CN104888234A - 纳米-金属有机骨架化合物负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

纳米-金属有机骨架化合物负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗肿瘤靶向技术领域，公开了一种纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料为纳米X-金属有机骨架化合物MIL-101，X为硒、钌或金；所述的siRNA为Pgp-siRNA和VEGF-siRNA。本发明利用小干扰RNA逆转肿瘤细胞多药耐药性，以及纳米药物高效、安全的载药功能，合成了具有良好抗肿瘤活性的纳米-金属有机骨架化合物复合材料，并以此作为siRNA的载体，发挥siRNA对多药耐药肿瘤细胞的抑制作用。纳米X-金属有机骨架化合物既作为抑制肿瘤的药物，也作为负载siRNA载体的协同作用，从而应用于制备抗肿瘤药物中。

Description

纳米-金属有机骨架化合物负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤靶向技术领域，特别涉及一种纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
近20年来癌症呈现年轻化及发病率和死亡率“三线”走高的趋势。癌症已成为威胁人类健康和生命的头号杀手，其危险性不容小觑。因此开发高效、低毒、广谱、高选择性的抗癌药物一直是癌症治疗领域的重要课题也是广大科学家的努力方向。
肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的新的生物，常表现为局部肿块，它生长旺盛，常呈持续性生长。化疗药物是临床上常用的抗癌药物，但是给药后化疗药物在杀死癌细胞的同时也将正常细胞一同杀害，这种“敌我不分”、“玉石俱焚”的治疗方法对机体的损伤非常大，不能达到病人延长寿命的健康需求。
目前，联合化疗对恶性肿瘤患者的生存期有积极的临床意义，但肿瘤细胞产生的耐药性又是化疗失败最常见而又最难解决的问题之一。多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的其他多种抗肿瘤药物产生交叉耐药性。因此，如何有效逆转多药耐药性已经成为当今科研面临的迫切问题。
面对目前癌症防治时所存在的局限：①癌症产生耐药性，②非特异性载药及药物的针对性差，③药物缺乏有效的示踪治疗手段等。纳米载药体系的发展及其具有载药靶向运输并能同时实现检测靶向运输和有效治疗的功能为实现癌症早期检测、诊断及治疗带来了新希望。在肿瘤治疗过程中，纳米粒子给药系统可以形成载药纳米复合物，通过靶向分子与癌细胞表面受体的特异性结合，利用恶性肿瘤独特的病理生理学特征选择性地累积在肿瘤部位，实现安全有效的靶向药物运输和治疗。
随着纳米技术的不断发展，纳米材料独特的结构和理化性质使其在癌症的治疗上取得了一定的进展。目前关于金属纳米颗粒作为基因载体的研究报道较多，主要有纳米金颗粒、锰锌铁氧体等。Sandhu等的研究显示，纳米金颗粒作为载体，表面修饰季铵盐后携带正电荷，其承载DNA的转染效率高。唐秋莎等以锰锌铁氧体(复合磁性纳米粒子)为载体，在外界磁场的作用下将pEGFP质粒DNA转入COS-1细胞，从而获得了靶基因的蛋白表达。
至今未发现有关纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料负载siRNA用于制备抑制肿瘤药物的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明利用小干扰RNA(Small interference RNA，siRNA)逆转肿瘤细胞多药耐药性的新策略，以及纳米药物高效、安全的载药功能，合成了具有抗肿瘤活性的纳米硒功能化金属有机骨架化合物，并以此作为siRNA的载体，发挥MDR-siRNA对多药耐药肿瘤细胞的抑制作用。所合成的纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料既具有抑制肿瘤的活性，也作为负载MDR-siRNA的载体，实现化学药物与基因治疗协同抑制肿瘤的作用。
本发明的目的通过下述方案实现：
纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。其中，所述的纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料既作为抑制肿瘤的活性成分，又作为负载siRNA的载体，所述siRNA为具有抑制多药耐药肿瘤细胞生长的Pgp-siRNA和VEGF-siRNA。本发明的纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料负载siRNA协同作用实现抗肿瘤的功效。
所述的纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料优选为纳米X-金属有机骨架化合物MIL-101，X为硒、钌或金。
所述的siRNA为Pgp-siRNA和VEGF-siRNA。
所述的纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料负载siRNA通过以下方法得到：
把纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料溶于水中，搅拌下加入siRNA溶液，37℃，孵育0.5～1.5h，得到纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料负载siRNA。
所用纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料的量与siRNA的摩尔比为5:1～10:1。
所用siRNA溶液浓度优选为20～50μmol/L。所述siRNA溶液中两种siRNA比例可为任意比例，优选摩尔比为1:1。
所述把纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料溶于水中得到溶液的浓度优选为0.5mmol/L。
上述孵育过程中体系pH值优选保持在7～9，优选通过滴加盐酸进行调节，更优选通过滴加0.1mol/L盐酸溶液进行调节。
所述的纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)半胱氨酸(Cys)修饰的MIL-101
将Cys溶解于乙醇中，加入金属有机骨架化合物MIL-101，搅拌反应，得到Cys修饰的MIL-101，分离、超声、洗涤后将其重悬于水中，得到Cys修饰的MIL-101纳米溶液；
(2)制备纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料
往步骤(1)制备的Cys修饰的MIL-101纳米溶液中加入纳米X前体药物溶液，搅拌反应，分离、超声、洗涤、干燥，得到纳米-金属有机骨架化合物(MOF)复合材料；
当X为硒时，所用纳米X前体药物优选为Na2SeO3；
当X为钌时，所用纳米X前体药物优选为RuCl3；
当X为金时，所用纳米X前体药物优选为HAuCl4。
步骤(1)中所用Cys和MIL-101的质量比优选为1.5:1～2:1。
步骤(1)中所述的反应优选为8～12h。
步骤(1)中所述将Cys溶解于乙醇中得到的溶液浓度优选为0.1～0.5mol/L。
步骤(1)中所述的金属有机骨架化合物MIL-101参照G.Férey等(AChromium Terephthalate-Based Solid with Unusually Large Pore Volumes andSurface Area,Science,309,2040(2005))的文献制备得到。
步骤(2)中所述搅拌反应的时间优选为1～3h。
步骤(2)中所用纳米X前体药物和Cys修饰的MIL-101的摩尔比优选为1.5:1～2:1。
步骤(2)中所用纳米X前体药物溶液的浓度优选为0.1～1.0mol/L。
上述制备过程中，所述的洗涤优选为使用PBS洗涤；所述的干燥的条件优选为60℃干燥2天。
本发明的机理为：
本发明利用小干扰RNA(Small interference RNA，siRNA)逆转肿瘤细胞多药耐药性的新策略，以及纳米药物高效、安全的载药功能，合成了具有良好抗肿瘤活性的纳米-金属有机骨架化合物复合材料，并以此作为siRNA的载体，发挥Pgp-siRNA和VEGF-siRNA对多药耐药肿瘤细胞的抑制作用。纳米X-金属有机骨架化合物既作为抑制肿瘤的药物，也作为负载Pgp-siRNA和VEGF-siRNA的载体的协同作用，从而应用于制备抗肿瘤药物中。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明提供纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA用于制备抗肿瘤药物中。本发明得到的纳米-金属有机骨架化合物既作为抑制肿瘤的活性成分，也作为负载siRNA的载体，协同具有抑制多药耐药肿瘤细胞生长的Pgp-siRNA和VEGF-siRNA实现高效抗肿瘤的作用。
(2)本发明制备的纳米-金属有机骨架化合物复合材料，制备过程无需添加其它辅助试剂、产物体系简单，产品的保存和使用方便快捷。
(3)本发明采用的不同的纳米前体药物，制备不同纳米修饰的金属有机骨架化合物复合材料，生物相容性好，有利于增加细胞的药物摄取量，减少外排，从而保证细胞内药物维持在较高水平。
附图说明
图1是实施例1制备得到的SeMIL-101的透视电镜图。
图2是实施例2制备得到的RuMIL-101的透视电镜图。
图3是实施例4中SeMIL-101和RuMIL-101细胞毒性图。
图4是激光共聚焦检测药物在细胞内的定位图。
图5是SeMIL-101、RuMIL-101负载Pgp-siRNA和VEGF-siRNA后的基因沉默效率图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所用原料的纯度只要达到分析纯以上即可，来源均可从市场购得。
实施例1：纳米硒-金属有机骨架化合物复合材料(SeMIL-101)的制备
MIL-101的制备方法参照G.Férey等(A Chromium Terephthalate-BasedSolid with Unusually Large Pore Volumes and Surface Area,Science,309,2040(2005))的文献，具体操作如下。
(1)准确称取2.007g，5mmol Cr(NO3)3·9H2O
(2)准确称取0.823g，5mmol对苯二甲酸
(3)量取5mL 48wt％，5mmol HF
(4)制备金属有机骨架化合物MIL-101，具体步骤如下：
将上述Cr(NO3)3·9H2O、HF、对苯二甲酸和24mL的去离子水加入100mL带有聚四氟乙烯的反应釜中，220℃保持8h。然后1h内降至150℃，接着12h内缓慢降至室温，最后得到含有MIL-101的混合溶液。为了去掉未反应的对苯二甲酸，漏斗过滤该混合物分离出MIL-101粉末，用去离子水和乙醇彻底洗涤该粉末。为了进一步去除残留在MIL-101上的对苯二甲酸杂质，将上述MIL-101粉末浸泡在95％乙醇(95％乙醇，5％水)中80℃静置24h。最终将浸泡过的MIL-101材料在150℃抽真空过夜。
(5)制备还原剂半胱氨酸Cys修饰的MIL-101
将1g Cys溶解于20mL乙醇中，然后加入0.5g步骤(1)中所得的MIL-101固体粉末。室温下搅拌8h，离心、超声、洗涤、干燥，重悬于水中，得到浓度为0.1g/mL半胱氨酸Cys修饰的MIL-101纳米溶液。
(6)将0.1729g Na2SeO3溶解于10mL纯净水配制成0.1mol/L的溶液，并储存在4℃备用；
(7)制备纳米硒-金属有机骨架化合物MIL-101(SeMIL-101)
将10mL步骤(5)中所得Cys修饰的MIL-101纳米溶液和5mL步骤(6)所述纳米硒前体药物Na2SeO3室温下混合搅拌1h，离心、超声、洗涤、干燥，得到纳米硒修饰的金属有机骨架化合物(SeMIL-101)。对所得SeMIL-101进行重悬得到10mL浓度为1mM的纳米溶液，取一滴滴在铜网上，并通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)观察，如图1所示。得到纳米粒子的分散体系，其粒径约为150±10nm。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。
实施例2：纳米钌-金属有机骨架化合物复合材料(RuMIL-101)的制备
(1)金属有机骨架化合物MIL-101的制备同实施例1。
(2)还原剂半胱氨酸Cys修饰的MIL-101制备同实施例1。
(3)将RuCl3溶解于纯净水配制成0.1mol/L的溶液，并储存在4℃备用；
(4)制备纳米钌-金属有机骨架化合物(RuMIL-101)
将10mL步骤(2)中所得Cys修饰的MIL-101纳米溶液和5mL步骤(3)所述纳米钌前体药物RuCl3溶液室温下混合搅拌1h，离心、超声、洗涤、干燥，得到纳米钌修饰的金属有机骨架化合物。对所得RuMIL-101进行重悬得到10mL浓度为1mM的纳米溶液，取一滴滴在铜网上，并通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)观察，如图2所示。得到纳米粒子的分散体系，其粒径约为140±10nm。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。
实施例3：纳米金-金属有机骨架化合物复合材料(AuMIL-101)的制备
(1)金属有机骨架化合物MIL-101的制备同实施例1。
(2)还原剂半胱氨酸Cys修饰的MIL-101制备同实施例1。
(3)将HAuCl4溶解于纯净水配制成0.1mol/L的溶液，并储存在4℃备用；
(4)制备纳米金-金属有机骨架化合物(AuMIL-101)
将10mL步骤(2)中所得Cys修饰的MIL-101纳米溶液和5mL步骤(3)所述纳米金前体药物HAuCl4溶液室温下混合搅拌1h，离心、超声、洗涤、干燥，得到纳米金修饰的金属有机骨架化合物。对所得AuMIL-101进行重悬得到10mL浓度为1mM的纳米溶液，其粒径约为120±10nm。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。
实施例4：纳米-金属有机骨架化合物复合材料的体外实验
本实验选择两种购自ATCC公司的肿瘤细胞株，分别为乳腺癌细胞(MCF-7)和耐紫杉醇乳腺癌细胞癌细胞(MCF-7/T)。
(1)MTT检测纳米细胞毒性
取处于对数生长期的肿瘤细胞，调整活细胞浓度为1×104/mL加于96孔培养板，每孔100μL，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h。待贴壁后，再分别加入不同浓度(10μM、20μM、40μM、80μM)上述实施例制备得到的纳米-金属有机骨架化合物复合材料溶液100μL，对照为等体积PBS溶液，加样组和对照组均设5个复孔，置37℃，5％CO2培养72h，然后加入MTT(5mg/mL)20μL/孔，4h后用移液枪移去上层清液，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL/孔，振荡10min左右，用酶标仪在570nm波长下测定OD值。计算细胞存活率。
细胞存活率(％)＝加药孔的实际OD值/对照孔的OD值；
细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率。
实验结果见图3，本发明的纳米-金属有机骨架化合物复合材料均具有良好的细胞相容性，特别是纳米硒-金属有机骨架化合物复合材料(SeMIL-101)和纳米钌-金属有机骨架化合物复合材料(RuMIL-101)易为人体吸收，在MTT试验中两者对肿瘤细胞均显示出较强的抑制作用，且SeMIL-101的抗肿瘤效果更好。
(2)激光共聚焦扫描显微镜检测药物在细胞内摄取和释放
①纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA的制备：
分别取实施例1～2制备得到的纳米硒-金属有机骨架化合物复合材料(SeMIL-101)和纳米钌-金属有机骨架化合物复合材料(RuMIL-101)，与荧光标记的Pgp-siRNA和VEGF-siRNA(表示为siRNAFAM)溶液(购买于上海吉玛生物有限公司)的混合溶液混合，制备得到纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA(SeMIL-101-siRNAFAM和RuMIL-101-siRNAFAM)；其中复合材料含量和siRNAFAM的负载量可通过调节原溶液的浓度调整。
所述Pgp-siRNA和VEGF-siRNA的序列分别为：
Pgp-siRNA:Sense strand:5’-AAGAAGGAAAAGAAACCAACUdTdT-3’；
Antisense strand:5’-dTdTUUCUUCCUUUUCUUUG GUUGA-3’。
VEGF-siRNA:Sense strand:5’-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAATT-3’；
Antisense strand:3’-TTUAACACUUACGUCUGGUUU-CUU-5’。
②取细胞浓度为1×104/mL的MCF-7/T细胞接种在直径为15mm的共聚焦培养皿中，每个皿加入300μL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。待贴壁后，每个皿中分别加入上述SeMIL-101-siRNAFAM或RuMIL-101-siRNAFAM，使体系中含20μM纳米复合材料和200nM的siRNAFAM，分别在37℃下孵育细胞不同时间间隔(30min和120min)。弃去培养基，细胞用PBS冲洗3次，并用LysoTracker溶酶体荧光探针染色1h后，再次用PBS洗涤3次。使用Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜(Leica Microsystems公司，韦茨拉尔，德国)对样品的荧光进行检测。siRNAFAM(绿色)的激发波长为488nm，并发射范围是490～510nm。溶酶体荧光探针的荧光信号(红)激发为577nm并在590nm处检测。
SeMIL-101-siRNAFAM或RuMIL-101-siRNAFAM在细胞内摄取和释放情况如图4所示。可直观的发现，RuL-SeNPs-siRNAFAM具有更强的细胞吸收能力。MCF-7/T细胞处理30min后，SeMIL-101-siRNAFAM和RuMIL-101-siRNAFAM能很好的穿过细胞膜，并且siRNA、钌配合物在细胞内共定位，120min后，siRNA从载体中释放。
(3)Western Blot检测
通过Western Blot法检测相关耐药蛋白P-gp及血管内皮生长因子VEGF(购买于Gene Tex公司)的表达量。具体方法：以1×105/mL细胞密度接种于内置无菌盖玻片的六孔板中，约24小时后，待细胞覆盖率达30～50％，加入准备好的纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA 100μL。48h后，胰酶消化、收集RNA干扰后细胞PBS洗涤3次；加入含l％蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor cocktail)的细胞蛋白裂解液50μL，振荡混匀，冰浴30min；4℃离心15min，然后将离心后的上清分装，-20℃保存，备用。蛋白分离采用Tricine-SDS-PAGE体系，每泳道以30～60μg蛋白上样(按结果信号强弱定)，电转至硝酸纤维膜1h，5％脱脂牛奶封闭1h后加入不同蛋白的特异性抗体(购自Cell Signaling Technology公司)，4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗(购买于Gene Tex公司)孵育2h，最后用Kodak X-ray化学发光检测仪显色。每次实验均以β-actin作为内参校正。
SeMIL-101-siRNA或RuMIL-101-siRNA在细胞内对相关蛋白的沉默效率如图5所示，对照组中P-gp、VEGF蛋白都具有很高的表达水平，加入SeMIL-101-siRNA或RuMIL-101-siRNA处理后，与对照组相比P-gp或VEGF的表达量明显下调。图5的结果表明，本发明制备的纳米-金属有机骨架化合物复合材料具有良好负载siRNA沉默特定基因的作用，说明本发明的纳米-金属有机骨架化合物复合材料能够作为负载基因药物的载体。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料为纳米X-金属有机骨架化合物MIL-101，X为硒、钌或金；所述的siRNA为Pgp-siRNA和VEGF-siRNA。
2.根据权利要求1所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA通过以下方法得到：
把纳米-金属有机骨架化合物复合材料溶于水中，搅拌下加入siRNA溶液，37℃，孵育0.5～1.5h，得到纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA。
3.根据权利要求2所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所用纳米-金属有机骨架化合物复合材料的量与siRNA的摩尔比为5:1～10:1。
4.根据权利要求2所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述siRNA溶液中两种siRNA摩尔比为1:1。
5.根据权利要求2所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所用siRNA溶液浓度为20～50μmol/L。
6.根据权利要求1所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)半胱氨酸修饰的MIL-101
将半胱氨酸溶解于乙醇中，加入金属有机骨架化合物MIL-101，搅拌反应，得到半胱氨酸修饰的MIL-101，分离、超声、洗涤后将其重悬于水中，得到半胱氨酸修饰的MIL-101纳米溶液；
(2)制备纳米-金属有机骨架化合物复合材料
往步骤(1)制备的半胱氨酸修饰的MIL-101纳米溶液中加入纳米X前体药物溶液，搅拌反应，分离、超声、洗涤、干燥，得到纳米-金属有机骨架化合物复合材料；
当X为硒时，所用纳米X前体药物优选为Na2SeO3；
当X为钌时，所用纳米X前体药物优选为RuCl3；
当X为金时，所用纳米X前体药物优选为HAuCl4。
7.根据权利要求6所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：步骤(1)中所用半胱氨酸和MIL-101的质量比为1.5:1～2:1；步骤(2)中所用纳米X前体药物和半胱氨酸修饰的MIL-101的摩尔比为1.5:1～2:1。
8.根据权利要求6所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：步骤(1)中所述的反应为8～12h；步骤(2)中所述搅拌反应的时间为1～3h。
9.根据权利要求6所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：步骤(1)中所述将半胱氨酸溶解于乙醇中得到的溶液浓度为0.1～0.5mol/L。
10.根据权利要求6所述的纳米-金属有机骨架化合物复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：步骤(2)中所用纳米X前体药物溶液的浓度为0.1～1.0mol/L。
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