CN104841399B - 一种喹噁啉‑2‑甲醛‑1，4‑二氧‑亲和基质的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种喹噁啉‑2‑甲醛‑1,4‑二氧‑亲和基质的制备方法及应用，其步骤：A、喹噁啉‑2‑甲醛‑1,4‑二氧的制备，加入丙酮中充分溶解，收集黄色固体，将二甲基亚砜∶无水乙醇加入反应釜中，调节转速，向反应釜中投入二氧化硒与甲基喹噁啉进行反应，收集黄色针状固体即为喹噁啉‑2‑甲醛‑1,4‑二氧；B、喹噁啉‑2‑甲醛‑1,4‑二氧与基质的偶联：合成溶解于DMF中的喹噁啉‑2‑甲醛‑1,4‑二氧充分混合，再加入氰基硼氢化钠，磁力搅拌，取出过夜偶联的反应物，过滤离心，将喹噁啉‑2‑甲醛‑1,4‑二氧‑亲和基质保存在酒精溶液中；C、高效液相色谱分析偶联效率。偶联效率达到了76.84%。简便快捷，减少了对人体的伤害，安全性更高。提高了亲和层析的分离选择性和效率。

Description

一种喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧-亲和基质的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物化学及层析领域，更具体涉及一种喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质的制备方法，同时还涉及一种喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质的用途。

背景技术

亲和层析技术(Affinity Chromatography,AC)是一种液相色谱方法，是利用生物大分子与亲和色谱固定化配体之间存在的特异性吸附作用力，来进行选择性分离生物大分子的方法(于世林，2008；Leslie et al.,2008)，是筛选配体结合蛋白的经典技术(Hage,1999)。亲和层析技术的最大优点在于它能够从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需高纯度的活性物质(陈勇等，2001)。将药物分子固定到固相载体(如微珠)上，与细胞蛋白质裂解液充分混合孵育，然后洗脱去除没有结合的蛋白质，再通过高离子强度洗脱或是煮沸处理等方法将靶标蛋白与固相载体上的药物配体分离，这样上清液中的蛋白质即为药物结合蛋白(周婷婷等，2011；Cautrecasas et al.,1971)。因此，药物小分子能否偶联到固相载体(即亲和基质)上形成固定化的配体是决定亲和色谱成功与否的关键(Cautrecasas,1999)。运用亲和层析技术已成功鉴定出多种内源及外源性物质的结合蛋白，如对植物生长与发育至关重要的脱落酸(Abscisic acid,ABA)的结合蛋白(Shen et al.,2006；Zhang etal.,2002)。高效的亲和层析方法不仅在药物与蛋白质的结合(Joseph et al.,2010)、药物靶标的高通量筛选(Vuignier et al.,2013)中具有广泛应用，在蛋白复合物的分离及蛋白与蛋白相互作用网络方面同样扮演着重要角色(Azarkan et al.,2007；Fukao,2012)。

配体的固定化过程是运用亲和层析方法筛选药物结合蛋白的关键步骤(Cautrecasas et al.,1971)，选择合适的亲和基质对于我们分离与鉴定生物活性化合物的靶蛋白至关重要。常用的亲和基质主要有琼脂糖凝胶，但是琼脂糖等固相载体容易亲和非特异性结合蛋白，不能有效分离与生物活性化合物特异性结合的蛋白质，使得靶蛋白鉴定更加复杂(Kuramochi et al.,2008；Shimizu et al.,2000；Yamamoto et al.,2006)。因此在将琼脂糖亲和珠与目标化合物进行偶联形成固定化配体(immobilized-ligand)的过程中，连接臂的使用不仅能使药物与基质顺利偶联，提高配基的空间利用度，还可以避免基质对靶蛋白的空间干扰效应(Ziegler et al.,2013)。脱落酸(Abscisic acid,ABA)是一种对植物生长与发育至关 重要的激素，Zhang等利用EAH-Sepharose 4B基质与ABA进行偶联，通过亲和层析方法成功筛选到ABA的结合蛋白(Shen et al.,2006；Zhang et al.,2002)。AffiGel是一种琼脂糖衍生物，因其良好的亲水性质而减少非特异性结合蛋白，使其成为应用最广泛的偶联基质(Takahashi et al.,2006)。但是因为大多数药物的疏水性质，使得高亲水性和化学易碎性的AffiGel与药物在有机试剂的条件下偶联困难，因此能稳定存在于有机试剂中的聚甲基丙烯酸酯衍生物亲和基质Toyopearl成为了很好的替代产品。Takahashi等改进了Toyopearl亲和基质使其具有如同AffiGel一样亲水性的优点，同时能够稳定存在于有机试剂中，因而降低了非特异性结合蛋白的结合几率，同时提高了偶联效率(Takahashi et al.,2006)。同时，一些高效能的亲和珠，如FG-beads，SG-beads，也用来改变配体偶联的条件，提高配体的偶联效率(Shimizu et al.,2000；Sakamoto et al.,2009；Ito et al.,2010)，从而筛选出目标化合物的结合蛋白。

喹赛多(Cyadox，CYA)作为一类新型喹噁啉-1,4-二氧化合物，在国内由华中农业大学兽药研究所首次合成，本实验室对其进行了广泛而且深入细致的研究。喹赛多作为喹噁啉类饲料添加剂，对猪、鸡、鱼等食品动物具有明显的抗菌促生长作用。与同类药物相比，喹赛多毒副作用小，安全性高，属于实际无毒物质，且用药后吸收迅速，残留期短，具有良好的应用前景。将喹赛多以饲料添加剂的形式添加于仔猪日粮当中，能够显著提高仔猪体增重，并且其肝脏组织中表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信使RNA(mRNA)的表达也得到显著性提高(p＜0.05)，因此推测喹赛多可能是通过对动物体内EGF和IGF-1等生长因子的转录调控而发挥作用(王国永，2004)。朱惠玲则从内分泌角度，全面系统的研究了喹赛多促进仔猪生长的作用机制。研究推测喹赛多主要通过两种机制发挥其促生长效应：一是通过提高血液中生长激素(GH)、胰岛素、性激素、IGF等激素水平，同时降低皮质醇(COR)与生长抑素(SS)浓度，从而加速体内同化作用，刺激骨骼肌蛋白的合成，并抑制蛋白质的分解；二是通过提高EGF、IGF-1、胰岛素及胃泌素(Gas)水平，改善胃肠道黏膜的结构与功能，从而促进营养物质的吸收与利用(朱惠玲，2007)。丁明星研究也发现喹赛多可以增加小肠绒毛膜表面积，促进营养物质的吸收(丁明星，2005)。戴梦红等应用mRNA差异显示技术筛选出在喹赛多作用下，猪肝脏组织中差异表达的8条基 因，包括锌指蛋白(Zinc FingerCCHC3)、抗细胞衰亡因子1(DAD1)、补体C3(C3)、EGF和IGF-1等5条与喹赛多作用正相关的基因，两条表达量上调但随着喹赛多剂量增加表达量不变的差异基因，分别是转酮醇酶(TK)、ADP核糖聚合酶(PARP-1)，还有一条表达量与喹赛多剂量呈负相关的新基因(戴梦红等，2009)。在此基础上，邢丹与郭菊就喹赛多作用下差异表达的8条基因信号通路与表达调控进行了研究，发现多条信号通路参与喹赛多对差异基因的表达调控，其中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)与核转录因子-κB(NF-κB)信号通路是主要的调控通路，发挥喹赛多的药理作用(郭菊，2012；邢丹，2012)。与此同时，利用双向电泳与生物质谱技术筛选并鉴定了喹赛多在L-02细胞与猪原代肝细胞中相关蛋白质的表达，结果显示这些差异蛋白主要参与三羧酸循环等与能量代谢相关的过程，从而发挥喹赛多药理作用(刘亚辉，2012)。虽然喹赛多促生长作用机理得到了较为细致的诠释，但是其在细胞内作用靶标一直未能确定。有文献报道，药物的作用靶标主要为蛋白质(邱宗荫等，2008)。党永辉利用放射性同位素氚标记喹赛多，通过在体与离体实验筛选其在猪肝脏组织中的结合蛋白，结果发现，氚标喹赛多在细胞核蛋白裂解液中随着孵育浓度的升高而趋于饱和，但是并没有成功筛选到能与喹赛多特异性结合的蛋白质(党永辉，2012)。喹赛多作用细胞之后，是否有特异性结合蛋白与之相互作用，打通下游信号通路，从而发挥其促生长的药理作用，对我们研究喹赛多的促生长机理具有重要意义。虽然喹赛多的促生长作用已在基因水平、蛋白水平以及整体动物的水平得以阐释，但是喹赛多激发这些效应的基础是什么还不甚明了。而药物与细胞内或细胞膜靶标之间的相互作用，是药物发挥作用的基础(周婷婷等，2011)。

肝脏是药物代谢的主要器官，胥宁研究喹赛多在动物体内的分布与消除规律发现，在猪肝脏与肾脏中药物消除最慢(胥宁，2012)。通过前期在体与离体试验研究发现，喹赛多能够上调EGF、IGF-1mRNA的表达(党永辉，2012；王国永，2004)。L-02细胞系是从成人正常肝脏分离培养而来，具有肝脏特异性功能，能稳定传代，且不会像肿瘤细胞一样恶性增殖(Chen et al.,2012)，因此成为很好的肝细胞研究模型。

聚甲基丙烯酸酯衍生物亲和基质Toyopearl不同于琼脂糖衍生物等亲和基质，能够在有机试剂中稳定存在。Teruki等改进了Toyopearl亲和基质，使其具有如 同琼脂糖一样良好的亲水性，同时能够稳定存在于有机试剂中，因而降低了非特异性结合蛋白的结合几率，同时提高了偶联效率(Takahashi et al.,2006)。因此我们在实验中选用富含氨基的Toyopearl AF-Amino-650M亲和基质，与改造化合物进行偶联，得到固定化配体。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质的制备方法，以具有良好亲水性的Toyopearl AF-Amino-650M树脂为固体支持物，偶联药物小分子配体后形成稳定的亲和层析基质，降低了非特异性结合蛋白的结合几率，同时提高了偶联效率。

本发明的另一个目的是在于提供了一种喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质的应用，在适合的缓冲液条件下能够捕获细胞蛋白裂解液中与喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧特异性结合的蛋白质，同时还可以用来筛选具备喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧结构的药物或化合物的特异性结合蛋白。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质的制备方法，其步骤是：

A、喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧的制备：

以苯并呋咱为原料，称取0.24kg苯并呋咱，充分溶解于500mL丙酮中，向其中缓慢滴加5～6滴四氢吡咯，保持55～60℃反应，反应完成后，收集黄色固体即甲基喹噁啉。将体积比为9∶1的二甲基亚砜∶无水乙醇加入反应釜中，调节转速1300rpm，待温度升高为80℃后，向反应釜中投入2倍于甲基喹噁啉质量的二氧化硒。反应完毕后，收集黄色针状固体即为喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧。

B、喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与基质的偶联：

取200μL用DMF预处理过的亲和树脂基质，与步骤A中合成的充分溶解于DMF中的喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧充分混合，再加入6.4mg氰基硼氢化钠，磁力搅拌器低速室温(20-25℃，以下相同)过夜。同时准备未与喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧偶联的空白基质对照组。

取出过夜偶联的反应物，过滤或瞬时离心，上清取100μL标记为“偶联喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质后上清液”，留作HPLC分析，沉淀基质用DMF洗1～2次。

将实验组与空白组基质分别用1～2mL醋酸酐(含20％DMF)室温混合 30～60min，然后用DMF和20％(体积比,以下相同)酒精洗1～2次。将获得的喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质保存在20％酒精溶液中，备用。

C、高效液相色谱分析偶联效率：

标记的待检样品有“溶剂DMF空白对照”、“喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧”、“偶联喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质后上清液”，将待检样品用流动相稀释2000倍，利用HPLC检测溶液中化合物的出峰时间与峰面积，从而计算化合物喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与亲和基质的偶联效率，检测条件如下，结果见图1。

色谱条件：Zorbax eclipse XDB-C18(150mm×2.1mm，3.5μm)，紫外检测波长372nm，柱温30℃，流速为1mL/min，进样量50μL，每个样品检测时间为10min。流动相体积比为35∶50∶15的去离子水∶甲醇(色谱级)∶乙腈(色谱级)，等度洗脱。

一种喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质的应用，其步骤是：

A、喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质对蛋白质的连续亲和层析实验：

取100μL喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质(实验组)、25μL未偶联喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧的树脂基质(空白基质对照组)分别与1mL裂解buffer 4℃混合至少40min。

将实验组均分成4×25μL，1200rpm、4℃离心1min，吸弃上清buffer。取25μL空白基质对照组分别与1mL细胞核蛋白，4℃轻轻混匀孵育40min。4℃、12000rpm离心1min，沉淀A4℃保存，留作SDS-PAGE分析。上清与另一份25μL喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质4℃轻轻混匀孵育40min。重复以上步骤4次，得到沉淀B、C、D、E。

沉淀A、B、C、D、E均用1mL裂解buffer轻洗1次，1200rpm、4℃离心1min。在各沉淀基质中加入NuPAGE LDS Sample Buffer(4×)7.5μL、NuPAGE Reducing Agent(10×)3μL、裂解液19.5μL，70℃煮沸10min，4℃冷却5min，离心，取上清20μL点样跑SDS-PAGE，以分离蛋白质。

将跑好的PAGE胶用考马斯亮蓝R-250染液染色过夜，用去离子水脱色至凝胶透明，然后用扫描仪扫描拍摄凝胶。

B、蛋白质谱鉴定：

用剪刀将200μL枪头尖端剪掉约1～2cm，孔的直径约为2～3mm，用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，再转入200μL离心管中(离心管灭菌后浸 泡于75％乙醇中，用时取出自然干燥)。

每管加入100μL脱色液(50％乙腈，25mM碳酸氢铵)，室温放置30min，吸弃脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。加入60μL 乙腈使凝胶脱水10min，吸弃上清液。每块凝胶加入约8μL(浓度为12.5ng/μL)溶于100mM碳酸氢铵的胰蛋白酶，4℃吸胀1h，吸出多余酶液，倒置于37℃温箱中保温12h。加入10μL 5％三氟乙酸，1h后将溶液转移到新的Ep管内，重复2次将溶液合并。加入10μL2.5％三氟乙酸/50％乙腈，1h后将溶液与之前溶液合并，重复2次。将肽段溶液在冻干机中真空低温冻干，以备用于质谱鉴定。用0.2％三氟乙酸充分溶解肽段，立即进行质谱鉴定。

将冻干肽混合物中加入2μL 0.2％三氟乙酸溶液，充分溶解肽段。取每个样品0.6μL手工点于MALDI靶板上，避光干燥。再取0.6μL饱和基质α-氰基-4-羟肉桂酸(CHCA)溶液(5mg/mL，溶剂为0.1％TFA、50％ACN)手工点于MALDI靶板上，避光干燥。待溶剂挥发后，将MALDI靶置入MALDI-TOF-TOF质谱仪(4800Proteomies Analyzer)。样品用4800串联飞行时间质谱仪4800Proteomies Analyzer进行质谱分析，采用反射模式，一级、二级质谱连续自动检测，采用自动获取数据的模式采集数据。肽指纹图谱(PMF)质量扫描范围为800～4000Da，且一级质谱强度最大的5个峰进行串级质谱分析。谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

利用HPLC检测偶联前后溶液中化合物的含量，反向计算出偶联效率，偶联效率达到了76.84％。该方法简便快捷，同时避免了使用刺激性气味极强且易挥发的吡啶，减少了对人体的伤害，安全性更高。

Toyopearl AF Amino-650是一种既可以偶联蛋白质也可以用来连接小分子配体的亲和色谱树脂。在本实验室中为了排除基质对蛋白质的亲和干扰，加入了空白基质与蛋白裂解液孵育相同的时间作为处理对照，改进了连续亲和层析方法，提高了亲和层析的分离选择性和效率。

附图说明

图1为一种利用HPLC检测喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与Toyopearl AF-Amino-650M树脂进行偶联的效率示意图。

注：大面积峰表示喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与树脂基质偶联之前的含量；小面积峰表示喹 噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与树脂基质偶联之后的含量；未叠加的面积即为喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质的偶联效率。

利用高效液相色谱方法检测喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与亲和树脂基质Toyopearl-AF-Amino 650M resins的偶联效率，如图1所示，通过比较样品“喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧”与“偶联喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质后上清液”的色谱图，计算两者峰面积之差，得到化合物喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与亲和树脂基质偶联的效率为76.84％。

图2为一种利用制备成功的喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质筛选细胞核蛋白裂解中与喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧特异性结合的蛋白质示意图。

注：图中M表示蛋白标示Marker，kD表示Marker的分子量，A孔道表示将空白亲和基质与蛋白裂解液孵育40分钟后瞬时离心得到沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳，B,C,D,E孔道分别表示将喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质与上一步离心得到的蛋白上清液孵育相同时间后瞬时离心得到沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳，详细步骤见实施例2。

图2是将细胞核蛋白裂解液与喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质进行连续亲和层析实验，然后将各亲和基质所结合到的物质进行4～12％梯度凝胶电泳，以分离结合到固相载体上的蛋白质，经过考马斯亮蓝R-250染色及去离子水脱色后，利用扫描仪扫描拍摄的凝胶图片。通过比对各孔道蛋白条带颜色的深浅变化，挑选出从B到E孔道颜色明显减弱的蛋白条带，条带深浅基本无变化的则可能为非特异性结合蛋白。图2中能够筛选出五条颜色明显减弱的蛋白条带，因此说明喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质与细胞核蛋白裂解液进行SAC，能够筛选出与喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧特异性结合的细胞核蛋白。

图3、4为应用制备成功的喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质筛选到的细胞核蛋白裂解液中与喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧特异性结合的蛋白质hnRNP A2/B1的质谱鉴定图。

注：此图为特异性蛋白hnRNP A2/B1蛋白经胰蛋白酶消化后，MALDI-TOF/TOF鉴定的一级质谱(上)及质荷比为1377.6的二级质谱图(下)。

将差异性蛋白条带挖点后进行胶内酶解与肽段提取，肽段液冻干后利用MALDI-TOF-TOF质谱仪进行蛋白质谱鉴定，并通过UniprotKB数据库进行检索，成功鉴定出核内不均一核糖核蛋白A2/B1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1,hnRNP A2/B1)。利用GPS软件在UniprotKB数据库中进 行检索，得到蛋白质分数显著大于65分为合格，并且蛋白质分子量与其在凝胶上的位置相符合，差异蛋白才鉴定成功。实验中所鉴定出的蛋白的肽指纹图谱(PMF)和串联质谱(MS/MS)图谱信噪比高，背景低(图3)，在UniprotKB数据库中搜索MASCOT得分高，可信度至少大于95％。

具体实施方式

实施例1：

一种喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质的制备方法，其步骤是：

A、喹噁啉-2-甲醛1,4-二氧的制备：

称取0.24kg苯并呋咱，充分溶解于500mL丙酮中，并缓慢滴加四氢吡咯，保持55或57或59或60℃进行反应，反应完成后，收集黄色固体即甲基喹噁啉。将体积比为9∶1的二甲基亚砜∶无水乙醇加入反应釜中，调节转速1300rpm，待温度升高为80℃后，向反应釜中投入二氧化硒与甲基喹噁啉进行反应。反应完毕后，收集黄色针状固体即为喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧。反应路线图如下。

B、喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与基质的偶联：

将储存在20％(体积比)酒精的树脂基质用1mL DMF吹洗5或6次。取200μL已预处理的亲和树脂基质，与A中充分溶解于DMF中的喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧充分混合，再加入6.4mg氰基硼氢化钠，磁力搅拌器低速室温过夜。同时准备空白基质对照组，即未与喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧偶联。

取出过夜偶联的反应物，过滤或瞬时离心，上清取100μL标记为“偶联喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质后上清液”，留作HPLC分析，沉淀基质用DMF洗1或2次。

将实验组与空白组基质分别用1或2mL醋酸酐(含20％DMF)室温混合30或35或40或45或50或55或60min，然后用DMF和20％(体积比)酒精洗1或2次。

将偶联完成的基质保存在20％(体积比)酒精溶液中，备用。

C、高效液相色谱分析偶联效率：

标记的待检样品有“溶剂DMF空白对照”、“喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧”、“偶联喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质后上清液”，将待检样品用流动相稀释2000倍，利用HPLC检测溶液中化合物的出峰时间与峰面积，从而计算化合物喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与亲和基质的偶联效率，检测条件如下，结果见图1。

色谱条件：Zorbax eclipse XDB-C18(150mm×2.1mm，3.5μm)，紫外检测波长372nm，柱温30℃，流速为1mL/min，进样量50μL，每个样品检测时间为10min。流动相体积比为35∶50∶15的去离子水∶甲醇(色谱级)∶乙腈(色谱级)，等度洗脱。获得一种喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质。

实施例2：

一种喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质的应用，其步骤是：

A、喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质对蛋白质的连续亲和层析：

取100μL喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质(实验组)、25μL未偶联喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧的树脂基质(空白基质对照组)分别与1mL裂解buffer 4℃混合至少40min。

将实验组均分成4×25μL，1200rpm、4℃离心1min，吸弃上清buffer。取25μL空白基质对照组分别与1mL细胞核蛋白，4℃轻轻混匀孵育40min。4℃、12000rpm离心1min，沉淀A4℃保存，留作SDS-PAGE分析。上清与另一份25μL喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质4℃轻轻混匀孵育40min。重复以上步骤4次，得到沉淀B、C、D、E。

沉淀A、B、C、D、E均用1mL裂解buffer轻洗1次，1200rpm、4℃离心1min。在各沉淀基质中加入NuPAGE LDS Sample Buffer(4×)7.5μL、NuPAGE Reducing Agent(10×)3μL、裂解液19.5μL，70℃煮沸10min，4℃冷却5min，离心，取上清20μL点样跑SDS-PAGE，以分离蛋白质。

将跑好的PAGE胶用考马斯亮蓝R-250染液染色过夜，用去离子水脱色至凝胶透明，然后用扫描仪扫描拍摄凝胶。结果见附图2。

B、蛋白质谱鉴定：

用剪刀将200μL枪头尖端剪掉约1～2cm，孔的直径约为2～3mm，用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，再转入200μL离心管中(离心管灭菌后浸泡于75％乙醇中，用时取出自然干燥)。

每管加入100μL脱色液(50％乙腈，25mM碳酸氢铵)，室温放置30min， 吸弃脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。加入60μL乙腈使凝胶脱水10min，吸弃上清液。每块凝胶加入约8μL(浓度为12.5ng/μL)溶于100mM碳酸氢铵的胰蛋白酶，4℃吸胀1h，吸出多余酶液，倒置于37℃温箱中保温12h。加入10μL 5％三氟乙酸，1h后将溶液转移到新的Ep管内，重复2次将溶液合并。加入10μL 2.5％三氟乙酸/50％乙腈，1h后将溶液与之前溶液合并，重复2次。将肽段溶液在冻干机中真空低温冻干，以备用于质谱鉴定。用0.2％三氟乙酸充分溶解肽段，立即进行质谱鉴定。

将冻干肽混合物中加入2μL 0.2％三氟乙酸溶液，充分溶解肽段。取每个样品0.6μL手工点于MALDI靶板上，避光干燥。再取0.6μL饱和基质α-氰基-4-羟肉桂酸(CHCA)溶液(5mg/mL，溶剂为0.1％TFA、50％ACN)手工点于MALDI靶板上，避光干燥。待溶剂挥发后，将MALDI靶置入MALDI-TOF-TOF质谱仪(4800Proteomies Analyzer)。样品用4800串联飞行时间质谱仪4800Proteomies Analyzer进行质谱分析，采用反射模式，一级、二级质谱连续自动检测，采用自动获取数据的模式采集数据。肽指纹图谱(PMF)质量扫描范围为800～4000Da，且一级质谱强度最大的5个峰进行串级质谱分析。谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正。结果见图3。

Claims (1)

1.一种喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质的制备方法，其步骤是：

A、喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧的制备：

以苯并呋咱为原料，称取0.24kg苯并呋咱，充分溶解于500mL丙酮中，向其中滴加5～6滴四氢吡咯，保持55～60℃反应，反应完成后，收集黄色固体即甲基喹噁啉，将体积比为9∶1的二甲基亚砜∶无水乙醇加入反应釜中，调节转速1300rpm，待温度升高为80℃后，向反应釜中投入2倍于甲基喹噁啉质量的二氧化硒，反应完毕后，收集黄色针状固体即为喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧；

B、喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与基质的偶联：

取200μL用DMF预处理过的亲和树脂基质，与步骤A中合成的充分溶解于DMF中的喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧充分混合，再加入6.4mg氰基硼氢化钠，磁力搅拌器低速室温过夜，同时准备未与喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧偶联的空白基质对照组，取出过夜偶联的反应物，过滤或瞬时离心，上清取100μL标记为偶联喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质后上清液，沉淀基质用DMF洗1～2次；

将实验组与空白组基质分别用1～2mL醋酸酐室温混合30～60min，然后用DMF和20％体积比酒精洗1～2次，将获得的喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质保存在20％酒精溶液中，备用；

C、高效液相色谱分析偶联效率：

标记的待检样品有溶剂DMF空白对照、喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧、偶联喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质后上清液，将待检样品用流动相稀释2000倍，利用HPLC检测溶液中化合物的出峰时间与峰面积，计算化合物喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与亲和基质的偶联效率，检测条件如下：

色谱条件：Zorbax eclipse XDB-C18，紫外检测波长372nm，柱温30℃，流速为1mL/min，进样量50μL，每个样品检测时间10min，流动相体积比为35∶50∶15的去离子水∶甲醇∶乙腈，等度洗脱。