CN104870641A

CN104870641A - 纤维二糖水解酶的变体

Info

Publication number: CN104870641A
Application number: CN201380063988.XA
Authority: CN
Inventors: R·R·博特; M·福卡拉基; R·霍莫斯; T·卡佩尔; B·R·凯莱门; S·克拉利; I·尼古拉耶夫; M·桑德格伦; J·范利斯豪特; S·范斯提格桑斯
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2015-08-26
Also published as: EP2931890A1; KR20150093729A; US20150315560A1; WO2014093294A1; MX2015007235A; CA2893059A1; BR112015013646A2

Abstract

本发明公开了红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)Cel7A(原为里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I或CBH1)的许多同源物和变体，编码其的核酸以及其产生方法。所述同源物和变体纤维素酶具有家族7A的糖基水解酶的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸残基被置换和/或缺失。

Description

纤维二糖水解酶的变体

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年12月12日提交的美国临时专利申请序列No.61/736,354的优先权权益，并且以引用的方式全文并入本文中。

技术领域

本公开总体上涉及糖苷水解酶变体，特别是纤维二糖水解酶(CBH)的变体。还描述了编码CBH变体的核酸、包含CBH变体的组合物、产生CBH变体的方法以及使用所述变体的方法。

政府权利

本发明是在由美国能源部授予的基金号DE-FC36-08GO18078下、在政府支持下进行的。政府具有本发明的某些权利。

发明背景

纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们能被许多会产生能够将聚合物底物水解成单体糖的胞外酶的微生物(包括细菌、酵母和真菌)降解并且用作能源(Aro等人，2001)。由于对非可再生资源途径的限制，所以纤维素成为主要可再生能源的潜能是巨大的(Krishna等人，2001)。通过生物过程对纤维素的有效利用是克服食品、饲料和燃料短缺的一种途径(Ohmiya等人，1997)。

纤维素酶是水解纤维素(β-1,4-葡聚糖或βD-糖苷键)导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维低聚糖等的酶。传统上将纤维素酶分成三个主要类型：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡萄糖苷酶([β]-D-葡萄糖苷葡糖水解酶；EC3.2.1.21)(“BG”)。(Knowles等人，1987；Shulein，1988)。内切葡聚糖酶主要作用在纤维素纤维的非晶部分，而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素(Nevalainen和Penttila，1995)。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶体系中的存在是结晶纤维素有效溶解所必需的(Suurnakki等人，2000)。β-葡萄糖苷酶起到从纤维二糖、纤维低聚糖和其他葡萄糖苷释放D-葡萄糖单位的作用(Freer,1993)。

已知纤维素酶由大量细菌、酵母和真菌产生。某些真菌会产生能够降解结晶形式的纤维素的整个纤维素酶体系，使得纤维素酶容易通过发酵大量产生。由于许多酵母诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)缺少水解纤维素的能力，因此丝状真菌起特殊作用。(参见例如Aro等人，2001；Aubert等人，1988；Wood等人，1988；和Coughlan等人)。

CBH、EG和BG的真菌纤维素酶分类可进一步扩展以包括每个分类内的多个组分。例如，已从包括里氏木霉(Trichoderma reesei)的多个真菌来源分离了多种CBH、EG和BG，里氏木霉含有2种CBH的已知基因，即，CBH I和CBH II、至少8种EG的已知基因，即，EG I、EG II、EG III、EGIV、EGV、EGVI、EGVII和EGVIII以及至少5种BG的已知基因，即，BG1、BG2、BG3、BG4和BG5。

为了将结晶纤维素有效地转化成葡萄糖，需要包含来自CBH、EG和BG每个分类的组分的整个纤维素酶体系，而分离的组分在水解结晶纤维素方面不太有效(Filho等人，1996)。已观察到来自不同分类的纤维素酶组分之间的协同关系。具体地讲，EG型纤维素酶和CBH型纤维素酶协同地相互作用以有效地降解纤维素。(参见例如Wood，1985)。

在本领域中已知的是，纤维素酶可用于处理纺织品，用于增强洗涤剂组合物的清洁能力，用作软化剂，用于改善棉织物的触感和外观等(Kumar等人，1997)。

已描述了具有改善的清洁性能(美国专利No.4,435,307；英国申请No.2,095,275和2,094,826)并且用于处理织物以改善纺织品的触感和外观的含有纤维素酶的洗涤剂组合物(美国专利No.5,648,263、5,691,178和5,776,757；英国申请No.1,358,599；静岡県立纺织品工业研究所报告(TheShizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute Report),第24卷，第54-61页，1986)。

在本领域中进一步已知的是，纤维素酶可用于将纤维素原料转化成乙醇。这一过程具有许多优点，包括否则将丢弃(例如焚烧或土地填埋原料)的大量原料的易于可利用性。已考虑将主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的其他材料，例如木材、草本作物和农业或城市废物用作乙醇产生的原料。

本领域中有利地是提供纤维二糖水解酶(CBH)变体，其具有改善的用于将纤维素材料转化成单糖、二糖和多糖的特性。变体CBH的改进的特性包括但不限于：改变的温度依赖性活性概况、热稳定性、pH活性、pH稳定性、底物特异性、产物特异性和化学稳定性。

发明内容

本公开描述了具有纤维素酶活性的分离的纤维二糖水解酶(CBH)、编码此类CBH酶的核酸、含有CBH酶编码多核苷酸的宿主细胞(例如表达CBH酶的宿主细胞)、含有CBH酶的组合物以及其产生和使用方法。

因此，本发明的方面提供变体CBH酶，其相对于野生型CBH酶具有改善，其中对于选自以下各项的一种或多种特性来说，所述变体得到显著改善：增大的解链温度(Tm)、PASC水解测定性能、全水解产物PCS(whPCS)测定性能和稀氨玉米秆(daCS)测定性能。在某些实施例中，CBH变体具有所述改善的特性中的至少两种、所述改善的特性中的至少三种或所有所述改善的特性。

本发明的方面提供如以下所述的亲本纤维二糖水解酶(CBH)的分离的变体，其中任何所指示的CBH氨基酸位置均对应于SEQ ID NO:3的氨基酸序列：

1.一种CBH变体，其中所述变体具有纤维素酶活性，与SEQ IDNO:3具有至少80％的序列同一性，并且与亲本CBH酶相比具有显著增大的解链温度(Tm)。

2.根据1所述的CBH变体，其中所述变体包含选自由以下各项组成的组的氨基酸置换：T356L、T246P、T255D、N200R以及其组合，其中各氨基酸置换的位置对应于SEQ ID NO:3。

3.根据2所述的CBH变体，其中所述变体包含T356L置换。

4.根据2或3所述的CBH变体，其中所述变体包含T246P置换。

5.根据2、3或4所述的CBH变体，其中所述变体包含T255D置换。

6.根据2、3、4或5所述的CBH变体，其中所述变体包含N200R置换。

7.根据2至6中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含氨基酸置换，所述氨基酸置换选自由以下各项组成的组：F418M、T246S、T255V以及其组合。

8.根据2至7中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含氨基酸置换，所述氨基酸置换选自由以下各项组成的组：D241N、G234D、P194V、T255I、T255K、T255R以及其组合。

9.根据2至8中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含氨基酸置换，所述氨基酸置换选自由以下各项组成的组：Y247D、T246V、N49P、N200G以及其组合。

10.根据2至9中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含氨基酸置换，所述氨基酸置换选自由以下各项组成的组：T255P、S92T、T41I以及其组合。

11.根据3所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T246S置换。

12.根据3所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T246V置换。

13.根据3、4、11或12所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T255D置换。

14.根据3、4、11或12所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T255V置换。

15.根据3、4、11或12所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T255I置换。

16.根据3、4、10或11所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T255K置换。

17.根据3、4、11或12所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T255R置换。

18.根据3、4、11或12所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T255P置换。

19.根据3、4和11至18中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含D241N置换。

20.根据3、4和11至19中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含G234D置换。

21.根据3、4和11至20中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含P194V置换。

22.根据3、4和11至21中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含N200R置换。

23.根据3、4和11至21中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含N200G置换。

24.根据3、4和11至23中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含N49P置换。

25.根据3、4和11至24中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含Y247D置换。

26.根据3、4和11至25中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含S92T置换。

27.根据3、4和11至26中任一项所述的CBH变体，其中所述变体进一步包含T41I置换。

在某些实施例中，亲本CBH为真菌纤维二糖水解酶1(CBH1)，例如来自以下各项的CBH1：红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)、东方肉座菌(Hypocrea orientalis)、施韦尼兹肉座菌(Hypocrea schweinitzii)、桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)、拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)、康长木霉(Trichoderma konilangbra)、哈茨木霉(Trichoderma harzanium)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、嗜热色串孢(Scytalidiumthermophilum)和柄孢霉(Podospora anderina)(或其相应的无性型、有性型或全型对应形式)，例如选自SEQ ID NO:3至15中的任一者的CBH1。在某些实施例中，亲本CBH与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性，例如至少95％序列同一性。

本发明的方面包括分离的多核苷酸，其包含编码如本文所述的亲本CBH的变体的多核苷酸序列。所述分离的多核苷酸可存在于载体中，例如表达载体或用于多核苷酸增殖的载体。载体可存在于使载体增殖和/或表达如本文所述的所编码CBH变体的宿主细胞中。宿主细胞可为可用于使CBH变体多核苷酸增殖和/或表达所编码CBH变体的任何细胞，例如细菌细胞、真菌细胞等。可采用的合适真菌细胞类型的例子包括丝状真菌细胞，例如以下各项的细胞：里氏木霉、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、哈茨木霉、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、特异腐质霉(Humicola insolens)、灰腐质霉、金孢子菌属(Chrysosporium)、鲁克文金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophila)、粘帚霉属(Gliocladium)、曲霉菌属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、脉胞菌属(Neurospora)、肉座菌属(Hypocrea)、翘孢霉属(Emericella)、黑曲霉、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、棘孢曲霉和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。或者，真菌宿主细胞可为酵母细胞，例如酿酒酵母、裂殖酵母(Schizzosaccharomyces pombe)、西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactus)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、白假丝酵母(Candida albicans)、具柄毕赤酵母(Pichia stipitis)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶罗威亚酵母(Yarrowialipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)、Arxula adeninivorans、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)或多形德巴利酵母(Debaryomyces polymorphus)。

本发明的方面包括产生变体CBH的方法，其包括在由多核苷酸表达(或产生)CBH变体的合适培养基中和合适条件下培养含有编码CBH变体的多核苷酸的宿主细胞，例如其中所述编码CBH变体的多核苷酸存在于表达载体中(即其中CBH变体编码多核苷酸可操作地连接至驱动CBH变体在宿主细胞中的表达的启动子。在某些实施例中，所述方法进一步包括分离所产生的CBH变体。

本发明的方面还包括含有如本文所述的CBH变体的组合物。合适的组合物的例子包括但不限于洗涤剂组合物、饲料添加剂和用于处理(或水解)纤维素底物(例如含有纤维素的纺织品，例如粗斜纹布；含有纤维素的生物质材料，例如已任选地经受水解前加工预处理的木质素纤维素生物质材料的混合物等)的组合物。包含如本文所述的CBH变体和纤维素底物的组合物代表本发明的另外方面。含有CHB变体的洗涤剂组合物包括洗衣洗涤剂和碗碟洗涤剂，其中此类洗涤剂可进一步包含其他组分，例如表面活性剂。合适纤维底物的例子包括但不限于草、柳枝稷、绳草、黑麦草、草芦、芒草、糖加工残余物、甘蔗渣、农业废物、稻草、稻壳、大麦秸、玉米芯、谷草、小麦秸、油菜秸、燕麦秸、燕麦壳、玉米纤维、稿秆、大豆秆、玉米秆、林业废物、木浆、循环利用的木浆纤维、造纸污泥、锯屑、硬木材、软木材和其组合。

本发明的方面包括用于水解纤维底物的方法，其包括使所述底物与如本文所述的变体CBH相接触。在某些实施例中，以不含细胞的组合物形式提供CBH变体，而在其他实施例中，以宿主细胞组合物形式提供CBH变体，其中宿主细胞表达CBH变体。因此，用于水解纤维素底物的方法的某些实施例包括使所述底物与含有CBH变体表达载体的宿主细胞相接触。在某些实施例中，所述方法用于将木质素纤维素生物质转化成葡萄糖，其中在这些实施例的一些中，木质素纤维素生物质选自但不限于：草、柳枝稷、绳草、黑麦草、草芦、芒草、糖加工残余物、甘蔗渣、农业废物、稻草、稻壳、大麦秸、玉米芯、谷草、小麦秸、油菜秸、燕麦秸、燕麦壳、玉米纤维、稿秆、大豆秆、玉米秆、林业废物、木浆、循环利用的木浆纤维、造纸污泥、锯屑、硬木材、软木材和其组合。在某些其他实施例中，纤维素底物为含有纤维素的纺织品，例如粗斜纹布，其中在这些实施例的一些中，所述方法用于处理靛青染色的粗斜纹布(例如在石磨洗过程中)。

本发明的方面包括含有如本文所述的CBH变体的细胞培养上清液组合物。例如，通过以下获得细胞培养上清液：在由多核苷酸表达CBH变体并且将CBH变体分泌到细胞培养上清液中的合适培养基中和合适条件下培养含有编码CBH变体的多核苷酸的宿主细胞。此类细胞培养上清液可包含宿主细胞产生的其他蛋白质和/或酶，包括内源性和/或外源性表达的蛋白质和/或酶。培养基的此类上清液可原样使用，进行最低或不进行产生后处理，所述处理可典型地包括过滤以去除细胞碎片，细胞杀死程序和/或超滤或其他步骤，以富集或浓缩其中的酶。此类上清液在本文中称为“全发酵液”或“全纤维素酶发酵液”。

可通过与一种或多种其他纤维素酶和/或一种或多种半纤维素酶共表达来产生CBH变体。或者，可在没有其他纤维素酶或半纤维素酶的情况下产生CBH变体。在后一种情况下，CBH变体任选地可与一种或多种其他纤维素酶和/或一种或多种半纤维素酶进行物理混合，以形成可用于特定应用的酶组合物，例如可用于水解木质素纤维素生物质底物。

还涵盖含有所需变体纤维素酶的其他组合物以及此类组合物的使用方法。

附图说明

图1A和1B示出来自红褐肉座菌的野生型Cel7A(CBH1)的核酸序列(顶部线)(SEQ ID NO:1)和氨基酸序列(底部线)(SEQ ID NO:3)。

图2A、2B、2C以及2D示出源自红褐肉座菌(SEQ ID NO:3)、东方肉座菌(SEQ ID NO:4)、施韦尼兹肉座菌(SEQ ID NO:5)、桔绿木霉(SEQ IDNO:6)、拟康氏木霉(SEQ ID NO:7)、康长木霉(SEQ ID NO:8)、哈茨木霉(SEQ ID NO:9)、棘孢曲霉(SEQ ID NO:10)、黑曲霉(SEQ ID NO:11)、微紫青霉菌(SEQ ID NO:12)、灰腐质霉(EQ ID NO:13)、嗜热色串孢(SEQ ID NO:14)和柄孢霉(SEQ ID NO:15)的成熟形式的CBH酶的氨基酸比对。顶部的编号指示成熟形式的红褐肉座菌的氨基酸编号。同一、保守和半保守的氨基酸分别用星号(*)、冒号(:)和句点(.)指示。

图3为表达载体pTTT-pyrG-cbh1的示意性图示。

图4示出展现出显著的解链温度变化(ΔTm)的CBH置换变体。ΔTm处于X轴，其中具有显著ΔTm的各特异性变体示出在其ΔTm值处。截距值指示模型对于没有置换的分子(即野生型)的ΔTm的预测。

图5示出在whPCS测定中展现出显著的性能指数变化(ΔPI)的CBH置换变体。ΔPI处于X轴(标记为“whPCS PI的收益”)，其中具有显著ΔPI的各特异性变体示出在其近似ΔPI值处。截距值指示模型对于没有置换的分子(即野生型)的ΔPI的预测。

图6示出在daCS测定中展现出显著的性能指数变化(ΔPI)的CBH置换变体。ΔPI处于X轴(标记为“daCS PI的收益”)，其中具有显著ΔPI的各特异性变体示出在其近似ΔPI值处。截距值指示模型对于没有置换的分子(即野生型)的ΔPI的预测。

图7示出在PASC测定中展现出显著的性能指数变化(ΔPI)的CBH置换变体。ΔPI处于X轴(标记为“daCS PI的收益”)，其中具有显著ΔPI的各特异性变体示出在其近似ΔPI值处。截距值指示模型对于没有置换的分子(即野生型)的ΔPI的预测。

图8A、8B和8C示出来自红褐肉座菌、含有本文所述的氨基酸置换的CBH1氨基酸序列(SEQ ID NO:16)。标号“Xaa”指示可进行不止一个置换的氨基酸位置。在图8C的底部指示这些Xaa位点处的置换(在位置200、246和255处)。置换的氨基酸位置以粗下划线示出。

具体实施方式

现将仅通过参考使用以下定义和实例来详细描述本发明。本文提及的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有序列，明确地以引用方式并入。

除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(《微生物学和分子生物学词典》)，第三版，纽约约翰威立国际出版公司(John Wiley andSons,Ltd.,New York)(2007)；以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY(《哈珀柯林斯生物学词典》)，纽约哈珀永久出版社(Harper Perennial,NY)(1991)为技术人员提供了许多本发明所用术语的通用词典。虽然任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料均可用于实施或测试本发明，但描述的是优选的方法和材料。数值范围包括定义该范围的数字。除非另外指示，否则分别是核酸以5'至3'的取向从左向右书写，而氨基酸序列以氨基至羧基取向从左向右书写。对于本领域的定义和术语，从业者尤其被引导向Green和Sambrook，MolecularCloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第四版)，ColdSpring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)2012和Ausubel FM等，1993。应当理解，本发明并不限于所述的具体方法、规程和试剂，它们可以有所不同。

本文提供的标题并不排除本发明的其他各个方面或实施例，这些方面或实施例都可以借助对说明书做整体参考而获得。相应地，下面就要定义的术语通过将说明书作为一个整体来参考会得到更完全的定义。

本文引述的所有出版物明确地以引用的方式并入本文，用以描述和公开可结合本发明使用的组合物和方法。

I定义

术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是同义词，并且可互换使用。当这些氨基酸序列展现活性时，其可称为“酶”。使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码，其中氨基酸序列是以标准的氨基至羧基末端取向(即N→C)呈现。

术语“核酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，并且可以具有化学修饰。术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。由于遗传密码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。因此，本发明设想了编码CBH或其变体的每种可能的变体核苷酸序列，考虑到遗传密码的简并性，所有这些变体核苷酸序列都是可能的。除非另作指示，否则核酸序列以5'至3'取向呈现。

“纤维素酶(cellulase或cellulase enzyme)”意指细菌或真菌外切葡聚糖酶或外切纤维二糖水解酶和/或内切葡聚糖酶和/或β-葡萄糖苷酶。已知这三种不同类型的纤维素酶协同作用，将纤维素及其衍生物转化成葡萄糖。

如本文中所用的“纤维二糖水解酶”或“CBH”或“CBH酶”或“CBH多肽”被定义为1,4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维四糖(cellotetriose)或任何含有β-1,4-连接葡萄糖的聚合物中1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从链的非还原性末端释放出纤维二糖。根据以下文献所述的程序出于本发明的目的测定纤维二糖水解酶(CBH)活性：Lever等人，1972,Anal.Biochem.(《应用生物化学杂志》)47:273-279和其变化形式(参见下文的实例部分)，和/或van Tilbeurgh等人，1982,FEBS Letters(《欧洲生物化学协会联合会快报》)，149:152-156。

如本文所述的酶、蛋白质、多肽、核酸或多核苷酸的“变体”意指变体是衍生自亲本多肽或亲本核酸(例如原生、野生型或其他限定的亲本多肽或核酸)，与亲本相比包括至少一个修饰或改变。改变/修饰可包括亲本中一个或多个位点处的氨基酸/核酸残基置换成不同的氨基酸/核酸残基、亲本中一个或多个位点处的氨基酸/核酸残基(或一系列氨基酸/核酸残基)缺失、亲本中一个或多个位点处的氨基酸/核酸残基(或一系列氨基酸/核酸残基)插入、氨基和/或羧基末端氨基酸序列或5’或3’核酸序列截短，以及其组合。根据本发明方面的变体CBH酶(有时称为“CBH变体”)保留纤维素酶活性，但在一些具体方面可具有改变的特性，例如改进的特性。例如，变体CBH酶可具有改变的pH最适性、改进的热稳定性或氧化稳定性或其组合，但将保留其特征性纤维素酶活性。

“组合变体”是包含两个或更多个突变，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等置换、缺失和/或插入的变体。

如本文所用的“亲本CBH1酶”或“亲本CBH酶”或“亲本CBH多肽”或其对等词意指成熟形式包含以下氨基酸序列的多肽：与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列，包括与SEQ ID NO:3具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，SEQ ID NO:3提供来自红褐肉座菌的成熟形式的野生型CBH1的氨基酸序列。应注意词语“亲本”和“亲本的”在此语境中可互换使用。在某些方面，亲本CBH酶包含SEQ ID NO:2至8中任一者或其等位基因变体的氨基酸序列，或其具有纤维素酶活性的片段。在某些实施例中，亲本CBH酶是来自真菌和卵菌亚门的丝状真菌。丝状真菌的特征在于营养菌丝体的细胞壁由甲壳素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂的多糖组成，通过菌丝伸长和专性好氧的碳代谢来进行营养生长。丝状真菌亲本细胞可为但不限于以下物种的细胞：木霉属，例如长枝木霉、绿色木霉、康宁木霉、哈茨木霉；青霉属；腐质霉属，包括特异腐质霉和灰腐质霉；金孢子菌属，包括鲁克文金孢子菌；毁丝菌属、粘帚霉属、曲霉菌属、镰孢属、脉胞菌属、肉座菌属例如红褐肉座菌和翘孢霉属。如本文所用，术语“木霉属”(Trichoderma)或“木霉菌”(Trichoderma sp)是指先前已分类为木霉属或目前分类为木霉属的任何真菌菌株。

术语“野生型”是指天然存在的多肽或核酸序列，即不包含人为变异的多肽或核酸序列。

术语“异源”在关于核酸的部分使用时指示核酸包含在自然界中通常不会被发现彼此成相同关系的两个或更多个子序列。例如，核酸典型地重组产生，具有两个或更多个例如来自不相关基因的序列，所述序列经排列制成了新的功能性核酸，例如启动子来自一个源并且编码区来自另一个源。类似地，异源多肽通常将是指在自然界中通常不会被发现彼此成相同关系的两个或更多个子序列(例如融合多肽)。

当关于例如细胞或核酸、多肽或载体使用时，术语“重组”指示细胞、核酸、多肽或载体已通过引入异源核酸或多肽或改变原生核酸或多肽来进行修饰，或细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的该细胞内未发现的基因，或者表达原本会异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。

如本文所用，术语“分离的”或“纯化的”是指从其天然产生的环境中移出的核酸或多核苷酸。一般来讲，在分离的或纯化的核酸或多肽样品中，与关注的一种或多种核酸或一种或多种多肽天然产生的环境相比，其是以增大的绝对或相对浓度存在。

在描述组合物中的组分或材料(例如多肽或多核苷酸)时，术语“富集”意指与产生所富集组合物的起始组合物相比，所述组分或材料在所述组合物中是以相对增大的浓度存在。例如，富集的CBH组合物(或样品)是其中与来自宿主生物体的初始发酵产物相比，CBH的相对或绝对浓度增大的CBH组合物(或样品)。

如本文所用，术语“启动子”是指起到引导下游基因转录的作用的核酸序列。启动子一般将适于靶基因在其中被表达的宿主细胞。启动子连同其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)对于表达给定基因是必要的。一般来讲，转录和翻译调控核酸序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活序列。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控下有活性的启动子。可用于本发明的诱导型启动子的例子为里氏木霉(红褐肉座菌)cbh1启动子，其以寄存编号D86235寄存在GenBank中。在另一方面，启动子为来自红褐肉座菌的cbh II或木糖聚酶启动子。合适启动子的例子包括来自以下基因的启动子：泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg,J.H.等人。(1984)Mol.Cell.Biol.(《分子生物学杂志》)4,2306-2315；Boel,E.等人。(1984)EMBO J.(《欧洲分子生物学学会杂志》)3,1581-1585)、米赫毛霉(Mucor miehei)羧基蛋白酶基因、红褐肉座菌纤维二糖水解酶I基因(Shoemaker,S.P.等人。(1984)欧洲专利申请No.EPO0137280A1)、构巢曲霉trpC基因(Yelton,M.等人。(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)81,1470-1474；Mullaney,E.J.等人。(1985)Mol.Gen.Genet.(《当代遗传学》)199,37-45)、构巢曲霉alcA基因(Lockington,R.A.等人。(1986)Gene(《基因》)33,137-149)、构巢曲霉tpiA基因(McKnight,G.L.等人。(1986)Cell(《细胞》)46,143-147)、构巢曲霉amdS基因(Hynes,M.J.等人。(1983)Mol.Cell Biol.(《分子细胞生物学杂志》)3,1430-1439)、红褐肉座菌xln1基因、红褐肉座菌cbh2基因、红褐肉座菌eg1基因、红褐肉座菌eg2基因、红褐肉座菌eg3基因以及较高等真核生物启动子，诸如SV40早期启动子(Barclay,S.L和E.Meller(1983)Molecular and Cellular Biology(《分子细胞生物学杂志》)3,2117-2130)。

核酸当被置于与另一核酸序列发生功能关系时，该核酸是“有效连接的”。例如，编码分泌前导序列、即信号肽的DNA有效连接到某多肽的DNA的条件是它被表达成参与该多肽的分泌的前体蛋白质；启动子或增强子有效连接至编码序列的条件是它影响该序列的转录；或者核糖体结合位点有效连接至编码序列的条件是它被定位成能促进翻译。一般来讲，“有效连接”意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导区的情况下，被连接的DNA序列是连续的并在阅读框中。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在便利的限制性位点处的连接来实现的。如果不存在这种位点，则按照常规做法使用合成的寡核苷酸接头或连接子。因此，术语“有效连接的”是指核酸表达控制序列(诸如启动子或转录因子结合位点的阵列)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中该表达控制序列引导对应于该第二序列的核酸的转录。

术语“信号序列”、“信号肽”、“分泌序列”、“分泌肽”、“分泌信号序列”、“分泌信号肽”等表示肽序列以及编码此类肽的核酸，所述肽作为较大多肽的组分，引导较大多肽通过合成其的细胞的分泌途径。一般来讲，较大多肽(或蛋白质)通常在运输通过分泌途径的过程中裂解以去除分泌/信号肽，其中多肽的裂解形式(即，没有分泌/信号肽的形式)在本文中通常称为多肽的“成熟形式”。例如，SEQ ID NO:2提供来自红褐肉座菌、具有信号肽的CBH1的氨基酸序列，而SEQ ID NO:3提供来自红褐肉座菌的成熟形式的CBH1(即没有信号肽)的氨基酸序列。

如本文所用，术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指能够将异源DNA片段掺入外来细胞中并在该细胞中表达异源DNA片段的载体。许多原核和真核表达载体是可商购获得的。适当表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围之内。

因此，“表达盒”或“表达载体”是通过重组或合成方式产生的核酸构建体，其具有一系列能让特定核酸在靶细胞内转录的指定核酸元件。可将重组表达盒掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子等序列。

如本文所用，术语“质粒”是指当存在于许多细菌和一些真核生物中时形成染色体外自我复制遗传元件的环状双链(ds)DNA构建体。可出于许多不同目的采用质粒，例如作为克隆载体、增殖载体、表达载体等。

如本文所用，术语“选择性标记”是指核苷酸序列或由其编码的多肽，其能够在细胞中表达，并且其中选择性标记在细胞中的表达赋予从不表达所述选择性标记的细胞分化的能力。在某些实施例中，选择性标记允许表达其的细胞在对应选择剂存在下或在对应选择生长条件下生长。在其他实施例中，选择性标记允许藉助于物理特征，例如通过荧光、免疫反应性差异等，从不表达其的细胞鉴定和/或分离表达其的细胞。

一般来讲，编码变体CBH1的核酸分子将在中等至高度严格条件下与本文中提供为SEQ ID NO:1的野生型序列(原生红褐肉座菌CBH1)杂交。然而，在一些情况中，使用具有显著不同的密码子用法的CBH1编码核苷酸序列，而由CBH1编码核苷酸序列所编码的酶具有与原生酶相同或基本上相同的氨基酸序列。例如，依照特定密码子被宿主利用的频率(通常称为“密码子优化”)，可修饰编码序列以促进CBH1在特定原核或真核表达系统中的快速表达。Te'o等人，(2000)例如描述了对基因进行优化以在丝状真菌中进行表达。此类核酸序列有时称为“简并序列”或“简并的序列”。

如果某核酸序列与参考核酸序列在中等至高度严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则认为这两个序列“选择性杂交”。杂交条件基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最严格”通常发生在约Tm-5℃(比探针Tm低5℃)；“高严格”发生在比Tm低约5-10℃；“中等”或“中间严格”或发生在比探针Tm低约10-20℃；而“低严格”发生在比Tm低约20-25℃。在功能上，最严格条件可用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近严格同一性的序列；而高严格条件用于鉴定与探针具有约80％或更高序列同一性的序列。

中等和高严格杂交条件在本领域是熟知的(参见例如，Sambrook等人，1989，第9和11章，和Ausubel,F.M.等人，1993，所述文献明确地以引用方式并入本文)。高严格条件的例子包括在约42℃下，在50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt's溶液、0.5％SDS和100μg/mL变性载体DNA中杂交，然后在室温下在2×SSC和0.5％SDS中洗涤两次，并且在42℃下在0.1×SSC和0.5％SDS中再洗涤两次。

如本文所用，关于细胞的术语“转化”、“稳定转化”或“转基因”意指该细胞有非原生(异源)核酸序列整合进其基因组中或作为附加型质粒存在，该附加型质粒经过多个传代都得到保留。

如本文所用，术语“表达”是指基于基因的核酸序列而产生多肽的过程。所述过程通常包括转录和翻译二者。

在将核酸序列插入细胞中的语境下的术语“引入”，是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括是指将核酸序列掺入真核或原核细胞，在其中核酸序列可被掺入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转变成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

由此得出术语“所需纤维素酶表达”是指转录和翻译所需纤维素酶基因，其产物包括前体RNA、mRNA、多肽、翻译后加工的多肽。举例来说，针对CBH1表达的测定包括如以下文献中所述的针对CBH1酶的蛋白质印迹、针对CBH1mRNA的RNA印记分析和逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)测定以及内切葡糖聚酶活性测定：Shoemaker S.P.和小BrownR.D.(Biochim.Biophys.Acta,1978(《生物化学与生物物理学报》)，523:133-146)和Schulein(1988)。

术语“宿主细胞”是指这样的细胞，其含有载体，且支持表达构建体的复制和/或转录和/或转录和翻译(表达)。在本发明中使用的宿主细胞可以是原核细胞诸如大肠杆菌(E.coli)或真核细胞诸如酵母、植物、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。在某些实施例中，宿主细胞是丝状真菌。

如本文所用，术语“洗涤剂组合物”是指旨在用在洗涤介质中用于洗涤弄脏的含纤维素织物的混合物。在本发明的上下文中，此类组合物除纤维素酶和表面活性剂外还可包含另外的水解酶、助剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、抗结块剂、掩蔽剂、纤维素酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。

如本文所用，术语“表面活性剂”是指任何在本领域中通常被认为具有表面活性性质的化合物。因此，例如，表面活性剂包括阴离子、阳离子和非离子表面活性剂，诸如一般在洗涤剂中存在的那些。阴离子表面活性剂包括直链或支链烷基苯磺酸盐；具有直链或支链烷基基团或烯基基团的烷基或烯基醚硫酸盐；烷基或烯基硫酸盐；烯烃磺酸盐；和链烷磺酸盐。两性表面活性剂包括季铵盐磺酸盐和甜菜碱型两性表面活性剂。此类两性表面活性剂在同一分子中具有带正电和负电的基团。非离子表面活性剂可包括聚氧化烯醚以及高级脂肪酸链烷醇酰胺或其亚烷基氧加合物、脂肪酸甘油单酯等。

如本文所用，术语“含纤维素织物”是指任何由含棉或不含棉纤维素或含棉或不含棉纤维素共混物制成的缝制或非缝制织物、纱线或纤维，包括天然纤维素材料和人造纤维素材料(诸如黄麻、亚麻、苎麻、人造丝和莱赛尔纤维(lyocell))。

如本文所用，术语“含棉织物”是指由纯棉或棉共混物制成的缝制或非缝制织物、纱线或纤维，包括棉机织物、棉针织品、粗斜纹棉布、棉纱线、原棉等。

如本文所用，术语“石洗组合物”是指用于石洗含纤维素织物的制剂。石洗组合物用于在销售之前，即，在制造过程中修饰含纤维素织物。相反，洗涤剂组合物目的是用于清洗弄脏的衣服而不是在制造过程中使用。

当第一多肽中的氨基酸位置(或残基)被标注为“对等于”第二相关多肽中的氨基酸位置时，这意指第一多肽的氨基酸位置通过以下各项中的一项或多项而对应于第二相关多肽中所标注的位置：(i)一级序列比对(参见以下对序列比对和序列同一性的描述)；(ii)结构序列同源性；或(iii)类似的功能特性。因此，第一CBH酶(或其变体)的氨基酸位置可鉴定为“对等于”(或同源于)第二CBH酶(或甚至多种不同CBH酶)中的氨基酸位置。

一级序列比对：可使用一级氨基酸序列比对法来确定对等氨基酸位置，许多一级氨基酸序列比对法在本领域是已知的。例如，通过比对两种或更多种不同CBH酶的一级氨基酸序列，有可能将一种CBH酶的氨基酸位置编号指定为对等于另一种比对的CBH酶的位置编号。按照这种方式，源于一种CBH酶(例如，SEQ ID NO:3所示的CBH1酶)的氨基酸序列的编号系统可用来鉴别其他CBH酶(例如，SEQ ID NO:4至15中所示的CBH1酶；参见图2)中的对等(或同源)氨基酸残基。

结构性序列同源性：除了使用一级序列比对法确定“对等”氨基酸位置以外，“对等”氨基酸位置还可由在二级和/或三级结构水平测定同源性来限定。例如，对于三级结构已通过x射线结晶学测定的纤维素酶来说，对等残基可限定为与红褐肉座菌CBH1比对后，纤维素酶的特定氨基酸残基的主链原子中的两个或更多个的原子坐标处于0.13nm内并且优选地0.1nm内(N对N、CA对CA、C对C以及O对O)的那些。比对是在使最佳模型定向和定位以给出所讨论的纤维素酶的非氢蛋白质原子的原子坐标与红褐肉座菌CBH1的最大限度重叠后实现的。最佳模型为对在可获得的最高分辨率下的实验衍射数据给出最低R因子的晶体学模型。

类似功能特性：在功能上类似于第二相关多肽的具体残基的第一多肽中的对等氨基酸残基(例如第一纤维素酶和红褐肉座菌CBH1)被限定为第一多肽中的、取某种构象以使得其以某种方式改变、修饰或促成多肽结构、底物结合或催化作用的那些氨基酸，所述方式限定至并且归于第二相关多肽(例如红褐肉座菌CBH1)的具体残基。当已通过x射线结晶学获得第一多肽的三级结构时，第一多肽的在功能上类似于第二多肽的氨基酸残基占据类似位置，其程度为尽管给定残基的主链原子可能不满足基于占据同源位置而论的对等标准，但残基的至少两个侧链原子的原子坐标处于第二多肽(例如红褐肉座菌CBH1)的对应侧链原子的0.13nm内。

关于变体酶(例如CBH变体)的术语“改进的特性”或“改进的性能”等等在本文中被定义为与变体酶相关的、与其相应亲本酶相比得到改进的特征或活性。改善的特性包括但不限于改善的热稳定性或改变的温度依赖性活性概况、所需pH或pH范围内改善的活性或稳定性、改善的底物特异性、改善的产物特异性、以及纤维素酶处理步骤中化学品或其他组分存在下改善的稳定性等等。可使用一种或多种特定测定确定改善的性能，所述测定包括但不限于：(a)表达(蛋白含量确定测定)、(b)PASC水解测定、(c)EG2存在下的PASC水解测定、(d)热孵育后PASC水解测定、(e)全水解产物PCS(whPCS)测定、(f)稀氨玉米芯(daCC)测定以及(g)稀氨玉米秆(daCS)测定。

关于变体蛋白(例如CBH变体)的术语“改进的热稳定性”在本文中被定义为在高温下孵育一段时间后，变体酶相对于亲本酶展现出酶活性保留。此类变体可能或可能不相对于亲本展现出改变的热活性概况。例如，在高温下孵育后，变体可相对于亲本具有改进的再折叠能力。

“改进的产物特异性”意指与亲本酶相比，变体酶展现出改变的产物概况，其中与亲本相比，变体的改变的产物概况是在给定应用中改进。“产物概况”在本文中被定义为由所关注酶产生的反应产物的化学组成。

“改进的化学稳定性”意指在一种或多种化学品存在下孵育一段时间后变体酶展现出酶活性保留，所述化学品在相同条件下降低亲本酶的酶活性。与亲本酶相比，化学稳定性改进的变体更好地能够在此类化学品存在下催化反应。

关于酶的“pH范围”是指酶展现出催化活性的pH值范围。

关于酶的术语“pH稳定的”和“pH稳定性”涉及在预定的时间段(例如，15分钟、30分钟、1小时)内酶在宽泛的pH值范围内保持活性的能力。

“序列同一性百分比”或其语法对等词意指使用比对算法，特定序列与指定的参考序列具有至少一定的氨基酸残基同一性百分比。适用于确定序列相似性的算法的例子是BLAST算法，其描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)215:403-410(1990)。用于进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(<www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov>)公开可获得。该算法涉及首先通过在查询序列中鉴定长度为W的短字串来鉴定高打分序列对(high scoringsequence pair,HSP)，该短字串当与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足某取正值的阈值分数T。这些最初的邻近命中字串充当起点来寻找含有它们的更长的HSP。使命中字串沿进行比较的两条序列的每一条朝两个方向扩展至累积比对分数不能增加为止。命中字串的延伸在以下情况时停止：累积比对分数从最大获得值下降达数量X；累积分数达到零或零以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定该算法的灵敏度和速度。BLAST程序使用的默认值是字长(W)为11，BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》89:10915(1989))，比对(B)为50、期望值(E)为10、M′5、N′-4和双链比较。

BLAST算法然后进行两条序列之间相似性的统计分析(参见例如，Karlin和Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallest sum probability,P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然发生的概率。例如，如果在试验氨基酸序列与蛋白酶氨基酸序列的比较中最小和概率小于约0.1、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001，则认为氨基酸序列与蛋白酶相似。

当对序列同一性百分比有疑问时，以使用默认参数的CLUSTAL W算法进行的比对为准。参见Thompson等人。(1994)Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数为：

II分子生物学

本发明的实施例提供所需纤维素酶(或纤维素酶组合)在所关注宿主细胞、例如丝状真菌中有功能的启动子控制下从纤维素酶编码核酸的表达。因此，本发明依靠重组遗传学领域中的许多常规技术。以上描述了公开合适的重组遗传学方法的例子的基本文本。

本发明设想了本领域已知的任何可将突变引入亲本核酸/多肽的方法。

本发明涉及变体CBH1酶的表达、纯化和/或分离和使用。这些酶可通过重组方法利用本领域已知的多种cbh1基因(例如SEQ ID NO:3至15的cbh1基因，例如来自红褐肉座菌)中的任一种来制备。可采用任何用于引入突变的便利方法，包括定点诱变。如以上所指示，突变(或变异)包括置换、添加、缺失或截短，其将对应于所表达CBH1变体中的一个或多个氨基酸变化。此外，定点诱变和在DNA水平上使表达的多肽中并入氨基酸变化的其他方法可见许多文献，例如Green和Sambrook等人，2012以及Ausubel等人。

通过本领域已知的多种方法制备编码亲本CBH1的氨基酸序列变体的DNA。这些方法包括但不限于通过对早期制备的编码亲本CBH1酶的DNA进行定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒诱变来制备。

定点诱变是一种可采用来制备置换变体的方法。这种技术在本领域是熟知的(参见，例如Carter等人。Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)13:4431-4443(1985)和Kunkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)82:488(1987))。简而言之，在进行DNA的定点诱变时，通过如下方式改变起始DNA：首先将编码所需的突变的寡核苷酸与该起始DNA的单链杂交。杂交之后，使用杂交的寡核苷酸作为引物，并且使用起始DNA的该条单链作为模板，用DNA聚合酶合成完整的第二链。从而将编码所需的突变的寡核苷酸掺入所得的双链DNA。

PCR诱变还适于制备亲本CBH1的氨基酸序列变体。参见Higuchi于PCR Protocols(《PCR方案》)，第177-183页(学术出版社(AcademicPress))，1990)；以及Vallette等人，Nuc.Acids Res.(《核酸研究》)17:723-733(1989)。简而言之，当少量的模板DNA用作PCR中的起始材料时，可使用在序列上与模板DNA中的对应区域稍微不同的引物来产生相对大量的特定DNA片段，所述DNA片段仅在引物不同于模板的位置处与模板序列不同。

另一种用于制备变体的方法—盒诱变—是基于Wells等人，Gene(《基因》)34:315-323(1985)所述的技术。起始材料是包含待突变的起始多肽DNA的质粒(或其他载体)。鉴定待突变的起始DNA中的密码子。所鉴定的突变位点的每侧必须存在唯一的限制性内切核酸酶位点。如果不存在此类限制性位点，那么它们可这样生成：使用上述寡核苷酸介导的诱变方法将它们引入在起始多肽DNA中的适当位置处。在这些位点对质粒DNA进行切割以使其线性化。使用标准程序合成编码限制性位点之间的DNA序列但包含所需的突变的双链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的两条链先单独合成，然后再使用标准技术杂交在一起。该双链寡核苷酸被称为盒。该盒被设计为具有与线性化质粒的末端相容的5'和3'端，使得其可被直接连接至质粒。该质粒现在便含有突变的DNA序列。

作为另外一种选择或除此以外，可确定编码所需纤维素酶的所需的氨基酸序列，并且可通过合成法产生编码此类氨基酸序列变体的核酸序列。

通常可根据纤维素酶的预期用途，对如此制备的一种或多种所需纤维素酶进行进一步修饰。此类修饰可涉及氨基酸序列的进一步改变、与异源多肽的融合和/或共价修饰。

III.变体CBH1多肽和编码其的核酸

在一个方面，提供变体CBH酶。如本文所述，变体CBH酶相对于亲本CBH酶具有一种或多种突变，所述亲本CBH酶与红褐肉座菌CBH1(SEQ ID NO:3)具有至少80％(即，80％或更大)的氨基酸序列同一性，包括与SEQ ID NO:3具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％直至并且包括100％的氨基酸序列同一性。在某些实施例中，亲本CBH为真菌纤维二糖水解酶1(CBH1)，例如来自红褐肉座菌、施韦尼兹肉座菌、东方肉座菌、拟康氏木霉、康长木霉、桔绿木霉、哈茨木霉、棘孢曲霉、黑曲霉、微紫青霉菌、灰腐质霉、嗜热色串孢或柄孢霉的真菌CBH1酶。另外，变体CBH酶具有纤维素酶活性，其中在某些实施例中，变体CBH与亲本CBH相比具有改进的特性(如本文所详述)。野生型、成熟形式的红褐肉座菌CBH1的氨基酸序列示出在图1中。

在某些实施例中，变体CBH酶在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸突变，所述氨基酸位置对应于来自红褐肉座菌的成熟形式的CBH1(SEQ IDNO:3)中的残基F418、T246、T255、D241、G234、P194、N200、N49、Y247、T356、S92和T41。由于根据本发明方面的某些亲本CBH酶可能不具有与来自红褐肉座菌的野生型CBH1相同的氨基酸，因此对应于上述残基的氨基酸位置还可仅仅通过位置编号(即418、246、255、241、234、194、200、49、247、356、92以及41)或用“X”前缀(即X418、X246、X255、X241、X234、X194、X200、X49、X247、X356、X92以及X41)来指定。此处应注意指定与来自红褐肉座菌的CBH1中的特定氨基酸残基对应的氨基酸位置的所有三种途径均是可互换的。

通过亲本氨基酸序列的一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入，而使CBH变体的氨基酸序列不同于亲本CBH氨基酸序列。如果CBH变体的残基(氨基酸)与红褐肉座菌CBH1中的特定残基或该残基的部分是同源的(即，一级结构或三级结构中的位置相对应)或者在功能上是类似的(即，具有相同或相似的功能能力以在化学上或结构上结合、反应或相互作用)，则CBH变体的残基(氨基酸)与红褐肉座菌CBH1的残基对等。如本文所用，编号旨在对应于如图1中所示的成熟CBH1氨基酸序列的编号。

确定同源性的氨基酸序列比对可通过使用“序列比较算法”来确定。用于比较的序列的最佳比对可通过以下方式进行，例如，通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.(《应用数学进展》)2:482(1981)的局部同源算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)48:443(1970)的同源比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)85:2444(1988)的寻找相似性方法、通过这些算法(威斯康星州麦迪逊市575科学路遗传计算小组的威斯康星遗传软件包中(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFAST)的计算机化执行或通过目测或由加拿大蒙特利尔的化学计算小组(ChemicalComputing Group,Montreal Canada)开发的MOE来进行。还参见以上定义部分中提供的对“序列同一性百分比”的说明。

在某些实施例中，变体CBH酶中的一个或多个突变为一个或多个位点处的氨基酸置换，所述位点对应于来自红褐肉座菌的CBH1(SEQ ID NO:3)中的氨基酸位置F418、T246、T255、D241、G234、P194、N200、N49、Y247、T356、S92以及T41，其中在一些实施例中，置换选自下组：F418M、T246S、T255V、D241N、G234D、P194V、T255I、T255K、T255R、N200G、N49P、T246V、Y247D、N200R、T246P、T255D、T356L、S92T、T255P、T41I。所指示位点处上述置换的所有可能的组合(即具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个置换)为本发明的设想实施例，包括但不限于以下：

1.CBH变体，其具有选自以下的任何单一氨基酸置换：F418M、T246S、T255V、D241N、G234D、P194V、T255I、T255K、T255R、N200G、N49P、T246V、Y247D、N200R、T246P、T255D、T356L；

2.根据以上1所述的CBH变体，其具有F418M置换；

3.根据以上1或2所述的CBH变体，其具有T246S置换；

4.根据以上1或2所述的CBH变体，其具有T246P置换；

5.根据以上1或2所述的CBH变体，其具有T246V置换；

6.根据以上1、2、3、4或5所述的CBH变体，其具有T255V置换；

7.根据以上1、2、3、4或5所述的CBH变体，其具有T255I置换；

8.根据以上1、2、3、4或5所述的CBH变体，其具有T255K置换；

9.根据以上1、2、3、4或5所述的CBH变体，其具有T255R置换；

10.根据以上1、2、3、4或5所述的CBH变体，其具有T255D置换；

11.根据以上1、2、3、4或5所述的CBH变体，并且其进一步包含T255P置换；

12.根据以上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所述的CBH变体，其具有D241N置换；

13.根据以上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12所述的CBH变体，其具有G234D置换；

14.根据以上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13所述的CBH变体，其具有P194V置换；

15.根据以上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14所述的CBH变体，其具有N200G置换；

16.根据以上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14所述的CBH变体，其具有N200R置换；

17.根据以上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16所述的CBH变体，其具有N49P置换；

18.根据以上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17所述的CBH变体，其具有Y247D置换；以及

19.根据以上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18所述的CBH变体，其具有T356L置换。

在某些实施例中，如以上所述的变体CBH酶在对应于SEQ ID NO:3的S92和T41的一个或两个氨基酸位置进一步包含另外的氨基酸突变，其中在这些实施例的某些中，一个或多个突变是选自以下的置换：S92T和T41I。

这些另外的突变与以上所述的置换的所有可能的组合为本发明的设想实施例，包括但不限于以下：

20.根据以上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18所述的CBH变体，并且其进一步包含S92T置换；

21.根据以上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19所述的CBH变体，并且其进一步包含T41I置换。

在另一实施方案中，如以上所述的CBH1变体包含另一。

在另一方面，提供编码相对于亲本CBH酶(例如，如以上所述)具有一个或多个突变的变体CBH酶的核酸。在某些实施例中，亲本CBH1与红褐肉座菌CBH1(SEQ ID NO:3)具有至少80％(即80％或更大)的氨基酸序列同一性。在某些实施例中，编码变体CBH酶的核酸与SEQ ID NO:1(不包括编码信号序列的核酸部分)至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％同源/一致。应当理解，由于遗传密码的简并性，多个核酸可编码相同的变体CBH酶。此外，编码如本文所述的变体CBH酶的核酸可被工程化来进行密码子优化，例如以便改进在所关注宿主细胞中的表达。某些密码子优化技术是本领域已知的。

在某些实施例中，变体CBH酶编码核酸在严格条件下与编码CBH的核酸杂交(或与编码CBH的核酸互补)，所述CBH与SEQ ID NO:1(不包括编码信号序列的核酸部分)具有至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％同源性/同一性。

核酸可编码“全长”(“fl”或“FL”)变体CBH酶(包括信号序列)、仅变体CBH酶的成熟形式(缺少信号序列)或变体CBH酶的截短形式(缺少成熟形式的N端或C端部分)。

编码变体CBH酶的核酸可在适于在一种或多种所关注宿主细胞中表达变体CBH酶的载体中与各种启动子和调控子有效连接，如以下所述。

IV.重组CBH1变体的表达

本发明的方面包括与产生编码CBH变体的核酸，含有此类核酸的宿主细胞，通过此类宿主细胞产生CBH变体，以及CBH变体的分离、纯化和/或使用相关的方法和组合物。

因而，本发明的实施例提供已用包含所需CBH变体编码核酸序列的表达载体转导、转化或转染的宿主细胞。例如，用表达载体转染丝状真菌细胞或酵母细胞，所述表达载体具有启动子或生物活性启动子片段或一个或多个(例如，一系列)增强子，其在宿主细胞系中起作用，有效连接至编码所需CBH变体的DNA段，使得CBH变体在所述细胞系中表达。

A.核酸构建体/表达载体

可将编码所需CBH变体的天然或合成多核苷酸片段并入异源核酸构建体或载体中，这些异源核酸构建体或载体能够引入所关注的宿主细胞(例如丝状真菌或酵母细胞)中并在其中复制。本文所公开的载体和方法适用于在宿主细胞中表达所需CBH变体。可使用任何载体，条件是其在引入其的一种或多种宿主细胞中满足所需复制/表达特征(此类特征一般由使用者限定)。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且许多是可商购获得的。克隆和表达载体在以下文献中也有描述：Sambrook等人，1989；Ausubel F M等人，1989和Strathern等人，1981，所述每篇文献明确地以引用方式并入本文。适用于真菌的表达载体描述于van den Hondel,C.A.M.J.J.等人。(1991)见Bennett,J.W.和Lasure,L.L.(编辑)More GeneManipulations in Fungi.(真菌中的更多基因操作)学术出版社，第396-428页中。可通过多种程序将适当的DNA序列插入到质粒或载体(本文统称为“载体”)中。一般来讲，通过标准程序将DNA序列插入到适当的限制性内切核酸酶位点中。此类程序和相关的亚克隆程序被认为是在本领域的技术人员的知识范围内。

包含所需CBH变体的编码序列的重组宿主细胞可通过将包含所需CBH变体编码序列的异源核酸构建体引入所需宿主细胞产生(例如，如以下进一步详细描述)。例如，可根据熟知的重组技术将所选择的所需CBH变体编码序列插入合适的载体中，并用于转化能够表达CBH的丝状真菌。如以上所述，由于遗传密码固有的简并性，编码基本上相同或功能上对等的氨基酸序列的其他核酸序列也可用于克隆和表达所需CBH变体。因此，应理解，编码区中的此类置换属于本发明所涵盖的序列变体。

本发明还包括重组核酸构建体，该构建体包含如上所述的所需CBH变体编码核酸序列中的一种或多种。所述构建体包含其中已正向或反向插入了本发明的序列的载体，例如质粒或病毒载体。

异源核酸构建体可包含如下形式的所需CBH变体编码序列：(i)分离；(ii)与另外的编码序列组合，所述另外的编码序列诸如融合多肽或信号肽编码序列，其中所需CBH变体编码序列为主编码序列；(iii)与非编码序列组合，所述非编码序列诸如内含子和控制元件，诸如启动子和终止子元件，或5'和/或3'非翻译区，其对于合适宿主中的编码序列的表达有效；和/或(iv)载体或宿主环境，其中所需CBH变体编码序列为异源基因。

在本发明的一个方面，采用异源核酸构建体将所需CBH变体编码核酸序列在体外转移到宿主细胞中，例如转移到已确立的丝状真菌和酵母细胞系。可通过产生稳定表达CBH变体的宿主细胞实现所需CBH变体的长期产生。因此，可以得出任何能有效产生稳定的转化株的方法都可用于实施本发明。

合适的载体通常配有编码选择性标记的核酸序列、插入位点和合适的控制元件，例如启动子和终止序列。载体可包含调控序列，包括例如非编码序列，诸如内含子和控制元件，即，启动子和终止子元件或5'和/或3'非翻译区，其有效连接至编码序列，并且能有效地使编码序列在宿主细胞中(和/或在其中通常不表达经修饰的可溶性蛋白质抗原编码序列的载体或宿主细胞环境中)得到表达。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的，其中许多可商购获得和/或描述于Sambrook等人(上文)。

合适启动子的例子包括组成型启动子和诱导型启动子，其例子包括CMV启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、EF-1α启动子、如所述含有tet-on或tet-off系统中的四环素应答元件(TRE)的启动子(ClonTech和BASF)、β肌动蛋白启动子以及可通过添加某些金属盐进行上调的金属硫蛋白启动子。启动子序列是被特定宿主细胞识别以实现表达目的的DNA序列。它有效连接至编码变体CBH1多肽的DNA序列。所述连接包括相对于表达载体中的编码变体CBH1多肽的DNA序列的起始密码子定位启动子，使得所述启动子可驱动CBH变体编码序列的转录/翻译。启动子序列含有介导变体CBH1多肽的表达的转录和翻译控制序列。例子包括来自以下的启动子：黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉(A.oryzae)葡糖淀粉酶、α-淀粉酶或β-葡糖苷酶编码基因；构巢曲酶gpdA或trpC基因；粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)cbh1或trp1基因；黑曲霉或米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶编码基因；红褐肉座菌cbh1、cbh2、egl1、egl2或其他纤维素酶编码基因。

适当的选择性标记的选择将取决于宿主细胞，并且适合不同宿主的标记是本领域熟知的。典型选择性标记基因包括来自构巢曲霉或红褐肉座菌的argB、来自构巢曲霉的amdS、来自粗糙脉孢菌或红褐肉座菌的pyr4、来自黑曲霉或构巢曲霉的pyrG。合适的选择性标记的另外例子包括但不限于trpc、trp1、oliC31、niaD或leu2，其包括在用于转化突变株(如trp-、pyr-、leu-等)的异源核酸构建体中。

此类选择性标记赋予转化株利用通常不被丝状真菌代谢的代谢物的能力。例如，来自红褐肉座菌的amdS基因编码乙酰胺酶这种酶，从而允许转化株细胞以乙酰胺作为氮源生长。选择性标记(例如pyrG)可恢复营养缺陷型突变株在选择性基本培养基上生长的能力，或者选择性标记(例如olic31)可赋予转化株在抑制性药物或抗生素的存在下生长的能力。

使用本领域一般采用的方法将选择性标记编码序列克隆到任何合适的质粒中。合适质粒的例子包括pUC18、pBR322、pRAX和pUC100。pRAX质粒含有来自构巢曲霉的AMA1序列，这使得它可以在黑曲霉中复制。

除非另有指示，否则本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域技术范围内。此类技术在文献中充分阐明。参见，例如，Sambrook等人，1989；Freshney，1987；Ausubel等人，1993；和Coligan等人，1991。

B.用于产生CBH1和变体CBH1酶的宿主细胞和培养条件

在编码CBH1变体的DNA序列已被克隆进DNA构建体后，该DNA用于转化微生物。出于表达根据本发明的变体CBH1的目的要进行转化的微生物可有利地选自多种多样的宿主细胞。提供以下部分作为宿主细胞/微生物的例子并且其不意在限制可用来实施本发明的方面的宿主细胞的范围。

(i)丝状真菌

本发明的方面包括丝状真菌，其已被相对于对应的非转化亲本丝状真菌以能有效引起所需CBH变体产生或表达的方式进行了修饰、选择和培养。

可被处理和/或修饰用于所需纤维素酶表达的亲本丝状真菌的物种的例子包括但不限于木霉属、青霉属、腐质霉属，包括特异腐质霉；曲霉属，包括黑曲霉；金孢子菌属、镰孢属、肉座菌属以及翘孢霉属。

在通常用于培养亲本真菌细胞系的条件下对表达所需CBH变体的细胞进行培养。一般来讲，在含有生理盐和营养素的标准培养基中培养细胞，例如Pourquie,J.等人，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation(纤维素降解生物化学与遗传学)，Aubert,J.P.等人编辑，美国学术出版社，第71-86页，1988年和Ilmen,M.等人，Appl.Environ.Microbiol.(《应用环境微生物学》)63:1298-1306,1997。标准培养条件在本领域是已知的，例如，将培养物在振荡培养器或发酵罐中在28℃下孵育，直到达到所需CBH变体的所需表达水平。

给定丝状真菌的培养条件可见例如科学文献和/或得自真菌的来源，例如美国典型培养物保藏中心(ATCCC)。在真菌生长已确立后，使细胞暴露于能有效引起或允许所需CBH变体表达的条件。

在所需CBH变体编码序列处于诱导型启动子的控制下的情况中，向培养基中以能有效诱导所需CBH变体表达的浓度加入诱导剂，例如糖、金属盐或抗生素。

在一个实施例中，菌株为黑曲霉菌株，它是可用于获得过表达的多肽的有用菌株。例如已知黑曲霉变种泡盛曲霉(A.niger var awamori)dgr246所分泌的分泌型纤维素酶的量提高(Goedegebuur等人，Curr.Genet(2002)41:89-98)。黑曲霉变种泡盛曲霉的其他菌株诸如GCDAP3、GCDAP4和GAP3-4是已知的，Ward等人(Ward,M,Wilson,L.J.和Kodama,K.H.,1993,Appl.Microbiol.(《应用环境微生物学》)Biotechnol.(《应用微生物学与生物技术》)39:738-743)。

在另一个实施例中，菌株为里氏木霉菌株，它是可用于获得过表达的多肽的有用菌株。例如，已知Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.(《应用环境微生物学》)Biotechnol.(《应用微生物学与生物技术》)20:46-53(1984)描述的RL-P37所分泌的纤维素酶的量提高。RL-P37的功能对等物包括里氏木霉菌株RUT-C30(ATCC No.56765)和菌株QM9414(ATCC No.26921)。预期这些菌株也可用于过表达变体CBH。

若需要在不存在潜在的有害的原生纤维素酶活性的情况下获得所需CBH变体，有用的是获得这样的宿主细胞菌株，其在引入含有编码所需CBH变体的DNA片段的DNA构建体或质粒之前，已使一个或多个纤维素酶基因缺失。可通过美国专利No.5,246,853和WO 92/06209中所公开的方法以任何便利方式制备此类菌株，所述专利的公开内容据此以引用方式并入本文。需要时，通过在缺少一个或多个纤维素酶基因(例如宿主细胞内源性CBH1基因)的宿主微生物中表达所需CBH变体，简化了鉴定和随后的纯化程序。

可通过本领域已知的方法将某种形式的待缺失或破坏的所需基因插入质粒，来完成基因缺失。然后在一个或多个适当的限制性酶位点(在所需的基因编码区的内部)切割该缺失质粒，并且用选择性标记替换基因编码序列或其部分。来自待缺失或破坏的基因的基因座的侧翼DNA序列(例如在约0.5至2.0kb之间)可保留在选择性标记基因的任一侧上。适当的缺失质粒将通常具有存在于其中的唯一限制性酶位点，以使得含有该缺失基因的片段(包括侧翼DNA序列)和选择性标记基因能作为单一线性块被去除。

在某些实施例中，编码所需CBH变体的DNA的不止一个复本可存在于宿主菌株中，以有利于CBH变体的过度表达。例如，宿主细胞可具有整合到基因组中的所需CBH变体的多个复本，或者包括能够在宿主生物体中自主复制的质粒载体。

(ii)酵母

本发明还设想到使用酵母作为产生所需CBH的宿主细胞。已在酿酒酵母的多个菌株中表达了编码水解酶的若干个其他基因。这些基因包括编码以下各物的序列：两个内切葡聚糖酶(Penttila等人，1987)、两个纤维二糖水解酶(Penttila等人，1988)和一个来自里氏木霉的β-葡糖苷酶(Cummings和Fowler,1996)、来自黑酵母菌(Aureobasidlium pullulans)的木聚糖酶(Li和Ljungdahl,1996)、来自小麦的α-淀粉酶(Rothstein等人，1987)等。另外，编码溶纤维丁酸孤菌(Butyrivibrio fibrisolvens)内-[β]-1,4-葡聚糖酶(END1)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)纤维二糖水解酶(CBH1)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)纤维糊精酶(CEL1)和內孢霉(Endomyces fibrilizer)纤维二糖酶(Bgl1)的纤维素酶基因盒已成功表达在酿酒酵母的实验室菌株中(Van Rensburg等人，1998)。

(iii)其他

进一步设想了在一些实施例中可采用除丝状真菌细胞或酵母细胞以外的宿主细胞表达系统，包括昆虫细胞或细菌细胞表达系统。某些细菌宿主细胞可例如为这样一种，其还为产乙醇菌，诸如工程化的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，其不仅能够表达所关注的一种或多种酶/其一种或多种变体，而且能够代谢某些单体和其他可发酵糖类，从而将其转变成乙醇。可根据使用者对本文所述的CBH变体的需要来选择宿主细胞，并且因此不旨在对所述方面进行限制。

C.将所需CBH编码核酸序列引入到宿主细胞中

本发明还提供经遗传修饰以包含外源提供的所需CBH变体编码核酸序列的细胞和细胞组合物。可用克隆载体或表达载体对亲本细胞或细胞系进行遗传修饰(例如，转导、转化或转染)。如上进一步描述，载体可以是例如质粒、病毒粒子、噬菌体等的形式。

本发明的转化方法可导致转化载体的全部或部分稳定整合到宿主细胞的基因组中。然而，还设想到使自主复制的染色体外转化载体得以维持的转化。

可使用任何公知的用于将外来核苷酸序列引入宿主细胞中的程序。这些程序包括使用磷酸钙转染、聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、生物导弹术(biolistics)、脂质体、微注射、质粒载体(plasma vector)、病毒载体和任何其他熟知的用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外来遗传材料引入宿主细胞中的方法(参见，例如，Sambrook等人，上文)。实质上，所使用的特定遗传工程程序应能够将多核苷酸(例如表达载体)成功引入到能够表达所需CBH变体的宿主细胞中。

可使用许多标准转染方法来产生表达大量异源多肽的里氏木霉细胞系。一些公布的用于将DNA构建体引入产纤维素酶的木霉属菌株中的方法包括Lorito、Hayes、DiPietro和Harman，1993,Curr.Genet.(《当代遗传学》)24:349-356；Goldman,Van Montagu和Herrera-Estrella,1990,Curr.Genet.(《当代遗传学》)17:169-174；Penttila、Nevalainen、Ratto、Salminen和Knowles，1987,Gene(《基因》)6:155-164；对于曲霉属，Yelton、Hamer和Timberlake，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)81:1470-1474；对于镰孢属，Bajar、Podila和Kolattukudy，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)88:8202-8212；对于链霉菌属，Hopwood等人，1985,The John InnesFoundation,Norwich,UK；以及对于芽孢杆菌属，Brigidi、DeRossi、Bertarini、Riccardi和Matteuzzi，1990,FEMS Microbiol.Lett.(《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》)55,135-138。用于曲霉菌属的合适转化过程的例子可见Campbell等人。Improved transformation efficiency of A.nigerusing homologous niaD gene for nitrate reductase.(使用硝酸盐还原酶的同源性niaD基因黑曲霉的转化效率改进)Curr.Genet.(《当代遗传学》)16:53-56；1989。

本发明还包括新型和有用宿主细胞，例如丝状真菌(诸如红褐肉座菌和黑曲霉)转化株，用于产生真菌纤维素酶组合物。因此，本发明的方面包括丝状真菌转化株，其包含所需CBH变体编码序列，有时还包括内源性cbh编码序列缺失。

此外，可使包含所需纤维素酶编码核酸序列的异源核酸构建体在体外转录，并且将所得的RNA通过熟知的方法(例如通过注射)引入宿主细胞中。

D.分析CBH1核酸编码序列和/或蛋白表达

为评估已用所需CBH变体编码核酸构建体转化的细胞系对所需CBH变体的表达，可在蛋白水平、RNA水平或通过使用特定针对纤维二糖水解酶活性和/或产生的功能性生物测定进行测定

一般来讲，用来分析所需CBH变体表达的测定包括但不限于使用适当标记的探针(基于核酸编码序列)进行的RNA印迹、斑点印迹(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)或原位杂交，和常规DNA印迹以及放射自显影。

另外，可在样品中直接测量所需CBH变体的产生和/或表达，例如通过针对纤维二糖水解酶活性、表达和/或产生的测定。此类测定描述在例如Becker等人，Biochem J.(《生物化学杂志》)(2001)356:19-30和Mitsuishi等人，FEBS(《欧洲生物化学协会联合会》)(1990)275:135-138，其各自以引用方式明确并入本文中。可使用以下文献中所述的测定来测量CBH1水解分离的可溶性和不可溶性底物的能力：Srisodsuk等人，J.Biotech.(《生物技术杂志》)(1997)57:49-57以及Nidetzky和Claeyssens Biotech.Bioeng.(《生物技术与生物工程》)(1994)44:961-966。可用于测定纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡糖苷酶活性的底物包括结晶纤维素、滤纸、磷酸溶胀纤维素、纤维低聚糖、甲基伞形酯乳糖苷、甲基伞形酯纤维二糖糖苷、邻硝基苯基乳糖苷、对硝基苯基乳糖苷、邻硝基苯基纤维二糖糖苷、对硝基苯基纤维二糖糖苷。

另外，蛋白表达可通过免疫学方法进行评估，所述方法诸如ELISA、竞争性免疫测定、放射性免疫测定、蛋白质印迹、间接免疫荧光测定等等。这些测定中的某些可使用可商购获得的设计来检测CBH酶的试剂和/或试剂盒进行。此类免疫测定法可用来定性和/或定量评估所需CBH变体的表达。这种方法的细节是本领域技术人员知道的，并且许多用于实施这种方法的试剂是可商购获得的。在某些实施例中，可采用对所需变体CBH酶具有特异性、但对其亲本CBH没有特异性的免疫学试剂，例如对CBH置换或CBH变体的融合搭配物具有特异性的抗体(例如N或C末端标记物序列，例如六个组氨酸的标记物或FLAG标记物)。因此，本发明的方面包括使用纯化形式的所需CBH变体来产生对供用于各种免疫测定的所表达多肽特异的单克隆或多克隆抗体。(参见例如Hu等人，1991)。

V.用于富集、分离和/或纯化CBH变体多肽的方法

一般来讲，宿主细胞培养物中所产生的所需CBH变体多肽被分泌到培养基中(产生含有CBH变体的培养物上清液)并且可例如通过从细胞培养基去除不想要的组分来富集、纯化或分离。然而，在一些情况下，所需CBH变体多肽可以细胞形式产生，这就需要从细胞溶解物中回收。可使用本领域技术人员常规应用的技术，从产生该酶的细胞或细胞上清液中收获所需CBH变体多肽。例子包括但不限于过滤(例如超滤或微滤)、离心、密度梯度分级分离(例如密度梯度超离心)、亲和性色谱法(Tilbeurgh等人，1984)、离子交换色谱法(Goyal等人，1991；Fliess等人，1983；Bhikhabhai等人，1984；Ellouz等人，1987)，包括使用具有高拆分力的材料进行离子交换(Medve等人，1998)、疏水相互作用色谱法(Tomaz和Queiroz，1999)以及两相分配(Brumbauer等人，1999)。

富集时，有时需要分离的或纯化的CBH变体多肽，在一些实施例中，在需要纤维二糖水解酶活性的测定中直接采用表达CBH变体多肽的宿主细胞。因此，并不总是需要所需CBH变体多肽的富集、分离或纯化来获得可用于纤维素酶测定或过程的CBH变体多肽组合物。例如，根据本发明的方面的纤维素酶系统可设计成允许表达如本文所述的变体CBH1的宿主细胞直接用于纤维素酶过程中，即，在用于所关注的测定之前不从宿主细胞分离CBH1。在一个这种例子中，可将CBH1变体表达酵母细胞直接添加至发酵过程中，使得酵母细胞将变体CBH1表达直接进入发酵液中，其中纤维素酶活性将不可发酵底物转化成可发酵糖，以供酵母直接将其转化成所需产物，例如转化成乙醇(参见例如Ilmén等人，High level secretion ofcellobiohydrolasess by Saccharomyces cerevisiae(通过酿酒酵母高水平分泌纤维二糖水解酶)，Biotechnology for Biofuels(《用于生物燃料的生物技术》)2011,4:30)。

VI.CBH1变体的效用

应理解，所需CBH变体编码核酸、所需CBH变体多肽和包含其的组合物可用于多种多样的应用，下文描述其中一些。可按多种方式利用本文描述的CBH变体的一种或多种改进的特性。例如，在热应激条件下具有改进的性能的CBH变体可用于增加在高温(例如亲本CBH性能较差的温度)下进行的测定中的纤维素酶活性，从而允许使用者减少所采用的CBH的总量(与使用亲本CBH相比)。在纤维素酶测定中可利用CBH变体多肽的其他改进的特性，包括具有以下各项的CBH变体：改变的pH最适性、在表面活性剂存在下增大的稳定性或活性、增大的对于底物的特异活性、改变的底物裂解模式、和/或在所关注细胞中高水平表达。

因此，如本文所述的CBH变体多肽可用于洗涤剂组合物、用于将木浆降解为糖的组合物(例如，用于生物乙醇生产)和/或在饲料组合物中，所述洗涤剂组合物展现出增强的清洁能力，可以用作软化剂和/或改进棉织物的触感(例如，“石洗”或“生物抛光”)。对CBH变体的分离和表征使得能够控制此类组合物的特征和活性。

含有如本文所述的所需CBH变体的纤维素酶组合物可用于乙醇生产。来自此过程的乙醇可进一步用作辛烷值增高剂，或代替汽油直接用作燃料，这是有利的，因为乙醇作为燃料源比石油源产品更环保。已知的是，乙醇的使用将改善空气质量并且有可能降低局部臭氧水平和烟雾。此外，在缓冲不可再生能源和石化供给的突然变动的影响方面，利用乙醇代替汽油具有政策重要性。

单独的糖化和发酵是这样的过程，其中存在于生物质(例如玉米秆)中的纤维素转化为葡萄糖，随后酵母菌株将葡萄糖转化为乙醇。同步糖化和发酵是这样的过程，其中存在于生物质中的纤维素转化为葡萄糖，与此同时并且在相同反应器中，酵母菌株将葡萄糖转化为乙醇。因此，本发明的CBH变体可用于这两个将生物质降解成乙醇的过程。通过易得的纤维素源制备乙醇提供了稳定的可再生燃料源。应进一步注意的是，在一些过程中，不将生物质完全分解成葡萄糖(含有例如二糖)，因为这类产物除了乙醇生产有其他用途。

纤维素基原料可呈多种形式并且可包括农业废物、草和木材以及其他低价值生物质，诸如城市废物(例如，回收纸、庭院修剪废料等)。可由这些纤维素原料中的任何一种的发酵产生乙醇。因此，很多种原料可与本发明的一种或多种所需纤维素酶一起使用，并且选择使用的那种原料可取决于进行该转化的区域。例如，在美国中西部，可能以农业废弃物如小麦秸、玉米秆和蔗渣为主，而在加利福尼亚，可能以稻草为主。然而，应当理解，任何可利用的纤维素生物质都可用在任何区域。

在另一实施例中，可对纤维素原料进行预处理。预处理可以通过高温并添加稀酸、浓酸或稀碱溶液而进行。将预处理溶液添加足以至少部分地水解半纤维素组分的时间然后进行中和。

除了生物质转化，如本文所述的CBH变体多肽可存在于洗涤剂组合物中，所述组合物可包含任一种或多种洗涤剂组分，例如表面活性剂(包括阴离子型、非离子型和两性离子型表面活性剂)、水解酶、助剂、漂白剂、上蓝剂和荧光染料、抗结块剂、增溶剂、阳离子型表面活性剂等等。所有这些组分在洗涤剂领域都是已知的。含有CBH变体多肽的洗涤剂组合物可呈任何便利形式，包括液体、颗粒、乳液、凝胶、糊剂等等。在某些形式(例如颗粒)中，洗涤剂组合物可配制成含有纤维素酶保护剂。对于更深入的探讨，参见标题为“含有缺乏CBH1型组分的纤维素酶组合物的洗涤剂组合物”的美国专利号6,162,782，其是以引用方式并入本文中。

在某些实施例中，存在于洗涤剂组合物中的CBH变体多肽为相对于总洗涤剂组合物0.00005重量百分比至5重量百分比，例如相对于总洗涤剂组合物为约0.0002重量百分比至约2重量百分比。

应注意，具有增加的热稳定性的CBH变体可用于例如这样的领域中，其中在较低温度下需要中和酶活性，以使得可能存在的其他酶不受影响。另外，酶可用于纤维素材料的限制转化中，例如用于控制结晶度或纤维素链长度。在达到所需转化程度后，可使糖化温度升高到脱稳CBH变体的存活温度以上。由于CBH活性对于结晶纤维素水解是必需的，结晶纤维素的转化在高温下将停止。

从上文可见，与亲本CBH酶相比，具有改进特性的CBH变体多肽(和编码其的核酸)可用于改进任何采用纤维二糖水解酶的许多测定和过程。

实例

在以下实例中更详细地描述本发明，所述实例不是旨在以任何方式限制受权利要求书保护的本发明的范围。附图意在被认为是说明书的组成部分并且是对本发明的描述。本文引述的所有参考文献都以引用方式将其全部内容具体并入本文。

实例1

I.测定

下述测定法用于下文描述的实例中。与下文提供的方案的任何偏离均在实例中指出。在这些实验中，使用分光光度计测量反应完成后形成的产物的吸光度。

A.性能指数

性能指数(PI)将相同多肽浓度下变体的性能或稳定性(测量值)与标准酶的性能或稳定性(理论值)相比较。另外，可用标准酶的朗缪尔方程的参数来计算理论值。通过使数据与截距为(y＝((x*a)/(x+b))+c)的朗缪尔方程拟合生成野生型EG4的剂量响应曲线，并将EG4变体的活性除以相同板的野生型EG4的计算活性，以获得性能指数。大于1的性能指数(PI)(PI>1)指示与标准(例如野生型红褐肉座菌纤维二糖水解酶1，也称为CBH1或Cel7A)相比变体的性能改善，而PI等于1(PI＝1)确定变体性能与标准的性能相同，PI小于1(PI<1)确定变体的性能比标准的性能差。

B.蛋白质含量测定

使用装备Acquity UPLC BEH200SEC 1.7μm(4.6×150mm)柱(Waters#186005225)的Agilent 1200HPLC测定来自合并的培养物上清液的CBH1变体多肽的浓度。将二十五(25)微升样品与75μL去矿物质水混合。将十(10)μL 4×稀释的样品注射到柱上。为洗脱样品，将25mM NaH2PO4pH6.7+100mM NaCl等度运行5.0min。由使用纯化的野生型CBH1(0-1410ppm)生成的标准曲线测定CBH1变体的蛋白质浓度。为计算性能指数(P_i或PI)，对变体产生的(平均)总蛋白与相同剂量下野生型产生的(平均)总蛋白之比取平均。

C.用于测量葡萄糖的ABTS测定

测量来自表达CBH1变体的红褐肉座菌培养物上清液的残余葡萄糖。具有残余葡萄糖的培养物上清液不进行合并以用于进一步研究。使用ABTS测定检测单体葡萄糖。检测分析缓冲液含有在50mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)中的2.74g/L 2,2’-联氮-双(3-乙基苯并-噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS，Sigma，目录号A1888)、0.1U/mL辣根过氧化物酶VI-A型(Sigma，目录号P8375)和1单位/毫升食品级葡萄糖氧化酶(5989U/mL)。将十(10)微升(稀释的)BGL1活性测定混合物添加至100μL ABTS检测分析溶液中。添加活性测定混合物后，在环境温度22℃下，于OD₄₂₀下对反应进行动力学跟踪5min。通常包括适合每种检测分析条件的葡萄糖校准曲线。

D.磷酸溶胀纤维素(PASC)水解测定

D.1.磷酸溶胀纤维素(PASC)水解测定

根据公布的方法(Walseth,Tappi,35:228,1971；和Wood,Biochem J.(《生物化学杂志》)，121:353-362,1971)从Avicel制备磷酸溶胀纤维素(PASC)。用缓冲液和水稀释该材料以获得0.5w/v％混合物，其中醋酸钠的最终浓度为50mM(pH 5.0)。通过将15μL培养物上清液添加至96孔微量滴定板(Costar平底PS 3641)中的85μL反应混合物(0.15％PASC；缺失cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3和bgl1的红褐肉座菌菌株的0.42mg/mL培养物上清液；29.4mM NaOAc(pH5.0))来测定CBH1活性。密封微量滴定板并且在50℃下在900rpm持续振荡下在恒温孵育器内孵育3小时，之后在冰上冷却5min。通过添加100μL淬灭缓冲液(100mM甘氨酸缓冲液(pH 10)；5mg/ml卡尔科弗卢尔(Sigma))停止水解反应。根据公布的方法测定活性(Du等人，Appl Biochem Biotechnol(《应用生物化学与生物技术》)161(1-8):313-7)。建立野生型CBH1酶的剂量响应曲线。测定一式四份地进行。为计算性能指数(P_i或PI)，对变体产生的(平均)总糖与相同剂量下野生型产生的(平均)总糖之比取平均。

D.2.磷酸溶胀纤维素(PASC)水解测定

根据公布的方法(Walseth,Tappi,35:228,1971；和Wood,Biochem J.(《生物化学杂志》)，121:353-362,1971)从Avicel制备磷酸溶胀纤维素(PASC)。用缓冲液和水稀释该材料以获得0.5w/v％混合物，其中醋酸钠的最终浓度为50mM(pH 5.0)。CBH1活性通过将5μL、10μL、20μL和40μL的400ppm阴离子纯化的(参见I.1)CBH1添加至96孔微量滴定板(Costar平底PS 3641)中的140μL反应混合物(0.36％PASC；29.4mMNaOAc(pH 5.0)；143mM NaCl)来测定。密封微量滴定板并且在50℃下在900rpm持续振荡下在恒温孵育器内孵育2小时，之后在冰上冷却5min。通过添加100μL淬灭缓冲液(100mM甘氨酸缓冲液(pH 10))停止水解反应。根据Lever,1972,Anal Biochem(《分析生物化学》),47:273-279使用PAHBAH测定分析水解反应产物，但修改如下：PAHBAH测定：将PAHBAH还原糖试剂(对于100mL试剂：1.5g对羟基苯甲酸肼(Sigma#H9882)、5g四水合酒石酸钾钠溶解在2％NaOH中)的150μL等分试样添加至空的微量滴定板中的所有孔。将十(10)微升水解反应上清液添加至PABAH反应板。密封所有板并且在69℃下在900rpm持续振荡下孵育。一小时后，将板放置在冰上五分钟，并且在720xg在室温下离心五分钟。在410nm下在分光光度计中测量板的吸光度(终点)。包括纤维二糖标准物作为对照和合适的空白样品。建立野生型CBH1酶的剂量响应曲线。为计算性能指数(PI)，将由变体CBH1产生的(平均)总糖除以由相同剂量下野生型CBH1(例如，参考酶)产生的(平均)总糖。

D.3.EGII存在下的磷酸溶胀纤维素(PASC)水解测定

如对于D.2(即，没有EGII)下的测定所述在2.5ppm里氏木霉EGII存在下进行PASC测定，但修改如下：在添加至测定之前，将400ppm阴离子纯化的CBH1酶稀释1.6倍，反应添加与D.2下相同，只有10μL 37.5ppmEGII被添加至反应混合物，得到150μL总反应体积。如D.2下所述计算PI。

E.全水解产物酸预处理的玉米秆(whPCS)测定

如所述，用2w/w％H₂SO₄对玉米秆进行预处理(Schell等人，J ApplBiochem Biotechnol(《应用生物化学与生物技术》)，105:69-86,2003)。3、5、10和25μL体积的上清液(在50mM NaOAc中2倍稀释)添加至whPCS反应混合物(6.5％(w/v)whPCS；缺失cbh1和cbh2的红褐肉座菌(如WO 2005/001036中所述)的1.43mg/mL上清液；0.22mg/mL Xyn3；0.15mg/mL Fv51A；0.18mg/mL Fv3A；0.15mg/mL Fv43D；0.22mg/mLBGL1)，最终总体积为160μL。(采用酶Xyn3、Fv51A、Fv3A、Fv43D和Bgl1的合适方法的例子描述在PCT申请公布WO2011/0038019中)。密封微量滴定板并且在50℃下在900rpm持续振荡下在恒温孵育器内孵育3小时，之后在冰上冷却5min。通过添加100μL淬灭缓冲液(100mM甘氨酸缓冲液，pH 10)停止水解反应。将板在室温下在3,000rpm下离心5分钟，并且通过添加10μL样品至190μL水对样品进行20×稀释。如测定C下所述，使用ABTS测定测量反应中的游离葡萄糖。

F.稀氨玉米秆(daCS)测定

基本上如对于稀氨玉米芯所述(WO2006/110901)，制备稀氨预处理的玉米秆。预处理的玉米秆作为50mM乙酸钠(pH 5.0)中的10％纤维素悬浮液使用。将3、5、10和20μL体积的上清液添加至daCS反应混合物(5.8％(w/v)纤维素；0.052mg/mL红褐肉座菌CBH2；0.13mg/mL红褐肉座菌Xyn3；0.011mg/mL Fv51A；0.006mg/mL Fv3A；0.011mg/mL Fv43D；0.08mg/mL Fv3C；0.04mg/mL EG4；0.05mg/mL红褐肉座菌Δ(cbh1,cbh2))，最终总体积为120μL。(如上所述，采用酶Xyn3、Fv51A、Fv3A、Fv43D和Fv3C的合适方法的例子描述在PCT申请公布WO2011/0038019中)。密封微量滴定板并且在50℃下在900rpm持续振荡下在恒温孵育器内孵育24小时，之后在冰上冷却5min。通过添加100μL淬灭缓冲液(100mM甘氨酸缓冲液(pH 10))停止水解反应。将板在室温下在3,000rpm下离心5分钟，并且通过添加10μL样品至190μL水对样品进行20×稀释。如测定C下所述，使用ABTS测定测量反应中的游离葡萄糖。

G.蛋白质纯化

对于小规模纯化，将200μL的90％乙醇转移至多屏深孔solvinert疏水性PTFE滤板(MiliPore#MDRPN0410)中，之后在50xg下离心1min。将四百(400)μL的DEAE琼脂糖快速流动树脂(GE-Healthcare#17-0709-01)转移至滤板，之后在50xg下离心1min。使用400μL MiliQ水将树脂洗涤三次，并且使用400μL的25mM NaH₂PO₄(pH6.7)将其平衡三次。使用25mMNaH₂PO₄(pH6.7)将四百五十(450)μL培养物上清液6×稀释至2700μL。将稀释的样品装载到树脂上。为洗脱所有未结合的蛋白，用25mM NaH₂PO₄(pH6.7)将树脂洗涤三次。使用400μL的25mM NaAc pH5.0+500mM NaCl洗脱CBH1变体。

对于大规模纯化，使用Vivaspin2010kDMWO过滤器(Sartorius#VS2001)来浓缩20mL的CBH1摇瓶样品至2.5mL(在3000xg下离心20分钟)。使用50mM NaAc pH5.0将所浓缩的样品稀释至10mL。使用25mMNaAc pH5.0来平衡1mL Hitrap DEAE FF柱(GE-Healthcare#17-5055-01)。将所稀释样品以1.0mL/min装载到柱上。样品装载完成后，用12个柱体积(CV)的25mM NaAc pH5.0以1mL/min洗涤柱。使用30CV以从0％至50％25mM NaAc pH5.0+1M NaCl的梯度从柱洗脱CBH1。梯度过程中，收集5mL级分。通过SDS-PAGE分析级分。合并含有大多数CBH1的三个级分。

H.测量蛋白质解链温度(Tm)

通过荧光染料结合热漂移测定法来测定CBH1变体的稳定性(Lavinder等人，High-throughput thermal scanning:A general,rapid dye-binding thermalshift screen for protein engineering(高通量热扫描：用于蛋白质工程学的通用快速染料结合热漂移筛选)(2009)JACS(《美国化学会杂志》)，131:3794-3795)。将Sypro橙(Molecular Probes)1:1000稀释在MQ水中。在孔中，将8μL稀释的染料与25μL于50mM NaOAc(pH5)中的100mg/L酶进行混合。使密封的板在ABI 7900HT rtPCR系统(Applied Biosystems)中以大致1℃/min的速率经受25℃至95℃的温度梯度。将荧光信号的一阶导数的中峰温度取为样品中CBH1酶的解链温度(Tm)。

实例2

红褐肉座菌CBH1变体的产生

在该实例中，描述了表达野生型红褐肉座菌纤维二糖水解酶1(CBH1)和其变体的里氏木霉菌株的构建。编码CBH1(SEQ ID NO:3)的、以下列为SEQ ID NO:1的cDNA片段(先前在美国专利7,452,707中有所描述)用作用于构建表达CBH1和其变体的里氏木霉菌株的模板DNA。将cDNA插入表达质粒pTTT-pyrG中，以产生pTTT-pyrG-cbh1(如图3所示)。

SEQ ID NO:1包括编码成熟形式的红褐肉座菌cbh1的野生型核苷酸序列，其邻近编码CBH1信号肽(加下划线)的序列：

atgtatcggaagttggccgtcatctcggccttcttggccacagctcgtgctcagtcggcctgcactctccaatcggagactcacccgcctctgacatggcagaaatgctcgtctggtggcacgtgcactcaacagacaggctccgtggtcatcgacgccaactggcgctggactcacgctacgaacagcagcacgaactgctacgatggcaacacttggagctcgaccctatgtcctgacaacgagacctgcgcgaagaactgctgtctggacggtgccgcctacgcgtccacgtacggagttaccacgagcggtaacagcctctccattggctttgtcacccagtctgcgcagaagaacgttggcgctcgcctttaccttatggcgagcgacacgacctaccaggaattcaccctgcttggcaacgagttctctttcgatgttgatgtttcgcagctgccgtgcggcttgaacggagctctctacttcgtgtccatggacgcggatggtggcgtgagcaagtatcccaccaacaccgctggcgccaagtacggcacggggtactgtgacagccagtgtccccgcgatctgaagttcatcaatggccaggccaacgttgagggctgggagccgtcatccaacaacgcgaacacgggcattggaggacacggaagctgctgctctgagatggatatctgggaggccaactccatctccgaggctcttaccccccacccttgcacgactgtcggccaggagatctgcgagggtgatgggtgcggcggaacttactccgataacagatatggcggcacttgcgatcccgatggctgcgactggaacccataccgcctgggcaacaccagcttctacggccctggctcaagctttaccctcgataccaccaagaaattgaccgttgtcacccagttcgagacgtcgggtgccatcaaccgatactatgtccagaatggcgtcactttccagcagcccaacgccgagcttggtagttactctggcaacgagctcaacgatgattactgcacagctgaggaggcagaattcggcggatcctctttctcagacaagggcggcctgactcagttcaagaaggctacctctggcggcatggttctggtcatgagtctgtgggatgattactacgccaacatgctgtggctggactccacctacccgacaaacgagacctcctccacacccggtgccgtgcgcggaagctgctccaccagctccggtgtccctgctcaggtcgaatctcagtctcccaacgccaaggtcaccttctccaacatcaagttcggacccattggcagcaccggcaaccctagcggcggcaaccctcccggcggaaacccgcctggcaccaccaccacccgccgcccagccactaccactggaagctctcccggacctacccagtctcactacggccagtgcggcggtattggctacagcggccccacggtctgcgccagcggcacaacttgccaggtcctgaacccttactactctcagtgcctg

SEQ ID NO:2示出了含有CBH1信号肽(加下划线)的红褐肉座菌CBH1全长多肽的序列：

Myrklavisaflataraqsactlqsethppltwqkcssggtctqqtgsvvidanwrwthatnsstncydgntwsstlcpdnetcaknccldgaayastygvttsgnslsigfvtqsaqknvgarlylmasdttyqeftllgnefsfdvdvsqlpcglngalyfvsmdadggvskyptntagakygtgycdsqcprdlkfingqanvegwepssnnantgigghgsccsemdiweansisealtphpcttvgqeicegdgcggtysdnryggtcdpdgcdwnpyrlgntsfygpgssftldttkkltvvtqfetsgainryyvqngvtfqqpnaelgsysgnelnddyctaeeaefggssfsdkggltqfkkatsggmvlvmslwddyyanmlwldstyptnetsstpgavrgscstssgvpaqvesqspnakvtfsnikfgpigstgnpsggnppggnppgttttrrpatttgsspgptqshygqcggigysgptvcasgttcqvlnpyysqcl

SEQ ID NO:3示出了红褐肉座菌CBH1成熟多肽的序列：

Qsactlqsethppltwqkcssggtctqqtgsvvidanwrwthatnsstncydgntwsstlcpdnetcaknccldgaayastygvttsgnslsigfvtqsaqknvgarlylmasdttyqeftllgnefsfdvdvsqlpcglngalyfvsmdadggvskyptntagakygtgycdsqcprdlkfingqanvegwepssnnantgigghgsccsemdiweansisealtphpcttvgqeicegdgcggtysdnryggtcdpdgcdwnpyrlgntsfygpgssftldttkkltvvtqfetsgainryyvqngvtfqqpnaelgsysgnelnddyctaeeaefggssfsdkggltqfkkatsggmvlvmslwddyyanmlwldstyptnetsstpgavrgscstssgvpaqvesqspnakvtfsnikfgpigstgnpsggnppggnppgttttrrpatttgsspgptqshygqcggigysgptvcasgttcqvlnpyysqcl

含有红褐肉座菌CBH1酶编码序列(SEQ ID NO:1)的pTTTpyrG-cbh1质粒用作产生CBH1变体的模板。

CBH1变体多肽的产生

在缺失六个基因的里氏木霉菌株(Δegl1、Δegl2、Δegl3、Δcbh1、Δcbh2、Δbgl1)中表达纯化的pTTTpyrG-cbh1质粒(P_cbh1，Amp^R，乙酰胺酶；参见图3所示的质粒示意图)，所述质粒表达编码CBH1变体酶的基因，所述菌株衍生自RL-P37(Sheir-Neiss,G等人。Appl.Microbiol.(《应用环境微生物学》)Biotechnol.(《应用微生物学与生物技术》)1984,20:46-53)，并且进一步描述在PCT申请公布WO2010/141779中。根据PCT申请公布WO2005/001036中所述的方法产生基因缺失，以制得缺失四个基因的里氏木霉菌株(Δegl1、Δegl2、Δcbh1、Δcbh2)，其类似地进一步缺失egl3和bgl1，得到缺失六个基因的菌株。用单独的pTTT-pyrG-cbh1构建体转化六重缺失的里氏木霉的原生质体(单个CBH1变体每次转化)，并且使其在含有乙酰胺的选择性琼脂上在28℃下生长7天，如先前在PCT申请公布WO2009/048488中所述。使里氏木霉的转化株在含有乙酰胺的选择性琼脂上复苏并且在28℃下孵育7天。通过用300μL盐水+0.015％Tween-80刮各孔收集孢子。对于CBH1变体产生，将10μL或25μL体积的孢子悬浮液分别添加至96孔或24孔板中的200μL的1mL Aachen培养基中。用Enzyscreen盖封闭板，并且在50mm摆度的Infors孵育器中在28℃和80％湿度下发酵7天。将发酵液转移至96孔滤板，并且在真空下过滤。如实例C所述，使用ABTS测定来测量残余葡萄糖。将剩余孢子悬浮液在-80℃下储存在50％甘油中。

实例3

具有显著Tm收益的CBH1变体

如以上在H中所述测定CBH1变体、包括多重置换的变体的Tm，并且进行分析以模拟每一种具体置换如何影响Tm。在图4的图表和表1中示出展现出显著的Tm变化的置换(显著性为0.001，或99.9％)。在图4中，Tm的变化处于X轴，其中所模拟的各特异性变体示出在其Tm值变化处，所述变化可以是正的或负的。“截距”值指示模型对于没有置换的分子(即野生型CBH1)的Tm变化的预测。(应注意模型的预测不总为0)。

如图4和表1(其示出针对图4中各CBH1变体所模拟的Tm值变化；括号中的数值是负的)所示，以下变体的Tm显著增大(即显著大于0)：T41I、T255P、T255D、T246P、N200R、T356L和T246V。

如图4和表1所示，以下变体展现出显著减小的Tm(即，显著小于0)：V403R、S248V、Y370F、K346T、N324K、S398F、E334A、P258L、S248K、F338E、K346P、E334G以及R394V。

应注意尽管在某些实施例中，需要Tm显著增大的CBH1变体，例如供用于其中需要多肽对高温灭活的耐受性的过程中，但在其他实施例中，需要Tm显著减小的CBH1变体，例如供用于其中需要高温CBH1灭活步骤的过程中。因而，图4和表1中所示的CBH1变体的合意性是取决于变体的预定用途。

表1.具有显著Tm值的CBH1变体

变体	ΔTm值
		T41I	5.7
T255P	2.1
		T255D	1.6

T246P	1.5
		N200R	1.2
T356L	1.2
		T246V	1.1
截距	(1.0)*
		V403R	(1.3)
S248V	(1.5)
		Y370F	(1.6)
K346T	(1.7)
		N324K	(1.8)
S398F	(2.3)
		E334A	(2.4)
P258L	(2.4)
		S248K	(2.4)
F338E	(4.6)
		K346P	(5.2)
E334G	(6.0)
		R394V	(18.3)

*括号中的数值是负的

实例4

在whPCS PI测定中具有显著收益的CBH1变体

如以上在E中所述测定CBH1变体、包括多重置换的变体的性能指数(PI)，并且进行分析以模拟每一种具体置换如显著何影响PI(显著性为0.10，或90％)。在图5的图表和表2中示出展现出显著的PI变化的置换。在图5中，PI变化(或ΔPI值)处于X轴(标记为“whPCS PI收益”)，其中具有显著PI变化的各特异性变体示出在其近似ΔPI值处。“截距”值指示模型对于没有置换的分子(即野生型CBH1)的PI变化的预测。(应注意模型的预测不总为0)。

如图5和表2(其示出针对图5中各CBH1变体的ΔPI值；括号中的数值是负的)所示，以下变体展现出显著增大的PI(即显著大于0)：S92T、F418M、T246S和T255V。

如图5和表2所示，以下变体展现出显著减小的PI(即显著小于0)：Y247D*、N49P*、T246P*、A106S*、T246V*、Y492A*、Y370F*、Y492N*、T255D*、Y247M*、E334A*、N49D*、S248K、R394V、N200G、N49A、N49V、T285K、N200R、P258L、E295K、P227A、P227L和R394Y。用*指示的变体的模拟ΔPI显著小于0，但大于截距(即野生型)的模拟ΔPI。

表2.在whPCS测定中具有显著ΔPI值的CBH1变体

变体	ΔPI值
		S92T	0.18
F418M	0.02
		T246S	0.02
T255V	0.018
		Y247D	(0.013)*
N49P	(0.013)
		T246P	(0.014)
A106S	(0.016)
		T246V	(0.021)
Y492A	(0.021)
		Y370F	(0.022)
Y492N	(0.023)
		T255D	(0.023)
Y247M	(0.023)
		E334A	(0.025)
N49D	(0.025)
		截距	(0.029)
F338E	(0.029)
		S248K	(0.038)
R394V	(0.038)
		N200G	(0.039)
N49A	(0.041)
		N49V	(0.044)
T285K	(0.052)
		N200R	(0.061)
P258L	(0.064)
		E295K	(0.077)
P227A	(0.092)
		P227L	(0.11)
R394Y	(0.13)

*括号中的数值是负的

实例5

在daCS PI测定中具有显著收益的CBH1变体

如以上在F中所述在daCS测定中测定单独置换的CBH1变体的性能指数(PI)，并且进行分析以确定与野生型CBH1酶相比，PI是否显著减小或显著增大(显著性为0.25，或75％)。在图6的图表和表3中示出展现出显著的PI变化的置换。在图6中，PI变化(或ΔPI值)处于X轴(标记为“daCS PI收益”)，其中具有显著PI变化的各特异性变体示出在其近似ΔPI值处。“截距”值指示模型对于没有置换的分子(即野生型CBH1)的PI变化的预测。(应注意模型的预测不总为0)。

如图6和表3(其示出针对图6中各CBH1变体的ΔPI值；括号中的数值是负的)所示，以下变体展现出显著增大的PI(即显著大于0)：D241N、G234D、F418M、T246S、T255R、T255P、T255I、T255V、Y247D、T255K、P194V、G340T、Y492A、S398F、E334A、Y370F、N49A和S248K。

如图6和表3所示，以下变体展现出显著减小的PI(即显著小于0)：P258L、N200R、N49V和F338E。

表3.在daCS测定中具有显著ΔPI值的CBH1变体

变体	ΔPI值
		D241N	0.12
G234D	0.11
		F418M	0.063
T246S	0.049
		T255R	0.035
T255P	0.031
		T255I	0.029
T255V	0.025
		P194V	0.025
T255K	0.020
		Y247D	0.020
Y492A	(0.020)*
		Y370F	(0.023)
S398F	(0.024)
		E334A	(0.024)
N49A	(0.043)
		S248K	(0.046)
F338E	(0.060)
		截距	(0.062)
N49V	(0.068)
		P258L	(0.078)
N200R	(0.081)
		P194L	(0.29)

*括号中的数值是负的

实例6

在PASC PI测定中具有显著收益的CBH1变体

如以上在D(D1至D3)中所述在一个或多个PASC测定中测定单独置换的CBH1变体的性能指数(PI)，并且进行分析以确定与野生型CBH1酶相比，PI是否显著减小或显著增大(显著性为0.1，或90％)。在图7的图表和表4中示出展现出显著的PI变化的置换。在图7中，PI变化(或ΔPI值)处于X轴(标记为“PASC PI收益)，其中具有显著PI变化的各特异性变体示出在其近似ΔPI值处。“截距”值指示模型对于没有置换的分子(即野生型CBH1)的PI变化的预测。(在此模型中，截距并不显著不同于0，并且因此未出现在图上。)

如图7和表4(其示出针对图7中各CBH1变体的ΔPI值；括号中的数值是负的)所示，以下变体展现出显著增大的PI(即显著大于0)：T246V、N200G、Y247D、Y247M和N49P。

如图7和表4所示，以下变体展现出显著减小的PI(即，显著小于0)：E334A、T255I、T285K、Y492A、N49D、E295K、Y492N、S196T、Y492V、R394Y和R394V。

表4.在PASC测定中具有显著ΔPI值的CBH1变体

变体	ΔPI值
		T246V	0.18
N200G	0.16
		Y247D	0.12
Y247M	0.081
		N49P	0.060
E334A	(0.057)
		T255I	(0.11)
T285K	(0.16)
		Y492A	(0.18)
N49D	(0.20)
		E295K	(0.20)
Y492N	(0.21)
		S196T	(0.21)
Y492V	(0.40)
		R394Y	(1.0)
R394V	(1.2)

*括号中的数值是负的

实例7

代表性数据的总结

下表5示出在whPCS、daCS、PASC和Tm测定中的至少一个测定中具有有益效果的各CBH1变体的性能。具有“+”号或“-”号的数值指示在所指示的测定中，CBH1变异对CBH1酶性能的影响的相对大小(基于上表1至4中所示的值)。变体还根据其性能特征分成四组。组1：whPCS和daCS收益；组2：daCS收益；组3：PASC收益；以及组4：Tm收益。组5中的变体是在至少一个测定中示出性能收益并且可与其他CBH1变体组合使用的那些。应当注意，表5中变体的任何组合都是可以预期到的(如本文中其他处所述)。

表5：代表性CBH1变体的特性的总结

变体	whPCS(ΔPI)	daCS(ΔPI)	PASC(ΔPI)	ΔTm	组别
						F418M	+	++	(ns)	(ns)	1
T246S	+	+	(ns)	(ns)	1
						T255V	+	+	(ns)	(ns)	1
D241N	(ns)	+++	(ns)	(ns)	2
						G234D	(ns)	+++	(ns)	(ns)	2
P194V	(ns)	+	(ns)	(ns)	2
						T255I	(ns)	+	---	(ns)	2
T255K	(ns)	+	(ns)	(ns)	2
						T255R	(ns)	+	(ns)	(ns)	2
N200G	-	(ns)	++++	(ns)	3
						N49P	-*	(ns)	++	(ns)	3
T246V	-*	(ns)	++++	++	3
						Y247D	-*	+	+++	(ns)	3
N200R	--	--	(ns)	++	4
						T246P	-*	(ns)	(ns)	++	4
T255D	-*	(ns)	(ns)	++	4
						T356L	(ns)	(ns)	(ns)	++	4
S92T	++++	(ns)	(ns)	(ns)	5
						T255P	(ns)	+	(ns)	+++	5
T41I	(ns)	(ns)	(ns)	++++	5

*所模拟的ΔPI大于对于截距(即野生型)所模拟的ΔPI。

(ns)＝不显著不同于0。

如以上所述，表5中变体的任何组合可用于本发明的方面。

应理解本文所描述的实例和实施例仅用于说明目的，并且本领域技术人员将会想到根据其的各种修改或变化，并且这些修改和变化意欲包括在本申请的精神和界限以及随附权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利以及专利申请全文据此以引用方式并入。

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Claims

1.一种分离的亲本纤维二糖水解酶(CBH)变体，其中所述变体具有纤维素酶活性，与SEQ ID NO:3具有至少80％的序列同一性，并且与所述亲本CBH酶相比具有显著增加的解链温度(Tm)。

2.根据权利要求1所述的分离的变体，其中所述变体包含选自由以下各项组成的组的氨基酸置换：T356L、T246P、T255D、N200R以及其组合，其中各氨基酸置换的位置对应于SEQ ID NO:3。

3.根据权利要求2所述的分离的变体，其中所述变体包含T356L置换。

4.根据权利要求2或3所述的分离的变体，其中所述变体包含T246P置换。

5.根据权利要求2、3或4所述的分离的变体，其中所述变体包含T255D置换。

6.根据权利要求2、3、4或5所述的分离的变体，其中所述变体包含N200R置换。

7.根据权利要求2、3、5或6所述的分离的变体，其中所述变体进一步包含氨基酸置换，所述氨基酸置换选自由以下各项组成的组：T246S和T246V。

8.根据权利要求2、3、4或6所述的分离的变体，其中所述变体进一步包含氨基酸置换，所述氨基酸置换选自由以下各项组成的组：T255I、T255K、T255P、T255R和T255V。

9.根据权利要求2、3、4或5所述的分离的变体，其中所述变体进一步包含N200G氨基酸置换。

10.根据权利要求2至9中任一项所述的分离的变体，其中所述变体进一步包含氨基酸置换，所述氨基酸置换选自由以下各项组成的组：F418M、D241N、G234D、P194V、Y247D、N49P、S92T、T41I以及其组合。

11.根据前述权利要求中任一项所述的分离的变体，其中所述亲本CBH多肽为真菌纤维二糖水解酶1(CBH1)。

12.根据权利要求11所述的分离的变体，其中所述真菌CBH1是来自红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)、施韦尼兹肉座菌(Hypocreaschweinitzii)、东方肉座菌(Hypocrea orientalis)、拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)、康长木霉(Trichoderma konilangbra)、桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)、哈茨木霉(Trichodermaharzanium)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、嗜热色串孢(Scytalidium thermophilum)或柄孢霉(Podosporaanderina)。

13.根据前述权利要求中任一项所述的分离的变体，其中所述亲本CBH多肽与SEQ ID NO:3具有至少90％的序列同一性。

14.一种分离的多核苷酸，其包含编码根据前述权利要求中任一项所述的亲本CBH多肽变体的多核苷酸序列。

15.一种载体，其包含根据权利要求14所述的分离的多核苷酸。

16.根据权利要求15所述的载体，其中所述载体为表达载体。

17.一种宿主细胞，其包含根据权利要求14所述的分离的多核苷酸、根据权利要求15所述的载体或根据权利要求16所述的表达载体。

18.根据权利要求17所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真菌细胞或细菌细胞。

19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由以下各项组成的组：

丝状真菌细胞，其选自以下各项组成的组：里氏木霉(Trichodermareesei)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、灰腐质霉(Humicola grisea)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鲁克文金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)、粘帚霉属(Gliocladium)、曲霉菌属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、脉胞菌属(Neurospora)、肉座菌属(Hypocrea)、翘孢霉属(Emericella)、黑曲霉、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、棘孢曲霉和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)；

酵母细胞，其选自以下各项组成的组：酿酒酵母(Saccharomycescervisiae)、裂殖酵母(Schizzosaccharomyces pombe)、西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyceslactus)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、具柄毕赤酵母(Pichia stipitis)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)、Arxulaadeninivorans、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)和多形德巴利酵母(Debaryomyces polymorphus)；以及

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)细菌细胞。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达由所述分离的多核苷酸、载体或表达载体编码的亲本CBH多肽变体。

21.一种产生变体CBH多肽的方法，其包括在产生所述变体的合适培养基中和合适条件下培养根据权利要求16所述的宿主细胞。

22.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括分离所述产生的变体。

23.一种洗涤剂组合物，其包含表面活性剂和根据权利要求1至13中任一项所述的变体CBH多肽。

24.一种饲料添加剂，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的变体CBH多肽。

25.一种用于水解纤维素底物的方法，其包括：

使所述底物与根据权利要求1至13中任一项所述的分离的变体CBH多肽相接触；

使所述底物与根据权利要求20所述的宿主细胞相接触；

或两者的组合。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述纤维素底物是选自以下各项组成的组的木质素纤维素生物质：草、柳枝稷、绳草、黑麦草、草芦、芒草、糖加工残余物、甘蔗渣、农业废物、稻草、稻壳、大麦秸、玉米芯、谷草、小麦秸、油菜秸、燕麦秸、燕麦壳、玉米纤维、稿秆、大豆秆、玉米秆、林业废物、木浆、循环利用的木浆纤维、造纸污泥、锯屑、硬木材、软木材和其组合。

27.一种细胞培养上清液，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的CBH变体。

28.根据权利要求27所述的细胞培养上清液，其中所述细胞培养上清液得自根据权利要求20所述的宿主细胞的培养物。

29.根据权利要求27或28所述的细胞培养上清液，其进一步包含一种或多种另外的纤维素酶或半纤维素酶。

30.一种产生包含CBH变体的细胞培养上清液的方法，所述方法包括：

在表达所述CBH变体的合适条件下培养根据权利要求16所述的宿主细胞；以及

收集所述培养物的细胞培养上清液，进而产生包含所述CBH变体的细胞培养上清液。

31.根据权利要求30所述的方法，其进一步包括以下步骤中的一个或多个：

在所述培养步骤之后杀死所述宿主细胞；

过滤所述收集的细胞培养上清液以去除细胞碎片；以及

使所述细胞培养上清液经受超滤或其他步骤以富集或浓缩所述CBH变体。

32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述宿主细胞进一步表达一种或多种另外的纤维素酶和/或半纤维素酶，其中所述一种或多种另外的纤维素酶和/或半纤维素酶存在于所述细胞培养上清液中。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述一种或多种另外的纤维素酶和/或半纤维素酶被外源性表达在所述宿主细胞中、内源性表达在所述宿主细胞中、与所述细胞培养上清液混合，或其组合。

34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述细胞培养上清液与木质素纤维素生物质底物相接触。