CN104911121A - 假浅灰链霉菌及其微生物菌剂和应用 - Google Patents

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Abstract

假浅灰链霉菌及其微生物菌剂和应用。本发明公开了一种用于防治番茄苗期瘁倒病的假浅灰链霉菌（Aspergillus awamori)，该菌株已于2015 年02 月04日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10520；本发明还公开了利用该菌株生产的微生物菌剂及其制备方法。本发明提供的假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4及其微生物菌剂，拮抗作用强，能减少番茄苗期瘁倒病发病率，番茄苗的株高和茎粗有所增加，且能促进番茄生长，半发酵腐熟的菇渣与酒糟基质相比，拮抗菌共培养菇渣制备的基质对瘁倒病的防控率更优。

Description

假浅灰链霉菌及其微生物菌剂和应用
技术领域
本发明具体涉及一种用于防治番茄苗期瘁倒病的假浅灰链霉菌和含有该假浅灰链霉菌的微生物菌剂，及其在防治番茄苗期瘁倒病上的应用，属于农业微生物技术领域。
背景技术
黄猝倒病是由致病性腐霉菌属(Pythium spp.)引起的真菌病害，是世界著名的毁灭性病害，可为害茄子、番茄、辣椒、黄瓜、甘篮、芹菜、洋葱、菜豆；莴苣等多种蔬菜幼苗，是中国保护地春秋季育苗中常见病害，一般苗圃发病率为20%～50%，严重时可达80%以上，目前在基质育苗中也较为突出，给农业生产造成了巨大的经济损失。目前，国内对猝倒病的防治仍以化学防治为主，但其严重污染环境，而且随着药剂使用时间的延长，还诱导病原菌的抗病性，因此开发绿色的瘁倒病防控技术受到广泛关注。
发明内容
本发明第一目的在于提供一种用于防治番茄苗期瘁倒病的假浅灰链霉菌及其微生物菌剂。
本发明第二目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。
本发明第三目的在于提供上述假浅灰链霉菌菌株及其微生物菌剂在防治番茄苗期瘁倒病上的应用。
上述假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4菌株，于2015 年02 月04日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10520。
菌株生理特征：上述假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4在马铃薯琼脂固体（PDA）培养基上，在28℃培养4天，菌丝长满整个9cm培养皿，菌落平坦，表面质地呈粉粒状，表面暗褐色，菌落反面呈橙黄色。分生孢子头幼龄时多呈辐射形；老熟时呈疏松或裂成疏松的圆粒状结构；分生孢子顶囊呈球形或近球形，淡褐色；分生孢子球形或近球形。
菌株的鉴定：通过提取上述假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4菌株的基因组，并用18S通用引物对该菌株进行测定，并测得其核苷酸和氨基酸序列表，和从18S rDNA基因序列测定结果来看上述菌株可以归为假浅灰链霉菌。
利用上述假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4制备的微生物菌剂，所述微生物菌剂为或固体菌剂，由假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4和及其培养物组成；其活性成分为假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4菌体和它的胞外代谢产物。
上述微生物菌剂，其内含有的假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4的活菌数大于1.0×108 cfu/g或等于1.0×108 cfu/ml。
一种上述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）   菌株活化培养：将分离的假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4菌株斜面
保藏物接种到PDA斜面，实施斜面活化培养；
（2）   液体培养基扩培，获取种子液；
（3）将扩培后的对数期种子液，按照2%的接种量接种至共培养基质中，充分搅拌混匀后，在28℃培养5-7d，培养结束后用于育苗试验。
上述共培养基质，选择半发酵腐熟的酒糟和菇渣，并加入10%的麸皮和1%的酵母膏，调节含水率至40%-50%。
上述假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4在番茄苗期瘁倒病的应用。
上述微生物菌剂在防治番茄苗期瘁倒病上的应用。
本发明提供的假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4及其微生物菌剂，具有以下优点：拮抗作用强，能减少番茄苗期瘁倒病发病率，番茄苗的株高和茎粗有所增加，且能促进番茄生长；半发酵腐熟的菇渣与酒糟基质相比，拮抗菌共培养菇渣制备的基质对瘁倒病的防控率更优，本发明所提供的微生物菌剂对人、畜安全，不会污染水和土壤，对其他农作物也没有危害。
说明书附图
图1假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4对菇渣基质番茄育苗瘁倒病发病率的影响。（图中内4代表nmg4）。
图2假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4接种菇渣基质对番茄幼苗株高的影响。（图中内4代表nmg4）。
图3假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4接种菇渣基质对番茄幼苗茎粗的影响。（图中内4代表nmg4）。
图4假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4酒糟基质对番茄育苗瘁倒病发病率的影响。（图中内4代表nmg4）。
图5假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4酒糟基质对番茄幼苗株高的影响。（图中内4代表nmg4）。
图6 假假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4酒糟基质对番茄幼苗茎粗的影响。（图中内4代表nmg4）。
具体实施方式
蔬菜工厂化基质育苗技术一直是蔬菜产业化发展的方向，而均有生防功能的基质[更是这一领域的研究热点。本研究以实验室分离保藏的终极腐霉拮抗菌假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4作为拮抗菌剂，通过与酒糟、菇渣等初步发酵后的生物质固体废弃物进行共培养后作为育苗基质，通过接种终极腐霉病原微生物考察拮抗功能基质对育苗瘁倒病的影响,以期为克服或减轻番茄等苗期猝倒病害提供生防育苗基质奠定基础。
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体说明。
实施例1。
菌剂的制备。
对所涉材料的说明：供试番茄品种为浙杂205；瘁倒病拮抗菌株nmg4（Streptomyces pseudogriseolus）由本实验室分离保藏。猝倒病病原菌株终极腐霉(Phthium ultinum，ACCC36075，下简称36075)购于中国农业微生物菌种保藏中心。
假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4采用高氏一号放线菌培养基，瘁倒病病原菌的培养采用PDA培养基。
基质材料及共培养基质：常规基质原料分别采用发酵腐熟的黄酒酒糟和金针菇栽培后菇渣；共培养基质选择半发酵腐熟的酒糟和菇渣，接种拮抗微生物前，先加入10%的麸皮和1%的酵母膏，调节含水率至40%-50%。
抗病功能基质和致病菌剂制备方法：假浅灰链霉菌在斜面活化后，进行液体培养基扩培，将扩培后的对数期种子液，按照2%的接种量接种至共培养基质中，充分搅拌混匀后，在28℃培养5-7d，培养结束后用于育苗试验。
瘁倒病病原菌在培养基斜面活化后，进行液体培养基扩培，培养基中加入玻璃珠，使菌丝体分散，培养至对数期后用于育苗基质接种。
实施例2。
育苗对比试验。
选择番茄种子进行拮抗基质育苗试验，试验设置常规基质接种致病菌、拮抗菌共培养基质、拮抗菌共培养基质接种致病菌等三个处理，采用25穴的育苗盘，试验重复3次。播种之前将共培拮抗基质及常规基质材料、珍珠岩和蛭石分别按照8:1:1的比例混合均匀，再按照6g/kg的量将复合肥（15-15-15）和2%的10倍稀释致病菌培养液按照比例与基质混合均匀。种子在28℃培养箱中催芽，待出芽后及时播种于穴盘中。定期考苗，记录发病率，试验结束后每个重复随机抽取10株测定株高及茎粗等。本试验数据用DPS8.0 软件进行统计分析。
2.1拮抗菌假浅灰链霉菌nmg4对菇渣基质番茄育苗的影响。
    以菇渣作为假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4的共培养基质，播种番茄种子后，对番茄苗的发病死亡率进行统计如图1所示。从图中可见，不接种终极腐霉病原菌的拮抗菇渣基质中番茄苗的发病死亡率较低，为10.66%，而接种终极腐霉的拮抗菌共培养基质中番茄发病率死亡率为17.33%，略高于不接种终极腐霉的处理，而常规菇渣基质对照中，由于接种了瘁倒病致病菌，番茄苗死亡率较高，达62.63%，显著高于其它两个处理（P<0.05）。以上结果说明，通过在半发酵腐熟中的菇渣基质中通过添加一定的营养助剂，并接种终极腐霉拮抗菌假浅灰链霉菌nmg4进行共培后，能够有效发挥其拮抗作用，减少瘁倒病发病率。
试验结束后，测定番茄苗的株高及茎粗，结果如图2和图3所示。采用拮抗菌接种的菇渣共培养基质的两个处理中，接种致病菌的拮抗菇渣基质中的番茄苗株高要小于不接种病原菌的拮抗菌菇渣基质，但均要大于接种病原菌的常规菇渣基质。经Tukey方差分析表明2个拮抗菌共培养菇渣基质中的番茄苗株高要显著高于常规菇渣基质（P<0.01）。测定番茄苗的茎粗表明，不接种病原菌的拮抗菌共培养基质和接种病原菌的常规基质中苗的茎粗要大于接种病原菌的拮抗基质。说明病原菌终极腐霉不仅容易造成幼苗瘁倒病的发生，而且对番茄幼苗的生长具有一定的抑制作用，而拮抗菌nmg4不仅能够降低瘁倒病的发病率而且对番茄苗的生长具有一定的促进作用。
2.2假浅灰链霉菌nmg4对酒糟基质番茄育苗的影响。
以酒糟作为假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4的共培养基质，播种番茄种子后，对番茄苗的发病死亡率进行统计如图4所示。从图中可见，不接种终极腐霉的拮抗菌酒糟基质中番茄苗的发病死亡率较低，为12.00%，而接种了终极腐霉的拮抗菌共培养基质中番茄发病率死亡率为20.00%，高于不接种终极腐霉的处理，而常规菇渣基质对照中，由于接种了瘁倒病致病菌，番茄苗死亡率较达到30.67%，高于其它两个处理。以上结果说明，通过在半发酵腐熟中的酒糟基质中通过添加一定的营养助剂，并接种终极腐霉拮抗菌假浅灰链霉菌nmg4进行共培后，对病原菌具有一定的抑制作用，减少瘁倒病害的发生，但与菇渣基质相比，拮抗菌共培养酒糟基质对瘁倒病的防控率较低。
试验结束后，测定番茄幼苗的株高及茎粗，结果如图5和图6所示。采用拮抗菌接种的酒糟共培养基质的两个处理，接种致病菌的拮抗菌共培养酒糟基质中的番茄苗株高要高于不接种病原菌的拮抗菌共培养酒糟基质，但均要大于接种病原菌的常规酒糟基质。经Tukey方差分析表明2个拮抗菌共培养酒糟基质中的番茄苗株高要显著高于常规酒糟基质（P<0.01）。测定番茄苗的茎粗表明，接种病原菌的拮抗基质中苗的茎粗要显著大于接种病原菌的拮抗菌共培养基质和常规基质。说明病原菌终极腐霉不仅容易造成幼苗瘁倒病的发生，而且对番茄幼苗的生长具有一定的抑制作用，而拮抗菌nmg4不仅能够降低瘁倒病的发病率而且对番茄幼苗的生长具有一定促进作用，这一结果与菇渣基质育苗结果相一致。
综上所述，半发酵腐熟的菇渣或酒糟通过添加一定的营养助剂再与拮抗菌假浅灰链霉菌共培养后制备基质，能够有效发挥其拮抗作用，减少番茄苗期瘁倒病发病率，番茄苗的株高和茎粗有所增加，表现出一定的促生长作用；病原菌终极腐霉不仅容易造成幼苗瘁倒病的发生，而且对番茄幼苗的生长具有一定的抑制作用；半发酵腐熟的菇渣与酒糟基质相比，拮抗菌共培养菇渣制备的基质对瘁倒病的防控率更优。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  浙江省农业科学院
 
<120>  假浅灰链霉菌及其微生物菌剂和应用
 
<130>  2015
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  1472
<212>  DNA
<213>  假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）
 
<400>  1
ggcgaggggg gtcgcgcact atatcatgca agtcgaacga tgaaccactt cggtggggat     60
 
tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct gcactctggg acaagccctg    120
 
gaaacggggt ctaataccgg atactgatca tcttgggcat ccttggtgat cgaaagctcc    180
 
ggcggtgcag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt gaggtaatgg ctcaccaagg    240
 
cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac tgggactgag acacggccca    300
 
gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg    360
 
acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg gaagaagcga    420
 
aagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac    480
 
gtagggcgcg agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggcttgtcgc    540
 
gtcggttgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcag tcgatacggg caggctagag    600
 
ttcggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa    660
 
caccggtggc gaaggcggat ctctgggccg atactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg    720
 
agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cggtgggcac taggtgtggg    780
 
cgacattcca cgtcgtccgt gccgcagcta acgcattaag tgccccgcct ggggagtacg    840
 
gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggcg gagcatgtgg    900
 
cttaattcga cgcaacgcga agaaccttac caaggcttga catacaccgg aaaaccctgg    960
 
agacagggtc ccccttgtgg tcggtgtaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc   1020
 
gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gtcccgtgtt gccagcaggc   1080
 
ccttgtggtg ctggggactc acgggagacc gccggggtca actcggagga aggtggggac   1140
 
gacgtcaagt catcatgccc cttatgtctt gggctgcaca cgtgctacaa tggccggtac   1200
 
aatgagctgc gataccgtga ggtggagcga atctcaaaaa gccggtctca gttcggattg   1260
 
gggtctgcaa ctcgacccca tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc agcattgctg   1320
 
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca cgtcacgaaa gtcggtaaca   1380
 
cccgaagccg gtggcccaac cccttgtggg agggagctgt cgaaggtggg actggcgatg   1440
 
ggacgaagtc gtagctatgt gtccctccgc ca                                 1472
 
 

Claims (7)

1.一种假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4，其特征在于，于2015 年02 月04日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10520。
2.利用权利要求1 所述假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4制备的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液体或固体菌剂，由假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4和及其培养物组成；其活性成分为假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4菌体和它的胞外代谢产物。
3.如权利要求2 所述的微生物菌剂，其特征在于，其内含有的假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4的活菌数大于1.0×108 cfu/g或等于1.0×108 cfu/ml。
4.一种如权利要求2 或3所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌株活化培养：将分离的假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4菌株斜面保藏物接种到PDA斜面，实施斜面活化培养；
（2）液体培养基扩培，获取种子液；
（3）将扩培后的对数期种子液，按照2%的接种量接种至共培养基质中，充分搅拌混匀后，在28℃培养5-7d，培养结束后用于育苗试验。
5.一种如权利要求4所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述共培养基质包括半发酵腐熟的酒糟或菇渣，并加入10%的麸皮和1%的酵母膏，调节含水率至40%-50%。
6.一种如权利要求1 所述的假浅灰链霉菌（Streptomyces pseudogriseolus）nmg4在番茄苗期瘁倒病的应用。
7.一种如权利要求2所述的微生物菌剂在防治番茄苗期瘁倒病上的应用。
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