CN104902881A - 包含金属微粒的静电结合型囊泡 - Google Patents
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Abstract
一种包含金属微粒的囊泡,其具有膜,所述膜由以下的(a)或(b)的第一聚合物与以下的(c)或(d)的第二聚合物形成(其中不包括(b)与(d)的组合),该膜为所述聚合物中的阳离子性链段和阴离子性链段的一部分交联而成的。第一聚合物:(a)具有不带电亲水性链段和阳离子性链段的嵌段共聚物I、(b)具有阳离子性链段的氨基酸聚合物I;第二聚合物:(c)具有不带电亲水性链段和阴离子性链段的嵌段共聚物II、(d)具有阴离子性链段的氨基酸聚合物II。
Description
技术领域
本发明涉及包含金属微粒的囊泡,其为水溶性、且由带电的聚合物形成。
背景技术
已知一级结构受到精密控制的高分子能够自发产生组装从而形成高级结构体。作为其具体例子可列举出胶束、囊泡等结构体。这样的经高分子的自组装而成的结构体可以进行多样的分子设计,在高分子本来具有的性质的基础上,还可以成为具备新的功能的结构体。研究在以生物医学、材料科学为首的各种领域中利用这样的经高分子的自组装而成的结构体。
例如,非专利文献1中公开了使具有不带电亲水性链段和带电性链段的嵌段共聚物(例如聚乙二醇(PEG)-聚阴离子)、与和前述带电性链段带相反电荷的共聚物(例如聚阳离子)自组装而成的囊泡。通过该方法,仅将两种聚合物水溶液进行混合,就可以简便地制造包含直径统一为100-400nm的尺寸的单片静电结合性膜的囊泡。另外,根据专利文献1和专利文献2,仅混合两种聚合物水溶液不仅可以简便地制造囊泡,还可以通过交联得到稳定化的囊泡。
另一方面,也有将金属微粒应用于生物医学领域、光学领域等的报告。例如,专利文献3、专利文献4中,金纳米杆用于将近红外光用作探针的新型光谱分析的材料、或基于双光子发光的肿瘤细胞等的图像用途、进一步利用光热转换功能而用所产生的热杀灭肿瘤细胞等的光热治疗用途。对于包含金属微粒的自组装的结构体,非专利文献2中评价使用包埋了金纳米颗粒的脂质体进入细胞内。另外,非专利文献3中,将内包有金胶体的脂质体对小鼠进行给药,通过透射型电子显微镜(以下记为“TEM”。)观察从而确认金胶体存在于移植肿瘤组织中、血管附近。
但是,非专利文献1中并没有包含金属微粒的静电结合型囊泡的记载,专利文献1中作为空囊泡的空隙部内的被内包物质例而列举出能够分散于水的金属纳米颗粒,但是却没有记载在囊泡的静电结合性膜(囊泡膜)内插入金属纳米颗粒。专利文献3、专利文献4中有使用金属微粒应用于生物医学领域、光学领域的报告,但没有非专利文献1、专利文献1、专利文献2中记载的囊泡那样内包化合物的功能。非专利文献2、非专利文献3中记载了在脂质体中封入金属微粒并进入细胞内、以颗粒水平解析脂质体在小鼠体内的行为,但未记载金属微粒会稳定地存在而不从脂质体中放出。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开WO2011/145745号
专利文献2:国际公开WO2011/014942号
专利文献3:日本特开2010-53111号公报
专利文献4:日本特开2011-63867号公报
非专利文献
非专利文献1:J.Am.Chem.Soc.,2010,132(5),1631-1636
非专利文献2:nanomedicine,2010,6(1),161-169
非专利文献3:J.Electron Microsc.(Tokyo),2011,60(1),95-99
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种包含金属微粒的囊泡,其为水溶性、且由带电的聚合物形成,尤其提供的是囊泡膜内包含金属微粒的囊泡。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究,结果发现,不仅能够简便地制作包含金属微粒的囊泡,而且在生物体内的环境下金属微粒也不会从囊泡中放出而稳定地存在于囊泡膜内,从而完成了本发明。
即本发明为包含金属微粒的囊泡,其具有膜,所述膜由以下的(a)或(b)的第一聚合物与以下的(c)或(d)的第二聚合物形成(其中不包括(b)与(d)的组合),该膜为第一聚合物中的阳离子性链段与第二聚合物中的阴离子性链段的一部分交联而成的。
第一聚合物:
(a)具有不带电亲水性链段和阳离子性链段的嵌段共聚物I
(b)具有阳离子性链段的氨基酸聚合物I
第二聚合物:
(c)具有不带电亲水性链段和阴离子性链段的嵌段共聚物II
(d)具有阴离子性链段的氨基酸聚合物II
发明的效果
本发明的囊泡即使在生物体内的环境下也能够稳定地存在、能够在囊泡膜内封入药物等。尤其,囊泡膜内包含金属微粒的囊泡可以稳定地保持该金属微粒。
附图说明
图1为实施例1中制备的金胶体包埋型囊泡的TEM像。
图2为添加实施例2中制备的金胶体包埋型囊泡后的细胞切片的TEM像。
图3为实施例3中制备的金胶体包埋型囊泡静脉内给药后的小鼠肝脏切片的TEM像。
图4为实施例4中制备的包埋钯胶体的囊泡的TEM像。
图5为实施例5中制备的包埋铂胶体的囊泡的TEM像。
图6为实施例6中制备的包埋金纳米杆的囊泡的TEM像。
图7为包埋金胶体的囊泡的小鼠的血中浓度相对于给药量的比例的经时图。
图8为内包金胶体的脂质体的小鼠的血中浓度相对于给药量的比例的经时图。
图9为加入了包埋金胶体的囊泡和氯仿作为温度标记的试样的反斯托克斯、斯托克斯散射的拉曼光谱。实线表示Au(+)、虚线表示Au(-)。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式的例子进行详细说明。
1.概要
本发明人等发现,通过使用包含带正电的链段和带负电的链段的二个聚合物,并将其与金属微粒混合,从而可以简便地制作包含金属微粒的囊泡。另外,本发明人等发现,在生物体内的环境下,金属微粒不会从囊泡中放出而能够稳定地存在。本发明是基于这些发现而完成的。
本发明的囊泡在其制造中不需要使用有机溶剂、可以有利地用于生物材料的领域、药物传递系统(DDS)。另外,囊泡膜的内侧具有空间(中央空隙),可以封入大量化合物等物质,因此,可以有利地用于生物体内物质和药物的转送载体、将中央空隙作为酶的反应场所的反应微粒等。进而,在生理盐水、血清的存在下,可以稳定地保持其结构,可以赋予该囊泡膜半透性等多样的功能。因此,本发明的囊泡可以有利地用作结构稳定性、环境敏感性优异的生物材料或药物传递系统。
本发明的囊泡在前述囊泡的特征的基础上,还可以有利地用于将近红外光用作探针的新型光谱分析的材料、或者基于双光子发光或X射线的肿瘤细胞等的图像用途、或利用光热转换功能来用所产生的热杀灭肿瘤细胞等的光热治疗用途、进而用于以TEM观察的探针等、生物医学、材料、光学、和工业用途。
本说明书中,“囊泡”是内部具有空隙且被囊泡膜封闭的基本结构体的含义。
本说明书中,只要没有特别限定,作为基团或基团的一部分的“烷基”或“烷氧基”这样的词是基团为直链状、支链状或环状的烷基或烷氧基的含义。另外,例如称作“C1-12烷基”时的“C1-12”是该烷基的碳数为1~12个的含义。
本发明中,作为“C1-12烷基”,可列举出:甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、癸基、十一烷基等。“C1-6烷基”可列举出:甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。
本说明书中,只要没有特别限定,“芳基”是苯基、萘基、蒽基、或芘基等的含义。
本说明书中,“卤素原子”是氟原子、氯原子、溴原子、或碘原子的含义。
本说明书中,烷基“任选被取代”是烷基上的1个或1个以上氢原子可以被1个或1个以上取代基(相同或不同均可)取代的含义。取代基的最大数可以取决于烷基上的可取代的氢原子的个数来决定对本领域技术人员是显而易见的。对于烷基以外的基团,“任选被取代”也与上述解释相同。
此处,“任选被取代”时的取代基选自由卤素原子、芳基、羟基、氨基、羧基、氰基、甲酰基、二甲缩醛化甲酰基、二乙缩醛化甲酰基、C1-6烷氧基羰基、C2-7酰基酰胺基、三C1-6烷基硅氧烷基(此处,C1-6烷基可以相同也可以不同)、硅氧烷基和甲硅烷基氨基组成的组。
2.囊泡
本发明的囊泡的特征之一在于,其为水溶性、且包含由带电的聚合物的相互作用而形成的囊泡膜。
本发明的囊泡具有由以下第一聚合物与第二聚合物形成的囊泡膜(其中不包括(b)与(d)的组合)。该囊泡膜是第一聚合物中的阳离子性链段与第二聚合物中的阴离子性链段的一部分交联而成的。
第一聚合物:
(a)具有不带电亲水性链段和阳离子性链段的嵌段共聚物I
(b)具有阳离子性链段的氨基酸聚合物I
第二聚合物:
(c)具有不带电亲水性链段和阴离子性链段的嵌段共聚物II
(d)具有阴离子性链段的氨基酸聚合物II
其中,该囊泡膜优选不具有硫化物基团等硫化物结构。
另外,本发明的囊泡膜的外侧和内侧优选为亲水性。即,优选的是,本发明的囊泡的囊泡膜具有包含外层、中间层和内层的三层结构,外层和内层由不带电亲水性链段构成,中间层由一部分交联的阳离子性链段与阴离子性链段构成。即,优选的是:在本发明的囊泡的由第一聚合物与第二聚合物构成的囊泡膜中,第一聚合物和第二聚合物的不带电亲水性链段位于囊泡膜的外侧(内层、外层)、一部分交联的阳离子性链段与阴离子性链段位于囊泡膜的内侧(中间层)。
本发明的囊泡的形状通常为球状。另外,本发明的囊泡的粒径只要是中空结构就没有特别的限定,优选为10μm以下,更优选为50nm~1μm。
本发明的囊泡为在中间层形成了聚离子复合物(PIC)的内质网。因此,本发明的囊泡也称作“PICsome”。
3.链段
以下,对构成本发明的囊泡的链段进行说明。
(1)带电性链段
第一聚合物包含的带电性链段和第二聚合物包含的带电性链段可以带相互相反的电荷,本发明中,第一聚合物包含的带电性链段为阳离子性链段、第二聚合物包含的带电性链段为阴离子性链段。
另外,本发明中,使用多胺作为阳离子性链段时,向多胺加入酸可以使其带正电。加入的酸的种类根据囊泡的用法等适宜决定。
根据本发明优选的方式,第一聚合物的阳离子性链段用下述式(1)表示。
上述式(1)中,R0表示氢原子、乙酰基、三氟乙酰基、丙烯酰基、或甲基丙烯酰基,R1、R2分别独立地表示-(CH2)3NH2或-CONH(CH2)s-X,此处,s为0~20的整数,X为-NH2、吡啶基、吗啉基、1-咪唑基、哌嗪基、4-(C1-6烷基)-哌嗪基、4-(氨基C1-6烷基)-哌嗪基、吡咯烷-1-基、N-甲基-N-苯基氨基、哌啶基、胍基、二异丙基氨基、二甲氨基、二乙氨基、-(CH2)tNH2、或-(NR9(CH2)o)pNHR10,此处,R9表示氢原子或甲基,R10表示氢原子、乙酰基、三氟乙酰基、苄氧基羰基、-C(=NH)-NH2、或叔丁氧基羰基,o为1~15的整数,p为1~5的整数,t为0~15的整数,m为1或2,a1和a2分别为0~5000的整数、b1和b2分别为0~5000的整数、且a1+a2+b1+b2为2~5000,“/”符号表示各单体单元的排列顺序为任意顺序。
进而,根据本发明更优选的方式,上述式(1)中,X为-NH2或胍基,s为2~8的整数,o为1~10的整数,R0为氢原子,a1和a2分别为0~200的整数、b1和b2为0~200的整数、且a1+a2+b1+b2为10~200。
本发明中,第一聚合物形成具有阳离子性链段的氨基酸聚合物I时,阳离子性链段可以用上述式(1)表示,该R0的相反侧的单个末端可列举为-NH(CH2)k-1CH3、-NH-(CH2)k-1-C(三键)CH(k为1以上的整数)等,优选为-NH(CH2)3CH3。
本发明的一个方式中,上述氨基酸聚合物I包含阳离子性链段。
另外,根据本发明优选的方式,第二聚合物的阴离子性链段用下述式(2)表示。
上述式(2)中,R0表示氢原子、乙酰基、三氟乙酰基、丙烯酰基、或甲基丙烯酰基,m为1或2,c、d分别为0~5000的整数、且c+d为2~5000。
进而,根据本发明更优选的方式,上述式(2)中,R0为氢原子,c、d分别为0~200的整数、且c+d为10~200。
本发明中,第二聚合物形成具有阴离子性链段的氨基酸聚合物II时,阴离子性链段可以用上述式(2)表示,该R0的相反侧的单个末端可列举出-NH(CH2)w-1CH3、-NH-(CH2)w-1-C(三键)CH(w为1以上的整数)等,优选为-NH(CH2)3CH3。
本发明的一个方式中,上述氨基酸聚合物II包含阴离子性链段。
(2)不带电亲水性链段
不带电亲水性链段为不带电且具有亲水性性质的聚合物链段。此处“不带电”是指链段整体为中性。作为例子,可列举出链段不带有正/负电荷的情况。另外,即使链段在分子内带有正/负电荷时,只要链段整体的电荷被中和至局部的有效电荷密度不高、不妨碍由自组装形成囊泡的程度,则也属于“不带电”。另外,“亲水性”是指对水性介质显示溶解性。
作为嵌段共聚物包含的不带电亲水性链段,例如可列举出以聚乙二醇为首的聚亚烷基二醇、或聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚(2-正丙基-2-噁唑啉)、聚(2-异丙基-2-噁唑啉)等聚(2-噁唑啉),还可列举出多糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)、等电点为7附近的肽、蛋白质、和它们的衍生物等。通过包含上述不带电亲水性链段,嵌段共聚物在水溶液中稳定地存在而不会缔合、沉淀,可以有效地构建囊泡。进而,通过由上述的包含不带电亲水性链段的嵌段共聚物进行构建,囊泡可以保持会在水溶液中稳定的结构。
根据本发明优选的方式,第一聚合物和第二聚合物的不带电亲水性链段为聚乙二醇和/或聚(2-异丙基-2-噁唑啉),优选为聚乙二醇。使用聚乙二醇作为不带电亲水性链段在对囊泡赋予生物适应性上有利。
使用聚乙二醇作为不带电亲水性链段时,聚乙二醇的分子量优选为500~15000,更优选为1000~5000。使用嵌段共聚物中具有上述分子量的不带电亲水性链段在与形成胶束相比更优先形成囊泡方面是有利的。
4.嵌段共聚物
(1)具有阳离子性链段的嵌段共聚物I
根据本发明优选的方式,具有阳离子性链段的嵌段共聚物I用下述式(3)表示。
上述式(3)中,R0表示氢原子、乙酰基、三氟乙酰基、丙烯酰基、或甲基丙烯酰基,R1、R2分别独立地表示-(CH2)3NH2或-CONH(CH2)s-X,此处,s为0~20的整数,X为-NH2、吡啶基、吗啉基、1-咪唑基、哌嗪基、4-(C1-6烷基)-哌嗪基、4-(氨基C1-6烷基)-哌嗪基、吡咯烷-1-基、N-甲基-N-苯基氨基、哌啶基、胍基、二异丙基氨基、二甲氨基、二乙氨基、-(CH2)tNH2、或-(NR9(CH2)o)pNHR10,此处,R9表示氢原子或甲基,R10表示氢原子、乙酰基、三氟乙酰基、苄氧基羰基、-C(=NH)-NH2、或叔丁氧基羰基,o为1~15的整数,p为1~5的整数,t为0~15的整数,R3表示氢原子或任选被取代的直链或者支链的C1-12烷基,R4表示-(CH2)gNH-、且g为0~5的整数,e为5~2500的整数,m为1或2,a1和a2分别为0~5000的整数、b1和b2分别为0~5000的整数、且a1+a2+b1+b2为2~5000,“/”符号表示各单体单元的排列顺序为任意顺序。
另外,根据本发明更优选的方式,上述式(3)中,X为-NH2或胍基,s为2~8的整数、o为1~10的整数,R0为氢原子,R3为甲基,a1和a2分别为0~200的整数、b1和b2为0~200的整数、且a1+a2+b1+b2为10~200、e为10~300的整数。
(2)具有阴离子性链段的嵌段共聚物II
另外,根据本发明优选的方式,具有阴离子性链段的嵌段共聚物II用下述式(4)表示。
上述式(4)中,R0表示氢原子、乙酰基、三氟乙酰基、丙烯酰基、或甲基丙烯酰基,R3表示氢原子或任选被取代的直链或者支链的C1-12烷基,R4表示-(CH2)gNH-、且g为0~5的整数,f为5~2500的整数,m为1或2,c、d分别为0~5000的整数、且c+d为2~5000。
根据本发明更优选的方式,上述式(4)中,R0为氢原子,R3为甲基,c、d分别为0~200的整数、且c+d为10~200,f为10~300的整数。
5.交联
本发明的囊泡膜是第一聚合物中的阳离子性链段和第二聚合物中的阴离子性链段的一部分交联而成的膜。
交联时,在适当的缩合剂存在下,例如阳离子性链段的侧链末端的氨基与阴离子性链段的侧链末端的羧基之间形成酰胺键从而可以使两链段交联,但阳离子性链段、阴离子性链段的交联位置、交联时利用的官能团的种类、交联的键合形式并不限定于此。另外,不限定于阳离子性链段与阴离子性链段间的交联,在本发明中也包含阳离子性链段间、或阴离子性链段间交联而成的膜、以及混合存在有这些交联的膜。
使用交联剂时,对交联剂的种类没有限制,可以根据囊泡的用途、第一聚合物和第二聚合物的种类、其它膜成分的种类等进行适宜选择,从有效进行交联且提高囊泡内包物质的稳定性的观点来看,优选与第一聚合物和第二聚合物的带电性链段具有的带电性基团(例如氨基等阳离子基团、羧基等阴离子基团)反应而不与被内包物质发生反应的交联剂。作为交联剂的具体例子,可列举出:交联氨基的交联剂(例如,戊二醛、辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐(dimethyl suberimidate dihydrochloride:DMS)、二甲基-3,3’-二硫双丙酰亚胺酸(dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate:DTBP))、使氨基与羧基缩合来进行交联的交联剂(例如,1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropy)carbodiimide:EDC)),优选戊二醛、EDC等,特别优选EDC。另外可以单独使用1种交联剂,也可以按任意组合以及比率来使用2种以上交联剂。
使用交联剂时,只要是本领域技术人员就可以根据交联剂的性质或要进行交联的基团的性质等适宜设定交联剂的量。例如,在使氨基与羧基缩合来进行交联的交联剂的情况下,相对于羧基或氨基可以使用0.05~20当量、优选0.1~20当量,例如0.1、0.5、1.0、5.0或10当量。
6.包含金属微粒的囊泡的制造
本发明的囊泡的制造方法、阳离子性链段与阴离子性链段的最佳混合条件等详细内容在前述专利文献中也有公开,如本发明这样地制造包含金属微粒的囊泡时,例如可以通过向包含第一聚合物和第二聚合物的混合液中添加金属微粒来实现,或者通过向第一水溶液和第二水溶液中的任一者或两者中预先添加金属微粒从而制备它们的混合溶液这样的简便方法来实现,发现此时金属微粒仅选择性地聚集于囊泡膜。尤其,即使本发明的囊泡在囊泡膜内包含金属微粒时,囊泡膜以外的部分存在金属微粒也无妨。
根据本发明优选的方式,金属微粒的金属只要以能够微粒的形式存在就没有特别的限定,作为该金属,例如可列举出:金、银、铂、铜、镍、钯、铱、铑等。金属微粒的尺寸需要小于囊泡的尺寸,金属微粒的形状为球状时,粒径优选为0.1nm~1000nm,更优选为1nm~100nm。金属微粒的形状为棒状时,较长者的长度优选为0.1nm~1000nm,更优选为1nm~100nm。对本发明的金属微粒的形状没有特别的限定,优选的形状为球状或棒状。
另外,意外的发现,如此制造的包含金属微粒的囊泡在生物体内不会分解,保持金属微粒插入囊泡膜的状态而稳定地存在。由此,本发明的囊泡可以有利地用于将近红外光用作探针的新型光谱分析的材料、或基于双光子发光、X射线的肿瘤细胞等的图像用途、或利用光热转换功能来用所产生的热杀灭肿瘤细胞等的光热治疗用途、进一步用作以TEM观察的探针用途、生物医学、材料、光学和工业用途。
实施例
[实施例1]
包埋金胶体的囊泡的制备
<阴离子性链段和阳离子性链段的合成>
阴离子性嵌段共聚物PEG-poly(a,b-天冬氨酸)(PEG-P(Asp);Mn ofPEG=2000,DP(聚合度)of P(Asp)=75)、聚([5-氨基戊基]-a,b-天冬酰胺)(homo-P(Asp-AP);DP of P(Asp-AP)=82)通过文献记载的方法(AnrakuY.et al.,J.Am.Chem.Soc.,2010,132(5),1631-1636)合成。
<包埋金胶体的囊泡的制备>
分别以1mg/mL的浓度将通过上述方法合成的PEG-P(Asp)和homo-P(Asp-AP)制成10mM磷酸缓冲(0mM NaCl、pH7.4)溶液。混合PEG-P(Asp)溶液3mL、homo-P(Asp-AP)溶液4.2mL,搅拌2分钟。PICsome的鉴定通过动态光散射(DLS)测定来进行,平均粒径为126.3nm、多分散指数(PdI)为0.066。在如此制备的PICsome溶液3.5mL中加入0.4mL金胶体溶液(平均粒径8nm、WINERED CHEMICAL CO.LTD,.制造),搅拌2分钟,为了使得到的PICsome的聚离子复合物(PIC)膜交联,加入EDC溶液(10mg/mL),使其相对于-COO-侧链为0.3当量,在室温下使其反应一晩。将反应液通过超滤纯化后,加入Cy3 Mono-reactive Dye Pack(目录编号PA23001、GE Healthcare公司制造)进行荧光标记,用PD-10柱(GE Healthcare公司制造)进行凝胶过滤纯化,制备作为目标的包埋金胶体的囊泡。根据DLS测定,平均粒径为125.8nm、PdI为0.02。
<基于TEM观察的包埋金胶体的囊泡的结构确认>
通过TEM进行由上述工艺制造的包埋金胶体的囊泡的结构确认。制作经纯化的囊泡的切片供于观察。图1为其TEM观察照片。确认来自囊泡的中空结构的特征图像,进一步明确金胶体仅聚集、插入至囊泡膜。而且,超滤液中没有发现金胶体特有的红色,通过TEM像也没有发现游离的金胶体,由此可以判明金胶体意外地具有浓缩在囊泡膜的性质。
[实施例2]
包埋金胶体的囊泡进入细胞内
使用来自人子宫颈癌的HeLa细胞株作为导入细胞。24孔板的孔底放置PET薄膜并接种HeLa细胞,用含有10%FBS的DMEM培养基在37℃、5%CO2存在下进行培养,使细胞附着在PET薄膜上。其后,添加实施例1中制备的包埋金胶体的囊泡,进一步培养24小时。将HeLa细胞/PET薄膜用磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液洗涤2次后,用2.5%戊二醛/PBS进行固定,进行TEM观察。图2为其TEM像。观察到包埋金胶体的囊泡附着在细胞膜表面后,保持其状态并原样进入细胞内的图像。由此可知包埋金胶体的囊泡可以用作解析囊泡的细胞内动态的有效工具。
[实施例3]
包埋金胶体的囊泡的生物体内稳定性评价
<小鼠的脏器分布评价>
将实施例1中纯化的包埋金胶体的囊泡溶液对ICR小鼠的尾静脉内给药,给药后1小时用醚过麻醉使其安乐死,取肝脏浸于2.5%戊二醛/PBS溶液进行固定。
<基于TEM观察的囊泡分布状态确认>
制作经上述固定的肝脏组织的切片,进行TEM观察。图3为其TEM像。可以确认箭头前端为包埋金胶体的囊泡。广泛观察到包埋金胶体的囊泡以颗粒未崩裂的状态存在肝脏中。由此可知,包埋金胶体的囊泡在生物体内条件下也稳定地存在,可以有利地用作追踪囊泡的体内动态的探针。
<小鼠的血中浓度推移>
通过与上述同样的方法,将由Cy5标记的PEG-P(Asp)、homo-P(Asp-AP)、金胶体、EDC10等量制备的包埋金胶体的囊泡对ICR小鼠的尾静脉内给药,经时采血。对得到的血浆样品进行荧光测定,算出囊泡的血浆中浓度。将同样得到的血浆样品用ICP-AES进行测定从而算出血浆中金浓度。图7为血中浓度相对于给药量的比例的经时图。由囊泡和金胶体同样的推移可知,包埋金胶体的囊泡的金胶体未从囊泡中放出而稳定地存在于囊泡中。
[比较例1]
将氢化大豆磷脂酰胆碱、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺钠盐、胆固醇按照组成(mol%)为57:5:38的方式溶解于氯仿/甲醇混合溶液,蒸馏除去溶剂后,真空干燥,向由此得到的液态膜(lipid film)中加入金胶体水溶液(0.4mg/mL)使其水化。用浴槽型超声波装置进行处理,超滤去除未内包的金胶体。在得到的脂质体溶液中添加1,1’-双十八烷基四甲基吲哚三羰花青碘化物(1,1’-dioctadecyltetramethylindotricarbocyanine Iodide)使最终浓度为50μg/mL。一边超滤去除游离的荧光基质一边进行浓缩操作,最后通过0.45μm的过滤器,制备金胶体内包荧光标记脂质体。将制备的脂质体对ICR小鼠的尾静脉内给药,测定血浆样品的荧光和金浓度。图8为血中浓度相对于给药量的比例的经时图。由荧光测定结果算出的脂质体的浓度推移为长时间滞留,与其相对,由ICP-AES测定结果算出的金胶体的浓度推移为在给药后迅速消失。由此可知,金胶体在生物体内从脂质体中迅速被放出。
[实施例4]
包埋钯胶体的囊泡的制备
代替实施例1的金胶体,使用钯胶体溶液(平均粒径43nm、WINEREDCHEMICAL CO.LTD,.制造)时,可以制备包埋钯胶体的囊泡。通过DLS测定,囊泡的平均粒径为74.3nm、PdI为0.19。图4为经纯化的囊泡的TEM(负染)图像。
[实施例5]
包埋铂胶体的囊泡的制备
代替实施例1的金胶体,使用铂胶体溶液(平均粒径20nm、WINEREDCHEMICAL CO.LTD,.制造)时,可以制备包埋铂胶体的囊泡。通过DLS测定,囊泡的平均粒径为143.3nm、PdI为0.115。图5为经纯化的囊泡的TEM(负染)图像。
[实施例6]
包埋金纳米杆的囊泡的制备
代替实施例1的金胶体,使用金纳米杆水分散液(大日本涂料株式会社制造)时,可以制备包埋金纳米杆的囊泡。通过DLS测定,囊泡的平均粒径为136.7nm、PdI为0.046。图6为经纯化的囊泡的TEM(负染)图像。
[实施例7]
CT造影能力评价
制备由PEG-P(Asp)、homo-P(Asp-AP)、金胶体、EDC10等量制备的包埋金胶体的囊泡,评价CT造影能力。制备的囊泡中的金胶体浓度为6mg/mL。使用3D微型X射线CT RmCT(Rigaku Corporation制造)测定制备的溶液的CT值,结果为340HT(水设为0HT时),确认了CT造影能力。包埋金胶体的囊泡在生物体内稳定,因此可以期待作为CT造影剂的应用。
[实施例8]
光热效果的评价
<基于拉曼光谱法的温度测定>
通过拉曼光谱法来观测基于激光照射的包含金属微粒的静电结合型囊泡的温度上升。入射到试样的激光分为:与入射光相同振动频率的瑞利散射和与入射光不同振动频率的拉曼散射。进而,拉曼散射中,将具有比入射光低的振动频率的成分分类为斯托克斯(Stokes)散射、将具有比入射光高的振动频率的成分分类为反斯托克斯(anti-Stokes)散射。接着,由该反斯托克斯、斯托克斯散射光的强度比,通过以下的关系式可以求出试样的温度。
h:普兰克常数、k:波尔兹曼常数、T:绝对温度
ω0+ωk、ω0-ωk:anti-Stokes、Stokes散射光的角频率
拉曼分光装置使用JobinYvon公司制造的T64000。测定体系设为微距模式,一边用小型磁力搅拌器搅拌试验管中加入的试样一边得到光谱。作为激发激光,使用半导体激光(波长:785nm、激光功率:170mA)和、Ar+激光(波长:514.5nm、激光功率:1W)。分光器使用单系多色仪,检测器使用CCD多道检测器。另外,在分光器前配置用于阻断瑞利光的陷波器。
本实施例中制备的囊泡在测定区域不具有适当的拉曼散射,因此使用氯仿作为温度测定用的标记。确认氯仿在拉曼装置的激发激光的波长区域(785、514.5nm)没有较大吸收。
图9表示包埋金胶体的囊泡和加入氯仿作为温度标记的试样的反斯托克斯、斯托克斯散射的拉曼光谱。横轴表示拉曼位移、纵轴表示散射光的强度。拉曼位移表示激发激光的波数与拉曼散射光的波数之差,是物质固有的值。图9中显示的260cm-1、-260cm-1的峰为氯仿的斯托克斯、反斯托克斯散射峰。
<包埋金胶体的囊泡>
514.5nm的激光作为激发源,求出向包埋金胶体的囊泡中加入了氯仿的体系的反斯托克斯散射与斯托克斯散射的强度比为0.286。不添加包埋金胶体的囊泡时为0.235,因此可知通过添加而导致温度上升。
<包埋金纳米杆的囊泡>
768nm的激光作为激发源,向包埋金纳米杆的囊泡中加入了氯仿,求出反斯托克斯散射与斯托克斯散射的强度比为0.578。不添加包埋金纳米杆的囊泡时为0.543,因此可知通过添加而导致温度上升。
产业上的可利用性
本发明的包含金属微粒的囊泡在生物体内可以稳定地保持其结构,例如作为生物材料、生物体内物质、药物的转送载体、将中央空隙作为酶的反应场所的反应微粒、光谱分析的材料、肿瘤细胞等的图像、光热治疗、TEM用的探针在生物医学、材料、光学等领域是有用的。
Claims (14)
1.一种包含金属微粒的囊泡,其具有膜,所述膜由以下的(a)或(b)的第一聚合物与以下的(c)或(d)的第二聚合物形成,其中不包括(b)与(d)的组合,该膜为第一聚合物中的阳离子性链段和第二聚合物中的阴离子性链段的一部分交联而成的,
第一聚合物:
(a)具有不带电亲水性链段和阳离子性链段的嵌段共聚物I、
(b)具有阳离子性链段的氨基酸聚合物I,
第二聚合物:
(c)具有不带电亲水性链段和阴离子性链段的嵌段共聚物II、
(d)具有阴离子性链段的氨基酸聚合物II。
2.根据权利要求1所述的囊泡,其中,金属微粒存在于囊泡的膜内。
3.根据权利要求1或2所述的囊泡,其中,膜具有包含外层、中间层和内层的三层结构,外层和内层由不带电亲水性链段构成,中间层由阳离子性链段和阴离子性链段构成。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的囊泡,其中,不带电亲水性链段为聚乙二醇。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的囊泡,其中,金属微粒的金属为选自由金、银、铂、铜、镍、钯、铱、和铑组成的组中的一种以上金属。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的囊泡,其中,金属微粒的形状为球状或棒状。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的囊泡,其中,所述阳离子性链段用下述式(1)表示,
式(1)中,R0表示氢原子、乙酰基、三氟乙酰基、丙烯酰基、或甲基丙烯酰基,R1、R2分别独立地表示-(CH2)3NH2或-CONH(CH2)s-X,此处,s为0~20的整数,X为-NH2、吡啶基、吗啉基、1-咪唑基、哌嗪基、4-(C1-6烷基)-哌嗪基、4-(氨基C1-6烷基)-哌嗪基、吡咯烷-1-基、N-甲基-N-苯基氨基、哌啶基、胍基、二异丙基氨基、二甲氨基、二乙氨基、-(CH2)tNH2、或-(NR9(CH2)o)pNHR10,此处,R9表示氢原子或甲基,R10表示氢原子、乙酰基、三氟乙酰基、苄氧基羰基、-C(=NH)-NH2、或叔丁氧基羰基,o为1~15的整数,p为1~5的整数,t为0~15的整数,m为1或2,a1和a2分别为0~5000的整数、b1和b2分别为0~5000的整数、且a1+a2+b1+b2为2~5000,“/”符号表示各单体单元的排列顺序为任意顺序。
8.根据权利要求7所述的囊泡,其中,X为-NH2或胍基,s为2~8的整数,o为1~10的整数,R0为氢原子,a1和a2分别为0~200的整数、b1和b2为0~200的整数、且a1+a2+b1+b2为10~200。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的囊泡,其中,阴离子性链段用下述式(2)表示,
式(2)中,R0表示氢原子、乙酰基、三氟乙酰基、丙烯酰基、或甲基丙烯酰基,m为1或2,c、d分别为0~5000的整数、且c+d为2~5000。
10.根据权利要求9所述的囊泡,其中,R0为氢原子,c、d分别为0~200的整数、且c+d为10~200。
11.根据权利要求1~6中任一项所述的包含金属微粒的囊泡,其中,嵌段共聚物I用下述式(3)表示,
式(3)中,R0表示氢原子、乙酰基、三氟乙酰基、丙烯酰基、或甲基丙烯酰基,R1、R2分别独立地表示-(CH2)3NH2或-CONH(CH2)s-X,此处,s为0~20的整数,X为-NH2、吡啶基、吗啉基、1-咪唑基、哌嗪基、4-(C1-6烷基)-哌嗪基、4-(氨基C1-6烷基)-哌嗪基、吡咯烷-1-基、N-甲基-N-苯基氨基、哌啶基、胍基、二异丙基氨基、二甲氨基、二乙氨基、-(CH2)tNH2、或-(NR9(CH2)o)pNHR10,此处,R9表示氢原子或甲基,R10表示氢原子、乙酰基、三氟乙酰基、苄氧基羰基、-C(=NH)-NH2、或叔丁氧基羰基,o为1~15的整数,p为1~5的整数,t为0~15的整数,R3表示氢原子或任选被取代的直链或者支链的C1-12烷基,R4表示-(CH2)gNH-、且g为0~5的整数,e为5~2500的整数,m为1或2,a1和a2分别为0~5000的整数、b1和b2分别为0~5000的整数、且a1+a2+b1+b2为2~5000,“/”符号表示各单体单元的排列顺序为任意顺序。
12.根据权利要求11所述的囊泡,其中,X为-NH2或胍基,s为2~8的整数,o为1~10的整数,R0为氢原子,R3为甲基,a1和a2分别为0~200的整数、b1和b2为0~200的整数、且a1+a2+b1+b2为10~200,e为10~300的整数。
13.根据权利要求1~8中任一项所述的囊泡,其中,嵌段共聚物II用下述式(4)表示,
式(4)中,R0表示氢原子、乙酰基、三氟乙酰基、丙烯酰基、或甲基丙烯酰基,R3表示氢原子或任选被取代的直链或者支链的C1-12烷基,R4表示-(CH2)gNH-、且g为0~5的整数,f为5~2500的整数,m为1或2,c、d分别为0~5000的整数、且c+d为2~5000。
14.根据权利要求13所述的包含金属微粒的囊泡,其中,R0为氢原子,R3为甲基,c、d分别为0~200的整数、且c+d为10~200,f为10~300的整数。
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