CN104822822A - 一种固态发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于微生物的固态发酵从而产生终产物的方法，该方法包括在包含固态发酵底物的托盘中发酵该微生物，该托盘进一步包括：a.一个顶表面；以及b.该顶表面上的两个或更多个凹陷，其中每个凹陷都包括一种用于固态发酵的底物。
Description
发明领域
本发明涉及一种或多种使用一个或多个托盘的固态发酵方法。
发明背景
与涉及分散在连续液相中的微生物的生长的深层液体发酵(SLF)相反，在颗粒之间的空间包含一个连续气相和最少的可见水的情况下，固态发酵(SSF)涉及微生物在潮湿固体颗粒上的生长。SSF已经被有效用于生产次级代谢产物(如酶、芳香族物质和着色物质以及药物活性物质)，生产在农用杀有害生物剂中呈生物剂形式的微生物或从食物中消除毒素或其他有害物质或富集蛋白质或维生素。
尽管SSF已经被已知很长时间，但是与SLF相比，它在工业中的用途并未非常大规模地普遍开来。这主要是由于与SLF相比，在控制SSF中的发酵条件方面的困难，这些发酵条件导致低的且不可预测的产量，以及在按比例放大方面的复杂性。例如，在SLF中，与SSF相比，控制温度、pH、氧的可用性及营养素以及防止真菌菌丝脱水是相对简单的。具体而言，在SSF过程中，底物床内达到的令人不希望的高温是在使用大规模SSF生物反应器中面临的主要问题之一。
在SSF中需要可以有助于更好地控制发酵条件、提供更简单的按比例放大并增加产量的更加新颖的方法。
发明概述
在一个方面中，本发明提供了一种用于固态发酵的托盘，该托盘包括：a)一个顶表面；以及b)该顶表面中的两个或更多个凹陷，其中每个凹陷都包括一种用于固态发酵的底物。
在另一个方面中，该托盘进一步包括以下项中的一者或两者：
a.两个从顶表面的长度向上延伸的侧壁和两个从该顶表面的宽度向上延伸的后壁；
b.一个盖，用于覆盖该托盘的顶表面。
在一个方面中，侧壁的高度大于后壁的高度。
在另一个方面中，后壁的高度大于侧壁的高度。
在另一个方面中，这些后壁和侧壁沿着其高度连接在该托盘的顶表面的拐角处。
在一个方面中，该终产物是一种代谢产物或一种微生物，其中该代谢产物是一种或多种酶。
在另一个方面中，与使用没有凹陷的平托盘进行的发酵相比，酶的产量增加至少20％。
在一个方面中，这些凹陷在该托盘的顶表面上等间距地隔开。
在一个方面中，该托盘具有3-50个之间的凹陷。
在一个方面中，凹陷的深度是1-10cm和/或凹陷在其最宽点处的长度是5至15cm。
在一个方面中，凹陷的体积是40至400cm3。
在一个方面中，该微生物是一种真菌或一种细菌。
在一个方面中，该固态发酵底物选自下组，该组由以下各项组成：糠、蔗渣、木屑、椰壳纤维或其混合物。
在一个方面中，沿着该顶表面的长度的最末端处的凹陷离该顶表面的最末端1-5cm。
在一个方面中，沿着该顶表面的长度的两个连续凹陷之间的距离是0.5至5.0cm和/或沿着该顶表面的宽度的两个连续凹陷之间的距离是0.5至5.0cm。
在另一个方面中，该盖的末端是弯曲的或卷起的。
附图简要说明
图1示出了均包含固态发酵底物(在此情况下是日本酒曲)的测试托盘生物反应器和标准托盘生物反应器的照片。将测试托盘生物反应器的各个凹陷从1标记至32。
图2示出了托盘生物反应器的顶视图。
图3示出了托盘生物反应器的底视图。
发明详细说明
固态发酵(SSF)涉及微生物在潮湿固体颗粒上的生长，其中这些颗粒之间的空间包含一个连续气相和最少的可见水。尽管这些颗粒之间可能存在水滴并且颗粒表面可能存在薄的水膜，但是颗粒之间的水相是不连续的并且颗粒之间的大部分空间被气相填充。该系统中的大多数水还被吸收进潮湿固体颗粒内(对于综述，参见米切尔(Mitchell)等人，(编辑)固态发酵生物反应器：设计与操作的基本原理(Solid-State Fermentation Bioreactors:Fundamentals of Design and Operation)，柏林海德堡施普林格出版社(Springer-Verlag Berlin Heidelberg)，2006)。
因为SSF涉及其颗粒之间的空间具有连续气相和最少的可见水的固体底物，所以对于研发适合大规模工业应用(包括但不限于温度控制、窜流、压力过度以及蒸发)的在商业上可行的SSF反应器和工艺而言存在许多挑战。通常有机化合物并且具体而言包含在生物质中或释放自生物质的糖的发酵是放热反应，从而在进行转化的微生物的局部区域产生热量。这使得反应器中的生物质内的局部温度升高。SSF生物反应器内的升高的温度可以导致温度远高于微生物生长的最佳值，这反过来可以抑制有效地发生发酵过程。
因此，需要允许在转化过程的过程中将生物反应器内的温度维持在可接受的过程极限内的SSF生物反应器设计以及使用该生物反应器的方法。
根据使用的生物反应器的类型，可以将SSF分为6种类型(对于概述，请参见，生物反应器的类型：综述(Types of bioreactors:a review)，米切尔(Mitchell)等人，2000，过程生物化学(Process Biochemistry)35,1211-1225)。简言之，它们包括：
1.托盘反应器：这些是未进行强制通风的未混床。在没有机械搅拌的情况下在静止托盘中进行培养。注意可以手动地进行间歇混合，但是通常这仅仅每天发生一次。
2.填充床反应器：这些是进行强制通风的未混床。填充床生物反应器典型地在通过其以任何手段引入经调节的空气的多孔板顶部包括一个固定床。
3.不连续转筒：这些是涉及在未进行强制通风情况下间歇搅拌的床。它在静态期过程中像托盘生物反应器一样运作，并且在转动期过程中像转筒一样运作。
4.连续转筒：这些是涉及在未进行强制通风情况下连续搅拌的床。在此生物反应器中，将底物床保持在水平或近水平筒内，该筒可以具有或可以不具有挡板并且连续转动。
5.间歇搅拌床：这些是涉及在进行强制通风情况下间歇搅拌的床。间歇搅拌床典型地类似于填充床，除了该床包含一个搅拌器之外。在混合之间的期间的过程中，该系统与填充床完全相同。
6.具有连续混合和强制通风两者的生物反应器：这些是具有用于连续混合和强制通风的装置的床。三种类型的生物反应器属于此组：气固流化床、连续搅拌通气床和摇筒生物反应器。
本发明主要聚焦于托盘生物反应器。托盘生物反应器典型地由一个腔室组成，在该腔室中，温度和相对湿度受控的空气围绕多个托盘循环，这些托盘是一个或多个保持底物的、通常由木材或塑料或金属制成的浅平容器。每个托盘都包含一薄层底物，典型地在5与15cm深之间，并且通常具有一个开放顶且有孔的底部。不能简单地通过升高托盘中的床高度而在托盘生物反应器中实现按比例放大，因为这迅速导致过热问题。一般可以通过增加托盘的面积而实现按比例放大，这可以通过使用更宽的托盘或简单地通过使用更多托盘而完成。托盘表面和顶表面可以可互换地使用。
本发明的诸位发明人已经发现了一种改进发酵过程并因此改进如图1-3中所示的托盘生物反应器中的产量的方法。
在本发明的一个方面中，诸位发明人已经发明了一种用于固态发酵的托盘，该托盘包括：
a)一个顶表面；以及
b)该顶表面中的两个或更多个凹陷，其中每个凹陷都包括一种用于固态发酵的底物。
在一个方面中，本发明的诸位发明人已经发明了一种用于固态发酵微生物以产生终产物的方法，该方法包括在包含固态发酵底物的托盘中发酵微生物，该托盘进一步包括：
a.一个顶表面；以及
b.该顶表面中的两个或更多个凹陷，其中每个凹陷都包括一种用于固态发酵的底物。
在本发明的另一个方面中，该托盘进一步包括以下项中的一者或两者：
a.两个从顶表面的长度向上延伸的侧壁和两个从该顶表面的宽度向上延伸的后壁；
b.一个盖，用于覆盖该托盘的顶表面。
在一个方面中，侧壁的高度大于后壁的高度。
在另一个方面中，后壁的高度大于侧壁的高度。
在另一个方面中，这些后壁和侧壁沿着其高度连接在该托盘的顶表面的拐角处。
在一个方面中，覆盖该托盘的顶表面的盖任选地与该托盘的底部密封隔离。
在另一个方面中，覆盖该托盘的顶表面的盖任选地与该托盘的侧壁或后壁的任一端密封隔离。
在一个方面中，该盖由金属或金属合金制成。金属可以包括但不限于铝、钢等。
在另一个方面中，该盖由塑料制成。塑料包括但不限于聚碳酸酯、聚氨酯、丙烯酸、聚酯、有机硅、卤化塑料等。
在又另一个方面中，该盖由木材制成。在不同实施例中，该盖还可以由材料的混合物制成，例如但不限于木材和金属或塑料和金属、或木材和塑料或两种或更多种不同金属。
在另一个方面中，该盖的末端可以被制成直的或向上弯曲的(隆起的)或向下弯曲的(凹陷的)。
可以遵循固态发酵方法的标准过程，以使得微生物在存在于托盘中的底物中生长。(对于综述，请参见米切尔(Mitchell)等人，(编辑)固态发酵生物反应器：设计与操作的基本原理(Solid-State Fermentation Bioreactors:Fundamentals of Design and Operation)，柏林海德堡施普林格出版社(Springer-Verlag Berlin Heidelberg)，2006)。
该终产物可以是例如微生物本身或其代谢产物或甚至可以是所得固态发酵产物。该终产物可以包括但不限于例如，酶(例如，淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、鞣酸酶、阿拉伯糖酶、木聚糖酶、纤维素酶及其他酶)、凝乳酶、色素，芳香化合物和风味化合物、“小有机物”(包括但不限于乙醇、草酸、柠檬酸、乳酸及其他小有机物)、一种或多种植物生长激素(例如，赤霉酸)、用作动物饲料的富含蛋白质的农业废弃物、具有减少的毒素水平或改进的可消化性的动物饲料、抗生素(例如，青霉素、土霉素)、生物控制剂(包括但不限于例如，生物杀虫剂和生物除草剂)、孢子接种体(例如，用于生产蓝奶酪的娄地青霉的孢子接种体)。
在一个方面中，该终产物是一种代谢产物或一种微生物。
在一个优选实施例中，该终产物是一种代谢产物。
在另一个优选实施例中，该终产物是一种微生物。
在一个优选方面中，该代谢产物是一种或多种酶。
在一个方面中，该微生物是一种真菌。
在其他方面中，该微生物可以是放线菌、细菌、酵母、藻类等。
在一个方面中，该微生物是一种细菌。
在一个方面中，该固态发酵底物选自下组，该组由以下各项组成：糠、蔗渣、木屑、椰壳纤维或其混合物。
在一个优选实施例中，该固态发酵底物是糠。该糠是麦糠或米糠。
包含用于SSF的底物的这些托盘可以直立和倒置孵育。
在一个方面中，倒置孵育这些托盘，即顶表面朝下。
当使用本发明的方法时，尤其是当终产物是一种酶时，当与使用没有凹陷的平托盘进行的发酵相比时，这使得酶产量增加。在不同方面中，当与使用没有凹陷的平托盘进行的发酵相比时，本发明的方法使得酶产量增加至少20％，如例如，至少21％，例如至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％，如例如至少30％，例如至少31％，例如至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％，如例如至少40％、至少41％，例如至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％，如例如增加至少50％。
该托盘(其是一个浅平容器)具有顶表面以及两个或更多个凹陷，这两个或更多个凹陷是一个或多个下陷低于其围绕物(在此情况下是顶表面)的区域，每个凹陷都包括一种用于固态发酵的底物。
该托盘可以由任何材料制成，优选能以任何手段进行灭菌的材料。
灭菌方法包括但不限于热灭菌-例如，高压灭菌、干热灭菌，化学灭菌-例如，熏蒸法等。
在一个方面中，该托盘由金属或金属合金制成。金属可以包括但不限于铝、钢等。
在另一个方面中，该托盘由塑料制成。塑料包括但不限于聚碳酸酯、聚氨酯、丙烯酸、聚酯、有机硅、卤化塑料等。
在又另一个方面中，该托盘由木材制成。在不同实施例中，这些托盘还可以由材料的混合物制成，例如但不限于木材和金属或塑料和金属、或木材和塑料或两种或更多种不同金属。
凹陷可以具有任何形状，包括但不限于圆柱形、半球形、圆锥形、立方形、锥形等。它还可以是不同形状的组合，例如一侧是方形的并且另一侧是三角形的。
在一个实施例中，凹陷是圆柱形的。
在另一个实施例中，凹陷是半球形的。
该托盘表面上的凹陷可以是任何数目，优选地其方式为使得在一个特定的托盘中总共至少2.5千克(Kg)的底物。在具体实施例中，在湿基上，存在至少2.6Kg，如至少2.7Kg，例如，至少2.8Kg、至少2.9Kg、至少3.0Kg、至少3.1Kg、至少3.2Kg、至少3.3Kg、至少3.4Kg、至少3.5Kg、至少3.6Kg、至少3.7Kg、至少3.8Kg、至少3.9Kg，如至少4.0Kg，例如，至少4.1Kg、至少4.2Kg、至少4.3Kg、至少4.4Kg、至少4.5Kg、至少4.6Kg、至少4.7Kg、至少4.8Kg、至少4.9Kg，优选约5.0Kg的固态发酵底物。
在一个方面中，该托盘表面上的凹陷数目是3个左右至50个左右。在不同实施例中，该托盘表面上的凹陷数目是3个或4个或5个或6个或7个或8个或9个或10个或11个或12个或13个或14个或15个或16个或17个或18个或19个或20个或21个或22个或23个或24个或25个或26个或27个或28个或29个或30个或31个或32个或33个或34个或35个或36个或37个或38个或39个或40个或41个或42个或43个或44个或45个或46个或47个或48个或49个或甚至在该托盘表面上有50个凹陷。
在一个方面中，根据凹陷的体积和每个托盘所需的SSF底物的总重计算托盘表面上的凹陷数目并且可以由本领域的普通技术人员计算。
在一个方面中，凹陷的体积是从约40至约400立方厘米(cm3)。在不同实施例中，凹陷的体积是约40，例如约45，如例如，约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155、约160、约165、约170、约175、约180、约185、约190、约195、约200，如约205、约210、约215、约220、约225、约230、约235、约240、约245、约250、约255、约260、约265、约270、约275、约280、约285、约290、约295、约300，如约305、约310、约315、约320、约325、约330、约335、约340、约345、约350、约355、约360、约365、约370、约375、约380、约385、约390、约395，例如，约400cm3。
可以根据凹陷的形状计算凹陷的体积并且是本领域的普通技术人员已知的。
在一个方面中，凹陷的深度是从约1cm至约10cm。在不同实施例中，凹陷的深度是约1.5cm，如约2cm，例如约2.5cm、约3cm、约3.5cm、约4.0cm、约4.5cm、约5.0cm、约5.5cm、约6.0cm、约6.5cm、约7.0cm、约7.5cm、约8.0cm、约9.5cm，如例如，约10.0cm。优选地，凹陷的深度是约1cm至约5cm。
在另一个方面中，凹陷在其最宽点处的长度是从约5cm至约15cm。在不同实施例中，凹陷的深度可以是约5.5cm，如约6.0cm、约6.5cm、约7.0cm、约7.5cm、约8.0cm、约8.5cm、约9.0cm、约9.5cm、约10.0cm、约10.5cm、约11.0cm、约11.5cm、约12.0cm、约12.5cm、约13.0cm、约13.5cm、约14.0cm、约14.5cm，如例如，约15.0cm。优选地，凹陷在其最宽点处的长度是从约5cm至约12cm。
在一个另外的方面中，这些凹陷可以被随机置于该顶表面上或可以将其以周期性间隔置于该顶表面上或两者的组合。在一个优选实施例中，这些凹陷以周期性间隔置于该顶表面上。
在一个方面中，沿着该顶表面的长度的最末端处的这些凹陷被放置离该顶表面的最末端约1cm至5cm。在不同实施例中，这些凹陷可以被放置离该顶表面的最末端约1.2cm，如约1.4cm，例如，约1.6cm、约1.8cm、约2.0cm、约2.2cm，如约2.4cm，例如，约2.6cm、约2.8cm、约3.0cm，如约3.2cm、约3.4cm，例如，约3.6cm、约3.8cm、约4.0cm，如约4.2cm、约4.4cm，例如，约4.6cm、约4.8cm，如例如约5.0cm。在一个优选实施例中，沿着该顶表面的长度的最末端处的这些凹陷被放置离该顶表面的最末端约1.0cm至4.0cm。
在另一个方面中，沿着该顶表面的长度的两个连续凹陷之间的距离是约0.5cm至约5cm。在不同实施例中，可以沿着该顶表面的长度以约0.5cm，如约0.7cm，例如，约0.8cm、约0.9cm、约1.0cm、约1.2cm，如约1.4cm，例如，约1.6cm、约1.8cm、约2.0cm，如约2.2cm、约2.4cm，例如，约2.6cm、约2.8cm、约3.0cm，如约3.2cm、约3.4cm，例如，约3.6cm、约3.8cm，如例如约4.0cm，如约4.2cm、约4.4cm，例如，约4.6cm、约4.8cm，如例如约5.0cm放置两个连续凹陷。在一个优选实施例中，沿着该顶表面的长度的两个连续凹陷之间的距离是约0.5cm至约4.0cm。
在另一个方面中，沿着该顶表面的宽度的两个连续凹陷之间的距离是约0.5cm至约5cm。在不同实施例中，可以沿着该顶表面的宽度以约0.5cm，如约0.7cm，例如，约0.8cm、约0.9cm、约1.0cm、约1.2cm，如约1.4cm，例如，约1.6cm、约1.8cm、约2.0cm，如约2.2cm、约2.4cm，例如，约2.6cm、约2.8cm、约3.0cm，如约3.2cm、约3.4cm，例如，约3.6cm、约3.8cm，如例如约4.0cm，如约4.2cm、约4.4cm，例如，约4.6cm、约4.8cm，如例如约5.0cm放置两个连续凹陷。在一个优选实施例中，沿着该顶表面的宽度的两个连续凹陷之间的距离是约0.5cm至约4.0cm。
该托盘的顶表面的末端可以被制成直的或向上弯曲的(隆起的)或向下弯曲的(凹陷的)。
在一个优选实施例中，该托盘的最末端顶表面被卷起以给出更多强度。
在一个方面中，该托盘的这些侧壁或这些后壁被卷起以给出更多强度。
在一个方面中，该顶表面上的每个凹陷的边缘由一个隆起限制。该隆起可以具有任何形状，例如，它可以是圆柱形的或立方形的或圆锥形或它可以是一个平二维平面。在一个优选方面中，该隆起是一个平二维平面。
该隆起的高度可以从约0.1cm至约4.0cm变化。在不同实施例中，该隆起的高度可以从约1.0cm，如约1.2cm，例如，约1.4cm，例如，约1.6cm、约1.8cm、约2.0cm，如约2.2cm、约2.4cm，例如，约2.6cm、约2.8cm、约3.0cm，如约3.2cm、约3.4cm，例如，约3.6cm、约3.8cm，如例如约4.0cm变化。在一个优选实施例中，该隆起的高度可以从约0.1cm至约2.0cm变化。
托盘中的每个凹陷都包括一种SSF底物。这些SSF底物可以是选择为适合支持生产生物体的生长和发酵希望的产物的常用的农业和食品加工的废物或副产物。此类废物和副产物包括但不限于谷粒、堆肥、麦糠、米糠、玉米糠、谷物糠、油压饼、苹果渣、葡萄渣、香蕉皮、柑橘皮、香蕉废弃物、茶叶废弃物、木薯废弃物、杨木浆、甜高粱浆、花生粕、菜籽饼、麦秸、稻草、稻壳、大豆皮、西米渣、葡萄藤修剪粉尘、锯屑、玉米芯、椰棕瓤、咖啡渣、柑橘渣、甜菜渣、咖啡壳、蔗渣、椰子油饼、芥末油饼、木薯粉、小麦粉、玉米粉、蒸米饭、蒸汽预处理柳树、淀粉、甜菜糖蜜以及合成底物。有时，使用高价值的农业和食品材料，如粒状凝乳、饲料甜菜、水稻以及木薯粉。SSF底物还可以是用有机/无机营养液浸渍的隋性支持体；有时是天然惰性支持体(如蔗渣)或人工支持体(如聚氨酯泡沫立方体、粒状粘土和蛭石)。在一个优选实施例中，该底物是糠，例如但不限于麦糠或米糠。
用在该底物上生长的微生物接种该SSF底物。可以根据有待分解的固态发酵底物选择这些微生物，或可以根据需要生长的微生物选择该SSF底物。
在一个方面中，该微生物是一种真菌。在其他方面中，该微生物可以是放线菌、细菌、酵母、藻类等。
在一个优选方面中，该微生物是一种真菌。该真菌可以选自曲霉属、木霉属、根霉属、Cerenna、青霉属、革盖菌属、侧耳属、香菇、粘帚霉属、葡萄孢属(Botritis)、侧孢霉属、多孔菌类(Polyporous)、脉孢菌属、Spiecellum、链霉菌属、拟盘多毛孢属、平革菌属、香菇属、射脉菌属(Phlebia)、Melanocarpus、毛壳菌属、嗜热真菌属(Thermomyces)、嗜热子囊菌属、腐质霉属、高温单孢菌属(Thermomonospora)、篮状菌属(Talaromyces)、栓菌属、火菇属(Flammulina)、革耳属(Panus)、硬孔菌属(Rigidoporus)、根毛霉属、克鲁维酵母菌属、红栓菌属(Pycnoporous)、覆膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、淀粉霉属、枝顶孢霉属、镰刀菌属、毛霉属、毁丝霉属、梭孢壳属、弯颈霉属(Tolypocladium)、伞菌属、Ascovaginospora、Chaetotomastia、盘基网柄菌属(Dictyostelium)、根毛霉属、核盘菌属(Sclerotinia)、毛癣菌属(Trichophyton)、Whetzelinia、疫霉属等。
在一个方面中，该微生物是一种选自以下各项的细菌：假单胞菌属、芽孢杆菌属、弧菌属、气单胞菌属、葡萄球菌属、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、爱德华菌属、欧文菌属、埃希氏杆菌属、克雷伯杆菌属、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺菌属等。
在另一个方面中，该微生物是一种选自以下各项的放线菌：链霉菌属、假丝酵母属、酵母菌属等。
实例
材料与方法
使用的所有化学品都是分析/商业/工业等级的。
测定：
多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)测定(PG(DNS))
多聚半乳糖醛酸酶是催化果胶酸以及其他聚半乳糖醛酸中的(1.4)-α-D-半乳糖苷糖醛酸(galactosiduronic)键的随机水解的果胶酶。它们也被称为果胶去聚合酶。
多聚半乳糖醛酸酶水解多聚半乳糖醛酸中的α-1,4-糖苷键，并且生成物半乳糖醛酸释放。然后，此还原糖与3,5-二硝基水杨酸反应(DNS)。由于DNS的还原而产生的颜色变化与释放的半乳糖醛酸的量是成比例的，这反过来与该样品中的多聚半乳糖醛酸酶的活性是成比例的。
将一个多聚半乳糖醛酸酶单位(PG(DNS))定义为在标准条件(乙酸盐缓冲液(pH 4.5)，40℃，10min反应时间，540nm)下每分钟产生1mg的半乳糖醛酸钠盐的酶量。
果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)测定(PL)
果胶裂解酶是催化(1.4)-α-D-聚半乳糖醛酸甲酯的消除性切割而给出在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-醛酸基(enuronosyl)基团的寡糖的果胶酶。它们可替代地被称为果胶酶(Pectolyase)、聚甲基半乳糖醛反式消除酶(Polymethyl galacturonic transeliminase)、果胶甲基反式消除酶(Pectin methyltranseliminase)、果胶反式消除酶(Pectin trans-eliminase)等。
果胶裂解酶酶促反应由裂解α 1-4半乳糖醛酸糖苷(galacturonosidyl)键，从而产生不饱和的δ4,5糖醛化合物(uronide)组成。在C6中具有羰基官能团的双键具有U.V吸收。235nm下的光密度测定果胶裂解酶活性。
一个果胶裂解酶(PL)单位是根据45℃和pH 5.5的描述条件，催化结合的内切α 1-4半乳糖醛酸糖苷(galacturonosidyl)(C6甲酯)的裂解，从而在一分钟内产生一微摩尔的δ4,5不饱和产物的酶量。
果胶酯酶(EC 3.1.1.11)测定(PEU)
果胶酯酶是将果胶水解为甲醇和果胶酸酯的果胶酶。它们还可替代地被称为果胶脱甲氧酶、果胶甲氧酶、果胶甲基酯酶等。
果胶酯酶催化从果胶中释放甲醇，其中生成物的pH降低。添加氢氧化钠，以将pH维持在4.40。消耗的氢氧化钠的量指示酶活性。
一个单位的PE活性是在标准条件[30℃，pH 4.4]下每分钟消耗1微当量的氢氧化钠的酶量。
果胶反式消除酶(EC 4.2.2.10)测定(PECTU)
此测定估计了样品中的果胶反式消除酶活性(PECTU)。该方法是根据该酶通过反式消除反应降解果胶底物(Obipektin公司，Brown Ribbon Pure)溶液，形成的双键导致238nm下的吸收增加，随后是分光光度计(30℃，pH3.5，360s)，相对于PECTU标准品确定该活性。
日本酒曲含水率和干重的确定：
分别从该测试托盘的每个凹陷中移出日本酒曲并记录其重量(W1g)。将来自每个凹陷的称重的日本酒曲分别转移进研钵中并使用刮刀加以破碎，以得到均质混合物。将来自每个凹陷的20g(W2＝20g)的破碎的日本酒曲称重进分开的皮氏平皿(petri-plates)中并在设置为40℃的热空气干燥器中保存约16小时/过夜。将日本酒曲从干燥器中移出，并且保证它们是松脆且完全干燥的。如果未完全干燥，根据需要将它们再保存更长时间。写下每个干燥的日本酒曲的重量(W3g)。将干燥的日本酒曲转移进干塑料瓶中并存储在冷室中，用于各种测定。
使用以下公式计算水分：
水分％＝[(W2-W3)/W2]x 100
在此情况下，它是[(20–W3)/20]x 100]。
使用以下公式计算日本酒曲的最终干重：
总干重(以克计)＝[100–M％]x W1/100
实例1
使用托盘生物反应器产生果胶酶。
使用不锈钢制作测试托盘生物反应器的凹陷并且使用木材制作其顶表面，该测试托盘生物反应器包含32个高4cm、底宽7.5cm、顶宽9cm、总计体积～253cm3的方形凹陷。
将测试托盘木制反应器用防水胶带包裹并在biohood中在紫外(UV)光下灭菌～16hr，之后在无菌条件下将其用无菌日本酒曲接种，该无菌日本酒曲由预先在108℃下灭菌90分钟的无菌麦糠和产生果胶裂解酶的黑曲霉的良好生长培养物的混合物组成。使该培养物在30℃下生长。日本酒曲水分为58.3％。该托盘生物反应器的32个凹陷中的每个凹陷都含有104g的日本酒曲，因此每个托盘总计3.22Kg。将该托盘生物反应器用在UV下以类似方式灭菌的铝盖盖住并且将整个托盘-盖组件连同标准生产托盘一起在温度和湿度受控的日本酒曲室中在架上倒置孵育。这些标准生产托盘是具有单一凹陷的标准托盘生物反应器，每个托盘包含3.22Kg的日本酒曲。也将它们用铝盖盖住，但是直立孵育。使用蒸汽、冷冻水喷雾和冷冻空气控制日本酒曲室的温度，这样使得将日本酒曲的温度维持在30℃+/-5℃。将该反应器孵育120小时。在任何时间点日本酒曲都没有与外部元件相接触，因为它被该盖很好地保护。通过跨越该室的具沟通道供应蒸汽、水和空气。
在120小时的发酵结束时，从该测试托盘反应器的每个凹陷中移出日本酒曲并在40℃下在干烤箱中干燥12小时。还通过将来自32个斜面的日本酒曲的相等的等分部分混合而制备复合样品。还取标准生产托盘反应器的适当的复合样品用于比较。然后，用水萃取干燥的日本酒曲样品和测试托盘的复合物以及生产托盘对照的复合样品中的每种的等分部分，以便将额外的细胞酶加入溶液中。分析这些萃取物的果胶裂解酶活性(以PECTU单位计)。萃取后，在灭菌后将用过的日本酒曲丢弃。
结果：
下表给出了该复合测试样品相对于该对照托盘样品的各种活性的％增加。将对照假定为100％。
*PECTU(果胶反式消除酶)；PL(果胶裂解酶)；PG(多聚半乳糖醛酸酶)；PE(果胶酯酶)；u/g(每克干日本酒曲的酶单位)
下表给出了该测试托盘生物反应器的每个单独的凹陷相对于对照托盘的日本酒曲活性的％增加。将对照假定为100％。
*这些编号指示单独的凹陷样品
下表给出了针对该测试托盘生物反应器的每个单独凹陷的干重和水分
&EOF(发酵结束)
下表概述了该测试托盘生物反应器的凹陷的结果：
因此，关于PL、PECTU和PE活性，相对于该对照生产托盘，在该测试托盘生物反应器中看到超过20％的显著增加。
实例2
使用托盘生物反应器产生果胶酶。
使用铝制作测试托盘生物反应器的凹陷和顶表面，该测试托盘生物反应器包含32个高4cm、底宽6.21cm、顶宽8.16cm、总计体积～206.5cm3的凹陷。
将测试托盘铝反应器在180℃下在干热灭菌器中灭菌2小时，之后在无菌条件下将其用无菌日本酒曲接种，该无菌日本酒曲由预先在108℃下灭菌90分钟的无菌麦糠和产生果胶裂解酶的黑曲霉的良好生长培养物的混合物组成。使该培养物在30℃下生长。日本酒曲水分为58.1％。该托盘生物反应器的32个凹陷中的每个凹陷都含有大约106g的日本酒曲，因此每个托盘总计3.39Kg。将该托盘生物反应器用以类似方式灭菌的铝盖盖住并且将整个托盘-盖组件连同标准生产托盘一起在温度和湿度受控的日本酒曲室中在架上直立孵育。这些标准生产托盘是具有单一凹陷的标准托盘生物反应器，每个托盘包含3.22Kg的日本酒曲。也将它们用铝盖盖住，并且直立孵育。使用蒸汽、冷冻水喷雾和冷冻空气控制日本酒曲室的温度，这样使得将日本酒曲的温度维持在30℃+/-5℃。将该反应器孵育120小时。在任何时间点日本酒曲都没有与外部元件相接触，因为它被该盖很好地保护。通过跨越该室的具沟通道供应蒸汽、水和空气。
在120小时的发酵结束时，从该测试托盘反应器的每个凹陷中移出日本酒曲并在40℃下在干烤箱中干燥12小时。还通过将来自32个斜面的日本酒曲的相等的等分部分混合而制备复合样品。还取标准生产托盘反应器的适当的复合样品用于比较。然后，用水萃取干燥的日本酒曲样品和测试托盘的复合物以及生产托盘对照的复合样品中的每种的等分部分，以便将额外的细胞酶加入溶液中。分析这些萃取物的果胶裂解酶活性(以PECTU单位计)。萃取后，在灭菌后将用过的日本酒曲丢弃。
结果：
下表给出了该复合测试样品相对于该对照托盘样品的各种活性的％增加。将对照假定为100％。
*PECTU(果胶反式消除酶)；PL(果胶裂解酶)；PG(多聚半乳糖醛酸酶)；PE(果胶酯酶)；u/g(每克干日本酒曲的酶单位)
下表给出了该测试托盘生物反应器的每个单独的凹陷相对于对照托盘的日本酒曲活性的％增加。将对照假定为100％。
*这些编号指示单独的凹陷样品
下表给出了针对该测试托盘生物反应器的每个单独凹陷的干重和水分
&EOF(发酵结束)
下表概述了该测试托盘生物反应器的凹陷的结果：
因此，关于PL、PECTU、PG和PE活性，相对于该对照生产托盘，在该测试托盘生物反应器中看到超过20％的显著增加。
Claims (17)
1.一种用于微生物的固态发酵从而产生终产物的方法，该方法包括在包含固态发酵底物的托盘中发酵该微生物，该托盘进一步包括：
a.一个顶表面；以及
b.该顶表面上的两个或更多个凹陷，其中每个凹陷都包括一种用于固态发酵的底物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该托盘进一步包括
从该顶表面的长度向上延伸的两个侧壁和从该顶表面的宽度向上延伸的两个后壁；和/或
一个盖，用于覆盖该托盘的顶表面。
3.根据权利要求2所述的方法，其中侧壁的高度大于后壁的高度。
4.根据权利要求2所述的方法，其中后壁的高度大于侧壁的高度。
5.根据权利要求2所述的方法，其中这些后壁和侧壁沿着其高度连接在该托盘的顶表面的拐角处。
6.根据权利要求1所述的方法，其中该终产物是一种代谢产物或一种微生物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中该代谢产物是一种或多种酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中与使用没有凹陷的平托盘进行的发酵相比，该酶的产量增加至少20％。
9.根据权利要求1所述的方法，其中这些凹陷在该托盘的顶表面上等间距地隔开。
10.根据权利要求1所述的方法，其中该托盘具有3-50个之间的凹陷。
11.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个凹陷是圆柱形的。
12.根据权利要求1所述的方法，其中该凹陷的深度是1-10cm和/或该凹陷在其最宽点处的长度是5至15cm。
13.根据权利要求1所述的方法，其中该凹陷的体积是从40至400cm3。
14.根据权利要求1所述的方法，其中该微生物是一种真菌或一种细菌。
15.根据权利要求1所述的方法，其中该固态发酵底物选自下组，该组由以下各项组成：糠、蔗渣、木屑、椰壳纤维或其混合物。
16.根据权利要求1所述的方法，其中沿着该顶表面的长度的最末端处的这些凹陷离该顶表面的最末端1-5cm。
17.根据权利要求1所述的方法，其中沿着该顶表面的长度的两个连续凹陷之间的距离是0.5至5.0cm和/或沿着该顶表面的宽度的两个连续凹陷之间的距离是从0.5至5.0cm。
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