CN104920479B

CN104920479B - 一种除草剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104920479B
Application number: CN201510406199.2A
Authority: CN
Inventors: 旷文丰; 陈娟; 王承芳; 陈晨; 干华磊; 毛伟力
Original assignee: SHANGHAI WANLIHUA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI WANLIHUA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2018-07-10
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: CN104920479A

Abstract

本发明提供了一种除草剂的制备方法，包括：步骤1：对能产生除草活性物质的橘绿木霉菌进行发酵培养，得到含有除草活性代谢产物的培养液；步骤2：将得到的含有除草活性代谢产物的培养液进行粗提取操作，得到除草活性物质的粗提物；步骤3：使用本技术领域已知的农药所通用的载体，将所述粗提物配制成任意剂型，得到所述除草剂。所述除草剂是一种以橘绿木霉菌的粗代谢产物为有效成分的新型除草剂，具有使用量少、杀草谱广，对环境安排等特点，能广泛用于水田，旱田的灭杀性除草。

Description

一种除草剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及农药领域，尤其涉及一种除草剂，具体涉及一种以微生物代谢产物为有效成分的除草剂，及其制备方法和应用。

背景技术

随着化学除草剂在我国的广泛使用，给环境带来的负面影响日益显著。大量施用化学农药不仅会污染了地下水，而且造成了土地退化。长远的观点来看，长残效除草剂的大量使用所造成的残毒药害，甚至会导致农作物严重减产。目前全世界已有100余种化学除草剂在30多个国家被禁用。但此举又带来了新的问题，即反复施用单一品种的除草剂，导致抗药性杂草种群的形成。根据国际除草剂抗性的调查，至少有66个国家的84种作物中存在竞争性的抗性杂草，在全球范围已有437个除草剂抗性的案例被证实，包括对一种或多种化学类别产生抗性的品种。除草剂作用于杂草的25个已知作用位点，已有22个位点由于抗性而作用减弱，导致了杂草的抗性和交叉抗性没有机理上的阻碍。全球已经发现188种杂草的324个生物类型对19类化学除草剂产生了抗药性，使得药效降低，用药量增加，成本提高，也加重了环境污染。

利用自然界活体生物所产生的代谢物，研制和开发生物源除草剂，是一个有光明前景的革命性举措。开发生物源除草剂不仅具有研究周期短和开发费用低等优点，同时，发展绿色除草剂可以减少或取代现有化学除草剂的使用量，提高环境保护与粮食安全，符合农业可持续发展的战略要求。

据统计，国外创制一个新除草剂品种需投资一亿美元以上，并耗时10年以上。对这样一个耗时耗力又有极大风险的领域，国内企业很少愿意涉足。因此，化学除草剂的专利技术大多掌握在几家大型跨国公司手中。而对于环境更加友好的生物除草剂国外大公司也未放弃研发，在中国投入人力和物力，收集天然产物活性信息，收购天然产物化合物库。由于生物农药的开发，仅仅为传统的化学农药开发成本的十分之一。国内外也有许多研发机构进行了生物源除草剂的开发，早在1970年日本的田村竹松等人发现了第一个具有除草活性的微生物代谢产物放线菌酮。1972年德国的Zohne研究组分离的一株链霉菌(Streptomycesviridichromogenes)产生既抗细菌又抗真菌的抗生素，以后又发现它有强烈的除草活性，能防治一年生和多年生的农田杂草。该化合物后被命名为双丙氨膦(Bialaphos)，它是第一个直接开发成商品除草剂的微生物代谢产物。作为一种非选择性内吸除草剂，它对单子叶植物杂草和双子叶植物杂草都有很好的效果。

自20世纪80年代以来，全世界已经成功开发的生物除草剂产品有20余个品种，目前市场上可用的生物除草剂大约有11个。有8个商业化的生物除草剂是以真菌及其代谢物质为主要基础的。自2002年至今，加拿大就登记注册了3个真菌生物除草剂产品。在最近的4年间美国登记的生物农药品种76个，其中5个品种是生物除草剂新品种。然而，目前国内微生物源除草剂研究方向多集中在放线菌与细菌领域，真菌源除草剂的开发仍然是空白。我国幅员辽阔，微生物资源多样性显著，从微生物代谢产物库中筛选具有除草活性的天然化合物，具有广阔的开发前景。

发明内容

在上述大背景的前提下，本发明的发明人于2013年从辽宁省采集的土壤中分离得到一株微生物菌种，菌种纯化后，对菌株进行摇瓶发酵，发酵液及菌丝体有机溶剂提取液显示，该培养物对稗草、马齿苋、反枝苋等多种农田杂草有良好的防除效果。

进一步地，通过对这种菌株的生理生化鉴定以及分子遗传学鉴定，将其分类归属为桔绿木霉菌(Trichoderm citrinoviridevs)，该菌株在中国普通微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No8722。

因此，本发明的首要目的在于提供一种以该微生物的代谢产物为有效成分的除草剂。

本发明的另一个目的在于提供一种以该微生物的代谢产物为有效成分的除草剂的制备方法。

本发明还有一个目的是提供一种以该微生物的代谢产物为有效成分的除草剂的应用。

本发明的第一方面的主题是一种除草剂的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：对能产生除草活性物质的橘绿木霉菌进行发酵培养，得到含有除草活性代谢产物的培养液；

步骤2：将得到的含有除草活性代谢产物的培养液进行粗提取操作，得到除草活性物质的粗提物；

步骤3：使用本技术领域已知的农药所通用的载体，将所述粗提物配制成任意剂型，得到所述除草剂。

优选地，所述橘绿木霉菌为中国普通微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCCNo8722的菌株。

在本发明的实施例中，所述步骤1通过常规的微生物源抗生素的生产方法，培养所述桔绿木霉菌即可得到它的代谢产物，也即本发明的除草剂中的有效成分。优选地，所述发酵培养方法既可为深层液体培养，也可为固体培养，进一步地，为了有利于工业性培养，亦将所述木霉菌的孢子悬浮液接种到培养基上，维持一定温度进行通气搅拌。

优选地，所述发酵培养使用的培养基中的营养源无特殊的规定，可使用常规的碳源、氮源、及其它营养物。其中，所述碳源优选自淀粉、糊精、葡萄糖、甘油、蔗糖、甘露醇中的任意一种或几种；所述氮源优选自黄豆饼粉、花生粉、土豆粉、肉膏、肉胨、酵母、玉米浆、麦麸、尿素、硝酸盐以及其它有机或无机含氮化合物中的任意一种或几种；其它营养物可以为一些适当的无机盐，优选为氯化钠、硫酸二氢钾、氯化钾、钙、锰、铁金属离子中的任意一种或几种；培养基中还可加入吐温80等表面活性剂以增加除草剂在发酵液中的积累，必要时可添加消泡剂，优选为植物油、泡敌。

优选地，所述发酵培养的环境要求，如温度、PH，无严格限制，以适合所述橘绿木霉菌的发酵培养为准，并以选择除草活性最高的条件为好。更加优选地，培养基的pH范围为4-8；培养温度在24-37℃，以接近30℃为更好；通气量以通气比1:0.3-3之间为宜；培养时间为72小时-144小时，以122小时为最佳。

上述所述这些培养基的组分、pH、培养温度、通气条件，培养时间等均应根据实际情况进行适当调整，以获得最好效果。

在本发明的另外一个优选实施例中，所述步骤2的粗提取操作，由于除草活性物质易溶于有机溶剂，因此可以通过正丁醇或醋酸乙酯进行萃取；或通过一些常规的大孔吸附树脂吸附解析方法进行提取，以获得初提物；另外，菌丝体可以通过常规的丙酮或乙醇浸泡后提取活性物质。

在本发明的实施例中，所述步骤3中，优选地，通过使用该技术领域已知的农药所通用的固相液相及乳化剂分散润湿剂等各种载体，配制成颗粒剂、粉剂、乳剂、可湿性粉剂、胶悬剂，微胶囊剂中的任意剂型。

进一步地，各种剂型中的有效成分配比，可根据不同的使用目的而适量的增减。一般来说，粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂的有效成分含量(重量)在1-30％，乳油、胶悬剂的有效成分含量(重量)在0.2-10％，微胶囊的有效成分含量(重量)在10-30％。

在实际使用中，该除草剂在使用前可以用水稀释至合适的浓度。

优选地，在配制过程中，适当添加一些助剂，包括分散剂、润湿剂、乳化剂、渗透剂、粘着剂、消泡剂、发泡剂、增稠剂、稳定剂中的任意一种或几种，但不能加入碱性助剂。进一步地，所述分散剂包括十二烷基磺酸钙、NNO、GY-D04、GY-D06、GY-D10、GY-800、EL-20、SG-50中的任一种或几种。所述助剂还可以是羧甲基纤维素、聚乙二醇、阿拉伯胶、黄原胶。

所述载体，包括滑石粉、膨润土、高岭土、白炭黑、蛭石粉、轻质碳酸钙、尿素、硫酸铵的固体载体，以及包括异丙醇、二甲苯、环己烷、甲基萘的液体载体。

本发明的第二方面的主题是一种上述所述制备方法制备得到的除草剂。

本发明的第三方面的主题是一种上述所述制备方法制备得到的除草剂的应用。

优选在对稗草、马齿苋、反枝苋多种农田杂草的防除方面的应用。

优选地，应用时采用植株喷雾处理。

所述应用可以是二次参加并与其他除草剂结合使用。

具体地，所述除草剂可在杂草发芽之前或之后进行地面施药或者叶面施药：对于地面施药，本发明的除草剂的施用量为每亩10-20克活性成分；对于叶面施药，以每亩5-20克活性成分的剂量稀释后施加。

本发明的以上述桔绿木霉的代谢产物为活性组份的除草剂对稗草，马齿苋，反枝苋等多种农田杂草具有良好的触杀效果。因该除草剂对大多数草本植物有显著的触杀效果而对木本植物无影响，因此，该除草剂可以广泛用于水田，旱田的灭生性除草。除此以外，所述除草剂还具有使用量少、杀草谱广、对环境安全等特点。

具体实施方式

本发明提供了一种除草剂的制备方法，其特征在于，包括：

所述橘绿木霉菌为中国普通微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No8722的菌株。

所述发酵培养使用的培养基中的营养源无特殊的规定，可使用常规的碳源、氮源、及其它营养物。其中，所述碳源优选自淀粉、糊精、葡萄糖、甘油、蔗糖、甘露醇中的任意一种或几种；所述氮源优选自黄豆饼粉、花生粉、土豆粉、肉膏、肉胨、酵母、玉米浆、麦麸、尿素、硝酸盐以及其它有机或无机含氮化合物中的任意一种或几种；其它营养物可以为一些适当的无机盐，优选为氯化钠、硫酸二氢钾、氯化钾、钙、锰、铁金属离子中的任意一种或几种；培养基中还可加入吐温80等表面活性剂以增加除草剂在发酵液中的积累，必要时可添加消泡剂，优选为植物油、泡敌。

所述发酵培养的环境要求，如温度、PH，无严格限制，以适合所述橘绿木霉菌的发酵培养为准，并以选择除草活性最高的条件为好。更加优选地，培养基的pH范围为4-8；培养温度在24-37℃，以接近30℃为更好；通气量以通气比1:0.3-3之间为宜；培养时间为72小时-144小时，以122小时为最佳。

在配制过程中，适当添加一些助剂，包括分散剂、润湿剂、乳化剂、渗透剂、粘着剂、消泡剂、发泡剂、增稠剂、稳定剂中的任意一种或几种，但不能加入碱性助剂。进一步地，所述分散剂包括十二烷基磺酸钙、NNO、GY-D04、GY-D06、GY-D10、GY-800、EL-20、SG-50中的任一种或几种。所述助剂还可以是羧甲基纤维素、聚乙二醇、阿拉伯胶、黄原胶。

本发明还提供了一种上述所述制备方法制备得到的除草剂。

本发明还提供了一种上述所述制备方法制备得到的除草剂的应用。

优选在对稗草、马齿苋、反枝苋多种农田杂草的防除方面的应用；应用时采用植株喷雾处理。

所述应用可以是二次参加并与其他除草剂结合使用。

下面通过具体实例，对本发明的技术方案进行进一步解释和说明。其中，以下涉及的原材料皆为市售得到，且所涉及的浓度为重量浓度。

实施例1——除草活性物质的粗提物的制备

以葡萄糖3％，土豆粉2.5％、酵母粉0.3％、酵母膏0.1％、吐温800.5％、磷酸二氢钾0.05％，氯化镁0.5％、消泡剂LX-6030.1％的比例配制成摇瓶培养基，pH调节到7.0，摇瓶装瓶量150ml/1L，在121℃下，灭菌20分钟；

将生长与马铃薯蔗糖培养基斜面的桔绿木霉菌(Trichoderm citrinoviridevs)CGMCC No8722菌种接种于该培养基中，摇瓶置于28℃下，200rpm，培养30-38小时，然后以5-15％的体积比例接种与上述培养基35L的50L发酵罐中，通气比1V/V，罐压0.03Mpa，温度29℃，搅拌速度200rpm，培养92-96小时，发酵完成后得到含有除草活性代谢产物的培养液；

调节发酵液pH到3.8，通过碟片式离心机离心，得到40L滤液和8L滤渣；滤液通过2L，HZ-806大孔吸附树脂吸附后，先用20％乙醇水溶液洗脱杂质，再用50％乙醇水溶液洗脱，搜集洗脱液，50℃减压蒸馏除去乙醇，得到粗提物浓缩液1；

滤渣用8L 80％乙醇浸泡两次，浸泡液50℃减压蒸馏除去乙醇后，用正丁醇萃取两次，55℃减压蒸馏除去正丁醇，得到粗提物浓缩液2；

将粗提物浓缩液1和2合并，60℃减压浓缩得到50g淡褐色固体粗提物，即为除草活性物质的粗提物。

实施例2——可湿性粉剂的制备

取实施例1中得到的粗提物30份(重量比，下同)、Borresperse NA6份、K122份，白炭黑4份、高岭土58份混合，气流粉碎既得含量为30％的可湿性粉剂。

实施例3——乳油的制备

取实施例1中的粗提物8份，用30份乙醇溶解，加入40份醋酸仲丁酯和20ml二甲苯助溶，最后加10份乳化剂SP-4099，既得含量为8％的乳油。

实施例4——粉剂的制备

取实施例1中的粗提物5份、硬脂酸钙5份、滑石粉45份、及膨润土45份混合，气流粉碎既得含量为5％的粉剂。

实施例5——水分散颗粒剂的制备

取实施例1中的粗提物10份、聚丙烯酸衍生物3份、木质素奈磺酸盐3份、交联吡咯烷酮1份、甘露醇5份、羧甲基纤维素2份、无水氯化钙2份、白炭黑37份、高岭土37份混合，将18份水加入粉体中，在捏合机中捏合成软料，将软料投入到挤压造粒机中挤压造粒，80℃干燥既得水分散颗粒剂。

应用实施例6——乳油除草剂杀草谱实验测试

1、实验设计

按实施例3配制的乳油除草剂进行实验，采用温室盆栽法，对各杂草靶标进行不同剂量的土壤及植株喷雾处理，每个处理重复三次，另设空白对照。喷雾装置为POTTER型自动喷雾塔，雾滴直径30微米、有效附着率＞99％。处理后置于温室中生长，定时观察植株反应症状，并分别于药后3、10天左右按照0-100％分级法目测评价综合除草活性，评价标准见表1。

2、实验结果

实验结果(表2、表3)表明，药后3天，在20克有效成分/亩剂量下，对马齿苋、反枝苋、稗草、马唐、藜都很敏感，目测防效均在80％以上，而在10克有效成分/亩剂量下，除马齿苋较敏感，目测防效为80％，其余防效较差；药后10天观察，两个剂量对测试植物均有较好的防效，均在80％以上。

表1：目测法除草活性评价标准

除草活性	除草活性综合评语
		(％)	(对植株茎或根抑制、畸形、白化、烂等影响程度)
0	同对照，无活性
		10-30	活性低，稍有影响
40-50	活性低，对生长有明显影响
		60-70	有活性，能抑制生长

80-90	活性好，严重抑制生长
		100	植株死亡

表2：杀草谱药后3天目测结果

表3：杀草谱药后10天目测结果

应用实施例7——乳油除草剂防除菜园杂草田间实验测试

1、实验设计

按实施例3配制的8％乳油制剂进行试验，试验设置8％乳油的四个剂量处理，以清水为空白对照，共5个处理，重复4次，总计20个小区，每小区面积为10㎡，按照随机区组排列。按照表4所设计各处理用药量，每亩兑水50kg配制药液，采用背负式工农-16型喷雾器(操作压力0.3～0.4MPa，喷孔口径0.8mm)施药，施药前调查杂草基数，施药后3、7、10天分别调查试验小区杂草密度，并计算防效。采用绝对值调查法，在每个小区内随机选择3个点进行抽样调查，每点1㎡，调查每种杂草总株数，用Duncan’s新复极差法进行统计分析。2、实验结果

试验结果如表5所示，每亩使用8％乳油制剂有效成分5-30克，施药后第三天对马齿苋、马唐、藜的密度防效分别为81.20％-93.83％、74.20％-80.96％、78.62％-87.66％；药后7天的密度防效分别为83.61％-100.00％、76.42％-86.68％、80.22％-94.07％；药后10天的密度防效分别为93.30％-100.00％、80.39％-100.00％、83.17％-91.21％。

表4：试验设计用药量

表5：乳油除草剂防除菜园马齿苋、马唐、藜的效果

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种除草剂的制备方法，其特征在于，包括：

步骤3：使用本技术领域已知的农药所通用的载体，将所述粗提物配制成任意剂型，得到所述除草剂；

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤2的培养液通过离心分离得到滤液和滤渣，所述步骤2的粗提取操作，滤液通过正丁醇或醋酸乙酯进行萃取；或通过一些常规的大孔吸附树脂吸附解析方法进行提取，以获得粗提物；所述滤渣通过丙酮或乙醇浸泡后提取得到粗提物。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤3中，通过使用该技术领域已知的农药所通用的载体，配制成颗粒剂、粉剂、乳油、可湿性粉剂、胶悬剂、微胶囊剂中的任意剂型。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂的有效成分的重量含量在1-30％，乳油、胶悬剂的有效成分的重量含量在0.2-10％，微胶囊的有效成分的重量含量在10-30％。

5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，在配制过程中，添加一些助剂，包括分散剂、润湿剂、乳化剂、渗透剂、粘着剂、消泡剂、发泡剂、增稠剂、稳定剂中的任意一种或几种，但不能加入碱性助剂。

6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述载体，包括滑石粉、膨润土、高岭土、白炭黑、蛭石粉、轻质碳酸钙、尿素、硫酸铵中的任意一种或几种固体载体，以及包括异丙醇、二甲苯、环己烷、甲基萘中的任意一种或几种液体载体。

7.一种如权利要求1-6任意一项所述的制备方法制备得到的除草剂。

8.一种如权利要求1-6任意一项所述的制备方法制备得到的除草剂的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，对稗草、马齿苋、反枝苋多种农田杂草的防除方面的应用。