CN104906557B - P311蛋白在治疗皮肤创面中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学治疗技术领域，具体涉及P311蛋白在治疗皮肤创面中的用途。本发明属于生物医学治疗技术领域，具体涉及P311蛋白在治疗皮肤创面中的用途。本发明从调控创面愈合中的肌成纤维细胞入手，发现了新的特异调控蛋白P311蛋白。本发明发现的P311蛋白将会为促进创面愈合、预防瘢痕形成提供一种新的治疗策略，将为烧伤患者、糖尿病足患者以及外科手术患者等具有皮肤创面的患者带来福音，具有广阔的应用和市场前景。

Description

P311蛋白在治疗皮肤创面中的用途

技术领域

本发明属于生物医学治疗技术领域，具体涉及P311蛋白在治疗皮肤创面中的用途。

背景技术

创伤、烧伤、手术等引起的皮肤创面是最常见的临床问题之一。如何有效促进创面愈合、避免瘢痕形成是治疗皮肤创面的关键。但由于对创面愈合和瘢痕形成的机制不甚清楚，导致对创面和瘢痕的治疗效果十分有限。目前认为，肌成纤维细胞在创面正常愈合和瘢痕形成中发挥关键作用：肌成纤维细胞产生的强大收缩力可以促进创面的快速闭合，但是如果肌成纤维细胞活性持续升高，则会导致瘢痕形成。虽然创周的成纤维细胞是肌成纤维细胞的来源之一，但近几年的研究表明，基底层的表皮干细胞也可能通过向肌成纤维细胞转分化的方式参与到创面修复。此外，上皮间质转化也是瘢痕形成和肿瘤恶化的主要机制之一。因此，调控表皮干细胞向肌成纤维细胞的转分化，可能是促进创面愈合和防治瘢痕形成的一种新的治疗策略。

目前临床上用于治疗皮肤创面的药物，大致可分为抗感染和生长因子两类。其发挥促进创面愈合的机制也不同：抗感染药物和炎性细胞刺激因子等以调控炎症反应为主，表皮生长因子以调控表皮细胞为主，碱性成纤维细胞生长因子以调控成纤维细胞为主。但仍未有特异性调控肌成纤维细胞，尤其是表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化的药物。

发明内容

本发明的目的是为皮肤创面愈合提供一种新的治疗策略。

本发明的技术方案是发现一种特异调控表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化的药物，其主要活性成分是P311蛋白。

进一步的，所述P311蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述编码P311蛋白的核甘酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了促进皮肤创面愈合的药物，其特征在于：主要活性成分是P311蛋白。

进一步的，所述P311蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述编码P311蛋白的核甘酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了P311蛋白在制备特异调控表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化的药物中的用途。

本发明还提供了P311蛋白在制备创面修复药物中的用途。

SEQ ID No.1P311蛋白的氨基酸序列：

mvyypelfvw vsqepfpnkd megrlpkgrl pvpkevnrkk ndetnaaslt plgsselrsprisylhff

SEQ ID No.2编码P311蛋白的核甘酸序列：

atggtttatta cccagaactc tttgtctggg tcagtcaaga accatttcca aacaaggacatggagggaag gcttcctaag ggaagacttc ctgtcccaaa ggaagtgaac cgcaagaaga acgatgagacaaacgctgcc tccctgactc cactgggcag cagtgaactc cgctccccaa gaatcagtta cctccactttttttaa

本发明的P311蛋白可通过常规的蛋白表达和纯化技术获得。用于传送药物的载体可以是凝胶，也可以是生物敷料，也可以是经过基因改造后的细胞载体，这些载体可通过商业化途径购得，也可根据标准的制作流程获得。搭载所述P311蛋白的各种药物载体，只需按照常规使用，无需特殊操作，本领域的临床医生能够结合本产品特点正确使用。

首先，通过组织病理学技术对烧伤早期患者标本检测，发现P311蛋白的分布与表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化发生的部位一致，均在新生表皮中(图1)。然后，通过腺病毒转染使体外培养的人和小鼠表皮干细胞高表达P311蛋白，证实P311可促进表皮干细胞向肌成纤维细胞的转分化(图2、3)。最后，在建立P311野生型和敲基因小鼠浅II°烧伤动物模型的基础上，发现P311敲除后表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化下降，伤口愈合速度也下降(图4、5)。综上，发明人发现并证实了P311蛋白可以促进表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化，进而加速烧伤创面愈合，防治瘢痕形成。

本发明的有益效果：本发明通过对烧伤患者标本检测、细胞实验和动物实验发现并证实了P311蛋白可以促进表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化，进而加速烧伤创面愈合，防治瘢痕形成。本发明从调控创面愈合中的肌成纤维细胞入手，发现了新的特异调控蛋白P311蛋白。本发明发现的P311蛋白将会为促进创面愈合、预防瘢痕形成提供一种新的治疗策略，将为烧伤患者、糖尿病足患者以及外科手术患者等具有皮肤创面的患者带来福音，具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1、烧伤患者皮肤中表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化标志物和P311的分布特点。A为烧伤患者连续切片的HE(苏木素伊红)染色和免疫荧光染色。肌成纤维细胞标志α-平滑肌肌动蛋白标记为红色，表皮干细胞标志角质蛋白19标记为绿色，细胞核DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)标记为蓝色。B为间质细胞标记Vimentin在表皮和真皮中的表达，Vimentin标记为红色，细胞核DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)标记为蓝色。C为P311蛋白在烧伤患者新生表皮(左)和正常皮肤(中)的表达，褐色为阳性区域，蓝色为苏木素复染后的细胞核。PBS代替一抗，作为阴性对照组(右图)。

图2 P311促进体外培养的人表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化。P311腺病毒转染人表皮干细胞72小时。A、免疫荧光染色观察α-平滑肌肌动蛋白和表皮标志物上皮细胞钙粘蛋白的表达。B、α-平滑肌肌动蛋白单阳性和上皮细胞钙粘蛋白单阳性细胞比例。**，P<0.01，与空载体组相比。

图3 P311促进体外培养的小鼠表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化。P311腺病毒转染小鼠表皮干细胞72小时。免疫荧光染色观察α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白和上皮细胞钙粘蛋白的表达。

图4 P311敲除小鼠烧伤伤口愈合减慢。A、P311野生型和敲基因小鼠浅II°烧伤后，大体观察伤口愈合规律。B、定量分析伤口面积的变化规律。C、形态定量分析表皮间距。*，P<0.05，与野生型小鼠相比；**，P<0.01，与野生型小鼠相比。D、形态定量分析新生表皮长度。*，P<0.05，与野生型小鼠相比；**，P<0.01，与野生型小鼠相比。

图5 P311敲除小鼠伤口中表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化现象减少。A、HE(苏木素伊红)染色观察伤口细胞形态变化。B、免疫荧光染色观察波形蛋白在表皮和真皮中的表达，波形蛋白标记为红色，细胞核DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)标记为蓝色。C、免疫荧光染色观察α-平滑肌肌动蛋白在表皮和真皮中的表达，α-平滑肌肌动蛋白标记为红色，细胞核DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)标记为蓝色。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面通过实例对本方面进行具体的描述。本申请中未明确记载的实验步骤和条件，则采用常规的实验步骤和条件。苏木素伊红染色、免疫荧光染色、免疫组织化学染色均参考《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社)和《组织和细胞培养技术》(人民卫生出版社)。

实施例1 P311蛋白和表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化标志物在烧伤患者伤口中的分布特点

收集热烧伤后15天内的患者伤口标本，常规福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片。一张用于HE染色，发现新生表皮处的细胞成梭形，并且与相邻细胞连接松弛(图1A)。一张用于角质蛋白19和α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色，发现新生表皮处基底层出现角质蛋白19和α-平滑肌肌动蛋白双阳性细胞以及α-平滑肌肌动蛋白单阳性细胞(图1A)。一张用于波形蛋白免疫荧光染色，发现新生表皮基底层出现散在的波形蛋白单阳性细胞(图1B)。α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白异位出现在表皮干细胞分布的部位，提示在烧伤创面愈合过程中，存在表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化。一张用于P311免疫组化，发现正常皮肤中不表达P311，而烧伤后P311高表达于新生表皮处，与表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化的部位一致(图1C)。提示，在烧伤创面愈合过程中P311可能参与了表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化。

实施例2 P311对体外培养的人和小鼠表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化的影响

细胞培养和处理方式：利用经典的两步消化法和差速贴壁法分离并培养1日龄小鼠和18-24岁人包皮的表皮干细胞，利用CD71和CD49f流式鉴定表皮干细胞纯度为95％以上。实验分为P311高表达组和空载体组，原代表皮干细胞达到70％汇合时，分别转染已构建好的P311腺病毒表达载体和Myc空载体(两种载体根据SEQ ID No.2设计，委托重庆金麦生物技术有限公司构建合成)，24h后观察转染比例并换液，72h后检测各项指标。

P311对人表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化的影响：相差显微镜观察细胞由立方形变为长梭形，免疫荧光染色发现P311高表达后35.16％的人表皮干细胞表达α-平滑肌肌动蛋白，与对照组相比显著升高(3.06％)；而上皮细胞钙粘蛋白阳性细胞比例为21.73％，显著低于对照组(62.57％)(图2A/B)。因此，P311可以促进人表皮干细胞向肌成纤维细胞的转分化。

P311对小鼠表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化的影响：相差显微镜观察细胞由立方形变为长梭形，免疫荧光染色发现P311高表达的表皮干细胞α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞数目和波形蛋白阳性细胞数目明显升高，而上皮细胞钙粘蛋白阳性细胞数目下降(图3)。因此，P311可以促进小鼠表皮干细胞向肌成纤维细胞的转分化。

综上，本实施例证实了P311蛋白可以促进人和小鼠表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化。

实施例3 P311敲除小鼠烧伤伤口愈合规律和表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化水平

小鼠浅II°烧伤动物模型的建立：成年雄性P311野生型和敲基因小鼠(Gregory ATaylor教授馈赠，美国杜克大学医学教研室，敲除序列如SEQ ID No.2)，体重20g左右，提前2天常规备皮脱毛，腹腔注射35mg/kg 1％戊巴比妥钠麻醉，使用YLS-5Q台式超级控温烫伤仪(购自济南益延科技发展有限公司)在小鼠背部制作两个烫伤伤口，致伤条件为：烫头面积：2cm²，烫头温度：80℃，持续时间：3s，施加压力：500g，伤口位于后正中线，上下两个伤口距离1.5cm。HE染色发现整个表皮细胞和部分真皮乳头层细胞核嗜碱性改变，发生细胞核溶解现象，符合浅II°烫伤典型病理改变。

小鼠伤口愈合规律观察：每日使用数码相机高清拍照，直至伤后7天(图4A)，ImageJ软件测量每日伤口面积变化，发现P311敲除小鼠伤口愈合速度减慢，伤后5天和7天的伤口面积分别为初始面积的94％和67％，显著高于P311野生型小鼠(伤后5、7天分别为69％和50％)(图4B)。HE染色后形态定量发现，伤后7天P311敲除小鼠伤口的上皮间距为9.88mm，显著高于P311野生型小鼠(6.02mm)，而新生上皮长度为1.55mm，显著低于野生型小鼠(2.40mm)(图4C)。因此，P311蛋白可能促进烧伤伤口的愈合。

小鼠伤口表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化水平检测：伤后7天取材，常规固定和石蜡包埋。HE染色发现，P311野生型小鼠新生表皮中梭形细胞和与基底膜脱离的细胞数目明显高于P311敲除组(图5A)。免疫荧光染色发现，P311敲基因小鼠新生表皮中波形蛋白蛋白和α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达明显低于P311野生型小鼠，且表皮较薄(图5B/C)。因此，P311敲除小鼠中表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化下降。

综上，本实施例从体内验证了P311蛋白可能通过促进表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化来促进伤口愈合，证实了P311蛋白在伤口愈合中的重要作用。

Claims (1)

1.P311蛋白在制备特异调控小鼠和人体表皮干细胞向肌成纤维细胞转分化的药物中的应用，所述P311蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。