CN104840945A - 诱骗受体3在治疗脓毒症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诱骗受体3在治疗脓毒症药物中的应用，DcR3在脓毒症患者血清中表达升高且与脓毒症的死亡率相关，DcR3参与脓毒症的发生发展；DcR3可以降低脓毒症小鼠的死亡率，减轻脓毒症小鼠的炎症反应，抑制脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡，保护肝以及肺等脏器的功能，因而，DcR3对脓毒症具有一定的治疗作用。

Description

诱骗受体3在治疗脓毒症药物中的应用

技术领域

本发明属药物新应用技术领域，涉及诱骗受体3在治疗脓毒症药物中的应用。

背景技术

败血症(sepsis)是一类因多种病原菌进入机体血液系统后迅速繁殖、产生大量毒素，机体受激发产生过度的炎症反应。目前败血症仍是ICU病房病人死亡的第一大原因，而且死亡率呈上升的趋势。据统计，在西方发达国家，大约每年有150万人患病，死亡率高达30％-50％。在败血症的发病机制方面，虽然近年来取得很大进展，但仍还尚未完全阐明，这也阻碍了败血症的有效治疗，导致死亡率居高不下。对于败血症的发病机制，目前主要有两种观点：一、败血症是由于机体过度炎症反应所引起的自身组织损伤，炎症因子补体C5a所介导的“补体损伤”是主要始动因素。二、败血症主要由于疾病发生过程中机体的免疫系统受到抑制引起，胸腺淋巴细胞大量凋亡是机体免疫功能受损的基础。在临床上，败血症初期为过度的炎症反应，晚期表现为免疫抑制状态，因此如何及时终止机体过度的炎症反应，恢复正常的免疫功能一直是该领域研究的热点和难点。目前以抑制炎症反应、抗血栓、恢复机体Th1/Th2免疫平衡为目标的治疗方案有多种，包括抗炎症因子C5a、抗C5a受体(C5aR)、抗IL-1、抗TNF-α及输注IFN-γ治疗、人重组蛋白C等等。上述策略虽然取得了一定的疗效，表现为能够抑制炎症反应、提高生存率等，但也存在效果不稳定，实验可重复性差的问题。表现为同一方案在不同的时间、不同的个体往往会有不同的治疗效果，或同一治疗方案在实验室能取得理想的疗效，而在临床实验中的效果较差等。因此，寻找败血症发病机制中新的关键作用分子、研发新的干预药物、联合抗生素治疗是提高败血症治疗水平，降低死亡率急需解决的问题。

近年来，大量的研究证实，凋亡在败血症的发病机制中起到重要作用，凋亡使免疫细胞和非免疫细胞功能缺失，进而导致免疫抑制和多器官功能衰竭。在几个败血症的动物模型中，采用Fas受体融合蛋白、RAN干扰、caspase-3、8抑制剂等不同抗凋亡治疗手段可明显提高败血症的生存率。目前，凋亡已成为败血症研究和诊治的新热点。

诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)是新近发现的一种缺乏穿膜结构域的可溶性肿瘤坏死因子受体超家族成员，能够竞争性结合FasL、LIGHT和TL1A三种肿瘤坏死因子超家族配体，在调控细胞增殖、分化和凋亡中发挥重要作用。DcR3可以竞争性结合FasL抑制淋巴细胞凋亡和一些肿瘤细胞凋亡。DcR3还可以竞争性结合LIGHT抑制LIGHT诱导的细胞凋亡。有研究证实，DcR3竞争性结合TL1A可以促进T细胞增殖和活化。目前DcR3主要应用于肿瘤、自身免疫性疾病的诊断和治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱骗受体3在治疗脓毒症药物中的应用。

本发明前期研究发现，DcR3在脓毒症患者血清中表达升高且与脓毒症的死亡率相关，这提示DcR3可能参与脓毒症的发生发展。进一步研究发现，DcR3Fc可以降低脓毒症小鼠的死亡率，减轻脓毒症小鼠的炎症反应，抑制脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡，保护肝以及肺等脏器的功能，因而，DcR3对脓毒症具有一定的治疗作用。

作为优选的技术方案：

如上所述的诱骗受体3在治疗脓毒症药物中的应用，诱骗受体3为与人类IgG Fc段重组的重组蛋白，表示为DcR3Fc。DcR3本身是一个可溶性的小分子蛋白，但在人体内半寿期很短，很容易降解。DcR3Fc是利用DNA重组技术生产的DcR3蛋白，主要作用机理为弥补DcR3在体内寿命短的缺陷增加DcR3蛋白功能。DcR3Fc生产过程包括：鉴定具有生物作用活性的DcR3蛋白，分离或合成编码该蛋白的基因，然后将其插入合适的载体，转入宿主细胞，构建能高效表达蛋白的菌种库或细胞库，最后获得纯度90％以上的重组蛋白。本发明的DcR3Fc是从美国ENZO公司购买的成品，产品型号是ALX-522-055-C050，其中DcR3成分主要来源于人HEK293细胞，然后利用DNA重组技术将DcR3的1-246个氨基酸序列与人IgG1的Fc段融合，形成一个分子量约为58kd的稳定DcR3Fc。另外，美国Sigma公司也有DcR3Fc的成品，产品型号是D2441，其中DcR3成分主要来源于人Sf21细胞，然后利用重组技术将DcR3的功能区1-246个氨基酸序列与人IgG1的Fc段融合，形成一个分子量约为58kd的稳定DcR3Fc。

如上所述的诱骗受体3在治疗脓毒症药物中的应用，所述DcR3Fc采用静脉注射。诱骗受体3的作用主要是抗炎和抗凋亡作用，本发明检测DcR3是否通过抑制血液中的炎症因子以及淋巴细胞的凋亡来治疗脓毒症，所以认为采用静脉注射效果比较好。

如上所述的诱骗受体3在治疗脓毒症药物中的应用，所述脓毒症为重症脓毒症。根据动物实验结果，该药物具有治疗脓毒症包括重症脓毒症的应用价值。

有益效果

本发明的诱骗受体3在治疗脓毒症药物中的应用，可以降低脓毒症小鼠的死亡率，减轻脓毒症小鼠的炎症反应，抑制脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡，保护肝以及肺等脏器的功能。

附图说明

图1为各组小鼠的生存状况

图2为假手术组小鼠HE染色肝损伤情况

图3为模型组小鼠HE染色肝损伤情况

图4为DcR3治疗组小鼠HE染色肝损伤情况

图5为各组小鼠炎症因子水平

图6为各组小鼠淋巴细胞凋亡情况

图7为各组小鼠的生存状况

图8为假手术组小鼠HE染色肺损伤情况

图9为模型组小鼠HE染色肺损伤情况

图10为DcR3治疗组小鼠HE染色肺损伤情况

图11为各组小鼠炎症因子水平

图12为模型组淋巴细胞凋亡情况

图13为假手术组淋巴细胞凋亡情况

图14为DcR3治疗组淋巴细胞凋亡情况

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

本实验利用脓毒症小鼠模型，体外研究DcR3对小鼠脓毒症是否具有保护作用，并通过体外细胞刺激实验研究DcR3是否会影响淋巴细胞凋亡及功能，并以此探求其在脓毒症免疫调节中的作用，以及脓毒症免疫治疗合理可靠的治疗靶点。

实验方法

1.CLP诱导的脓毒症小鼠模型的建立

取8～l0周龄雄性BALB/c小鼠(体重25～30g)，术前8h禁食，自由饮水。术前腹腔注射2％水合氯醛溶液实施麻醉。使小鼠仰卧于手术台上，固定其四肢与头部，剃除下腹部毛并进行常规消毒。行下腹部正中皮肤纵向切口(长约l.5～2cm)，辨识腹肌白线，并于此处剖开腹游离并暴露盲肠，小肠、大肠仍留于腹腔中：在盲肠基底部与其末端之间的中点处结扎，保留盲肠近端血供，用2l号针头于盲肠末端与结扎位置的中部，沿肠系膜侧向其对侧穿孔l次，将盲肠还纳回腹腔内原位后逐层缝合。按体重皮下注射预热的生理盐水1ml用于小鼠术后复苏。

2.术前分组设计及动物处理

将40只C57BL/6小鼠随机分为四组：假手术组，CLP组，CLP+尾静脉注射100μgIg Fc组，CLP+尾静脉注射100μgDcR3Fc组；DcR3采用美国ENZO公司的ALX-522-055-C050。手术24小时后，收集各组小鼠血液，肺，肝，脾，胸腺组织进行下一步实验。另同时准备40只小鼠，按上述分组，观察DcR3Fc干预后小鼠7天生存率及生存时间。

3.血清中TNF-α，IL-6，IFN-γ检测

取CLP术后24小时血液，3000r离心10min，取上清,ELISA法检测上清中炎性因子(TNF-α，IL-6，IFN-γ)水平。操作说明简述如下：取标准品与血清样本各100μL至96孔微量反应板，覆盖反应孔，室温孵育1.5h，弃去孔内液体并洗涤4次(每次洗涤加300μL洗涤缓冲液,洗毕完全去除液体残留)；加入100μL生物素化的一抗稀释液，室温轻摇孵育1h，弃去液体并重复洗涤步骤；加入100μLHRP-链霉亲和素溶液，室温轻摇孵育45min，弃去液体并重复洗涤步骤；加入100μLTMB一步化底物试剂，室温避光轻摇孵育30min；加入50μL终止液，并立即在酶标仪检测其A450值绘制标准曲线，并计算血清样本中的含量。

4.组织病理学检查

CLP手术后24h取出小鼠部分肝脏组织，用4％多聚甲醛固定标本后常规石蜡包埋切片，经HE染色后光学显微镜下观察肺和肝脏组织的病理变化情况。

5.淋巴细胞凋亡检测

术后24h，分离胸腺组织，组织研磨后滤网过滤去除组织碎片，细胞用FACS液洗两次备用。首先用PE标记的抗-CD4抗体进行标记，随后按凋亡检测试剂盒说明书标记FITC标记的AnnexinⅤ抗体，细胞染色完成后立即用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。

实验结果

1.DcR3预处理提高CLP模型小鼠的存活率

实验每组样本量为10只，统计存活率与死亡率结果表明，假手术组小鼠术后全部存活，无一死亡；CLP组和CLP+Ig Fc组小鼠于术后7d内存活率仅有20％，而DcR3预处理后能显著改善CLP小鼠的存活情况，其存活率增至50％(见图1)。

2.DcR3Fc预处理缓解CLP模型小鼠肺和肝脏的损伤

HE染色显示，假手术组小鼠肝小叶结构清晰完整，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状整齐排列，肝细胞核大而圆，位于肝细胞中央，没有炎症细胞浸润(图2)。CLP术后模型组小鼠肝小叶失去正常结构，肝细胞索解离，可见大面积的肝细胞浑浊肿胀.空泡变性。细胞结构破坏，汇管区炎症细胞浸润，可见红细胞积聚(图3)。DcR3Fc治疗组肝细胞损伤明显减轻，肝小叶结构基本正常，只有小部分肝细胞变性坏死，少量炎症细胞浸润(图4)。

3.DcR3Fc预处理降低CLP小鼠血清TNF-α，IL-6，IFN-γ的含量

CLP术后24h，假手术组小鼠TNF-α，IL-6，IFN-γ含量均较低，经CLP诱导脓毒症后，TNF-α，IL-6，IFN-γ较假手术组组均有明显上升，而DcR3Fc预处理组，有效抑制了CLP诱导脓毒症小鼠的炎性因子释放，TNF-α，IL-6，IFN-γ表达水平均显著降低(图5)。

4.DcR3Fc预处理抑制CLP小鼠淋巴细胞凋亡

术后18-24小时为炎症反应的急性期，CLP组胸腺CD4+淋巴细胞的凋亡率为31.7％(图6)，明显高于假手术对照组CD4+淋巴细胞的凋亡率10.1％(图6)，而DcR3Fc显著抑制了CLP诱导的淋巴细胞凋亡，其CD4+淋巴细胞的凋亡率降至21.4％(图6)。

综上所述，DcR3Fc可以降低脓毒症小鼠的死亡率，减轻脓毒症小鼠的炎症反应，抑制脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡，保护肝以及肺等脏器的功能，对脓毒症具有一定的治疗作用。

实施例2

本实验利用脓毒症小鼠模型，体外研究DcR3对小鼠脓毒症是否具有保护作用，并通过体外细胞刺激实验研究DcR3是否会影响淋巴细胞凋亡及功能，并以此探求其在脓毒症免疫调节中的作用，以及脓毒症免疫治疗合理可靠的治疗靶点。

实验方法

1、CLP诱导的脓毒症小鼠模型的建立

取8～l0周龄～雄性BALB/c小鼠(体重25～30g)，术前8h禁食，自由饮水。术前腹腔注射2％水合氯醛溶液实施麻醉。使小鼠仰卧于手术台上，固定其四肢与头部，剃除下腹部毛并进行常规消毒。行下腹部正中皮肤纵向切口(长约l.5～2cm)，辨识腹肌白线，并于此处剖开腹游离并暴露盲肠，小肠、大肠仍留于腹腔中：在盲肠基底部与其末端之间的中点处结扎，保留盲肠近端血供，用2l号针头于盲肠末端与结扎位置的中部，沿肠系膜侧向其对侧穿孔l次，将盲肠还纳回腹腔内原位后逐层缝合。按体重皮下注射预热的生理盐水1ml用于小鼠术后复苏。

2、术前分组设计及动物处理

将40只C57BL/6小鼠随机分为四组：假手术组，CLP组，CLP+尾静脉注射100μgIg Fc组，CLP+尾静脉注射100μgDcR3Fc组；DcR3采用美国Sigma公司的D2441。手术24小时后，收集各组小鼠血液，肺，肝，脾，胸腺组织进行下一步实验。另同时准备40只小鼠，按上述分组，观察DcR3Fc干预后小鼠7天生存率及生存时间。

3、血清中TNF-α，IL-6，IFN-γ检测

取CLP术后24小时血液，3000r离心10min，取上清,ELISA法检测上清中炎性因子(TNF-α，IL-6，IFN-γ)水平。操作说明简述如下：取标准品与血清样本各100μL至96孔微量反应板，覆盖反应孔，室温孵育1.5h，弃去孔内液体并洗涤4次(每次洗涤加300μL洗涤缓冲液,洗毕完全去除液体残留)；加入100μL生物素化的一抗稀释液，室温轻摇孵育1h，弃去液体并重复洗涤步骤；加入100μLHRP-链霉亲和素溶液，室温轻摇孵育45min，弃去液体并重复洗涤步骤；加入100μLTMB一步化底物试剂，室温避光轻摇孵育30min；加入50μL终止液，并立即在酶标仪检测其A450值绘制标准曲线，并计算血清样本中的含量。

4、组织病理学检查

CLP手术后24h取出小鼠部分肺组织，用4％多聚甲醛固定标本后常规石蜡包埋切片，经HE染色后光学显微镜下观察肺和肝脏组织的病理变化情况。

5、淋巴细胞凋亡检测

术后24h，分离胸腺组织，组织研磨后滤网过滤去除组织碎片，细胞用FACS液洗两次备用。首先用PE标记的抗-CD4抗体进行标记，随后按凋亡检测试剂盒说明书标记FITC标记的AnnexinⅤ抗体，细胞染色完成后立即用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。

实验结果

1、DcR3预处理提高CLP模型小鼠的存活率

实验每组样本量为10只，统计存活率与死亡率结果表明，假手术组小鼠术后全部存活，无一死亡；CLP组和CLP+Ig Fc组小鼠于术后7d内存活率仅有20％，而DcR3预处理后能显著改善CLP小鼠的存活情况，其存活率增至50％(见图7)。

2、DcR3Fc预处理缓解CLP模型小鼠肺和肝脏的损伤

肺HE染色同样显示，假手术组小鼠肺组织结构完整，肺泡大小均匀，肺间隔未见增宽，肺间质未见出血、水肿及炎性细胞浸润(图8)。CLP组肺泡结构破坏，肺泡腔变小，肺泡壁增厚，肺泡和肺间质水肿，肺泡腔内可见淡红色浆液及大量炎性细胞浸润(图9)。DcR3Fc预处理组肺组织炎性细胞浸润、渗出等病理损伤程度较CLP组有所减轻(图10)。

3、DcR3Fc预处理降低CLP小鼠血清TNF-α，IL-6，IFN-γ的含量

CLP术后24h，假手术组小鼠TNF-α，IL-6，IFN-γ含量均较低，经CLP诱导脓毒症后，TNF-α，IL-6，IFN-γ较假手术组均有明显上升，而DcR3Fc预处理组，有效抑制了CLP诱导脓毒症小鼠的炎性因子释放，TNF-α，IL-6，IFN-γ表达水平均显著降低(图11)。

4、DcR3Fc预处理抑制CLP小鼠淋巴细胞凋亡

术后18-24小时为炎症反应的急性期，CLP组胸腺CD4+淋巴细胞的凋亡(图12)明显高于假手术对照组(图13)，而DcR3Fc显著抑制了CLP诱导的淋巴细胞凋亡，其CD4+淋巴细胞的凋亡明显降低(图14)。

综上所述，DcR3Fc可以降低脓毒症小鼠的死亡率，减轻脓毒症小鼠的炎症反应，抑制脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡，保护肝以及肺等脏器的功能，对脓毒症具有一定的治疗作用。

Claims (5)

1.诱骗受体3在治疗脓毒症药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，诱骗受体3为与人类IgG Fc段重组的重组蛋白，表示为DcR3 Fc。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述DcR3 Fc过程包括：鉴定具有生物作用活性的DcR3蛋白，分离或合成编码该蛋白的基因，然后将其插入合适的载体，转入宿主细胞，构建能高效表达蛋白的菌种库或细胞库，最后获得纯度90％以上的重组蛋白。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诱骗受体3重组蛋白采用静脉注射。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脓毒症为重症脓毒症。