CN104862395A - Hsa-miR-182基因的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Hsa-miR-182基因的新用途。miRNA的表达水平变化与肺癌分期有着一定的关联性。miR-182在NSCLC早期患者的血清中的表达量较其它分期具有显著提升,从而可能成为NSCLC血清检测的潜在标记。其中所公开的为Hsa-miR-182-5p作为肺癌病人血清循环miRNA标记的首次报导,该发明在临床上为肺癌检测提供了一定的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种Hsa-miR-182基因的新用途。
背景技术
肺癌是最为常见、死亡率最高、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。据报道,近50年来很多国家的肺癌发病率和死亡率均明显增高,男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位,女性发病率占第二位,死亡率第一。肺癌可以分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)。据统计,约80%的肺癌为NSCLC,它是最为常见的肺癌,主要包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞未分化癌三大类。
治疗NSCLC需要根据肺癌的临床分析进行。在肿瘤发生的I、II、IIIA期,主要以手术切除为主,对于淋巴转移严重的IV期肿瘤,通常于手术前辅以化疗或放疗。经研究发现,术后I期化疗者的生存周期与术后未化疗者的生存周期一致,这意味着术后I期化疗并不发挥作用;对于II期和IIIA期患者,术后化疗对患者有所伤害,会明显缩短病人的生存期。手术后,I期患者的5年生存率约70%、II期患者的5年生存率约50%,III期手术或化放疗联合治疗者的5年生存率为15-30%。而对于IIIB期(已侵犯邻近重要脏器)和IV期(已有远端转移)的患者将无法进行手术治疗,通常实行化学药物、放射线治疗或者中医中药治疗,患者的5年生存率仅为7%。
对于NSCLC患者的及时治疗能够大大提高病人的生存率,改善病人的健康状况。有效的早期诊断方法能够进行疾病管理,为高风险疾病患者尽早提供有效的治疗。肺癌的早期诊断可以通过胸部X射线来了解肺内的异常情况。此外,进行血液常规检查以及痰液病理细胞检测能够帮助肺癌的诊断。一系列深入的检查,包括支气管镜、纵隔镜、肺组织活检和胸腔镜等技术也用于肺癌的检查诊断中。然而,NSCLC具有生长分裂缓慢、转移能力强的特点,这为NSCLC的早期诊断带来了一定难度。在现有生理学诊断方法的基础上,我们需要寻找其它辅助诊断方法,而生物分子标记是一个值得探索的领域。
微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约20个核苷酸(nucleotide, nt)的内源性非编码RNA分子,它通过特异靶向信使RNA(messenge RNA, mRNA),在转录后水平上调控基因表达。miRNA在很多生物进程中发挥作用,例如控制发育,胚胎生成、细胞分化增殖及凋亡,目前对多数miRNA的靶基因及功能研究始终是RNA调控的研究热点。研究表明,很多miRNA在不同肿瘤中异常表达,在肿瘤的发病机制中扮演着重要的角色。miRNA及其靶基因的功能在肿瘤的发生发展中非常重要,一些miRNA甚至有望成为肿瘤治疗的基因靶点。而miRNA的表达谱可能成为肿瘤诊断、预后、个性化治疗和疾病分类的潜在生物标记。肺癌中的miRNA表达一直是研究的热点之一。
越来越多的研究证明,miRNA不仅在肿瘤组织中表达异常,它还存在于患者的唾液、血浆、血清和福尔马林固定组织之中。因此,循环miRNA的研究逐渐成为一个新型热点。随着人体生理代谢活动的进行,人类血清中也检测出循环miRNA的存在。由于血清易于获得,检测较为方便,且对病人的伤害较小,血清中miRNA诊断标记的研究将会对肺癌病人的诊断、预后、治疗等提供更为便捷的方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种Hsa-miR-182基因的异常表达在检测血清中非小细胞肺癌的应用。
本发明的目的之二在于提供一种Hsa-miR-182在制备筛选和诊断血清中非小细胞肺癌的试剂盒中的应用。
miRNA的异常表达在肿瘤生理过程中扮演着重要的角色,大量miRNA被证实在肿瘤病人的组织及血清中异常表达,从组织或血清中获得的miRNA能够作为肺癌(尤其是NSCLC)的潜在诊断标记。本申请通过solexa测序发现,小鼠诱导肿瘤组织中大量miRNA存在不同的表达差异,部分miRNA在肿瘤组织中表达上调,这在人类肺癌组织中也得到了验证,这表明miRNA的表达水平高低可以作为肿瘤组织的诊断标记。
同时,本发明还发现,人类血清中有稳定存在的miRNA。血清miRNA的异常表达与肿瘤的发生程度具有一定联系,因此,一些miRNA可以用作NSCLC病人的血清诊断标志物。
因此,本发明之一涉及Hsa-miR-182,该miRNA在小鼠诱导NSCLC组织、人类NSCLC组织、NSCLC病人血清样本及部分常见肺癌细胞系中表达量发生显著提高,且与肿瘤的分型和分期具有密切关系,因此可以作为NSCLC的诊断标志。
在一个优选实例中,发现Hsa-miR-182在人类NSCLC组织中表达异常。在另一个优选实例中,发现Hsa-miR-182在NSCLC病人血清中表达量升高,而且其表达量变化与肿瘤分期具有一定关系。
本发明另一涉及一种循环miRNA的抽提方法,该方法能够提高血清中miRNA的抽提效率及抽提纯度。
在一优选实例中,该方法能够获得足够RNA样本,可用于qRT-PCR检测及其它实验。
本发明再一涉及一种NSCLC病人血清中miRNA表达丰度的检测方法。
本发明还涉及Hsa-miR-182在筛选治疗和诊断试剂盒中的用途。
本发明的实施步骤如下所述:
第一步分别从小鼠正常肺组织和诱导NSCLC组织中提取RNA,逆转录构建二者的cDNA文库,进行solexa测序,获得二者的miRNA测序结果。
第二步,分析测序结果,选择表达差异显著的miRNA,作为候选的检测标记物。
第三步,通过多种渠道收集不同病理分期NSCLC肺癌病人血清样品,提取血清中miRNA,逆转录获得每个病人的血清miRNA文库。
第四步,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,检测候选miRNA在不同血清样本中的表达水平。
附图说明
图1为 Solexa测序结果。表中所列的是小鼠诱导NSCLC模型中表达差异的部分miRNA。
图2 诱导小鼠NSCLC模型中Mmu-miR-182的表达差异。L822T1是基因型KRAS+/+的良性肿瘤,L703T2是基因型LKB1-/-/KRAS+/+的恶性肿瘤,L903T1为P53-/-/KRAS+/+的恶性肿瘤。
图3 人常见NSCLC细胞系中Hsa-miR-182的表达差异。其中Beas-2B为人类非肿瘤性肺上皮细胞系,U6为内参,使用2-ΔΔCt法计算相对表达量,图示为3个重复实验结果。
图4 人类NSCLC组织中Hsa-miR-182的表达差异。其中每例样品以癌旁为参照,以U6为内参,使用2-ΔΔCt法计算相对表达量。
图5 NSCLC病人血清中Hsa-miR-182的表达情况。A. 正常血清样品(8例)与肿瘤病人血清(32例)中Hsa-miR-182的表达差异。B. 不同分期肿瘤病人血清及正常血清中Hsa-miR-182的表达差异变化。
图中* P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
具体实施方式
下面将结合具体实例进一步阐述本发明。这些实例仅用于阐述本发明,而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体实验条件的实验方法,通常按照常规条件,分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中的所述条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一:根据solexa测序结果,选择在NSCLC组织中表达变化明显的miRNA。
本发明所用到的KRAS基因突变小鼠NSCLC模型(L822T1、L703T2、L903T1)和正常肺癌模型(L1805)由中科院生化细胞所季红斌教授课题组提供。其中L822T1是基因型KRAS+/+的良性肿瘤,L703T2是基因型LKB1-/-/KRAS+/+的恶性肿瘤,L903T1为P53-/-/KRAS+/+的恶性肿瘤。
对正常小鼠的肺组织和诱导癌变的小鼠肺组织分别取样,使用Trizol法提取组织内总RNA。具体步骤为:以Trizol裂解组织,室温放置5分钟,使组织充分裂解,获得裂解液;加入氯仿,漩涡震荡15秒,以12000g/4℃离心10分钟;离心之后吸取上层水相并加入等量异丙醇颠倒混匀,室温放置20分钟;再次以12000g/4℃离心10分钟,弃去上清;加入75%乙醇洗涤沉淀,2000g/4℃离心3分钟;弃去上清液,室温干燥沉淀5-10分钟。晾干后以DEPC水溶解沉淀即获得总RNA。
其次,对于上述方法获得的总RNA产物,本发明使用Takara公司的One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit(Code No. D350A)进行逆转录,构建上述组织的cDNA文库,以oligo dT为引物进行逆转录,通过变性反应和逆转录2步获得后续实验所需的miRNA cDNA文库。
对样品进行Solexa法测序(Solexa测序由华大基因公司完成)。分析测序数据,结合相关研究报导,发现部分miRNA在诱导的肿瘤组织中的表达变化明显,可见其与肺癌的发病机制具有一定关联性,其中部分miRNA可能作为潜在的诊断标记(参见图1)。
根据测序结果可见,Mmu-miR-182在拥有不同基因背景的小鼠肿瘤的表达量均有所提高。根据测序结果可见,Mmu-miR-182在小鼠肺肿瘤模型的表达量较高,表达变化显著。其中,在无KRAS突变的L822T1模型中,miR-182的表达量提升了约2倍,而在KRAS突变的L703T2和L930T1模型中,miR-182的水平则提升了4倍左右。这意味着miR-182的表达量不仅与肺癌的发生相关,还可能与肿瘤的恶性程度具有一定联系。
实施例二:检测常见肺癌细胞系中miRNA的表达差异
本发明涉及的肺癌细胞系包括:A549、95-D、HCC827、H23、H1299、Spca-1等,其中,A549、HCC827和H23为人非小细胞肺癌细胞,Spca-1为人肺腺癌细胞,H1299为非小细胞肺癌上皮样细胞,95-D为人高转移性肺癌细胞。本实例以正常肺上皮细胞Beas-2B为参照,同时培养上述6种肺癌细胞系。细胞培养按照ATCC标准流程进行,分别培养于含10%胎牛血清的对应培养基中。细胞培养箱保持湿润,维持5% CO2的培养状态,以37℃培养细胞。
当细胞在6cm培养皿中达到约80%密度时,使用实施例一中的Trizol法抽提细胞RNA,并以Takara公司的One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit(Code No. D350A)逆转录获得上述细胞系的miRNA cDNA模板。本试剂盒可对样品中的miRNA及其它微小非编码RNA进行Poly(A)加尾反应,从而引入Uni-miR qPCR Primer结合位点,可对样品中的任意miRNA进行定量PCR反应。具体操作过程如下:
1. 配置如下体系:
2. 按上表配置的相应体系,放置于Bio-Rad C1000 Touch PCR仪上,以37℃-60分钟,85℃-5秒条件进行逆转录。
3. 用RNase free H2O稀释逆转录产物至800μl,储存于-20℃,用于后续实验。
miRNA检测使用Takara公司的SYBR PrimeScipt miRNA RT-PCR Kit(Code No. RR716)进行,本试剂中含有Taq DNA聚合酶、dNTP mix以及SYBR Green dye。该方法使用的仪器为Bio-Rad公司的iQ5系统。具体操作为:
1. 配置如下体系:
2. 上机检测:按照下列步骤设定仪器,检测。
①95℃, 30s; 预变性
②95℃, 10s; 变性
③53℃, 30s; 退火
④Plate read 读取数据
⑤Goto2, 42X 回到步骤2. 循环42次
⑥55℃, 30s;
⑦55℃, 5s +0.5℃/cycle Ramp 0.5℃/s;
⑧Plate read; 读取数据
⑨Goto 7, 80X. 回到步骤7. 循环80次
3. 以Beas-2b细胞为非肿瘤参照,以U6为内参基因,使用ΔΔCt法分析检测数据,筛选在人类非小细胞肺癌中表达量上升的miRNA。
结果显示:出Spca-1细胞系外,Hsa-miR-182在肺癌细胞系中的表达量皆有显著提高。其中以Beas-2B为参照,Hsa-miR-182在HCC827和H23细胞系中的表达量变化最为显著(图2)。虽然不同的细胞系具有不同的基因背景,但是Hsa-miR-182在实例涉及的6种细胞系中表达量都有显著提高,因此我们推断,Hsa-miR-182能够反映肿瘤的发生与生长,它的表达提高可以视作肿瘤产生的潜在标志。
实施例三:检测Hsa-miR-182在人类非小细胞肺癌组织中的表达情况
本实例涉及的26对肺癌及癌旁组织皆来自于上海市胸科医院。
本实例使用实施例一中的Trizol法提取组织的总RNA,cDNA的逆转录过程与实施例二一致。
使用实例二中的qRT-PCR检测法检测Hsa-miR-182在人体肿瘤样本中的表达情况。本实验检测所用的引物为:miR-182 Forward:5'-TTTGGCAATGGTAGAACTCACACT-3',Reverse:Uni-miR qPCR primer;实验使用U6作为内参基因,U6 Forward:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA -3',Reverse:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
在每个样品中分别检测U6及Hsa-miR-182的Ct值。结果处理方法如下:
1. 计算每个样品的ΔCt值。
ΔCt = CtmiR-182 - CtU6
2. 用肿瘤组织的ΔCt值减去癌旁组织的ΔCt值,得到ΔΔCt。
ΔΔCt = ΔCt肿瘤 - ΔCt癌旁
3. 计算2-ΔΔCt值,判断候选Hsa-miR-182在肿瘤组织中的表达情况。
根据病例组织数据可知,miR-182在肿瘤组织中的变化较为稳定,它的表达变化量为2-3倍,但是,miR-182在肿瘤中的表达差异性较为普遍,共有18例肿瘤组织中存在miR-182的异常表达。因此,Hsa-miR-182可能成为NSCLC疾病诊断的潜在标志之一,它表达稳定,且本底表达水平高,差异变化稳定,是一个较好的诊断标记。
实施例四:收集人类血清样品,抽取血清总RNA并构建miRNA文库
本实例涉及8例正常人类血清样品以及32例非小细胞肺癌病人血清样品,40例样品均收集自上海市胸科医院,每例血清总量约500μl,收集的血清样品保存于-80℃。其中32例非小细胞肺癌分期明确,I期、II期、III期和IV期各为8例。
miRNA片段通过人体循环,存在于人类的血液、血浆和血清中。随着细胞生理代谢,小片段RNA会随着人体循环系统游走至人体体液内。然而血清中RNA含量较少,加之血清的获得量有限,因此本实例对RNA的抽提方法进行改良,以提高RNA产率和纯度,改善提取效率。改良操作步骤如下:
1. 在每100μl血清中加入900μl Total RNA Extractor裂解液,漩涡震荡混匀。
2. 将裂解后样品室温放置 5-10 min,使得核蛋白与核酸完全分离。
3. 加入0.2 ml 氯仿,剧烈振荡15 sec,室温放置3 min。
4. 12,000 rpm 4℃离心10 min。
5. 吸取上层水相转移至干净的离心管中,加入2.5倍体积乙醇,1/10倍体积3M醋酸钠,以及糖原(工作浓度为50ng/ml)。颠倒混匀后,-80℃放置30-60min。【以取500μl上层水相为例,则需加入1250μl乙醇,50μl醋酸钠以及4.5μl糖原原液(原液浓度为:20mg/ml)。】
6. 12,000 rpm 4℃离心10 min,弃上清。
7. 加入1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。12,000 rpm 4°C 离心3 min,弃上清。室温干燥5-10 min。
8. 加入25μl RNase-free ddH2O,充分溶解RNA。将所得到的RNA溶液置于-80℃保存或用于后续试验。
miRNA文库的构建方法与实施例二相似,逆转录过程使用Takara公司的One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒。需要注意的是:血清中提取所得的RNA总量有限,因此逆转录体系中,加入的总RNA量为300ng。
逆转录获得的产物体积为20μl,用dH2O把逆转录产物稀释至200μl,储存于-20℃,用于后续实验。
实施例五:qRT-PCR方法检测候选miRNA在血清样品中的表达变化
本实例所用的检测仪器为Bio-Rad公司的iQ5系统,试剂为Takara公司的SYBR PrimeScipt miRNA RT-PCR Kit(Code No. RR716)。实验模板为实施例四中获得的最终产物。miR-182 Forward Primer:
5'-TTTGGCAATGGTAGAACTCACACT-3',Reverse Primer:Uni-miR qPCR primer。U6-Forward Primer:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',Reverse Primer:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
具体操作方法如下:
1. 配置如下体系
2. 按照实施例二中的步骤设定仪器,上机检测。
每个样品分别检测U6及Hsa-miR-182的Ct值。结果处理方法如下:
①计算每个样品的ΔCt值。
ΔCt = CtmiR-182 - CtU6
②得到8例正常样品的平均ΔCt值,计算其平均值 。
③用每例样品的ΔCt值减去,得到ΔΔCt,根据公式计算2-ΔΔCt值,判断候选Hsa-miR-182在血清样品中的表达量。
通过上述方法,我们对实施例四中获得的40例血清miRNA样本进行检测。经检测,Hsa-miR-182在肺癌病人的血清中的平均表达量是正常人群的7倍左右。根据病人肿瘤分型进一步分析发现,Hsa-miR-182在不同分期样品中具有一定提高。在肿瘤发生的中后期(II期、III期、IV期)miR-182表达变化的平均水平约3-7倍,这与实施例二和实施例三的结果相符。值得注意的是,Hsa-miR-182在I期肺癌病人的血清中,其平均表达量提升了约15倍,这意味着miR-182在初期肺癌病人的血清中含量发生明显变化,这一变化证明,miR-182不仅能够成为NSCLC诊断的血清标记,它也是证明疾病早期发生的标记之一。Hsa-miR-182的应用有望在NSCLC的诊断中发挥重要作用,有助于改善病人治疗结果和生存情况。
尽管本发明描述了具体的例子,但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的——即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此,所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的改动。
Claims (2)
1.一种Hsa-miR-182的异常表达在作为非小细胞肺癌病人肺癌组织miRNA标记的应用。
2.一种Hsa-miR-182在制备筛选和诊断血清中非小细胞肺癌的试剂盒中的应用。
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Application publication date: 20150826 |
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