CN104849227A - 一种葛花降糖活性的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及葛花降糖活性的定量检测方法，可有效解决对葛花降糖活性进行定量检测问题，方法是，包括以下步骤：制备葛花供试药物、配制检测用溶液、制备对照品溶液、测定葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率、效价测定与计算，将葛花供试药物的剂量调整到0.17mg?mL^-1~0.68mg?mL^-1，对照品的剂量调整为0.0025mg?mL^-1~0.0100mg?mL^-1，方可进行效价测定，对照品的约定效价值为100U?mg^-1，并根据预实验进行葛花的效价估计，本发明操作简单、快捷，效果好，费用低，基于葛花对α-葡萄糖苷酶活性的抑制，对葛花样品的效价值进行测定及质量控制评价，具有良好的经济和社会效益。

Description

一种葛花降糖活性的定量检测方法

技术领域

    本发明属于中药领域，特别是一种葛花降糖活性的定量检测方法。

背景技术    

    现行中药质量控制方法主要借鉴化学药的质量控制模式与方法，即以定性、定量测定成分为主。然而中药不同于单一成分的化学药，一般来说中药成分极其复杂，单一成分难以代表体现中药整体，难以关联中药药效。由此，《中国药典》2010 年版编制大纲明确指出，要建立符合中医药特点的质量标准体系，逐步由单一指标性成分定性定量向活性、有效成分及生物测定的综合检测过渡，向多成分及和指纹或特征图谱整体质量控制模式转化。由此而制定的“中药生物活性测定指导原则”已被《中国药典》（一部）2010 年版附录收载。

葛花又名葛条花，为豆科植物葛Puerarialobata (Willd.) Ohwi的干燥花蕾。性凉、味甘,入阳明经。为传统中药，《神经农本草经》、《本草纲目》等记载其具有解酒醒脾、除烦止渴之功效,主治醉酒、发热烦渴等症。现代研究葛花所含化学成分非常复杂，有挥发油类、黄酮类等等，如丁香油酚、芳樟醇、苯甲酸甲酯、丙酸甲酯、异戊酸甲酯、正己酸甲酯、染料木素、槲皮素、葛花甙、槐花二醇、β-谷甾醇、葛花异黄酮等等，多数成分有明显药理活性。与葛花同基源（来源于同一植物的不同部位）的另外一种中药葛根被证明具有降低血糖的药理作用。葛花、葛根均在糖尿病的临床治疗中体现了良好的具有除烦止渴的功效，且基源相同，但是对于葛花的降糖作用鲜有研究，更是缺乏相应的生物活性检定方法用于葛花的质量控制评价。因此，急需建立对葛花降糖活性的定量检测方法。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC3.2.1.20）又叫α-D-葡萄糖苷水解酶，食物中的碳水化合物主要成分是淀粉，麦芽糖和蔗糖。淀粉和蔗糖(双糖）均不能直接被肠壁细胞吸收。唾液和胰α-淀粉酶(α-Amylase）使淀粉水解生成寡糖及二糖，寡糖及二糖还需要在小肠上皮绒毛膜刷状缘上的α-葡萄糖苷酶的作用下酶解生成单糖（葡萄糖）后才能被吸收。α-葡萄糖苷酶不仅可以从低聚糖类的非还原末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，而且在糖蛋白和糖脂的形成中也有关键的影响。在动物体内，它主要存在于小肠上半段的刷状缘上它对食物中碳水化合物的消化起着非常重要的作用。α-葡萄糖苷酶抑制剂是二十世纪八十年代出现的一类新的药物，它通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，延缓总体碳水化合物的消化时间，从而降低餐后高血糖，防治糖尿病并减少糖尿病并发症。现有上市的糖尿病治疗药物，如，阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等药物已取得了良好的临床治疗效果。目前筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂主要是根据Piere C等的方法，即以4-硝基酚-α-D-吡喃葡糖苷(p-Nitrophenol-α-glucopyramoside，

PNPG）为底物，在波长400nm(或 405nm）处测定在酶作用下释放出的有颜色的物质硝基酚(PNP）的量，如果反应体系中有影响酶活性的物质，则PNP的量会发生改变，所得吸光度也会改变，从而测定和计算抑制或促进酶的活性大小，分别可以用抑制率或促进率表示。

对于药品进行质量控制的生物活性测定法又称生物检定（bioassay），常用于抗生素、生物制剂的质量控制，它是严格按照药品检定要求设计试验，将药物在体内或体外的生物反应值经一定统计学处理，用以定性、定量或半定量的表征该药品质量。其中《中国药典》2010版.二部附录ⅪⅤ 生物检定统计法中规定的“量反应的平行线测定法（2·2）”法、“量反应的平行线测定法（3·3）”法等便是得到专业认可的药品效价测定方法。该类方法依据平行线测定原理，即待测样品与对照品在一定条件下的生物活性测定中“量—效关系曲线”保持平行，再对二者剂量与效应值进行统计学处理，便可得出被测样品的效价值。

发明内容    

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种葛花降糖活性的定量检测方法，可有效解决对葛花降糖活性进行定量检测问题。

本发明的技术方案为，包括以下步骤：

1）葛花供试药物的制备：

    将葛花药材净选，粉碎，加入葛花重量8~12倍的双蒸水浸泡25~35分钟，超声提取15~25分钟，抽滤，得葛花水提物母液，母液质量浓度为0.1g/mL，即为葛花供试药物，密封，闭光40℃保存；

2）检测用溶液的配制：

    （1）制备PBS磷酸缓冲液：

    将2.0-2.5g K₂HPO₄溶解在100mL双蒸水中，制成K₂HPO₄母液；称取3.2-3.6g KH₂PO₄溶解在100mL双蒸水中，制成KH₂PO₄母液；取K₂HPO₄母液30-31ml、KH₂PO₄母液29-31ml，混匀，得PBS磷酸缓冲液；

（2）制备α-葡萄糖苷酶溶液：

将30U/mg的α-葡萄糖苷酶冻干粉9-11mg溶于28-32ml的PBS磷酸缓冲液中，再加入55-65mg小牛血清白蛋白，混匀成α-葡萄糖苷酶溶液，4℃保存；

    （3）制备PNPG溶液：

将85-95mg PNPG溶于28-32ml双蒸水中，得PNPG溶液；

    （4）制备Na₂CO₃溶液：

将10-11g无水Na₂CO₃溶于90-110ml双蒸水中，得Na₂CO₃溶液；

3）制备对照品溶液：

    取对照品40~60mg，溶于0.5~1.5ml双蒸水中，离心，取上清，即得对照品溶液；所述的对照品为阿卡波糖、伏格列波糖或米格列醇的一种；

4）测定葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    在样品管中加入葛花供试药物0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；在空白管中加入PBS磷酸缓冲液0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；在背景管中加入PBS磷酸缓冲液0.3~0.4ml、对照品溶液0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；然后将上述溶液在35~40℃保温8~12min，向空白管和样品管中分别加入α-葡萄糖苷酶0.2~0.3ml，35~40℃保温 18~22min；向空白管、样品管和背景管中加入Na₂CO₃溶液0.4~0.6ml，静置4~6min，从上述管中分别取180~220μl 溶液置于96孔板中，在波长400nm处用酶标仪分别测定各孔板中溶液的吸光度OD值，每管做3个重复，取平均值计算，并将得到的吸光度OD值代入以下公式计算，得葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    酶活性抑制率=[OD空白组-(OD样品组-OD背景组)]/OD空白组×100%；

5）效价测定与计算：

    将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入中国药典生物检定统计程序BS2000进行计算，即得葛花样品的效价值，实现葛花质量的评价；

将葛花供试药物的剂量调整到0.17mg·mL^-1~0.68mg·mL^-1，对照品的剂量调整为0.0025mg·mL^-1~0.0100mg·mL^-1，方可进行效价测定，对照品的约定效价值为100U·mg^-1，并根据预实验进行葛花的效价估计（说明：1、关于对照品效价的约定：葛花的效价值是通过与标准品比较而来的，而标准品要经过国家法定部门认定，在国家认定前我们称之为“工作对照品”，其效价值首次要人为赋予，就像长度值最初来源是“通过巴黎的地球子午线全长的四千万分之一作为长度单位米”。一般约定单位重量的工作对照品生物效价为整数，为了方便计算，本试验中对照品的约定效价值为100U·mg^-1。效价的单位常用“U”表示. 2、关于被测样品的效价估计：葛花的效价估计不同批次样品估计值不一样，估计值主要依据预实验绘制对照品与被测样品的量效关系图（就像附图图4）进行估计，如某次实验（因为每次测定数据均不相同，为了方便说明数据纯粹假设）工作对照品在0.075 mg·mL^-1时的抑制率为50%，被测样品在0.4mg·mL^-1时的抑制率为50%，则被测样品估计效价为对工作照品效价的1/5.3）。

本发明操作简单、快捷，效果好，费用低，基于葛花对α-葡萄糖苷酶活性的抑制，对葛花样品的效价值进行测定及质量控制评价，具有良好的经济和社会效益。

附图说明    

图1为葛花抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究与测定的工艺路线图。

图2为阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用的结果示意图。

图3为葛花供试药物对α-葡萄糖苷酶的的抑制作用的结果示意图。

图4为葛花供试药物与对照品的量效关系曲线图。

图5为20个批次的葛花供试样品的α-葡萄糖苷酶的抑制作用检测结果的SPSS19.0聚类分析。

具体实施方式

    以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

本发明在具体实施中可由以下实施例给出。

实施例1

本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：

1）葛花供试药物的制备：

    将葛花药材净选，粉碎，加入葛花重量10倍的双蒸水浸泡30分钟，超声提取20分钟，抽滤，得葛花水提物母液，母液质量浓度为0.1g/mL，即为葛花供试药物，密封，闭光40℃保存；

2）检测用溶液的配制：

    （1）制备PBS磷酸缓冲液：

    将2.28g K₂HPO₄溶解在100mL双蒸水中，制成K₂HPO₄母液；称取3.4g KH₂PO₄溶解在100mL双蒸水中，制成KH₂PO₄母液；取K₂HPO₄母液29.8ml、KH₂PO₄母液30.2ml，混匀，得PBS磷酸缓冲液；

（2）制备α-葡萄糖苷酶溶液：

将30U/mg的α-葡萄糖苷酶冻干粉10mg溶于30ml的PBS磷酸缓冲液中，再加入60mg小牛血清白蛋白，混匀成α-葡萄糖苷酶溶液，4℃保存；

（3）制备PNPG溶液：

将90mg PNPG溶于30ml双蒸水中，得PNPG溶液；

（4）制备Na₂CO₃溶液：

将10.6g无水Na₂CO₃溶于100ml双蒸水中，得Na₂CO₃溶液；

3）制备对照品溶液：

    取对照品50mg，溶于1ml双蒸水中，离心，取上清，即得对照品溶液；所述的对照品为阿卡波糖、伏格列波糖或米格列醇的一种；

4）测定葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    在样品管中加入葛花供试药物0.1ml和PNPG溶液0.5ml，混匀；在空白管中加入PBS磷酸缓冲液0.1ml和PNPG溶液0.5ml，混匀；在背景管中加入PBS磷酸缓冲液0.35ml、对照品溶液0.1ml和PNPG溶液0.5ml，混匀；然后将上述溶液在35~40℃保温10min，向空白管和样品管中分别加入α-葡萄糖苷酶0.25ml，35~40℃保温 20min；向空白管、样品管和背景管中加入Na₂CO₃溶液0.5ml，静置5min，从上述管中分别取200μl 溶液置于96孔板中，在波长400nm处用酶标仪分别测定各孔板中溶液的吸光度OD值，每管做3个重复，取平均值计算，并将得到的吸光度OD值代入以下公式计算，得葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    酶活性抑制率=[OD空白组-(OD样品组-OD背景组)]/OD空白组×100%；

5）效价测定与计算：

将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入中国药典生物检定统计程序BS2000进行计算，即得葛花样品的效价值，实现葛花质量的评价。

实施例2

本发明在具体实施中，还可由以下步骤实现

1）葛花供试药物的制备：

    将葛花药材净选，粉碎，加入葛花重量9倍的双蒸水浸泡26分钟，超声提取16分钟，抽滤，得葛花水提物母液，母液质量浓度为0.1g/mL，即为葛花供试药物，密封，闭光40℃保存；

2）检测用溶液的配制：

    （1）制备PBS磷酸缓冲液：

    将2.1g K₂HPO₄溶解在100mL双蒸水中，制成K₂HPO₄母液；称取3.3g KH₂PO₄溶解在100mL双蒸水中，制成KH₂PO₄母液；取K₂HPO₄母液30.2ml、KH₂PO₄母液29.2ml，混匀，得PBS磷酸缓冲液；

（2）制备α-葡萄糖苷酶溶液：

将30U/mg的α-葡萄糖苷酶冻干粉9.2mg溶于28.3ml的PBS磷酸缓冲液中，再加入55.2mg小牛血清白蛋白，混匀成α-葡萄糖苷酶溶液，4℃保存；

    （3）制备PNPG溶液：

将86mg PNPG溶于28.2ml双蒸水中，得PNPG溶液；

    （4）制备Na₂CO₃溶液：

将10.2g无水Na₂CO₃溶于92ml双蒸水中，得Na₂CO₃溶液；

3）制备对照品溶液：

    取对照品42mg，溶于0.6ml双蒸水中，离心，取上清，即得对照品溶液；所述的对照品为阿卡波糖、伏格列波糖或米格列醇的一种；

4）测定葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    在样品管中加入葛花供试药物0.07ml和PNPG溶液0.42ml，混匀；在空白管中加入PBS磷酸缓冲液0.07ml和PNPG溶液0.42ml，混匀；在背景管中加入PBS磷酸缓冲液0.32ml、对照品溶液0.07ml和PNPG溶液0.42ml，混匀；然后将上述溶液在35~40℃保温9min，向空白管和样品管中分别加入α-葡萄糖苷酶0.22ml，35~40℃保温 19min；向空白管、样品管和背景管中加入Na₂CO₃溶液0.42ml，静置4.5min，从上述管中分别取190μl 溶液置于96孔板中，在波长400nm处用酶标仪分别测定各孔板中溶液的吸光度OD值，每管做3个重复，取平均值计算，并将得到的吸光度OD值代入以下公式计算，得葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    酶活性抑制率=[OD空白组-(OD样品组-OD背景组)]/OD空白组×100%；

5）效价测定与计算：

    将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入中国药典生物检定统计程序BS2000进行计算，即得葛花样品的效价值，实现葛花质量的评价。

实施例3

本发明在具体实施中，也可由以下步骤实现

1）葛花供试药物的制备：

    将葛花药材净选，粉碎，加入葛花重量11倍的双蒸水浸泡33分钟，超声提取23分钟，抽滤，得葛花水提物母液，母液质量浓度为0.1g/mL，即为葛花供试药物，密封，闭光40℃保存；

2）检测用溶液的配制：

    （1）制备PBS磷酸缓冲液：

    将2.4g K₂HPO₄溶解在100mL双蒸水中，制成K₂HPO₄母液；称取3.5g KH₂PO₄溶解在100mL双蒸水中，制成KH₂PO₄母液；取K₂HPO₄母液30.8ml、KH₂PO₄母液30.8ml，混匀，得PBS磷酸缓冲液；

（2）制备α-葡萄糖苷酶溶液：

将30U/mg的α-葡萄糖苷酶冻干粉10.8mg溶于31ml的PBS磷酸缓冲液中，再加入63mg小牛血清白蛋白，混匀成α-葡萄糖苷酶溶液，4℃保存；

    （3）制备PNPG溶液：

将93mg PNPG溶于31ml双蒸水中，得PNPG溶液；

    （4）制备Na₂CO₃溶液：

将10.8g无水Na₂CO₃溶于108ml双蒸水中，得Na₂CO₃溶液；

3）制备对照品溶液：

    取对照品58mg，溶于1.3ml双蒸水中，离心，取上清，即得对照品溶液；所述的对照品为阿卡波糖、伏格列波糖或米格列醇的一种；

4）测定葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    在样品管中加入葛花供试药物0.18ml和PNPG溶液0.58ml，混匀；在空白管中加入PBS磷酸缓冲液0.18ml和PNPG溶液0.58ml，混匀；在背景管中加入PBS磷酸缓冲液0.38ml、对照品溶液0.18ml和PNPG溶液0.58ml，混匀；然后将上述溶液在35~40℃保温11min，向空白管和样品管中分别加入α-葡萄糖苷酶0.28ml，35~40℃保温21min；向空白管、样品管和背景管中加入Na₂CO₃溶液0.58ml，静置5.5min，从上述管中分别取210μl 溶液置于96孔板中，在波长400nm处用酶标仪分别测定各孔板中溶液的吸光度OD值，每管做3个重复，取平均值计算，并将得到的吸光度OD值代入以下公式计算，得葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    酶活性抑制率=[OD空白组-(OD样品组-OD背景组)]/OD空白组×100%；

5）效价测定与计算：

    将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入中国药典生物检定统计程序BS2000进行计算，即得葛花样品的效价值，实现葛花质量的评价。

本发明提供了一种葛花降糖活性的研究与测定方法。采用了如图1所示的中药提取、α葡萄糖苷酶活性检测方法等技术手段。建立的葛花降糖生物活性定量检测方法，技术方案是：葛花药材→研究体外α葡萄糖苷酶活性的影响→建立体外α-葡萄糖苷酶抑制活性检测方法→采用《中国药典》规定的“生物检定统计”设计、优化、规范检测实验→采用“中国药典生物检定统计程序BS2000”对检测结果进行统计处理→对多批葛花生物活性（α-葡萄糖苷酶抑制活性）进行定量的检测。

本发明首次建立以药效为基础的葛花质量生物测定方法，作为药典常规和化学测定的补充与提高，能够从多重角度共同把关其内在质量，完善现行质量控制和评价方法与标准，并能为其它药效物质不明确的中药质量控制与品质评价研究提供新的思路和参考。对于葛花作为糖尿病治疗药物的开发和质量控制评价具有重要意义。

本发明工艺简单，能对葛花降糖活性进行快速定量检测，经试验取得了满意的效果，有关试验结果如下：

实验1  α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型的建立

本发明研究表明葛花供试药物具有体外抑制α-葡萄糖苷酶的活性，且在一定浓度范围内具有明显量效关系。阿卡波糖（O-4,6-双脱氧-4[[(1S,4R,5S,6S)4,5,6-三羟基-3-(羟基甲基)-2-环己烯]氨基]-(-D-吡喃葡糖基(1→4)-O-)-D-吡喃葡糖基(1→4)-D-吡喃葡萄糖，经验分子式（希尔表示法） C25H43NO18 ，acarbose，CAS：56180-94-0）是当前公认的具有体外抑制α-葡萄糖苷酶而具有降糖作用的物质。本研究中以化学性质稳定的阿卡波糖为对照品（或称工作对照品），为计算需要，在此约定工作对照品的效价值（PS）为100.0U·mg^-1，按照量反应的平行线测定法（3·3）设计试验。

以阿卡波糖为对照品，通过对样品管和背景管做4个浓度梯度，以检测抑制活性的强弱。如图2所示：随着阿卡波糖含量的增多，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用也随之增强，当体系中阿卡波糖的含量仅为0.033mg时，对α-葡萄糖苷酶抑制作用的抑制率可达到86.34%。当体系中阿卡波糖的含量为0.165mg时，对α-葡萄糖苷酶抑制作用的抑制率可达到89.91%。当体系中阿卡波糖含量增加10倍，为0.33mg时，对α-葡萄糖苷酶抑制作用的抑制率可达到94.29%。结果表明：阿卡波糖作为阳性对照药来检测实验体系的可行性。

如图3所示：随着体系中葛花水提物含量的增多，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用也随之增强。当体系中提取物浓度相当于1mg葛花药材时，对α-葡萄糖苷酶抑制作用的抑制率可达到75.92%。当体系中提取物浓度相当于2mg葛花药材时，对α-葡萄糖苷酶抑制作用的抑制率可达到90.69%。当体系中提取物浓度相当于4mg葛花药材时，对α-葡萄糖苷酶抑制作用的抑制率可达到92.56%。当体系中提取物浓度增加到8mg葛花药材时，对α-葡萄糖苷酶抑制作用的抑制率可达到99.67%。葛花供试药物与阳性对照药阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶作用的量效关系曲线形状基本相同，说明二者有基本相同的药理作用。

实验2  基于α-葡萄糖苷酶抑制活性的葛花供试药物效价测定

具体方法与步骤同本发明实施例1所列的样品制备与测定方法，为效价计算的方便，需根据预实验与对待测样品（葛花）的效价估计，对供试样品与对照品（阿卡波糖）的加样量进行必要调整，保证反应强度围绕抑制率(T)在50%上下，并保证供试品与工作对照品反应的量效关系曲线平行，如图4，上图可以看出在葛花在0.17mg·mL^-1～0.68mg·mL^-1剂量范围内，阿卡波糖在0.0025mg·mL^-1～0.0100mg·mL^-1剂量范围内，其量效关系均呈现良好的线性（R＞99%）。待测样品与工作对照品在线性范围内反应曲线呈良好的平行关系（符合生物检定统计法基本要求）。可以进行效价的比对与计算。

将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入“中国药典生物检定统计程序BS2000”进行计算，结果需通过可靠性检验 (即直线回归P < 0.01, 偏离平行、二次曲线和反向二次曲线都必须P>0.05 ,平均可信限率( FL% ) 在15% 以内)。如下是一样品测定结果的可靠性检验示例：

样品名称	葛花
		S大剂量	0.25
T大剂量	0.255
		T估计效价	1.5U
剂 间 比	0.5

可靠性测验结果

变异来源	df	差方和	方差	F值	P值
						试品间	1	5.2083E-5	5.2083E-5	<1	>0.05
回归	1	0.30654	0.30654	990.33	<0.01
						偏离平行	1	8E-6	8E-6	<1	>0.05
二次曲线	1	0.0012327	0.0012327	3.9823	>0.05
						反向二次曲线	1	4.1667E-6	4.1667E-6	<1	>0.05
剂间	5	0.30784	0.061568	198.9	<0.0
						误差	6	0.0018572	0.00030954
总	11

效价及可信限计算结果如下

sm=0.01567

测得效价 PT=1.4491U

测得效价的可信限率为 FL=8.8381%

测得效价的可信限范围为1.3263 ～1.5825U

结果表明，该批样品效价值是1.4491U·mg-1可信限率为 FL=8.8381%，即该批样品的测得效价值在1.3263 ～1.5825U·mg^-1之间是可信的，结果能够通过可靠性检验。

实验3方法学考察：

1）精密度

按上述条件, 取同一份样品的供试液（0.34mg·mL^-1）,连续进行5 次吸光度测定并计算抑制率,分别为：55.3%、51.1%、54.3%、53.1%、52.6%，结果的变异系数RSD 为3.02%，说明仪器精密度良好。

2）重复性

同一批样品分提取, 制成供试品溶液, 按上法分别与工作对照品溶液进行对比检定, 计算效价分别为：1.56U·mg^-1、1.42U·mg^-1、1.44 U·mg^-1、1.45 U·mg^-1、1.36 U·mg^-1。 5 次测定的效价RSD 为5.03%, 表明该方法具有较好的重复性。

3）稳定性考察

分别于0、1、2、3 和4 h 将保存于4 ℃的同一供试品溶液进行效价检测,结果分别为：1.54 U·mg^-1、1.56 U·mg^-1、1.56 U·mg^-1、1.42 U·mg^-1、1.41 U·mg^-1。其RSD 为5.09%,表明供试品溶液在4 ℃条件下保存4 h 是稳定的。

4）方法适用性考察

    依据上述方法对20批葛花样品进行检测。结果表2：

表2：样品效价测定结果

No.	PT（U·mg-1）	FL%	No.	PT（U·mg-1）	FL%
						01	1.49	0.12	11	1.15	0.12
02	1.53	0.09	12	1.46	0.14
						03	1.96	0.05	13	1.77	0.03
04	1.58	0.08	14	1.62	0.04
						05	2.34	0.10	15	2.44	0.09
06	2.67	0.13	16	2.57	0.16
						07	2.31	0.06	17	1.44	0.07
08	1.23	0.08	18	1.53	0.04
						09	1.38	0.14	19	0.54	0.09
10	1.55	0.09	20	0.69	0.07

采用SPSS19.0软件包中的系统聚类分析程序，以20批葛花样品效价测定结果为变量，根据组内联结距离的大小进行聚类分组，组内联结距离越小者，最先聚为一类。树形图见图5。

可见：当样品间组内联结距离小于5时，第19、20批聚为一类，第5、6、7、15、16批聚为一类，其余各批样品聚为一类。聚为一类的样品差异较小。其中5、6、7批购自河南某葛根GAP种植基地，15、16批购自北京同仁堂药店，此5批按常规鉴别均为品质较好批次；19、20批为药房陈年存货，经常规鉴别为不合格品；其余各批购自亳州药材市场，经常规鉴定为合格品。

上述不同批次样品显示出不同效价值。如果以体外降糖活性为指标进行效价计算，并用以表征葛花质量，可以对不同产地不同批次葛花样品进行定量的评价。说明方法的适用性较好、方法可行。

本发明首次发现了中药葛花抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用；首次计算并绘制了葛花体外抑制α-葡萄糖苷酶药理活性的量效关系图；建立和完善了用于葛花质量生物活性测定的评价方法。本发明的意义与价值为：

1. 对于葛花具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用的发现，有助于完善葛花作为中药的药理作用机制。

2. 有助于指导葛花在临床上对于糖尿病疾病的治疗作用。

3. 有助于提高现有葛花质量控制水平。

本发明的葛花供试药物的选择不局限于水提液，可利用本发明的技术方案进一步探索有机溶剂提取、沉淀等常规中药提取手段制成的供试药物的治疗糖尿病的前景，对照品的选择不局限于阿卡波糖、伏格列波糖或米格列醇。

本发明操作简单、快捷，效果好，费用低，基于葛花对α-葡萄糖苷酶活性的抑制，对葛花样品的效价值进行测定及质量控制评价，具有良好的经济和社会效益。

Claims (5)

1.一种葛花降糖活性的定量检测评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）葛花供试药物的制备：

    将葛花药材净选，粉碎，加入葛花重量8~12倍的双蒸水浸泡25~35分钟，超声提取15~25分钟，抽滤，得葛花水提物母液，母液质量浓度为0.1g/mL，即为葛花供试药物，密封，闭光40℃保存；

2）检测用溶液的配制：

    （1）制备PBS磷酸缓冲液：

    将2.0-2.5g K₂HPO₄溶解在100mL双蒸水中，制成K₂HPO₄母液；称取3.2-3.6g KH₂PO₄溶解在100mL双蒸水中，制成KH₂PO₄母液；取K₂HPO₄母液30-31ml、KH₂PO₄母液29-31ml，混匀，得PBS磷酸缓冲液；

（2）制备α-葡萄糖苷酶溶液：

将30U/mg的α-葡萄糖苷酶冻干粉9-11mg溶于28-32ml的PBS磷酸缓冲液中，再加入55-65mg小牛血清白蛋白，混匀成α-葡萄糖苷酶溶液，4℃保存；

    （3）制备PNPG溶液：

将85-95mg PNPG溶于28-32ml双蒸水中，得PNPG溶液；

    （4）制备Na₂CO₃溶液：

将10-11g无水Na₂CO₃溶于90-110ml双蒸水中，得Na₂CO₃溶液；

3）制备对照品溶液：

    取对照品40~60mg，溶于0.5~1.5ml双蒸水中，离心，取上清，即得对照品溶液；所述的对照品为阿卡波糖、伏格列波糖或米格列醇的一种；

4）测定葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    在样品管中加入葛花供试药物0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；在空白管中加入PBS磷酸缓冲液0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；在背景管中加入PBS磷酸缓冲液0.3~0.4ml、对照品溶液0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混匀；然后将上述溶液在35~40℃保温8~12min，向空白管和样品管中分别加入α-葡萄糖苷酶0.2~0.3ml，35~40℃保温 18~22min；向空白管、样品管和背景管中加入Na₂CO₃溶液0.4~0.6ml，静置4~6min，从上述管中分别取180~220μl 溶液置于96孔板中，在波长400nm处用酶标仪分别测定各孔板中溶液的吸光度OD值，每管做3个重复，取平均值计算，并将得到的吸光度OD值代入以下公式计算，得葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    酶活性抑制率=[OD空白组-(OD样品组-OD背景组)]/OD空白组×100%；

5）效价测定与计算：

将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入中国药典生物检定统计程序BS2000进行计算，即得葛花样品的效价值，实现葛花质量的评价。

2.根据权利要求1所述的葛花降糖活性的定量检测评价方法，其特征在于，将葛花供试药物的剂量调整到0.17mg·mL^-1~0.68mg·mL^-1，对照品的剂量调整为0.0025mg·mL^-1~0.0100mg·mL^-1，方可进行效价测定，对照品的约定效价值为100U·mg^-1，并根据预实验进行葛花的效价估计。

3.根据权利要求1所述的葛花降糖活性的定量检测评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）葛花供试药物的制备：

    将葛花药材净选，粉碎，加入葛花重量10倍的双蒸水浸泡30分钟，超声提取20分钟，抽滤，得葛花水提物母液，母液质量浓度为0.1g/mL，即为葛花供试药物，密封，闭光40℃保存；

2）检测用溶液的配制：

    （1）制备PBS磷酸缓冲液：

    将2.28g K₂HPO₄溶解在100mL双蒸水中，制成K₂HPO₄母液；称取3.4g KH₂PO₄溶解在100mL双蒸水中，制成KH₂PO₄母液；取K₂HPO₄母液29.8ml、KH₂PO₄母液30.2ml，混匀，得PBS磷酸缓冲液；

（2）制备α-葡萄糖苷酶溶液：

将30U/mg的α-葡萄糖苷酶冻干粉10mg溶于30ml的PBS磷酸缓冲液中，再加入60mg小牛血清白蛋白，混匀成α-葡萄糖苷酶溶液，4℃保存；

（3）制备PNPG溶液：

将90mg PNPG溶于30ml双蒸水中，得PNPG溶液；

（4）制备Na₂CO₃溶液：

将10.6g无水Na₂CO₃溶于100ml双蒸水中，得Na₂CO₃溶液；

3）制备对照品溶液：

    取对照品50mg，溶于1ml双蒸水中，离心，取上清，即得对照品溶液；所述的对照品为阿卡波糖、伏格列波糖或米格列醇的一种；

4）测定葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    在样品管中加入葛花供试药物0.1ml和PNPG溶液0.5ml，混匀；在空白管中加入PBS磷酸缓冲液0.1ml和PNPG溶液0.5ml，混匀；在背景管中加入PBS磷酸缓冲液0.35ml、对照品溶液0.1ml和PNPG溶液0.5ml，混匀；然后将上述溶液在35~40℃保温10min，向空白管和样品管中分别加入α-葡萄糖苷酶0.25ml，35~40℃保温 20min；向空白管、样品管和背景管中加入Na₂CO₃溶液0.5ml，静置5min，从上述管中分别取200μl 溶液置于96孔板中，在波长400nm处用酶标仪分别测定各孔板中溶液的吸光度OD值，每管做3个重复，取平均值计算，并将得到的吸光度OD值代入以下公式计算，得葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    酶活性抑制率=[OD空白组-(OD样品组-OD背景组)]/OD空白组×100%；

5）效价测定与计算：

将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入中国药典生物检定统计程序BS2000进行计算，即得葛花样品的效价值，实现葛花质量的评价。

4.根据权利要求1所述的葛花降糖活性的定量检测评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）葛花供试药物的制备：

    将葛花药材净选，粉碎，加入葛花重量9倍的双蒸水浸泡26分钟，超声提取16分钟，抽滤，得葛花水提物母液，母液质量浓度为0.1g/mL，即为葛花供试药物，密封，闭光40℃保存；

2）检测用溶液的配制：

    （1）制备PBS磷酸缓冲液：

    将2.1g K₂HPO₄溶解在100mL双蒸水中，制成K₂HPO₄母液；称取3.3g KH₂PO₄溶解在100mL双蒸水中，制成KH₂PO₄母液；取K₂HPO₄母液30.2ml、KH₂PO₄母液29.2ml，混匀，得PBS磷酸缓冲液；

（2）制备α-葡萄糖苷酶溶液：

将30U/mg的α-葡萄糖苷酶冻干粉9.2mg溶于28.3ml的PBS磷酸缓冲液中，再加入55.2mg小牛血清白蛋白，混匀成α-葡萄糖苷酶溶液，4℃保存；

    （3）制备PNPG溶液：

将86mg PNPG溶于28.2ml双蒸水中，得PNPG溶液；

    （4）制备Na₂CO₃溶液：

将10.2g无水Na₂CO₃溶于92ml双蒸水中，得Na₂CO₃溶液；

3）制备对照品溶液：

    取对照品42mg，溶于0.6ml双蒸水中，离心，取上清，即得对照品溶液；所述的对照品为阿卡波糖、伏格列波糖或米格列醇的一种；

4）测定葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    在样品管中加入葛花供试药物0.07ml和PNPG溶液0.42ml，混匀；在空白管中加入PBS磷酸缓冲液0.07ml和PNPG溶液0.42ml，混匀；在背景管中加入PBS磷酸缓冲液0.32ml、对照品溶液0.07ml和PNPG溶液0.42ml，混匀；然后将上述溶液在35~40℃保温9min，向空白管和样品管中分别加入α-葡萄糖苷酶0.22ml，35~40℃保温 19min；向空白管、样品管和背景管中加入Na₂CO₃溶液0.42ml，静置4.5min，从上述管中分别取190μl 溶液置于96孔板中，在波长400nm处用酶标仪分别测定各孔板中溶液的吸光度OD值，每管做3个重复，取平均值计算，并将得到的吸光度OD值代入以下公式计算，得葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    酶活性抑制率=[OD空白组-(OD样品组-OD背景组)]/OD空白组×100%；

5）效价测定与计算：

    将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入中国药典生物检定统计程序BS2000进行计算，即得葛花样品的效价值，实现葛花质量的评价。

5.根据权利要求1所述的葛花降糖活性的定量检测评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）葛花供试药物的制备：

    将葛花药材净选，粉碎，加入葛花重量11倍的双蒸水浸泡33分钟，超声提取23分钟，抽滤，得葛花水提物母液，母液质量浓度为0.1g/mL，即为葛花供试药物，密封，闭光40℃保存；

2）检测用溶液的配制：

    （1）制备PBS磷酸缓冲液：

    将2.4g K₂HPO₄溶解在100mL双蒸水中，制成K₂HPO₄母液；称取3.5g KH₂PO₄溶解在100mL双蒸水中，制成KH₂PO₄母液；取K₂HPO₄母液30.8ml、KH₂PO₄母液30.8ml，混匀，得PBS磷酸缓冲液；

（2）制备α-葡萄糖苷酶溶液：

将30U/mg的α-葡萄糖苷酶冻干粉10.8mg溶于31ml的PBS磷酸缓冲液中，再加入63mg小牛血清白蛋白，混匀成α-葡萄糖苷酶溶液，4℃保存；

    （3）制备PNPG溶液：

将93mg PNPG溶于31ml双蒸水中，得PNPG溶液；

    （4）制备Na₂CO₃溶液：

将10.8g无水Na₂CO₃溶于108ml双蒸水中，得Na₂CO₃溶液；

3）制备对照品溶液：

    取对照品58mg，溶于1.3ml双蒸水中，离心，取上清，即得对照品溶液；所述的对照品为阿卡波糖、伏格列波糖或米格列醇的一种；

4）测定葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    在样品管中加入葛花供试药物0.18ml和PNPG溶液0.58ml，混匀；在空白管中加入PBS磷酸缓冲液0.18ml和PNPG溶液0.58ml，混匀；在背景管中加入PBS磷酸缓冲液0.38ml、对照品溶液0.18ml和PNPG溶液0.58ml，混匀；然后将上述溶液在35~40℃保温11min，向空白管和样品管中分别加入α-葡萄糖苷酶0.28ml，35~40℃保温21min；向空白管、样品管和背景管中加入Na₂CO₃溶液0.58ml，静置5.5min，从上述管中分别取210μl 溶液置于96孔板中，在波长400nm处用酶标仪分别测定各孔板中溶液的吸光度OD值，每管做3个重复，取平均值计算，并将得到的吸光度OD值代入以下公式计算，得葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

    酶活性抑制率=[OD空白组-(OD样品组-OD背景组)]/OD空白组×100%；

5）效价测定与计算：

    将葛花供试药物的剂量、对照品的剂量、葛花对α-葡萄糖苷酶活性抑制率、对照品的约定效价值、待测样品的估计效价值分别输入中国药典生物检定统计程序BS2000进行计算，即得葛花样品的效价值，实现葛花质量的评价。