作肿瘤显像剂对肿瘤进行显像外，还可以用作其它MMP-2高表达的受体的显像剂，如用作动脉粥样硬化斑块显像剂对动脉粥样硬化斑块的进行显像。

Claims (5)

1.放射性金属元素标记的小分子环肽，其特征在于，为式（I）所示的化合物： 
c(X1HWGFTLX2)-Y-Z   （I） 
c(X1HWGFTLX2)为8-10个氨基酸的结合所形成的环肽，X1和X2均为至少一个氨基酸基团； 
Y为螯合配体； 
Z为68Ga，与所述Y螯合， 
其中，所述环肽上含有游离氨基，所述游离氨基与所述Y配合。 
2.根据权利要求1所述的放射性金属元素标记的小分子环肽，其特征在于： 
其中，所述c(X1HWGFTLX2)为c(KAHWGFTLD)NH2。
3.根据权利要求1所述的放射性金属元素标记的小分子环肽，其特征在于： 
其中，所述Y为1,4,7-三氮环壬烷-1,4,7-三乙酸或1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸。 
4.一种组合物，其特征在于：包括如权利要求1～3中任意一项所述的放射性金属元素标记的小分子环肽和医学上可接受的载体。 
5.如权利要求1～3中任意一项所述的放射性金属元素标记的小分子环肽作为肿瘤显像剂的应用。 
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