CN104846052A - 环境水体致基因突变的遗传毒性检测技术及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种环境水体致基因突变的遗传毒性检测技术及应用，属于环境科学和健康风险评价领域。本发明以致基因突变能力为检测终点，以96孔微孔板作为SOS/umu实验的实验载体，包括环境水体的前处理过程、细菌染毒过程、结果检测和数据分析方法。本发明所用实验方法简化了现有SOS/umu实验的操作流程，提高了实验通量和实验效率，为完善水体遗传毒性监测技术体系提供了支持。

Description

环境水体致基因突变的遗传毒性检测技术及应用

技术领域

本发明涉及环境科学和健康风险评价领域，是检测环境样品遗传毒性的高通量实验方法，是通过改进的SOS/umu实验检测环境水体样品致基因突变能力大小的方法及其应用。

背景技术

环境水体样品综合遗传毒性检测可以了解环境污染对人群健康的危害效应，是环境健康综合监测中不可或缺的环节。传统的环境监测仅关注环境样品的理化指标，如具体污染物含量等，但无法回答其是否具有健康危害效应。且多种污染物共同存在时其综合毒性效应可能会发生改变。遗传毒性依据其检测原理不同有多种实验方法，基因突变与肿瘤等多种的发生相关是遗传毒性检测的重点研究内容之一。

适用于检测环境水体基因突变遗传毒性的研究方法有待进一步完善。以基因突变为检测终点的遗传毒性实验包括Ames试验、TK基因突变试验、SOS/umu实验等。其中Ames试验是通过鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型(his-)菌株在受试物的作用下回复突变的能力大小进行检测的。其操作步骤较为简单，应用比较广泛，但需要进行大量细菌的培养，给实验造成一定难度。TK基因突变实验是利用哺乳动物体细胞基因正向突变的试验，细胞在受试物的作用下若能够引起TK基因突变，则在三氟苷(TFT)等嘧啶类似物的存在下细胞依然能够存活，否则细胞死亡。TK基因突变试验可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍型和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变，但在实际应用中，使用该方法检测基因突变能力前为排除自发突变产生的tk^-/-细胞，需对细胞进行4天的预培养，耗时较长；另在实验开始前还需进行预实验确定合适的染毒浓度，这使得该方法在实际应用中较为复杂。SOS/umu实验是基于DNA损伤物诱导SOS反应而表达umuC基因的能力。正常情况下，生物体内的修复蛋白的mRNA合成受到阻遏蛋白LexA的抑制，表达量较低。当DNA两条链的都有损伤且损伤不能被修复时，细胞或细菌会进行SOS修复。SOS修复激活RecA蛋白介导LexA蛋白裂解，使SOS相关基因umuC、umuD等大量表达。在鼠伤寒沙门菌TA1535中导入携带umuC”LacZ嵌合体的质粒pSK1002，当细菌受诱变物作用引起SOS反应时，激活umuC”LacZ融合基因，表达出有β-半乳糖甘酶活性的融合蛋白，通过检测此酶的活性可以确定受试物引起DNA损伤的程度，若加入S9混合液，则可以检测化学物是否经代谢活化生成损害DNA的产物。SOS/umu实验操作简单，结果准确，在环境水体遗传毒性检测中已有一定程度的应用，但现有的实验方法仍存在一定不足之处。SOS/umu实验中为保证实验结果的准确性，一个样品通常设定5-6个浓度梯度，并设3个重复样，导致实验组较多，工作量较大，使其在大规模的环境水体遗传毒性综合监测中的应用带来不便。

改进后的SOS/umu实验可用于环境水体遗传毒性监测，提高实验效率。本发明对现有的SOS/umu实验进行了实验方法方面的改进，通过使用96孔微孔板，简化了实验流程，并可同时进行多个样品的遗传毒性测试工作，提高检测效率。

发明内容

本发明提供一种改进后的SOS/umu高通量检测方法，所述方法选用96孔微孔板作为反应容器，在实验操作时一个96孔板可同时测定4个样品，且96孔板操作方便快捷，可提高检测通量，能够满足大量的环境水体样品遗传毒性监测的需求。

本发明所述的SOS/umu实验方法包括水样前处理、染毒、结果检测以及结果分析等内容。

1水样前处理

(1)活化滤膜：使用活化后的0.45μm的玻璃纤维滤膜过滤水样，去除水样中粒径较大的杂质。活化方法为：使用马弗炉将0.45μm的玻璃纤维滤膜(GF/A，70mm，Whatman)于450℃-500℃温度下活化3h，活化后放在干燥器中室温平衡24h以上，使用前1h用超纯水再活化；

(2)HLB固相萃取柱活化：使用HLB固相萃取柱(Waters Oasis，6mL)富集水体中的有机物等，用于遗传毒性检测。每根HLB固相萃取柱先用6mL二氯甲烷浸泡5min，然后使溶液缓慢流出，待液面与上层滤板平行后，关上闸门，加入6mL甲醇，使二氯甲烷溶液完全流出后再关上闸门，之后加入6mL超纯水使之缓慢流出，最后柱内留有少量超纯水；

(3)过滤：待泥沙沉淀之后，再进行过滤。将0.45μm的玻璃纤维滤膜放于砂芯过滤装置对应位置，砂芯过滤装置连接真空泵(1500MA)进行过滤，过滤后的水样用润洗干净的棕色玻璃瓶保存。

(4)水样过柱：将HLB固相萃取柱安置在固相萃取仪顶端接口处，固相萃取柱顶端与大流量采样器相连，将采样器的采样头放置于装有过滤后的水样的玻璃瓶中；将固相萃取仪与抽滤瓶和真空泵连接，打开真空泵并小心开启固相萃取仪的阀门，调节每根柱子的流量，流速控制在6～8mL/min，每根HLB柱富集2L水样。富集完成后用真空泵抽干部分柱内水分，用氮吹仪将柱子吹干，若不立即使用可在-20℃保存。

(5)样品洗脱：在通风橱内，用10mL丙酮对HLB柱进行洗脱，使丙酮在无外力情况下自然流下，洗脱液用50mL棕色玻璃瓶收集，残留的丙酮用洗耳球吹下。丙酮可以稍微过量一些，保证样品洗脱液达到10mL。

(6)合并相同样品：将相同样品的洗脱液进行合并，首先对丙酮洗脱液进行氮吹浓缩，剩余约200μL后合并相同水样至同一样品管，将其它各管用少量丙酮冲洗3-4次，同样合并到同一样品管中，用氮吹仪吹至完全干燥。

(7)按照1L水样定容至10μL浓缩液的比例用DMSO定容样品，-20℃保存。

2试剂及配制

(1)TGA增菌液：10g胰蛋白胨、5g氯化钠，11.9g羟乙基哌嗪硫磺酸，溶于980mL蒸馏水中调pH为7.0±0.2，溶解2g葡葡糖到20mL蒸馏水中，分别高压灭菌后，将灭菌后的溶液混合，并在无菌条件下加入50mg氨苄青霉素，此溶液在-20℃保存4周。

(2)10×TGA：(不加S9实验)溶解胰蛋白胨10g，NaCl 5g，HEPES 11.9g于80mL蒸馏水中，调节PH为7.0±0.2；溶解葡萄糖2g于20mL蒸馏水中，分别以121℃高压20分钟灭菌；将灭菌后溶液混合，在无菌条件下加入50mg氨卞青霉素。(加S9实验)溶解胰蛋白胨10g，NaCl 5g，KCl 2.46g，MgCl₂·6H₂O 1.63g，HEPES 11.9g于80mL蒸馏水中，调节PH为7.0±0.2；溶解葡萄糖2g于20mL蒸馏水中，分别以121℃高压20分钟灭菌；将灭菌后溶液混合，在无菌条件下加入50mg氨卞青霉素。

(3)磷酸盐缓冲溶液：1.086g Na₂HPO₄·2H₂O和0.538g NaH₂PO₄·H₂O溶于100mL水中，调pH为7.0±0.2，高压灭菌。

(4)B-buffer溶液：Na₂HPO₄·2H₂O 2.018g，NaH₂PO₄·H₂O 0.55g，KCl 0.075g，MgSO₄7H₂O 0.025g，用100mL蒸馏水溶解，调pH为7.0±0.2，高压灭菌后加入0.1g SDS，使用前加入270μL的β-巯基乙醇，在2-5℃冰箱中保存备用。

(5)辅助因子：临用时溶解6-磷酸葡萄糖(G-6-P)76mg、辅酶(NADP)148mg于5mL 10×TGA中，实验操作需在冰上进行。

(6)4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)用作不加S9阳性对照：溶解4-NQO 5mg于5mLDMSO中，-20℃保存；临用前用含30％DMSO的溶液稀释2000倍。

(7)2-氨基蒽(2-AA)用作加S9时的阳性对照：溶解2-AA 5mg于5mL DMSO，-20℃保存(避光)；临用前用含30％DMSO的溶液稀释500倍。

(8)二甲基亚砜(DMSO)为稀释溶液和溶剂对照，配制成30％的水溶液。

(9)显色剂邻硝基苯半乳糖苷(ONPG)为酶反应底物：溶解ONPG 45mg于10mL磷酸盐缓冲液中(临用前2h配置，避光)。

(10)碳酸钠为酶反应阻断液：Na₂CO₃ 10.6g溶于100mL蒸馏水中，配制成1mol/L的溶液，使用前20min配制以避免出现沉淀。

(11)十二烷基硫酸钠(SDS)

(12)二氯甲烷、甲醇、丙酮、(均为HPLC级)

(13)氢氧化钠：c(NaOH)＝1mol/L分析纯

(14)盐酸：c(HCl)＝1mol/L分析纯

(15)纯水：符合GB6682实验室用水规格中一级水标准的水，即电导率≤0.01μs/cm(25℃)，吸光度≤0.001(254nm，1cm光程)，二氧化硅含量≤0.01mg/L

(16)S9：从酶诱导剂。

注：

(1)2-氨基蒽在配置及储存过程中同ONPG一样，要严格避光。

(2)4-NQO以及2-氨基蒽在实验前用DMSO配制成1g/L的储备液。前者在使用前用DMSO/水(3∶7)作2000倍稀释；后者在使用前用DMSO/去离子水(3∶7)作500倍稀释。

(3)TGA和10×TGA中可以加入11.9g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，可降低实验难度。

(4)在加S9的实验中，10×TGA中还要加入2.46g KCl/100mL，1.63g MgCl₂·6H₂O/100mL；使用前再向5mL溶液中加入148mg NADP/5mL 10×TGA，76mg G-6-P/5mL10×TGA，配制成含辅助因子的10×TGA，注意操作需在冰上进行。

(5)S9不可以反复冻融，解冻过程要缓慢进行，加入到其它体系中前要振荡均匀，使用过程中需在冰上进行。

3 SOS/umu试验步骤

大鼠肝脏微粒体酶系统(S9)作为体外代谢活化，实验分别在加和不加S9两种情况(+S9，-S9)下进行。以下为不加S9时的实验步骤。

(1)细菌复苏：

接种鼠伤寒沙门氏菌TA 1535/pSK1002菌株：从-80℃冰箱中取出菌株，缓慢解冻后混匀吸取100μL原菌液加入到10mL TGA培养基中，150-180r/min，37℃±1℃，振荡孵育过夜。第二天用TGA培养液10倍稀释，37℃振荡孵育1.5-3h。

(2)细菌预培养：

实验前一天晚上按照复苏过程接种菌株，第二天用TGA培养液10倍稀释，37℃振荡孵育1.5-3h，以TGA培养基为空白对照，测定600nm(紫外光)处的细菌溶液吸光度在340到350FNU之间，即测量值为0.25-0.3。此时，细菌处于指数生长期，正适合实验要求，须尽快进行实验。

(3)染毒

按照下面96孔微孔板示意图所示对待测水样的遗传毒性进行检测，每个样品最高浓度为加入10μL水样浓缩液(相当于1L水样，S)，按照等体积稀释的方法，依次设置浓度梯度：S、1/2S、1/4S、1/8S、1/16S、1/32S。同时用去离子水作为空白对照，30％DMSO水溶液作为阴性对照，0.5μg/mL 4-NQO作为阳性对照进行实验。

具体实验步骤如下：

1)加样品：

地下水水样最高染毒浓度为10μL水样浓缩液，然后依次2倍稀释为5μL、2.5μL、1.25μL、0.625μL、0.313μL，分别相当于1L、0.5L、0.25L、0.0125L、0.063L、0.031L水样体积；地表水水样最高染毒浓度为8μL水样浓缩液，然后依次2倍稀释为4μL、2μL、1μL、0.5μL、0.25μL，分别相当于0.8L、0.4L、0.2L、0.01L、0.05L、0.025L水样体积。

2)加对照：

向阳性对照孔加入终浓度为50ng/mL的4-NQO

向阴性对照组加入27μL 30％的DMSO，补足到180μL

空白对照只加180μL ddH₂O

3)加菌液：

向每个孔中加入10×TGA 20μL；

向每个孔中加入70μL菌液，混匀(从右至左)；

向空白对照孔中加入70μL TGA培养基，混匀。

此为培养板A

(4)培养：

1)盖上培养板A盖子，37℃±1℃，振荡培养2h，120r/min-150r/min，注意防止交叉污染；

2)准备一个新的96孔板B，每孔加入270μL TGA培养基，预热至37℃±1℃；从培养板A每孔中吸取30μL培养物至新培养板相对应的孔中；同样培养2小时。

(5)测试：

1)测培养板B在600nm下的吸光光度值(A600nm)；

2)准备96孔板C，每孔中加入120μL B-buffer，预热至28℃±1℃；吸取板B中菌液30μL至C中对应孔，迅速加入30μL ONPG，混匀；28℃±1℃振荡培养30分钟；

3)向每孔中加入120μL的反应阻断液，混匀并用冷气流去气泡，测其在600nm下的吸光光度值(A600nm)。

4)高压灭菌所用器具。

大鼠肝脏微粒体酶系统(S9)是肝匀浆液的去线粒体上清液，其主要有效成分为混合功能氧化酶系统，是许多体外实验常用的体外代谢活化系统。许多前致突变剂、致癌剂本身可能不具有强遗传毒性，但经体内生物转化后性质发生变化从而具有较强遗传毒性，其生物转化是依赖微粒体混合功能氧化酶系来完成的。因此，加S9的实验可以检测污染物经代谢后诱导细菌基因突变的能力。

加S9的SOS/umu实验其基本操作流程和结果计算方法和遗传毒性评判同不加S9的实验基本一致，仅有以下几点不同：

1)用2-氨基蒽作为阳性对照；

2)10×TGA培养基中需提前加入辅助因子(即溶解6-磷酸葡萄糖(G-6-P)76mg、辅酶(NADP)148mg于5mL 10×TGA中)；

3)在向样品孔与阳性、阴性、溶剂对照孔中加入70μL菌液前，需向15mL菌液中加入450μL S9，同理，加入空白对照孔中的TGA培养基中也需提前加入S9。

4结果计算

β-半乳糖酶(U)活性计算公式：

β-半乳糖酶活性(U)＝(A420_样品-A420_空白)/(A600_样品-A600_空白)

生长因子(G)活性计算公式：

生长因子(G)＝(A600_样品-A600_空白)/(A600_DMSO-A600_空白)

诱导率(R)计算公式：

诱导率(R)＝(A420_样品-A420_空白)/(A420_DMSO-A420_空白)/G

结果还可以以阳性对照物4-NQO的当量浓度来表示：

以不同浓度的受试样品或不同浓度的4-NQO为横坐标，以U值为纵坐标得到标准曲线，该曲线的斜率即为IR_样品(unit/L)或IR_4-NQO(unit/μg)，可以计算得到样品的4-NQO等当量浓度TEQ_4-NQO(ug/L)。

TEQ_4-NQO＝IR_S/IR_4-NQO

浅层地下水的致癌风险计算方法：

按照成年人体重65kg，每日饮水量1.6L，则样品基于SOS/umu实验遗传毒性效应的致癌风险为：

P＝[(TEQ_4-NQO×0.001×1.5)/65]×0.369

其中，S：样品结果；B：空白对照结果；N：阴性对照结果。

A420：菌液在420nm波长下的吸光度(显色剂ONPG的显色强度)

A600：菌液在600nm波长下的吸光度(菌液浊度)

注：G＞0.5的数据可用；R≥2可判断阳性。

附图说明

图1为本发明的流程图。

具体实施方式

本发明是对环境水体样品进行SOS/umu遗传毒性检测的高通量实施方法，该方法已应用于淮河流域环境健康综合监测中，检测了部分地表水、地下水的遗传毒性，对其实际应用进行了探索和完善。具体应用情况如下：

分别在F市部分地区的3个村庄采集了12个地下水样品，1个集中供水样品，以及3个地表水样品，按照发明内容中所示步骤对采集的样品进行了前处理、细菌培养、染毒以及结果计算分析等试验步骤。具体采样点信息见表1。表1水样采集信息

1水样前处理

每个样品采集水样至少10L，经活化的0.45μm的玻璃纤维滤膜过滤后，使用HLB固相萃取柱(活化)富集其中有机物，每根HLB柱富集2L水样。富集完成后吹干HLB柱并保存。之后使用丙酮洗脱富集物，合并相同样品后用氮气吹干，实验前用10μL DMSO定容。

2微核实验

本实验测定了不加S9的情况下水体样品的遗传毒性。

(1)细菌培养：实验前一天下午复苏细菌，取出冻存的鼠伤寒沙门氏菌TA 1535/pSK1002菌株，室温复苏后取100μL原菌液加入到10mL TGA培养基中，振荡孵育过夜。第二天用TGA培养液10倍稀释，37℃振荡孵育1.5-3h，使细菌处于指数生长期后即可进行实验。

(2)染毒：按照发明内容中步骤，准备一个96孔板进行待测水样染毒，按照最大染毒剂量10μL，并依此按2倍稀释设置5个浓度梯度。同时设置空白对照、阴性对照、阳性对照。

细菌经两次培养之后，首先检测其在600nm下的吸光光度值，再加入反应底物检测β-半乳糖苷酶活性，加入反应终止液之后检测其在420nm下的吸光光度值。

3结果计算

通过反应体系在600nm和420nm下的吸光光度值，可以计算得到β-半乳糖酶活性(U_S)、诱导率(IR)的结果，具体实验结果如表2所示。由于其他较低的染毒剂量下其IR值均较低，因此结果中只展示了0.5L和1.0L体积水样浓缩液的检测结果。

表2地下水和地表水SOS/umu实验结果

当受试水样具有较高的遗传毒性时，细菌受损伤越严重，会发生较多的SOS反应，从而使umu表达量增加并伴随着具有β-半乳糖酶活性的蛋白表达量增加。因此，β-半乳糖酶活性活性越高，说明水样的遗传毒性越大，诱导率(IR)的值也越高，实际水样的诱导率IR≥2则可判断为阳性，即可以认为水样有遗传毒性。

从结果可以看出，地表水中JH和YH水体样品的致突变能力较强，遗传毒性较大，因此可能对周围沿岸居民的健康造成一定的威胁；多个地下水样品在最高染毒剂量下也表现出较高的遗传毒性，对于以其为生活用水的居民健康具有较大威胁。

因此，通过SOS/umu实验可以发现，该地区部分地表水、地下水的遗传毒性较大，其健康威胁较大，对其周围居民，尤其以遗传毒性较高的地下水样品作为生活用水的居民的健康威胁较大，应引起注意并停止继续饮用。

4SOS/umu实验的实际应用

通过SOS/umu实验检测环境水体样品遗传毒性，有助于在环境污染物监测的基础上丰富对其健康效应的认识，完善环境健康综合监测技术体系。

本发明在传统的SOS/umu实验的基础上，通过采用96孔微孔板作为实验工具，简化了SOS/umu实验的操作步骤，提高了实验通量和实验效率，有助于推进SOS/umu实验技术在环境水体致基因突变的综合监测中的推广应用。

Claims (7)

1.一种环境水体致基因突变的遗传毒性高通量检测方法，所述方法为改进的SOS/umu实验方法，具体包括水样前处理、染毒、结果检测以及结果分析等步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其中具体步骤：

(1)环境水体样品采集之后首先经过0.45μm玻璃纤维滤膜过滤、HLB固相萃取柱富集以及丙酮洗脱、合并，以及干燥等具体前处理步骤；

(2)实验试剂配制；

(3)细菌的复苏与预培养、染毒剂量设定、染毒后细菌培养以及最后结果测定；

(4)通过样品在600nm和420nm下的吸光光度值计算得到β-半乳糖酶活性(U)、诱导率(R)，进而判断其是否具有遗传毒性。

3.如权利要求2所述的方法，其中步骤(1)具体为：

(1)活化滤膜：使用活化后的0.45μm的玻璃纤维滤膜过滤水样，去除水样中粒径较大的杂质；活化方法为：使用马弗炉将0.45μm的玻璃纤维滤膜(GF/A，70mm，Whatman)于450℃-500℃温度下活化3h，活化后放在干燥器中室温平衡24h以上，使用前1h用超纯水再活化；

(2)HLB固相萃取柱活化：使用HLB固相萃取柱(Waters Oasis，6mL)富集水体中的有机物等，用于遗传毒性检测；每根HLB固相萃取柱先用6mL二氯甲烷浸泡5min，然后使溶液缓慢流出，待液面与上层滤板平行后，关上闸门，加入6mL甲醇，使二氯甲烷溶液完全流出后再关上闸门，之后加入6mL超纯水使之缓慢流出，最后柱内留有少量超纯水；

(3)过滤：待泥沙沉淀之后，再进行过滤；将0.45μm的玻璃纤维滤膜放于砂芯过滤装置对应位置，砂芯过滤装置连接真空泵(1500MA)进行过滤，过滤后的水样用润洗干净的棕色玻璃瓶保存；

(4)水样过柱：将HLB固相萃取柱安置在固相萃取仪顶端接口处，固相萃取柱顶端与大流量采样器相连，将采样器的采样头放置于装有过滤后的水样的玻璃瓶中；将固相萃取仪与抽滤瓶和真空泵连接，打开真空泵并小心开启固相萃取仪的阀门，调节每根柱子的流量，流速控制在6～8mL/min，每根HLB柱富集2L水样。富集完成后用真空泵抽干部分柱内水分，用氮吹仪将柱子吹干，若不立即使用可在-20℃保存；

(5)样品洗脱：在通风橱内，用10mL丙酮对HLB柱进行洗脱，使丙酮在无外力情况下自然流下，洗脱液用50mL棕色玻璃瓶收集，残留的丙酮用洗耳球吹下；丙酮可以稍微过量一些，保证样品洗脱液达到10mL；

(6)合并相同样品：将相同样品的洗脱液进行合并，首先对丙酮洗脱液进行氮吹浓缩，剩余约200μL后合并相同水样至同一样品管，将其它各管用少量丙酮冲洗3-4次，同样合并到同一样品管中，用氮吹仪吹至完全干燥；

(7)按照1L水样定容至10μL浓缩液的比例用DMSO定容样品，-20℃保存。

4.如权利要求2所述的方法，其中步骤(2)具体为：

(1)TGA增菌液：10g胰蛋白胨、5g氯化钠，11.9g羟乙基哌嗪硫磺酸，溶于980mL蒸馏水中调pH为7.0±0.2，溶解2g葡萄糖到20mL蒸馏水中，分别高压灭菌后，将灭菌后的溶液混合，并在无菌条件下加入50mg氨苄青霉素，此溶液在-20℃保存4周；

(2)10×TGA：不加S9实验：溶解胰蛋白胨10g，NaCl 5g，HEPES 11.9g于80mL蒸馏水中，调节PH为7.0±0.2；溶解葡萄糖2g于20mL蒸馏水中，分别以121℃高压20分钟灭菌；将灭菌后溶液混合，在无菌条件下加入50mg氨卞青霉素；

加S9实验：溶解胰蛋白胨10g，NaCl 5g，KCl 2.46g，MgCl₂·6H₂O 1.63g，HEPES 11.9g于80mL蒸馏水中，调节PH为7.0±0.2；溶解葡萄糖2g于20mL蒸馏水中，分别以121℃高压20分钟灭菌；将灭菌后溶液混合，在无菌条件下加入50mg氨卞青霉素；

(3)磷酸盐缓冲溶液：1.086g Na₂HPO₄·2H₂O和0.538g NaH₂PO₄·H₂O溶于100mL水中，调pH为7.0±0.2，高压灭菌；

(4)B-buffer溶液：Na₂HPO₄·2H₂O 2.018g，NaH₂PO₄·H₂O 0.55g，KCl 0.075g，MgSO₄7H₂O 0.025g，用100mL蒸馏水溶解，调pH为7.0±0.2，高压灭菌后加入0.1g SDS，使用前加入270μL的β-巯基乙醇，在2-5℃冰箱中保存备用；

(5)辅助因子：临用时溶解6-磷酸葡萄糖(G-6-P)76mg、辅酶(NADP)148mg于5mL 10×TGA中，实验操作需在冰上进行；

(6)4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)用作不加S9阳性对照：溶解4-NQO 5mg于5mL DMSO中，-20℃保存；临用前用含30％DMSO的溶液稀释2000倍；

(7)2-氨基蒽(2-AA)用作加S9时的阳性对照：溶解2-AA 5mg于5mL DMSO，-20℃保存(避光)；临用前用含30％DMSO的溶液稀释500倍；

(8)二甲基亚砜(DMSO)为稀释溶液和溶剂对照，配制成30％的水溶液；

(9)显色剂邻硝基苯半乳糖苷(ONPG)为酶反应底物：溶解ONPG 45mg于10mL磷酸盐缓冲液中(临用前2h配置，避光)；

(10)碳酸钠为酶反应阻断液：Na₂CO₃10.6g溶于100mL蒸馏水中，配制成1mol/L的溶液，使用前20min配制以避免出现沉淀。

5.如权利要求2所述的方法，其中步骤(3)具体为：

(1)细菌复苏：

接种鼠伤寒沙门氏菌TA 1535/pSK1002菌株：从-80℃冰箱中取出菌株，缓慢解冻后混匀吸取100μL原菌液加入到10mL TGA培养基中，150-180r/min，37℃±1℃，振荡孵育过夜。第二天用TGA培养液10倍稀释，37℃振荡孵育1.5-3h；

(2)细菌预培养：

实验前一天晚上按照复苏过程接种菌株，第二天用TGA培养液10倍稀释，37℃振荡孵育1.5-3h，以TGA培养基为空白对照，测定600nm(紫外光)处的细菌溶液吸光度在340到350FNU之间，即测量值为0.25-0.3；

(3)染毒

按照下面96孔微孔板示意图所示对待测水样的遗传毒性进行检测，每个样品最高浓度为加入10μL(S)水样浓缩液，按照等体积稀释的方法，依次设置浓度梯度：S、1/2S、1/4S、1/8S、1/16S、1/32S。同时用去离子水作为空白对照，30％DMSO水溶液作为阴性对照，0.5μg/mL 4-NQO作为阳性对照进行实验。

6.如权利要求2所述的方法，其中步骤(4)具体为：

β-半乳糖酶(U)活性计算公式：

β-半乳糖酶活性(U)＝(A420_样品-A420_空白)/(A600_样品-A600_空白)

生长因子(G)活性计算公式：

生长因子(G)＝(A600_样品-A600_空白)/(A600_DMSO-A600_空白)

诱导率(R)计算公式：

诱导率(R)＝(A420_样品-A420_空白)/(A420_DMSO-A420_空白)/G

结果还可以以阳性对照物4-NQO的当量浓度来表示：

以不同浓度的受试样品或不同浓度的4-NQO为横坐标，以Us值为纵坐标得到标准曲线，该曲线的斜率即为IR_样品(unit/L)或IR_4-NQO(unit/μg)，可以计算得到样品的4-NQO等当量浓度TEQ_4-NQO(ug/L)。

TEQ_4-NQO＝IR_S/IR_4-NQO

浅层地下水的致癌风险计算方法：

按照成年人体重65kg，每日饮水量1.6L，则样品基于SOS/umu实验遗传毒性效应的致癌风险为：

P＝[(TEQ_4-NQO×0.001×1.5)/65]×0.369

其中，S：样品结果；B：空白对照结果；N：阴性对照结果；

A420：菌液在420nm波长下的吸光度(显色剂ONPG的显色强度)

A600：菌液在600nm波长下的吸光度(菌液浊度)

注：G＞0.5的数据可用；R≥2可判断阳性。

7.如权利要求1-6之一所述的方法在检测环境水体样品致基因突变毒性中的应用。