CN104845909A - 一株芡实根际促生细菌及其应用和菌剂 - Google Patents

一株芡实根际促生细菌及其应用和菌剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株芡实根际促生细菌，其分类命名为地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)Q67，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014652，本发明的芡实根际促生细菌Q67能够明显促进芡实幼苗的生长发育，提高芡实生长的土壤环境中可利用氮素的含量。本发明还涉及到上述芡实根际促生细菌在制备菌剂中的应用，结果显示，该菌剂可明显提高芡实种子的发芽率。

Description

一株芡实根际促生细菌及其应用和菌剂
技术领域
本发明涉及农业微生物领域，具体涉及一株芡实根际促生细菌，以及该细菌在微生物菌剂上的应用。
背景技术
芡实，又名：鸡头米、鸡头荷、鸡头莲、刺莲藕、假莲藕、湖南根等，是苏州地区一种具有代表性的水生蔬菜品种，其生产历史悠久，具有比较鲜明的特色，生产量逐年增加。芡实具有较高的营养价值及药用价值，在苏州“水八仙”种植地区所占比例较高，经济意义重大。长期以来，人们在芡实的种植中多采用化学肥料和农药，这虽然能够在一定程度上保证芡实的产量及品质，但长期以往极易造成土壤质量的下降并易导致农药残留等问题。随着人们环保意识的增强和对食品安全的重视，迫切的需要开发出一种适用于芡实等水生植物的生物产品，减少化学肥料的使用、提高作物的品质。
微生物对植物生长的作用至关重要，微生物一方面分解土壤中的有机物质形成腐殖质并释放出养分，另一方面又转化土壤碳素和固定无机营养元素。植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是一群定植于植物根际、与植物根密切相关的根际细菌，当接种于植物种子、根系、块根、块茎或土壤时，能够促进植物的生。研究表明，PGPR主要通过两个方面对植物起作用：一是分泌植物激素、有机酸等物质促进植物生长，或是改变土壤中营养元素的形态，使其更易于植物吸收，提高化肥的利用率；二是通过产生抗生素、铁载体或是营养竞争等方式抑制病原菌的生长，减缓植物病害。因此，利用PGPR菌株制备微生物促生菌剂，对农业无害化生产，提高作物的产量和品质具有十分重要的意义。但目前有关芡实根际促生细菌的研究尚未见报道。
有关PGPR的研究与应用技术不断被报道，微生物菌剂就是其中之一。目前促生菌剂已经大量的应用在旱地蔬菜上，并且取得了良好的效果。由于水体环境的特殊性，在菌株的选择和菌剂的使用方式上，水生蔬菜和旱地蔬菜具有很大的差异，目前尚未有专门针对芡实等水生植物的促生菌剂。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明从芡实根际土壤分离得到PGPR菌株地衣芽孢杆菌Q67(Baclicus lincheniformis)，通过发酵、载体吸附等方式制备成微生物菌剂，提高芡实的质量和产量，为水生作物的无害化生产奠定基础。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株芡实根际促生细菌，分离命名为地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)Q67，在本发明也称之为芡实根际促生细菌Q67，于2014年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014652。
所述芡实根际促生细菌Q67是一株兼性厌氧菌，在微氧环境中可良好生长。
所述芡实根际促生细菌Q67的特征为：菌落白色，一段时间后产生红色素，表面粗糙，非常干燥，不透明，边缘小锯齿状，中间点状突起，有褶皱，直径2～4mm。镜检具体呈杆状，长1.5～3.0μm，宽0.6～0.8μm，单生或集群，芽孢中生。
所述芡实根际促生细菌Q67的生理生化特征为：革兰氏染色阳性，接触酶阳性，产H2S，M.R实验阳性，V-P实验阳性，柠檬酸盐阳性，苯丙氨酸脱氨酶阴性，淀粉水解实验阳性，葡萄糖产酸不产气，硝酸盐还原阳性，吲哚实验阴性，明胶液化实验阳性，15-55℃范围生长，7％NaCl生长实验阳性。
所述芡实根际促生细菌Q67具有良好的生物学性质，可分泌蛋白酶、ACC-脱氨酶，可产生玉米素、激动素等植物激素，其发酵液中含有甲酸、乳酸、丙酸和丁二酸等有机酸。
所述芡实根际促生细菌Q67最适发酵条件为：糖蜜+淀粉(1.5:1)5％，豆粕粉2％，K2HPO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCO3 0.06％，pH 8.0，接种量为5％，种龄18h，装液量为500mL的三角瓶装液100mL。摇床转速为225r/min，发酵时间为44h，初始发酵温度为30℃，36h后升温至36℃。
本发明还公开了所述的芡实根际促生细菌在制备微生物菌剂中的应用。
本发明还公开了一种液态微生物菌剂，含有上述芡实根际促生细菌。
所述液态微生物菌剂的制备方法为：培养芡实根际促生细菌，得菌悬液，所述菌悬液作为液态微生物菌剂。
所述菌悬液的浓度为1×108～5×108CFU/mL。
本发明还公开了一种固态微生物菌剂，含有上述芡实根际促生细菌。
所述固态微生物菌剂的制备方法为：培养芡实根际促生细菌，得菌悬液，将菌悬液与载体混匀，制备成固态微生物菌剂。
所述菌悬液的浓度为1×109～2×109CFU/mL，固态微生物菌剂中有效活菌数为2×108～4×108CFU/g。
所述载体为蛭石和稻壳粉的混合物。
所述蛭石和稻壳粉的质量比比为2-5:0.5-1.5。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的芡实根际促生细菌Q67能够明显促进芡实幼苗的生长发育，提高芡实生长的土壤环境中可利用氮素的含量；
(2)采用本发明的液态微生物菌剂浸泡芡实种子，可明显提高芡实种子的发芽率。将本发明的芡实根际促生细菌Q67与蛭石、稻壳粉等载体混匀制备成固态微生物菌剂，施用于芡实幼苗根系周围，可显著促进芡实幼苗的根系发育，提高根部质量及根系活力等指标；增加芡实幼苗的叶片数、叶面积、生物量，促进叶片叶绿素的合成；提高土壤中硝态氮和铵态氮的含量；
(3)本发明为开发芡实等水生植物促生菌剂提供了优良的菌株资源，并为水生蔬菜的无害化生产奠定了良好的基础。
保藏信息
本发明的芡实根际促生细菌Q67，分类命名为地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)Q67，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014652，保藏日期为2014年12月25日。
说明书附图
图1是实施例3中盆栽试验对比图。
具体实施方式
以下通过芡实促生细菌Q67的分离试验、生物学特性分析试验和芡实苗期盆栽试验为例，对本发明进行进一步详细的说明。下述实施例中的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂市场购买得到，以下的“％”如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1：芡实根际促生细菌的筛选及鉴定
1、筛选过程
从苏州澄湖农业园区“水八仙”种植基地区芡实根际土壤样品，通过梯度稀释法，从根际土样中共分离得到236个细菌分离物，将其分别挑至无机磷培养基、有机磷培养基、解钾培养基和脱脂牛奶培养基上，培养基表明加盖一层水琼脂，尽量模拟水田中的少氧环境。培养5～7d后，挑选能够菌落周围形成透明圈的细菌分离物，分别筛选出磷细菌、钾细菌和蛋白酶产生菌，反复纯化后保存备用。通过保绿法、萝卜子叶增重法对以上菌株做进一步筛选，共得到12株对小麦叶片具有良好保绿效果的菌株、8株对萝卜子叶促生作用较为明显的菌株，增长率在234.25％～438.43％之间。综合比较分析，筛选出1株高产蛋白酶、对小麦叶片保绿和萝卜子叶增重效果均较好的菌株，将其命名为芡实根际促生细菌Q67。
2、芡实根际促生细菌Q67的生物学特性分析
(1)溶磷、解钾能力分析：
将保存的芡实根际促生细菌Q67活化后接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，200r/min，28℃摇床培养20h。无菌条件下利用浊度计将供试菌株菌液调节到相同的浊度为0.7％，制成种子液。将2mL种子液分别接种到40mL溶磷、解钾培养基中，28℃，200r/min培养6d。采用钼锑抗比色法测定培养液中的磷含量；原子吸收分光光度计测定钾含量。每株供试菌种做3个平行测定。取灭活的菌液作为空白对照。结果如表1所示。
表1 Q67的溶磷、解钾能力分析
速效磷(mg/L) 增加量(％) 速效钾(mg/L) 增加量(％)
对照(CK) 2.56±0.35b - 1.80±0.13b -
Q67 3.89±0.29a 51.95 2.08±0.09a 15.56
从表1可以看出，芡实根际促生细菌Q67菌液具有一定的溶磷、解钾效果，其发酵液中的磷、钾含量分别比对照高出51.95％和15.56％。可见，芡实根际促生细菌Q67对环境中难溶的磷、钾能元素具备良好的活化作用，有利于营养元素的释放，提高肥料的利用率。
(2)产蛋白酶能力分析：
将芡实根际促生细菌Q67活化后接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，200r/min，28℃摇床培养20h，制备成种子液。按2％的比例将种子液接种到装有发酵培养基的试管中，30℃，200r/min培养5d。培养完毕后，将各试管置于40℃水浴中预热2min，分别加入经同样预热的酪蛋白1mL，精确保温10min。时间到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL，以终止反应。继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤。另取试管2支，编号1、2，每管内加入滤液1mL；加0.4mol碳酸钠5mL，已稀释的福林试剂1mL，摇匀；40℃保温发色20min后进行光密度(OD)测定；空白试验也取试管2支，编号(1)、(2)，测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。每1min生成1μg酪氨酸所需酶量定义为一个酶活(IU)。
结果显示，发酵液中蛋白酶活性约为12.72IU，这说明芡实根际促生细菌Q67是一株高产蛋白酶菌株，蛋白酶可以水解土壤中的蛋白质，为水生植物田间提供大量的氮源，因此芡实根际促生细菌Q67在肥料的生产中具有较好的应用潜力。
(3)产ACC-脱氨酶能力分析：
将芡实根际促生细菌Q67在TSB培养液中24h的纯培养物4℃离心收集，用DF母液洗涤离心两次，菌体重悬浮于ADF培养液，在28℃摇床200r/min条件下培养24h，以诱导产生ACC脱氨酶。4℃离心(8000r/min，10min)收集菌体，用0.1M Tris-HC1缓冲液(pH 7.6)洗涤离心两次，重悬浮于600μL 0.1M Tris-HC1缓冲液(pH 8.5)中。加入30μL甲苯并迅速振荡30s以破碎细胞。
转移200μL含甲苯的细胞提取物于1.5mL离心管中，加入20μL 0.5M ACC混匀，立即于30℃水浴反应15min。加入1mL 0.56M HCl后混合均匀，离心(14000r，5min)取1mL上清液(空白直接取lmL pH为8.5的Tris-HCI缓冲液)加入800μL 0.56M HCL，再加入300μL 0.2％的2,4-二硝基苯肼(溶2M HCl溶液中)试剂，摇匀后30℃反应30min。加入2mL 2M NaOH显色，测540nm波长的OD值。以a-丁酮酸制作标准曲线，根据提取液中a-丁酮酸的含量，计算出单位时间ACC脱氨酶催化ACC生成a-丁酮酸的量，即单位酶活力，用μmol/min表示。
结果表明，芡实根际促生细菌Q67发酵液中ACC-脱氨酶活性为0.093μmolα-酮酸/mg.pro。ACC-脱氨酶能够将植物乙烯前体ACC分解成为a-丁酮酸和氨，从而可大大减少植物有害乙烯的产生，促进植物的生长发育，缓解植物对不良反应的影响。
(4)芡实根际促生细菌Q67发酵液中植物激素和有机酸含量测定
本发明采用高效液相色谱(HPLC)法研究芡实根际促生细菌Q67发酵产生植物激素的情况。色谱分析中，GA3、IAA、ZT、KT和脱落酸标准品分别在6.084min、11.230min、5.635min和16.084min时出现特征吸收峰，玉米素在2.897min、3.457min时出现2个特征吸收峰。根据出峰时间和峰面积对芡实根际促生细菌Q67发酵产物进行分析。结果表明，芡实根际促生细菌Q67能够合成玉米素和激动素，含量分别为4.96mg/L和0.55mg/L。
有机酸标准品分析显示，甲酸、乙酸、草酸、丙酸、丙二酸、柠檬酸和乳酸分别在3.554min、4.886min、3.126min、10.096min、4.383min、6.450min和4.652min分钟出现吸收峰，丁二酸在7.213和8.281min，酒石酸在3.423和9.390min出现2个吸收峰，苹果酸在4.055、8.204、7.380min时出现3个吸收峰。根据出峰时间和峰面积初步判断芡实根际促生细菌Q67发酵液中含有甲酸、乳酸、丙酸和丁二酸4种有机酸。
3、芡实根际促生细菌Q67的鉴定
参考《常见细菌系统鉴定手册》对芡实根际促生细菌Q67生理生化特征进行分析，结果为：革兰氏染色阳性，接触酶阳性，产H2S，M.R实验阳性，V-P实验阳性，柠檬酸盐阳性，苯丙氨酸脱氨酶阴性，淀粉水解实验阳性，葡萄糖产酸不产气，硝酸盐还原阳性，吲哚实验阴性，明胶液化实验阳性，15-55℃范围生长，7％NaCl生长实验阳性。
16S rDNA序列，见核苷酸序列表所示。将所测16S rDNA序列提交GenBank进行分析，选择相似度较高种属的模式株进行比对，结果表明：芡实根际促生细菌Q67与地衣芽孢杆菌模式株(登录号：CP000002)的相似度达99％。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，于2014年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014652。
实施例2：微生物菌剂应用及制备
将芡实根际促生细菌Q67活化后接种至NA培养基中制备种子液，以5％的比例接种至发酵培养基中，震荡培养48h，调节菌体浓度约为109CFU/mL。
液态微生物菌剂：取一部分上述发酵液用无菌水稀释至5×108CFU/mL，作为液态微生物菌剂。
固态微生物菌剂：将载体(蛭石：稻壳粉＝4：1)灭菌后分装在已灭菌的塑料袋中备用，在无菌条件下，将上述一部分发酵液与载体充分混匀，制备成固态微生物菌剂，活菌数约为3.1×108CFU/g。
实施例3：芡实苗期盆栽试验
(1)芡实种子发芽率测定：
1L去离子水加入100mL液态微生物菌剂，用磁力搅拌器搅拌约2h，静置30min，取上清液浸种(20颗种子)约1h，同时设置清水浸种对照。对芡实种子进行催芽，各处理3次重复。采用液态微生物菌剂浸种的芡实种子，相比于对照发芽率明显升高。菌剂浸泡过的种子，7～10d的发芽率约为45％，对照的发芽率仅为30％。可见，芡实根际促生细菌Q67制备液态微生物菌剂能够促进芡实种子的发芽，进一步证实了芡实根际促生细菌Q67能够分泌植物激素。
(2)盆栽试验：
试验共设计2个处理，处理1：对照(CK)；处理2：芡实根际促生细菌50g。采用直径约50cm，深度约40cm的塑料桶，每桶装塘泥约5kg(干重)并加适量清水，放置2～3d使塘泥刚好处于松软稀松的状态。按照各处理要求施加复合肥混匀作为底肥，2d后接种固态微生物菌剂，接种方式同复合肥。土壤平衡3d后加入清水，水位高约10cm，继续平衡4d。取长势一致的芡实幼苗移栽，每盆5颗。将各处理置于光照培养箱中培养，每日光照14h，光照强度为4000lx，控制湿度为白天60％，夜晚75％。随植株生长逐步加深水深，以利叶柄伸长，培养期为40d。
种植40d后，处理1(A)和处理2(B)的芡实生长情况见图1，分别测定芡实的茎长、叶片数量、叶面积、生物量等指标，三次重复取平均值，结果见表2。
表2各处理芡实幼苗的农艺性状
处理 茎长(cm) 单株叶片数(片) 最大叶面积(cm2) 干质量(g)
对照(CK) 18.49±0.91b 3.08±0.41b 7.17±0.68b 1.29±0.06
促生菌剂 23.20±1.32a 3.88±0.26a 12.52±0.70a 1.94±0.12
表2显示，接种固态微生物菌剂后，苗期芡实的茎长、单株叶片数、最大叶面积以及干质量量等指标均显著升高，增加幅度分别为25.47％、25.97％、74.62％和50.39％，经t检验分析，差异均达到显著水平。
采用丙酮浸提法测定植株叶片的叶绿素含量，结果显示，对照植株叶片的叶绿素含量为1.73mg/g，施加固态微生物菌剂的植株叶片叶绿素含量为2.15mg/g，这说明本发明的芡实促生菌剂剂促进了幼苗叶片叶绿素的合成，有利于叶片的光合作用，这对植株定植后的生长发育起到至关重要的作用。
本发明研究了固态微生物菌剂对植株根系发育的影响，结果见表3。
表3芡实根系发育情况
处理 根部干质量(g) 根冠比(％) 根系活力(μg/g-1FW·h-1)
对照(CK) 0.21±0.03b 19.62±0.04a 6.08±0.26b
促生菌剂 0.34±0.04a 21.37±0.05a 6.93±0.15a
表3结果显示，固态微生物菌剂有效提高了芡实幼苗的根系发育水平，施加菌剂的植株根部干质量、根冠比分别比对照高出61.90％和8.92％，根系活力则高出对照10.63％。
从表4可以看出，施加固态微生物菌剂有效提高了土壤中氮素的含量，硝态氮和铵态氮含量分别比对照高出25.85％和35.56％，植物可利用的营养成分显著增加。
表4芡实根际土壤中可利用氮素的含量(盆栽试验)
硝态氮(mg/kg) 增加量(％) 铵态氮(mg/kg) 增加量(％)
对照(CK) 18.92±1.35b - 14.71±1.13b -
促生菌剂 23.81±2.09a 25.85 19.50±1.29a 35.56
由上可见，本发明的芡实根际促生细菌Q67能够明显促进芡实幼苗的生长发育，提高芡实生长的土壤环境中可利用氮素的含量，采用本发明的液体菌剂浸泡芡实种子，可明显提高芡实种子的发芽率。将本发明的芡实根际促生细菌Q67与蛭石、稻壳粉等载体混匀制备成固态微生物菌剂，施用于芡实幼苗根系周围，可显著促进芡实幼苗的根系发育，提高根部质量及根系活力等指标；增加芡实幼苗的叶片数、叶面积、生物量，促进叶片叶绿素的合成；提高土壤中硝态氮和铵态氮的含量；
综上所述，但本发明并不局限于上述实施方式，本领域一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化，均在本发明的保护范围之内。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  深圳清华大学研究院
       苏州澄湖现代科技生态农业发展有限责任公司
       深圳市清研环境科技有限公司
 
<120>  一株芡实根际促生细菌及其应用和菌剂
 
<130> 
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  1458
<212>  DNA
<213>  Baclicus lincheniformis
 
<400>  1
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cgggaaaccg gggctaatac cggatgcttg attgaaccgc atggttcaat cataaaaggt    180
 
ggcttttagc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg    240
 
gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga    300
 
gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt    360
 
ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaaact ctgttgttag    420
 
ggaagaacaa gtaccgttcg aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac    480
 
ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat    540
 
tgggcgtaaa gcgcgcgcag gcggtttctt aagtctgatg tggaagcccc cggctcaacc    600
 
cgggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt    660
 
gtagcggtga aatgcgtaga gatgttgagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc    720
 
tgtaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt    780
 
ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc cgccctttag tgctgcagca    840
 
aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga    900
 
cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta    960
 
ccaggtcttg acatcctctg acaaccctag agatagggct tccccttcgg gggcagagtg   1020
 
acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac   1080
 
gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg   1140
 
tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct   1200
 
acacacgtgc tacaatgggc agaacaaagg gcagcgaagc cgcgaggcta agccaatccc   1260
 
acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc   1320
 
tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc   1380
 
gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taaccttttg gagccagccg   1440
 
ccgaagtgac agatctgg                                                 1458
 
 

Claims (10)

1.一株芡实根际促生细菌，其特征在于：该细菌为地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)Q67，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014652。
2.根据权利要求1所述的芡实根际促生细菌在制备微生物菌剂中的应用。
3.一种液态微生物菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的芡实根际促生细菌。
4.根据权利要求3所述的液态微生物菌剂的制备方法，其特征在于：培养芡实根际促生细菌，得菌悬液，所述菌悬液作为液态微生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的液态微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述菌悬液的浓度为1×108～5×108CFU/mL。
6.一种固态微生物菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的芡实根际促生细菌。
7.根据权利要求6所述的固态微生物菌剂的制备方法，其特征在于：培养芡实根际促生细菌，得菌悬液，将菌悬液与载体混匀，制备成固态微生物菌剂。
8.根据权利要求7所述的固态微生物菌剂的制备方法，其特征在于：菌悬液的浓度为1×109～2×109CFU/mL，固态微生物菌剂中有效活菌数为2×108～4×108CFU/g。
9.根据权利要求8所述的固态微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述载体为蛭石和稻壳粉的混合物。
10.根据权利要求9所述的固态微生物菌剂的制备方法，其特征在于：蛭石和稻壳粉的质量比为2-5:0.5-1.5。
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