CN104878068B - 一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法 - Google Patents
一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104878068B CN104878068B CN201510211652.4A CN201510211652A CN104878068B CN 104878068 B CN104878068 B CN 104878068B CN 201510211652 A CN201510211652 A CN 201510211652A CN 104878068 B CN104878068 B CN 104878068B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- auxin
- identification
- plant tissue
- nitrite ion
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于微生物技术领域,涉及一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法;包括以下步骤:(1)培养基及显色液的配制:所用的培养基为含色氨酸浓度0.5‑2 g/L的改良的R2A分离鉴定培养基,生长素显色液为2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为25~35%的高氯酸混匀;(2)植物组织的预处理:用体积分数为70~75%的乙醇和5~8%的次氯酸钠溶液分别浸泡后,用蒸馏水冲洗;(3)产生长素内生细菌的鉴定;本发明将分离培养基与产生长素鉴定培养基改良整合,在培养基中添加生产生长素的前体色氨酸,在分离菌株后立即施用生长素显色液,在5~10 min内快速辨别出产生长素的内生细菌;简化鉴定工序,操作方便,缩短时间,是一种能简单、快速、有效鉴定产生长素内生菌的方法。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,特别涉及一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法。
背景技术
大量研究证明有些植物内生细菌能够通过生物固氮、产生植物激素等方式,促进宿主植物对营养物质的吸收并促进宿主植物生长发育及其他生理活动((1)Ansari, M.W., D. K. Trivedi, et al. (2013). A critical review on fungi mediated plantresponses with special emphasis to Piriformospora indica on improvedproduction and protection of crops. Plant Physiology and Biochemistry 70:403-410.;(2)Rout, M. E. and T. H. Chrzanowski (2009). The invasive Sorghumhalepense harbors endophytic N2-fixing bacteria and alters soilbiogeochemistry. Plant and Soil 315(1-2): 163-172.;(3)Rout, M. E., T. H.Chrzanowski, et al. (2013). Bacterial Endophytes Enhance Competition byInvasive Plants. American Journal of Botany 100(9): 1726-1737.;(4)Waqas, M.,A. L. Khan, et al. (2012). Endophytic Fungi Produce Gibberellins andIndoleacetic Acid and Promotes Host-Plant Growth during Stress. Molecules 17(9): 10754-10773.)。
因此,现如今,越来越多的学者开始分离筛选植物内生细菌,并研究其生物功能。其中,能够产生促进植物生长的生长素的内生细菌受到包括农业在内众多研究领域的关注。通常,对产生长素的植物内生菌进行筛选的方法需经过分离、纯化培养、再活化、发酵、显色鉴定等过程。其中从再活化、发酵到最后的混合显色鉴定,这个过程极其繁琐,中间需更换多次不同成分的培养基及复杂的取样步骤,而且此过程菌体生长缓慢,往往会消耗大量时间(约5~10天)。因此,传统的植物内生细菌产生长素菌株的筛选方法既繁琐又需耗费大量时间。
那么,一种能够快速、有效地鉴定产生长素的植物内生菌的方法在农业生产及相关科学研究中很有必要。本发明提出了一种简单直观且快速的鉴定产生长素的植物内生细菌的方法,有目的地将能产生生长素的植物内生菌快速分离鉴定出来,能够大大缩短其研究周期、实验成本,使之能尽快被应用到农业作物等实际生产中,能有效提高作物产量,从而极大促进农业生产水平。
发明内容
本发明提出了一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法,能在短时间内有效鉴定出产生长素的植物内生细菌。本发明具有针对性强、周期短的特点。
本发明的技术方案通过以下方式实现的:
一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法,包括以下步骤:
(1)培养基及显色液的配制:
配制含有不同色氨酸浓度的改良的R2A分离鉴定培养基,具体配方如下:称取0.5g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3g磷酸二氢钾、0.024 g无水硫酸镁、0.3 g丙酮酸钠、15 g琼脂粉、0.5~2 g色氨酸,用双蒸水定容至1 L,并调pH至7.2,配成改良的R2A分离鉴定培养基,经115 ℃高压灭菌15 min后,分装倒入9 cm的无菌培养皿中,冷却备用。
配制生长素显色液:2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为25~35%的高氯酸充分混匀。
(2)植物组织的预处理:
选取生长良好的植物组织用蒸馏水冲洗干净后,置于无菌操作台中进行植物组织的表面消毒。由于消毒溶液浓度不够或者消毒时间较短,不能完全杀死植物组织表面的微生物,从而影响内生细菌的筛选;而浓度过高或时间太长,则容易损坏植物组织甚至是杀死植物内生菌,因此,我们选用体积分数为70~75%的乙醇浸泡消毒约1 min,并不断搅拌,倒掉乙醇,加入体积分数为5~8%的次氯酸钠溶液浸泡约6~10 min,并不断震荡,倒掉次氯酸钠溶液,用灭菌蒸馏水冲洗约5次,置于无菌培养皿中,用剪刀将植物组织边缘剪去,露出新鲜切口,并将切口贴在已倒好的改良R2A分离鉴定培养基上。将培养皿封口放入30 ℃的培养箱中暗培养。
(3)产生长素的内生细菌的分离与快速鉴定:
将植物组织切口附近生长出的单一植物内生细菌菌落标上序号,用接种环蘸取不同序号菌体,用划线培养法得到单菌落;之后在长内生细菌的植物组织切口周围喷施生长素显色液,在30 ℃中进行暗反应,观察周围有粉红色物质产生的菌落,此即是可产生长素的内生细菌。
本发明的有益效果:
本发明提供的产生长素的植物内生细菌的分离方法,可以快速、直观、有效鉴定出产生长素的内生细菌。传统的产生长素的植物内生细菌的分离鉴定方法需经历分离、纯化培养、再活化、发酵以及显色鉴定等过程,菌株分离纯化与菌株产生长素能力鉴定两部分被分割进行,即使除去分离纯化步骤,菌株产生长素能力的鉴定步骤仍需耗费约5~10天。而本发明将分离培养基与产生长素鉴定培养基进行改良整合,在培养基中添加了生产生长素的前体——色氨酸,并且在分离菌株后立即采用喷施法施用生长素显色液(传统方法需先对菌株进行发酵,之后对发酵液进一步处理后,才与显色液混合反应),一旦有内生细菌在培养过程分泌生长素,则显色液可迅速与之发生颜色反应,能在5~10 min内快速辨别出能产生长素的内生细菌。
本发明在菌株分离纯化的基础上,同时可进行菌株产生长素能力的鉴定,极大简化了菌株产生长素能力的鉴定工序,最后菌株产生长素能力的鉴定步骤仅在5~10 min内即可完成。
相比传统的分离鉴定方法,本方法不仅由于简化了鉴定工序而使得操作更为方便,也极大缩短了时间(仅大概为传统鉴定方法所用时间的0.1%),还因此可以减少相应的实验成本。所以,本发明是一种能简单、快速、有效地对产生长素内生细菌进行鉴定的方法。
附图说明
图1 为产生长素内生细菌的快速筛选结果,其中(a)为植物内生细菌的生长;(b)为分泌生长素的内生细菌经显色后可在周围形成红色物质。
具体实施方法
下面根据具体实施例和附图内容对本发明更好的说明,以便本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案。
实施例1:
(1)培养基及显色液的配制
配制含有0.05%色氨酸的改良的R2A分离鉴定培养基,具体配方如下:称取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氢钾、0.024 g无水硫酸镁、0.3 g丙酮酸钠、15 g琼脂粉、0.5 g色氨酸,用双蒸水定容至1 L,并调pH至7.2,配成改良的R2A分离鉴定培养基,经115 ℃高压灭菌15 min后,分装倒入9 cm的无菌培养皿中,冷却备用。
配制生长素显色液:2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为25%高氯酸充分混匀。
(2)植物组织的预处理
选取生长良好的植物组织用蒸馏水冲洗干净后,置于无菌操作台中;用体积分数为70%的乙醇浸泡消毒约1 min,并不断搅拌,倒掉乙醇,加入体积分数为5%的次氯酸钠溶液浸泡约6 min,并不断震荡,倒掉次氯酸钠溶液,用灭菌蒸馏水冲洗5次,置于无菌培养皿中,用剪刀将植物组织边缘剪去,露出新鲜切口,并将切口贴在已倒好的改良R2A分离鉴定培养基上。将培养皿封口放入30 ℃的培养箱中暗培养。
(3)产生长素的内生细菌的分离与快速鉴定
将植物组织切口附近生长出的单一植物内生细菌菌落标上序号,用接种环蘸取不同序号菌体,用划线培养法得到单菌落;之后在长内生细菌的植物组织切口周围喷施1 mL生长素显色液,在30 ℃中进行暗反应,观察周围有粉红色物质产生的菌落,即是可产生长素的内生细菌。
(4)若菌株可分泌生长素,暗反应约15 ~20min后,即可在该菌株周围产生较淡的红色物质。
实施例2:
(1)培养基及显色液的配制
配制含有0.1%色氨酸的改良的R2A分离鉴定培养基,具体配方如下:称取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氢钾、0.024 g无水硫酸镁、0.3 g丙酮酸钠、15 g琼脂粉、1 g色氨酸,用双蒸水定容至1 L,并调pH至7.2,配成改良的R2A分离鉴定培养基,经115 ℃高压灭菌15 min后,分装倒入9 cm的无菌培养皿中,冷却备用。
配制生长素显色液:2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为30%高氯酸充分混匀。
(2)植物组织的预处理
选取生长良好的植物组织用蒸馏水冲洗干净后,置于无菌操作台中;用体积分数为75%的乙醇浸泡消毒约1 min,并不断搅拌,倒掉乙醇,加入体积分数为6%的次氯酸钠溶液浸泡约8 min,并不断震荡,倒掉次氯酸钠溶液,用灭菌蒸馏水冲洗5次,置于无菌培养皿中,用剪刀将植物组织边缘剪去,露出新鲜切口,并将切口贴在已倒好的改良R2A分离鉴定培养基上。将培养皿放入30 ℃的培养箱中暗培养。
(3)产生长素的内生细菌的分离与快速鉴定
将植物组织切口附近生长出的单一植物内生细菌菌落标上序号,用接种环蘸取不同序号菌体,用划线培养法得到单菌落;并在长内生细菌的植物组织切口周围喷施1.5 mL生长素显色液,在30 ℃中进行暗反应,观察周围有粉红色物质产生的菌落,即是可产生长素的内生细菌。
(4)若菌株可分泌生长素,暗反应约10~12 min后,即可以发现有内生细菌周围产生清晰的颜色较深的红色物质。
实施例3:
(1)培养基及显色液的配制
配制含有0.2%色氨酸的改良的R2A分离鉴定培养基,具体配方如下:称取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氢钾、0.024 g无水硫酸镁、0.3 g丙酮酸钠、15 g琼脂粉、2 g色氨酸,用双蒸水定容至1 L,并调pH至7.2,配成改良的R2A分离鉴定培养基,经115 ℃高压灭菌15 min后,分装倒入9 cm的无菌培养皿中,冷却备用。
配制生长素显色液:2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为35%高氯酸充分混匀。
(2)植物组织的预处理
选取生长良好的植物组织用蒸馏水冲洗干净后,置于无菌操作台中;用体积分数为75 %的乙醇浸泡消毒约1 min,并不断搅拌,倒掉乙醇,加入体积分数为8%的次氯酸钠溶液浸泡约10 min,并不断震荡,倒掉次氯酸钠溶液,用灭菌蒸馏水冲洗5次,置于无菌培养皿中,用剪刀将植物组织边缘剪去,露出新鲜切口,并将切口贴在已倒好的改良R2A分离鉴定培养基上。将培养皿封口放入30 ℃的培养箱中暗培养。
(3)产生长素的内生细菌的分离与快速鉴定
将植物组织切口附近生长出的单一植物内生细菌菌落标上序号,用接种环蘸取不同序号菌体,用划线培养法得到单菌落;并在长内生细菌的植物组织切口周围喷施2 mL生长素显色液,在30 ℃中进行暗反应,观察周围有粉红色物质产生的菌落,即是可产生长素的内生菌。
(4)暗反应约5~8 min后,即可以发现有内生细菌周围产生清晰的颜色较深的红色物质,如图1所示,图1(a)中的植物组织切口处有植物内生菌的菌落生成;经过显色后,可以很明显地看出在图1(b)中植物组织切口附近菌落周围有明显的红色物质产生(在图中显示为灰暗色,箭头所示),该实验充分说明本发明提供的快速鉴定产生长素的植物内生菌的方法可以快速筛选出产生长素的内生细菌。
Claims (3)
1.一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)培养基及显色液的配制:
配制含有不同色氨酸浓度的改良的R2A分离鉴定培养基和生长素显色液;其中改良的R2A分离鉴定培养基每1L含0.5~2g色氨酸;
(2)植物组织的预处理:
选取生长良好的植物组织用蒸馏水冲洗干净后,置于无菌操作台中进行植物组织的表面消毒;然后用剪刀将植物组织边缘剪去,露出新鲜切口,并将切口贴在已倒好的改良R2A分离鉴定培养基上,将培养皿封口放入30 ℃的培养箱中暗培养;
(3)产生长素的内生细菌的分离与快速鉴定:
将植物组织切口附近生长出的单一植物内生细菌菌落标上序号,用接种环蘸取不同序号菌体,用划线培养法得到单菌落;之后立即在长内生细菌的植物组织切口周围喷施生长素显色液,在30 ℃中进行暗反应,观察周围有粉红色物质产生的菌落,此即是可产生长素的内生细菌;
步骤(1)中所述的改良的R2A分离鉴定培养基配方如下:称取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氢钾、0.024g无水硫酸镁、0.3 g丙酮酸钠、15 g琼脂粉、0.5~2 g色氨酸,用双蒸水定容至1 L,并调pH至7.2,配成改良的R2A分离鉴定培养基,经115℃高压灭菌15 min后,分装倒入无菌培养皿中,冷却备用。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法,其特征在于,步骤(1)中所述的生长素显色液按以下方法配制:2 mL的0.5 M氯化铁溶液以及98 mL的体积分数为25~35%的高氯酸充分混匀。
3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的植物组织的表面消毒具体操作为:用体积分数为70~75%的乙醇浸泡消毒约1 min,并不断搅拌,倒掉乙醇,加入体积分数为5~8%的次氯酸钠溶液浸泡约6~10 min,并不断震荡,倒掉次氯酸钠溶液,用灭菌蒸馏水冲洗后,置于无菌培养皿中。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510211652.4A CN104878068B (zh) | 2015-04-30 | 2015-04-30 | 一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510211652.4A CN104878068B (zh) | 2015-04-30 | 2015-04-30 | 一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104878068A CN104878068A (zh) | 2015-09-02 |
CN104878068B true CN104878068B (zh) | 2017-10-20 |
Family
ID=53945743
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510211652.4A Active CN104878068B (zh) | 2015-04-30 | 2015-04-30 | 一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104878068B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107236673A (zh) * | 2017-06-10 | 2017-10-10 | 安徽科技学院 | 一种快速准确筛选产漆酶真菌的有效方法 |
CN108041096A (zh) * | 2017-12-16 | 2018-05-18 | 李炫颖 | 一种治疗果树腐烂病制剂及其制备方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102643761B (zh) * | 2011-10-08 | 2013-10-23 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一株具有水稻促生功能的根瘤菌及其用途 |
CN104250616A (zh) * | 2014-09-03 | 2014-12-31 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种植物内生菌的分离方法 |
-
2015
- 2015-04-30 CN CN201510211652.4A patent/CN104878068B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104878068A (zh) | 2015-09-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106222118B (zh) | 一株链霉菌属放线菌及其用途 | |
CN102523917B (zh) | 一种草菇栽培方法 | |
CN107022355A (zh) | 一种生物酵素土壤改良剂及其制备方法 | |
CN104761308A (zh) | 一种土壤生态护理微生物菌肥的制备和应用 | |
CN106497838A (zh) | 一种铁皮石斛的复合菌剂 | |
CN111172060A (zh) | 一种具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢杆菌及其制备方法和应用 | |
CN106011022A (zh) | 一种玫瑰黄链霉菌固体发酵培养基及其制备和发酵方法 | |
JP2017532062A (ja) | 有用および機能性微生物を用いた微生物均質抽出物およびその製造方法 | |
CN105238703B (zh) | 一株高产阿魏酸酯酶的枝状枝孢菌及在食醋酿造中的应用 | |
CN104726378A (zh) | 采用强化耐盐微生物菌剂提高盐胁迫草坪草保护酶活性的方法 | |
CN104878068B (zh) | 一种快速鉴定产生长素的植物内生细菌的方法 | |
CN105132472B (zh) | 一种沙链霉菌的用途及香兰素的生产方法 | |
CN106865804B (zh) | 一种中生菌素母药清洁生产方法 | |
WO2020166828A1 (ko) | 가축분뇨액비품질인증(lfqc)에 기초한 액비 생산 방법과 이를 통해 생산된 고품질 액비 및 클로렐라 미생물비료 제조방법 | |
Iqbal et al. | Algal biofertilizer | |
CN111334458B (zh) | 一种生防放线菌及其在生姜茎基腐病或大豆疫病防治方面的应用 | |
CN106148250B (zh) | 一株哥斯达黎加链霉菌属放线菌及其用途 | |
CN104774788B (zh) | 垃圾堆肥中草坪耐盐强化复合微生物菌群的制备方法及应用 | |
RU2069229C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ γ -ИРОНА | |
CN110229757A (zh) | 一株有效促进作物生长的桔绿木霉js84及其研制的生物有机肥 | |
JP2526358B2 (ja) | 土壌病害防除資材 | |
CN108250000A (zh) | 一种新型光合作用促进剂联合氮镁叶面肥的制备方法 | |
CN104628434B (zh) | 一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法 | |
CN105238697B (zh) | 一株牡丹内生真菌及该菌生产丹皮酚的工艺 | |
CN104642018B (zh) | 一种花椒生物防治抗病促生的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |