CN104812446B - 癌干细胞接种和治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用放射疗法和已经暴露于癌干细胞或其部分的抗原呈递细胞的组合来治疗和预防受试者中的癌症的方法、系统和组合物。在某些实施方案中，所述抗原呈递细胞是已经用ALDH高癌干细胞脉冲的树突状细胞。
Description
本申请要求于2012年10月24日提交的美国临时申请序列号61/717,902的优先权，其通过引用整体并入本文。
本发明是在美国国立卫生研究院资助号CA82529下的政府支持下完成的。政府在本发明中具有一些权利。
发明领域
本发明涉及用放射疗法和已经暴露于癌干细胞或其部分的抗原呈递细胞的组合来治疗和预防受试者中的癌症的方法、系统和组合物。在某些实施方案中，所述抗原呈递细胞是已经用ALDEFLUOR+/ALDH高癌干细胞脉冲的树突状细胞。
发明背景
使用过继转移的T细胞(1至3)或树突状细胞(DC：参考文献4至6)治疗患有癌症的患者的临床试验已经示出了对患有晚期疾病的患者的疗效。然而，对于这样的免疫治疗方法的临床应答被限制于有限百分比的经治疗的患者。一般而言，已经使用具有异质性癌细胞群体的大肿瘤块作为生成效应T细胞或引发DC疫苗的抗原来源。人肿瘤由异质性的肿瘤细胞克隆组成，这些肿瘤细胞克隆在增殖、分化以及起始子肿瘤的能力方面各不相同。现有免疫方法不能靶向癌干细胞(CSC)，这是治疗失败的重要因素。
人CSC(7至17)的鉴定提供了用于开发癌症治疗的新模式。已经示出，这些干细胞已显示对常规化疗方案和放射(18，19)相对抗性，并且被认为是在这些治疗后与癌症复发和进展有关的细胞。CSC现象可以以类似的方式有害地影响对有效的癌症免疫治疗的开发。这些治疗涉及靶向表达分化的肿瘤抗原的细胞。然而，这样的抗原可在分化的肿瘤细胞上选择性地表达。不表达这些抗原的CSC可能因此逃过这些免疫干预。
发明概述
本发明涉及用放射疗法和已经暴露于癌干细胞或其部分的抗原呈递细胞的组合来治疗和预防受试者中的癌症的方法、系统和组合物。在某些实施方案中，所述抗原呈递细胞是已经用ALDEFLUOR+/ALDH高癌干细胞脉冲的树突状细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗(和/或预防)受试者(或疑似患有癌症的受试者)的癌症的方法，包括：以有效量的放射疗法和施用有效量的抗原呈递细胞的组合来治疗受试者，从而杀伤所述受试者中的至少一些癌细胞，其中所述抗原呈递细胞已经暴露于癌干细胞或所述癌干细胞的至少抗原部分。在某些实施方案中，所述抗原呈递细胞包括树突状细胞。在其他实施方案中，所述抗原呈递细胞包括巨噬细胞。在另一些实施方案中，抗原呈递细胞包括B细胞。
在具体实施方案中，与用放射疗法而没有施用所述抗原呈递细胞的存活长度相比，对所述受试者的所述治疗增加了所述受试者的存活长度。在另一些实施方案中，所述癌干细胞的所述至少抗原部分包括所述癌干细胞的细胞裂解物。在具体实施方案中，所述癌干细胞是ALDH+、或CD44+CD24-/低、或CD44+CD24+、或CD44+α2β1 hi CD133+、或CD44+BMI1+、或CD44+EpCAM高、或CD44+CK5+CK20-、或CD44+ESA+。
在具体实施方案中，受试者是人。在另一些实施方案中，所述受试者患有选自由以下组成的组的癌症：黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、脑癌、头颈鳞状细胞癌、皮肤癌和结肠癌。在其他实施方案中，所述方法还包括用化疗剂进一步治疗所述受试者。在另外的实施方案中，所述化疗剂选自表1。在其他实施方案中，所述放射疗法包括外射束放射疗法。在某些实施方案中，所述放射疗法包括内部放射疗法。
在某些实施方案中，本发明提供了包括以下的系统：a)已经暴露于癌干细胞或所述癌干细胞的至少抗原部分的抗原呈递细胞，以及b)经配置用于内部放射癌疗法的放射性移植物。在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞包括树突状细胞。在具体实施方案中，所述癌干细胞是ALDEFLUOR+/ALDH高。
在另外的实施方案中，本发明提供了包括以下的系统：a)已经暴露于癌干细胞或所述癌干细胞的至少抗原部分的抗原呈递细胞，以及b)经配置用于在外部放射癌疗法期间发射放射的装置。在另一些实施方案中，所述抗原呈递细胞包括树突状细胞。在另外的实施方案中，所述癌干细胞是ALDEFLUOR+/ALDH高。
在一些实施方案中，本发明提供了包含以下的组合物：已经暴露于癌干细胞或所述癌干细胞的至少抗原部分的抗原呈递细胞，以及放射性核苷酸。
附图说明
图1提供了来自实施例1的结果，并且示出放射疗法显著富集D5肿瘤中的ALDH高CSC，从4.5％升至9.5％(为大于100％倍的富集)。
图2提供了来自实施例1的结果，并且示出在用或不用癌干细胞疫苗的情况下经历放射疗法的动物中D5肿瘤细胞的皮下肿瘤生长。图2示出了4个治疗组的平均肿瘤尺寸(未治疗、仅放射疗法、放射疗法+阴性疫苗以及放射疗法+阳性疫苗)。
图3提供了来自实施例1的结果，并且示出在用或不用CSC疫苗的情况下经历放射疗法的具有皮下D5肿瘤的宿主的存活曲线。如在图3中所见，当还使用了放射疗法时，ALDH低疫苗与ALDH高疫苗之间的存活率上存在明显的差异。
图4提供了来自实施例1的结果，并且示出了经纯化和A/E的脾T细胞对未经分选的D5细胞的细胞毒性，所述脾T细胞收集自经历放射疗法以及放射疗法+CSC疫苗的动物。
图5提供了来自实施例1的结果，并且示出了经纯化和A/E的脾细胞对ALDH高以及ALDH低D5细胞的CTL，所述脾细胞收集自经历放射疗法以及放射疗法+CSC疫苗的动物。
图6提供了来自实施例1的结果，并且示出了经纯化和A/E的脾T细胞对ALDH高以及ALDH低D5细胞的CTL，所述脾T细胞收集自放射疗法+CSC疫苗。如该图所示，放射疗法+CSC疫苗-引发的CTL比ALDH非CSC杀伤更多ALDH+CSC，尤其当效应子与靶的比率为10∶1时更是如此。
图7提供了来自实施例1的结果，并且示出了经纯化和LPS/抗-CD40活化的脾B细胞的IgG产生，所述脾B细胞收集自经历放射疗法以及放射疗法+CSC疫苗的动物。
图8提供了来自实施例1的结果，并且示出了经纯化和LPS/抗-CD40活化的脾B细胞的培养物上清液，所述脾B细胞收集自经历放射疗法以及放射疗法+结合至ALDH+D5 CSC的CSC-DC治疗的动物。
图9提供了来自实施例1的结果，并且示出了由CSC-引发的抗体和补体依赖的细胞毒性(CDC)靶向CSC的结果。如该图所示，来自放射疗法+CSC接种的宿主的上清液比收集自放射疗法治疗的宿主的上清液介导显著更高效的D5 CSC裂解(P＝0.0094)。
图10提供了来自实施例1的结果，并且示出了ALDH高疫苗抑制皮下D5肿瘤向肺的转移。
图11提供了来自实施例1的结果，并且示出了D5皮下肿瘤上的趋化因子受体表达，所述肿瘤来自经历放射疗法以及放射疗法和CSC疫苗的动物。
图12提供了来自实施例1的结果，并且示出仅CSC疫苗可显著地抑制微转移模型中的D5肿瘤生长。图12示出，与未治疗的、经TPDC治疗以及经ALDH低疫苗治疗的动物相比，经ALDH高疫苗治疗的小鼠在37天后具有显著更小的肿瘤尺寸。
图13提供了来自实施例1的结果，并且示出微转移性疾病模型中的存活曲线，该曲线示出与未治疗的、经TPDC治疗以及经疫苗治疗的小鼠相比，约50天后经疫苗治疗的小鼠的存活百分比高得多。
图14示出CSC-DC疫苗在微转移性D5黑素瘤和SCC7鳞状细胞癌模型中诱导显著的抗肿瘤作用。(A，C)CSC-DC接种显著抑制皮下肿瘤生长。皮下接种D5(图14A)或SCC7(图14C)细胞后24小时，用如所示的不同疫苗治疗动物，并在一周后重复所述治疗。示出了肿瘤体积(平均值±SEM)。(B，D)CSC-DC疫苗显著延长了具有皮下D5的小鼠(图14B)和具有皮下SCC7的小鼠(图14D)的存活期。在14D中，经CSC-DC疫苗治疗的小鼠的中值存活期是71天，其示出优于未经治疗(PBS)组的25天存活期。而H-DC或ALDH低-DC疫苗表现出优于PBS对照的仅2至3天存活期。数据代表D5(14A，14B)进行的3次独立实验，并且在对SCC7(14C，14D)的第二实验中重复数据。
图15示出CSC-DC疫苗显著提高建立的D5和SCC7模型中的局部肿瘤放射疗法(RT)的疗效。(A，C)具有5天建立的D5皮下肿瘤(图15A)或SCC7皮下肿瘤(图15C)的小鼠经历用所示的PBS、仅RT、RT+ALDH低-DC或RT+ALDH高-DC(CSC-DC)疫苗的治疗。治疗分别于第12天和第19天重复。示出了肿瘤体积(平均值±SEM)。(B，D)分别经历了PBS、仅RT、RT+ALDH低-DC或RT+ALDH高-DC(CSC-DC)疫苗的具有D5的小鼠(图15B)和具有SCC7的小鼠(图15D)的存活曲线。数据代表对D5(15A，15B)进行的3次独立实验，并且在对SCC7(15C，15D)的第二实验中重复数据。
图16示出CSC-DC接种防止了微转移性D5模型的肺转移。(图16A)比较如表中所示治疗的组之间的肺转移(n＝11)的p值。(图16B)示出肺转移的百分比的直方图。(图16C)通过苏木精和伊红(H&E)染色验证了肺转移。代表性图示出肺组织的组织学变化。从正常B6小鼠收集的肺组织充当对照。红箭头指向肺组织的肿瘤损伤。数据代表所进行的3次独立实验。
图17示出局部肿瘤放射疗法(RT)接着CSC-DC接种显著抑制建立的D5模型中的肺转移。(图17A)比较如所示治疗的组之间的肺转移(n＝11)的p值。RT+ALDH高-DC(CSC-DC)显著抑制远距离肺转移。(图17B)示出肺转移的百分比的直方图。(图17C)对肺组织的组织学样本的H&E染色，所述样本收集自经历PBS、仅RT、RT+ALDH低-DC以及RT+ALDH高CSC-DC疫苗的小鼠。代表性图示出肺组织的组织学变化。从正常B6小鼠收集的肺组织充当对照。红箭头指向肺组织的肿瘤损伤(放大倍数，100X)。数据代表所进行的3次独立实验。
图18示出CSC-DC接种显著降低微转移设置中的D5细胞上CCR10和CCR7的表达。使用流式细胞术检测新鲜收集的皮下肿瘤中趋化因子受体的表达水平。(图18A)用PBS、H-DC、ALDH低-DC或ALDH高-DC(CSC-DC)治疗小鼠后的CCR10表达。直方图示出了具有SE的3次试验的结果，使用收集自各实验组的3只动物的D5细胞。(图18B)通过使用收集自各治疗组中的多只动物的混合D5细胞产生CCR10流式细胞术图。使用相同的方法检测收集自分别经历PBS、H-DC、ALDH低-DC或ALDH高-DC治疗的宿主的D5肿瘤上的CCR7表达(C和D)。
图19示出RT+CSC-DC接种显著降低建立的肿瘤设置中的D5细胞上CCR10和CCR7的表达。使用流式细胞术检测新鲜收集的皮下肿瘤中趋化因子受体的表达。(图19A和B)：收集自用PBS、仅RT、RT+ALDH低-DC或RT+ALDH高-DC(CSC-DC)治疗的小鼠的皮下肿瘤上的CCR10表达。直方图示出了具有SE的3次试验的结果，使用收集自各实验组的3只动物的D5细胞。通过使用收集自各治疗组中的多只动物的混合D5细胞产生CCR10流式细胞术图。使用相同的方法检测收集自分别经历PBS、仅RT、RT+ALDH低-DC或RT+ALDH高-DC(CSC-DC)治疗的宿主的D5肿瘤上的CCR7表达(图19C和D)。
图20示出ALDH高-DC(CSC-DC)和RT+CSC-DC疫苗显著降低收集自微转移性疾病设置中(图20A至C)以及建立的D5模型中(图20D至F)具有D5的宿主的肺组织中的趋化因子mRNA水平。收集自微转移以及建立的具有D5的小鼠的肺组织中的CCR7和CCR10所对应趋化因子的表达水平的分析通过实时定量PCR来完成。(图20A，D)分别收集自经历了所示治疗的患有微转移性疾病(图20A)或建立的疾病(图20D)的小鼠的肺组织中CCL21(CCR7配体)的mRNA表达。使用相同的PCR程序来评价CCR10、CCL27(图20B、E)和CCL28(图20C、F)的配体。在第二实验中重复数据。
图21示出CSC-DC或RT+CSC-DC疫苗治疗显著降低新鲜收集自微转移(21A、21B)或建立的(C、D)D5模型的原代皮下肿瘤中ALDH高细胞的百分比。将在ALDH抑制剂DEAB的存在下用ALDEFLUOR孵育的肿瘤细胞用作对照。实验通过使用来自各治疗组的多个个体小鼠的皮下肿瘤细胞来重复至少3次(21A、21C)。使用来自各组的多只小鼠的混合肿瘤细胞产生代表性的流式细胞术图(21B、21D)。
图22示出由D5 CSC疫苗引发的B细胞产生的抗体特异性地结合至D5 CSC。在微转移D5模型中，收集脾，并用LPS/抗-CD40活化脾细胞B细胞。(图22A)代表性的流式细胞术示出CSC-DC疫苗引发的Ab特异性地结合至ALDH高CSC，而H-DC或ALDH低-DC疫苗引发的Ab优先结合至ALDH低细胞。(图22B)分别由PBS、H-DC、ALDH低-DC或ALDH高-DC引发的免疫上清液对ALDH高CSC的结合的统计分析。结合实验重复3次。(图22C)分别由PBS、H-DC、ALDH低-DC或ALDH高-DC引发的免疫上清液对ALDH低D5细胞的结合的统计分析。结合实验重复3次。
图23示出基于CSC的接种赋予对建立的D5模型的局部肿瘤照射的设置中的疫苗引发的抗体特异性结合至CSC。脾收集自经历了PBS、仅RT、RT+ALDH低-DC或RT+ALDH高-DC疗法的具有D5的宿主。用LPS/抗-CD40活化脾细胞B细胞。(图23A)代表性的流式细胞术示出CSC-DC疫苗引发的Ab特异性地结合至ALDH高CSC，而相同的RT设置中，ALDH低-DC疫苗引发的Ab优先结合至ALDH低细胞。(图23B)分别由PBS、仅RT、RT+ALDH低-DC或RT+ALDH高-DC疗法引发的免疫上清液对ALDH高D5 CSC的结合的统计分析。结合实验重复3次。(图23C)分别由PBS、仅RT、RT+ALDH低-DC或RT+ALDH高-DC疗法引发的免疫上清液对ALDH低D5非CSC的结合的统计分析。结合实验重复3次。
图24示出CSC-DC疫苗引发的抗体通过补体依赖的细胞毒性(CDC)选择性地靶向CSC。通过用免疫B细胞的培养物上清液孵育作为靶的活ALDH高D5 CSC以及ALDH低D5非-CSC来测量抗体和补体介导的细胞毒性，所述免疫B细胞收集自微转移D5黑素瘤模型中(图24A)或建立的D5模型中(图24B)经历所示不同治疗的小鼠。数据表示为活细胞的百分比。较低的活细胞百分比意味着较高的细胞裂解。
定义
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不局限于人、非人灵长类、啮齿类等(例如，其将成为具体治疗的接受者，或者从其收集癌癌细胞的受试者)。通常来说，除非本文另有说明，否则术语“受试者”和“患者”可互换使用。
如本文所用，术语“疑似患有癌症的受试者”是指呈现一种或多种指示癌症的征兆或症状(例如，明显的肿块或团块)的受试者，或者正在筛查癌症(例如，在例行体检中期间)的受试者。疑似患有癌症的受试者还可具有一种或多种风险因素。疑似患有癌症的受试者一般不针对癌症进行测试。然而，“疑似患有癌症的受试者”涵盖已经接受了初步诊断(例如，CT扫描示出团块)但尚未完成确证测试(例如，组织活检和/或组织学)的个体，或者癌症阶段未知的个体。该术语还包括曾经患过癌症的人(例如，处于缓解期的个体)。“疑似患有癌症的受试者”有时被诊断为患有癌症，而有时被发现未患癌症。
如本文所用，术语“经诊断患有癌症的受试者”是指经测试并发现具有癌细胞的受试者。可使用任何合适的方法来诊断癌症，包括但不限于组织活检、x-射线、血液试验以及本发明的诊断方法。“初步诊断”是基于仅视觉上(例如，CT扫描或存在肿块)和抗原测试的诊断。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现有益的或期望的结果的组合物或治疗的量。可在一次或多次施用、施加或给药中施用有效量，并且不意图将有效量限制于特定的制剂或施用途径。
如本文所用，术语“施用”是指将癌干细胞疫苗(例如，经脉冲的抗原呈递细胞)药物、药物前体或其他试剂或者治疗性治疗给予受试者的行为。施用至人体的示例性途径可为通过眼(经眼)、口(经口)、皮肤(经皮)、鼻(经鼻)、肺(吸入剂)、口腔黏膜(经口腔)、耳、通过注射(例如，静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等)等。
“共施用”是指将多于一种化学试剂或治疗性治疗(例如，放射疗法)施用至生理系统(例如，受试者或者体内、体外或离体细胞、组织和器官)。各化学试剂以及治疗性治疗(例如放射疗法)的“共施用”可为同时的，或者以任何时间顺序或物理组合。
如在经富集的细胞群体中，可基于经分级的细胞组中具有特定标志物的细胞数比未经分级的细胞组中具有该标志物的细胞数增加来定义“富集”。然而，还可通过致瘤性功能来将术语“富集”定义为在有限稀释频率下(例如，在小鼠模型中)生成癌(例如，肿瘤)的最小的细胞数。例如，如果500个癌干细胞在63％的测试动物中形成肿瘤，但是在63％的测试动物中形成肿瘤需要5000个未经分级的肿瘤细胞，则癌干细胞群体对于致瘤活性富集了10倍。
如本文所用，术语“药物”和“化疗剂”是指用于诊断、治疗或预防生理系统(例如，受试者或体内、体外或离体细胞、组织以及器官)中的疾病或病理状态的药物活性分子。药物通过改变药物所被施用至的活生物体、组织、细胞或体外系统的生理而起作用。术语“药物”和“化疗剂”意图涵盖抗增生性以及抗瘤性的化合物，以及其他生物治疗性化合物。药物的例子可在下文的表1中找到。
发明详述
本发明涉及用放射疗法和已经暴露于癌干细胞或其部分的抗原呈递细胞的组合来治疗和预防受试者中的癌症的方法、系统和组合物。在某些实施方案中，所述抗原呈递细胞是已经用ALDEFLUOR+/ALDH高癌干细胞脉冲的树突状细胞。
本发明不受用于负载抗原呈递细胞的癌干细胞类型的限制。可从其分离或富集癌干细胞的癌症的例子包括但不限于，淋巴瘤(例如，霍奇金氏症或非霍奇金氏症)、白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、粒单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)，以及肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和成视网膜细胞瘤)。本发明还可适用于肉瘤和上皮癌，例如卵巢癌和乳腺癌，并且可适用于所有实体瘤。
在某些实施方案中，在用放射疗法和已经暴露于癌干细胞的抗原呈递细胞治疗患者之前，测试来自受试者的样品以确定患者是否具有癌干细胞(以及是什么类型)。可分析和筛选受试者的(例如，特定癌症患者的)癌干细胞(例如，一旦分离并使其在体外增殖)。例如，在一些实施方案中，将分析受试者的癌干细胞用作对受试者的诊断。因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于检测癌干细胞生物标志物的表达以鉴定患者是否具有特定的癌干细胞或其组合的方法。在一些实施方案中，直接(例如，在核酸水平或蛋白质水平)测量表达。在一些实施方案中，在组织样品(例如，活检组织)中检测表达。在其他实施方案中，在体液(例如，包括但不限于，血浆、血清、全血、粘液和尿)中检测表达。在一些优选实施方案中，通过测量细胞和组织(例如，癌细胞和组织)中癌干细胞生物标志物的表达水平来检测癌干细胞生物标志物。例如，在一些实施方案中，通过使用抗体或通过检测癌干细胞生物标志物蛋白/核酸(例如，CD44、CD24、EpCam、CD49f、ALDH、mir-221、mir-110和/或mir-93)来监测癌干细胞生物标志物。在一些实施方案中，在从受试者移除细胞或组织后，在细胞或组织上进行检测。在其他实施方案中，通过使存在于受试者内的细胞和组织中的癌干细胞生物标志物可视化来进行检测。在一些实施方案中，通过测量组织样品(例如，癌性组织)中的相应mRNA的表述来检测癌干细胞生物标志物。在一些实施方案中，通过Northern印迹分析来检测RNA。Northern印迹分析涉及RNA的分离和互补的经标记探针的杂交。
在某些实施方案中，额外的治疗剂与放射疗法和抗原呈递细胞一起施用。可与本发明的试剂共施用或与本发明的试剂相关的任何治疗剂适用于本发明的方法中。本发明的一些实施方案提供了用于施用至少一种额外的治疗剂(例如，包括但不限于，化疗性抗肿瘤剂、抗微生物剂、抗病毒剂、抗真菌剂以及抗炎剂)和/或治疗技术(例如，外科干预、放射疗法)的方法。
考虑了用于本发明某些实施方案的多种抗肿瘤剂(例如，抗癌剂)。适于与本发明一起使用的抗癌剂包括但不限于，诱导凋亡的试剂、抑制腺苷脱氨酶功能、抑制嘧啶生物合成、抑制嘌呤环生物合成、抑制核苷酸互变、抑制核糖核苷酸还原酶、抑制胸腺嘧啶单磷酸(TMP)合成、抑制二氢叶酸减少、抑制DNA合成、与DNA形成加合物、损伤DNA、抑制DNA修复、插入DNA、使天冬酰胺脱氨基、抑制RNA合成、抑制蛋白质合成或稳定性、抑制微管合成或功能等的试剂。
在一些实施方案中，适于与本发明一起使用的示例性抗癌试剂包括但不限于：1)生物碱，包括微管抑制剂(例如，长春新碱、长春碱和长春地辛等)、微管稳定剂(例如，紫杉醇(TAXOL)和多西他赛等)，以及染色质功能抑制剂，包括拓扑异构酶抑制剂，例如表鬼臼毒素类(例如，依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)等)，以及靶向拓扑异构酶I的试剂(例如，喜树碱和伊立替康(CPT-11)等)；2)共价DNA-结合试剂(烷化剂)，包括氮芥类(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、ifosphamide和白消安(MYLERAN)等)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀等)，以及其他烷化剂(例如，达卡巴嗪、羟基甲基蜜胺、噻替派和丝裂霉素等)；3)非共价的DNA结合剂(抗肿瘤抗生素)，包括核酸抑制剂(例如，更生霉素(放线菌素D)等)、蒽环类(例如，柔红霉素(道诺霉素和cerubidine)、多柔比星(阿霉素)和伊达比星(伊达霉素)等)、蒽二酮类(例如，蒽环霉素类似物，例如，米托蒽醌等)、博来霉素(BLENOXANE)等，以及普卡霉素(光辉霉素)等；4)抗代谢剂，包括叶酸拮抗剂(例如，甲氨蝶呤、FOLEX和MEXATE等)、嘌呤抗代谢剂(例如，6-巯基嘌呤(6-MP、PURINETHOL)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、硫唑嘌呤、阿昔洛韦、更昔洛韦、氯脱氧腺苷、2-氯脱氧腺苷(CdA)和2′-脱氧助间型霉素(喷司他汀)等)、嘧啶拮抗剂(例如，氟代嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶(ADRUCIL)、5-氟脱氧尿嘧啶(FdUrd)(氮尿苷))等)，以及胞嘧啶阿拉伯糖苷(例如，CYTOSAR(ara-C)和氟达拉滨等)；5)酶，包括L-天门冬酰胺酶和羟基脲等；6)激素，包括糖皮质激素、抗雌激素(例如他莫昔芬等)、非甾醇抗雄激素(例如，氟他胺等)和芳香化酶抑制剂(例如，阿那曲唑(ARIMIDEX)等)；7)铂化合物(例如，顺铂和卡铂等)；8)与抗癌药物、毒素和/或放射性核素等缀合的单克隆抗体；9)生物应答修饰剂(例如，干扰素(例如，IFN-α等)和白介素(例如，IL-2等)等)；10)过继性免疫疗法；11)造血性生长因子；12)诱导肿瘤细胞分化的试剂(例如，全反式维甲酸等)；13)基因治疗技术；14)反义治疗技术；15)肿瘤疫苗；16)针对肿瘤转移的疗法(例如，巴马司他等)；17)血管发生抑制剂；18)蛋白体抑制剂(例如，VELCADE)；19)乙酰化和/或甲基化的抑制剂(例如，HDAC抑制剂)；20)NFκB的调节剂；21)细胞周期调控的抑制剂(例如，CDK抑制剂)；22)p53蛋白功能的调节剂；以及23)放射。
任何用于癌症治疗环境的溶瘤剂可在本发明的组合物和方法中使用。例如，美国食品和药品管理局提供了经核准的用于美国的溶瘤剂的配方。美国F.D.A.的国际同类机构提供了类似的表。表1提供了经核准用于美国的示例性抗瘤剂的清单。本领域技术人员应领会，对于示例性的试剂而言，所有美国的经核准化学治疗上需要的“产品标记”描述经核准的适应症、给药信息、毒性数据等。
表1
实验
提供了以下实施例以展示和进一步描述本发明的某些优选实施方案和方面，并且这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1
组合的放射与癌干细胞疫苗治疗
在该实施例中，测试了用放射疗法(RT)和经癌干细胞脉冲的树突状细胞对肿瘤的组合治疗。
材料与方法
小鼠：使用7周龄或更大的雌性C57BL/6(B6)小鼠。密歇根大学动物医学实验室批准了所有动物方案。
鼠肿瘤：D5是自发起源的与B6小鼠同系的不良免疫原性的黑素瘤。
肿瘤模型：第一模型涉及使用CSC-DC疫苗作为放射疗法(RT)的附加策略来治疗经建立的肿瘤。第5天用局部RT治疗皮下D5肿瘤，并在第6天重复治疗。于第7天开始疫苗疗法。该组合治疗重复两次，之间隔一周。第二模型涉及对微转移性疾病的治疗。在皮下(s.c.)接种D5肿瘤细胞于B6小鼠后24小时开始疫苗接种，一周后重复疫苗接种。
疫苗接种：从经培养的D5细胞分离ALDHFLUOR+和ALDHFLUOR-细胞。在IL-4和GM-CSF中培养骨髓来源的树突状细胞(DC)，并用ALDHFLUOR+或ALDHFLUOR-细胞的裂解物脉冲DC以产生经肿瘤裂解物脉冲的DC。用DC疫苗经皮下接种小鼠。
流式细胞分析：分别使用PE缀合的CCR5、CCR7、CCR10、CXCR2和FITC缀合的CXCR4来染色来自新鲜收集的皮下D5肿瘤的细胞。使用匹配的同种型对照mAb染色两份样品。使用LSR仪分析数据。
CTL细胞毒性：通过抗-CD3/CD28活化和IL-2扩增来由脾细胞产生CTL。使用LDH释放测定来测试CTL介导的CSC或非CSC细胞毒性。
抗体产生：在实验结束时收集脾。使用LPS和抗-CD40活化脾B细胞，收集培养物上清液，并使用ELISA分析IgG产生。
免疫上清液的CSC结合：ALDEFLUOR+细胞与具有等量IgG的脾B细胞的培养物上清液一起孵育。然后用FITC抗-小鼠IgG孵育细胞。使用流式细胞术检测结合。
抗体和补体介导的细胞毒性：通过用上清液孵育105ALDHhi CSC或ALDH低非-CSC，然后在兔子补体存在下培养来评估由来自脾B细胞的培养物上清液中的抗体介导的CSC裂解。然后在台盼蓝染色后计数活细胞，以计算CSC裂解：活细胞的％＝上清液和补体孵育后计数的活细胞/105
统计学分析：通过非配对的t检验来分析数据。使用对数秩检验(1ong-rank test)来比较存活曲线。P值＜0.05视为统计显著的。
结果：
图1示出，放射疗法显著富集了D5肿瘤中的ALDH高CSC，从4.5％升至9.5％(为大于100％倍的富集)。图2示出在用或不用癌干细胞疫苗的情况下经历放射疗法的动物中D5肿瘤细胞的皮下肿瘤生长。图2示出了4个治疗组的平均肿瘤尺寸(未治疗、仅放射疗法、放射疗法+阴性疫苗以及放射疗法+阳性疫苗)。如在图中可见，在该建立的肿瘤模型中，在与放射疗法的相同设置中，ALDH低疫苗和ALDH高疫苗之间的皮下肿瘤生长没有显著差异。图3示出在用或不用CSC疫苗的情况下经历放射疗法的具有皮下D5肿瘤的宿主的存活曲线。如在图3中所见，在使用放射疗法的相同设置中，ALDH低疫苗与ALDH高疫苗之间的存活率上存在显著差异。图4示出了经纯化和A/E的脾T细胞对未经分选的D5细胞的细胞毒性，所述脾T细胞收集自经历放射疗法以及放射疗法+CSC疫苗的动物。图5示出了经纯化和A/E的脾细胞对ALDH高以及ALDH低D5细胞的CTL，所述脾细胞收集自经历放射疗法以及放射疗法+CSC疫苗的动物。图6示出了经纯化和A/E的脾T细胞对ALD高以及ALDH低D5细胞的CTL，所述脾T细胞收集自放射疗法+CSC疫苗。如该图所示，放射疗法+CSC疫苗-引发的CTL比ALDH非CSC杀伤更多ALDH+CSC，尤其当效应子与靶的比率为10∶1时更是如此。图7示出了经纯化和LPS/抗-CD40活化的脾B细胞的IgG产生，所述脾B细胞收集自经历放射疗法以及放射疗法+CSC疫苗的动物。在产生用于图7的数据中，脾细胞收集自在用或不用CSC疫苗的情况下经历放射疗法的动物。用LPS/抗-CD40活化经富集的脾B细胞。然后收集培养物上清液，用于使用ELISA的IgG检测。来自放射疗法+CSC接种的宿主的B细胞的培养物上清液包含更高水平的IgG。图8示出了经纯化和LPS/抗-CD40活化的脾B细胞的培养物上清液，所述脾B细胞收集自经历放射疗法以及放射疗法+结合至ALDH+D5 CSC的CSC-DC的治疗的动物。在产生用于图8的数据中，用具有等量IgG的脾B细胞的培养物上清液孵育ALDEFLUOR+细胞。然后用FITC抗-小鼠IgG孵育细胞。通过使用流式细胞术观察到，来自放射疗法+CSC接种的宿主的上清液与D5 CSC的结合(89.5％)比来自RT治疗的宿主(46.2％)的上清液的结合高效得多。图9示出了由CSC-引发的抗体和补体依赖的细胞毒性(CDC)靶向CSC的结果。如该图所示，来自放射疗法+CSC接种的宿主的上清液比收集自放射疗法治疗的宿主的上清液介导显著更高效的D5 CSC裂解(P＝0.0094)。由经CSC引发的抗体介导的这样的CDC是CSC特异性的，因为来自相同的放射疗法+CSC接种的宿主的上清液导致ALDEFLUOR-D4 5细胞的最小裂解。
图10示出了ALDH高疫苗抑制皮下D5肿瘤向肺的转移。图11示出了D5皮下肿瘤上的趋化因子受体表达，所述肿瘤来自经历放射疗法以及放射疗法和CSC疫苗的动物。如该图所示，与放射疗法相比，放射疗法+CSC疫苗显著降低皮下D5肿瘤中的CCR7和CCR10表达。图12示出仅CSC疫苗可显著地抑制微转移模型中的D5肿瘤生长。图12示出，与未治疗的、经TPDC(经肿瘤裂解物脉冲的树突状细胞)治疗的以及经ALDH低疫苗治疗的动物相比，在37天后经ALDH高疫苗治疗的小鼠具有显著更小的肿瘤尺寸。图13示出微转移性疾病模型中的存活曲线，该曲线示出，与未治疗的、经TPDC治疗的以及经疫苗治疗的小鼠相比，约50天后经疫苗治疗的小鼠的存活百分比高得多。
该实施例的结果示出了重要事物的数量。例如，示出了放射疗法显著富集D5中的ALDH高CSC(富集了＞100％)。还例如，在建立的D5模型中，虽然在相同的RT设置中，ALDH低和ALDH高疫苗之间不存在皮下肿瘤生长的显著差异，但是在这两组之间存在存活率的显著(p＜0.05)差异。示出的其他事项包括：1)ALDH高疫苗抑制皮下D5肿瘤向肺的转移；2)与RT相比，RT+CSC疫苗显著降低皮下D5肿瘤中CCR7和CCR10的表达；3)由收集自RT+CSC接种的宿主的脾细胞产生的CTL对ALDH高CSC的杀伤比对ALDH低非CSC的杀伤更高效；4)来自RT+CSC接种的宿主的B细胞的培养物上清液包含更高水平的结合至CSC的IgG，导致在补体存在的情况下CSC裂解；以及5)在微转移D5模型中，ALDH低与ALDH高疫苗之间皮下肿瘤生长存在显著差异，存活也存在显著差异。
实施例2
组合的放射与癌干细胞疫苗治疗
在该实施例中，测试了用放射疗法(RT)和经癌干细胞脉冲的树突状细胞对肿瘤的组合治疗。
方法
小鼠。雌性C57BL/6(B6)和C3H/HeNCr MTV(C3H)小鼠分别购自Jackson实验室和Charles River Laboratories。将所有小鼠饲养在密歇根大学动物研究所(University ofMichigan Animal facilities)不含特定病原体的条件下。用于实验的小鼠为7～8周龄。密歇根大学动物医学实验室批准了所有动物方案。
肿瘤细胞的培养。D5是与B6小鼠同系的黑素瘤细胞系B16的不良免疫原性克隆，并且是由我们实验室初始建立的。鳞状癌细胞系SCC7是不良免疫原性的肿瘤，与C3H小鼠同系。使细胞系生长于由补充有10％热失活胎牛血清、0.05mM 2-巯基乙醇、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素、50μg/mL庆大霉素和0.5μg/mL两性霉素B(fungizone)的RMPI 1640组成的完全培养基中。
ALDEFLUOR测定。如先前描述的(31；通过引用整体并入本文)使用ALDEFLUOR试剂盒(StemCell Technologies，British Columbia，Canada)从D5和SCC7细胞分离ALDEFLUOR+/ALDH高CSC和ALDEFLUOR-/ALDH低非CSC。
树突状细胞(DC)疫苗的制备。为了制备肿瘤细胞裂解物，以1ml完全培养基中100万个细胞的浓度将未经分选的D5或SCC7肿瘤细胞、经分选的ALDEFLUOR+/ALDH高或ALDEFLUOR-/ALDH低细胞混悬。通过在37℃水浴和液氮中五次快速冻融循环来裂解细胞(49)。离心后，收集肿瘤细胞裂解物，并储存于液氮中待后期使用。如之前所描述(49)来生成骨髓来源的鼠DC。以1×106细胞/ml的浓度将来自小鼠的骨髓细胞培养于补充有10ng/mLIL-4和10ng/mL GM-CSF的完全培养基中。在第2天和第4天添加补充有GM-CSF和IL-4的新鲜培养基。在第5天，通过轻轻地用移液管吸取收集DC，并由Opti-Prep密度梯度培养基富集。以1∶3的细胞当量比将未经分选的肿瘤细胞、ALDH低细胞或ALDH高细胞的裂解物添加至DC。然后用5％CO2于37℃下孵育DC 24小时。在孵育后，未经分选的肿瘤细胞裂解物脉冲的DC(H-DC)、ALDH低裂解物脉冲的DC(ALDH低-DC)或ALDH高裂解物脉冲的DC(ALDH高-DC，例如CSC-DC)将如所指定在后续实验中用作疫苗。每只小鼠都用200万个DC每种疫苗来接种。
肿瘤生长和治疗方案。在微转移性的肿瘤模型中，分别用2,500D5细胞或5,000SCC7细胞经皮下接种B6或C3H小鼠。肿瘤接种后24小时使用第一疫苗用于治疗，然后在第8天施用第二疫苗。在第15天，对具有肿瘤的C3H小鼠施用第三疫苗。在建立的肿瘤模型中，于第0天分别使B6或C3H小鼠皮下接种5万个D5细胞或50万个SCC7细胞。在第5天和第6天用局部放射疗法(RT)治疗小鼠，然后在第7天施用第一DC疫苗。分别于第12、13、14天以及第19、20、21天重复该组合的RT+疫苗治疗。因此，在第5、6、12、13、19和20天以51Gy(8.5Gy×6)的总剂量递送6次RT，同时在第7、14和21天(间隔一周)施用3次疫苗。每个实验组包含5至8只小鼠。肿瘤体积每周测量3次。测量肿瘤块的长径和短径，并且将肿瘤体积计算为：肿瘤体积＝(宽度2*长度)/2。监测存活，并记录为肿瘤接种后存活小鼠的百分比。
用于组织学分析的苏木精和伊红(H&E)染色。在实验结束时，收集肺，用10％福尔马林固定，石蜡包埋，并用H&E染色以观察组织病理变化。在显微镜下以100×放大倍数来观察切片。
肿瘤细胞上的趋化因子受体表达的测量。使用如之前描述(86)的酶消化将新鲜收集的原代皮下肿瘤解聚成单细胞混悬剂。在计数后，于4℃下用PE缀合的针对CCR7和CCR10的抗体或同种型对照孵育肿瘤细胞30分钟。然后将细胞重悬于2％福尔马林中。用BD LSR细胞计数器进行流式细胞术分析。
肺组织中趋化因子表达的检测。使用实时定量PCR(qRT-PCR)分析肺组织中趋化因子CCL21、CCL27或CCL28的mRNA表达水平。总RNA和cDNA的制备之前有描述(87)。用SYBR-GREEN主混合物(Invitrogen Life Technology，Carlsbad，CA)定量多种趋化因子和GAPDH(作为内部对照)的相对mRNA水平。然后通过使用比较性Ct法(2-ΔΔCT)将趋化因子的相对表达水平归一化至内部对照基因(GAPDH)的几何平均数。数据表示为相对倍数变化。
B细胞的纯化和培养。为了研究CSC疫苗诱导的抗CSC体液应答，在实验结束时从经历多种治疗的动物收集脾。使用CD19微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)纯化脾B细胞，并在补充有脂多糖(LPS)、抗-CD40(FGK45)和IL-2的完全培养基中活化5天。收集培养物上清液，并储存于-20℃以用于未来的实验。
免疫上清液结合CSC。经分选的ALDH低或ALDH高D5细胞用收集自具有等量IgG的培养的B细胞免疫上清液孵育，然后用二抗FITC-缀合的抗小鼠IgG孵育。使用流式细胞术评估上清液抗体与自ALDH低以及ALDH高D5细胞的结合(31)。
抗体和补体介导的细胞毒性。抗体和补体介导的针对CSC的细胞毒性在之前有描述(31)。简略而言，用收集自经纯化和活化的脾B细胞的培养物的免疫上清液孵育105个活ALDH高或ALDH低D5细胞。然后用兔子补体孵育细胞另外1小时。使用台盼蓝染色来评估细胞裂解物，其表示为：％活细胞＝免疫上清液和补体孵育后的活细胞数/105。各实验重复至少3次。
统计。使用GraphPad Prism6(GraphPad software)分析数据。通过对数秩检验确定存活分析。使用费舍尔精确检验来进行对肺转移存在的分析。通过未配对的学生t检验(2组)或单向方差分析(ANOVA)(＞2组)来评价其他数据。＜0.05的双尾P值视为显著性的。
结果
1.CSC-DC疫苗提供了对转移性疾病的治疗中的显著疗效。
为了评价治疗模型中的CSC-DC疫苗，一般接受的是，在转移性疾病的设置中肿瘤疫苗将具有它们最大的作用。使用了两种肿瘤模型来在该设置中测试CSC-DC疫苗的疗效。
使用鼠D5黑素瘤肿瘤模型，用2,500D5细胞来皮下接种正常的同系B6小鼠，然后，在接种24小时后(第1天)分别用ALDH高D5CSC(CSC-DC)裂解物、ALDH低D5细胞裂解物(ALDH低-DC)、异质的未经分选的D5细胞裂解物(H-DC)或PBS脉冲DC。在第8天重复该治疗。一周监测3次肿瘤尺寸。如图1A所示，经PBS治疗的对照、经H-DC或ALDH低-DC治疗的小鼠之间未观察到肿瘤生长的显著差异(P＞0.05)。然而，与任何这些对照组相比，CSC-DC疫苗治疗导致对肿瘤生长的显著抑制(图1A，相比于所有其他组P＜0.05)。此外，经CSC-DC治疗的小鼠比经历所有对照治疗的小鼠存活显著更久(图1B，相比于所有其他组P＜0.01)。
为了验证这些结果，使用与不同免疫活性的宿主(C3H小鼠)同系的第二肿瘤模型鳞状细胞癌(SCC7)进行相似的实验。用5,000SCC7细胞皮下接种正常C3H小鼠，然后在接种24小时后(第1天)分别用ALDH高SCC7 CSC(CSC-DC)裂解物、ALDH低SCC7细胞裂解物(ALDH低-DC)、异质的未经分选的SCC7细胞裂解物(H-DC)或PBS脉冲DC。在第8天和第15天重复该治疗。图1C中的肿瘤存活曲线示出ALDH低-DC或H-DC的最小疗效。然而，经CSC-DC疫苗治疗的小鼠的肿瘤体积显著小于经PBS治疗的对照(P＝0.0048)、经H-DC接种的宿主(P＝0.0378)或经ALDH低-DC接种的动物(P＝0.0255)的肿瘤体积。此外，CSC-DC疫苗显著延长了具有皮下SCC7的小鼠的总存活(图1D，相比于所有其他组P＜0.02)。
这些数据一起指示，用CSC-DC疫苗对转移性疾病设置中的具有皮下肿瘤的小鼠的治疗导致显著的抗肿瘤免疫性，这通过皮下肿瘤生长受抑制和具有肿瘤的宿主存活延长得以证明。这在该实施例中测试的两种遗传学上不同的同系免疫原活性宿主中的两种组织学上不同的肿瘤模型中观察到。
2.CSC-DC疫苗在治疗建立的疾病中的疗效
用于以上实验的特定微转移性肿瘤模型与未来的临床实验的设计有关，因为原代肿瘤的切除与高的局部复发率以及因复发疾病的死亡率有关(51，52)。现在公认的是，局部疾病复发是由于在切除原代肿瘤后存在残余的CSC(53)。因此，在辅助设置中，靶向处于微转移性水平的CSC的DC疫苗法可防止癌症复发。然而，在患有局部晚期癌症的患者中，放射疗法(RT)和/或化疗可能是可提供的唯一选择。因此，检查了CSC-DC疫苗在治疗建立的疾病中的疗效。
以前观察到，局部RT可减小建立的D5皮下肿瘤的肿瘤体积。发现，在RT治疗后的残余肿瘤中，ALDH高CSC群体被富集，从1.5％升至18.7％。这些数据显示，CSC抵抗局部RT。设想，作为附加治疗的基于CSC的疫苗可增强RT在建立的肿瘤模型中的疗效。为了测试该假说，将50,000 D5肿瘤细胞皮下接种至B6小鼠中，以建立皮下肿瘤。在第5、6、7天，用分别第一RT、第二RT和第一DC疫苗接种来治疗具有肿瘤的小鼠。在第12、13、14天分别用第三RT、第四RT和第二DC疫苗接种来重复治疗，并且在第19、20、21天分别用第五RT、第六RT和第三DC疫苗接种再次重复。每次接种包括ALDH高-DC(CSC-DC)以及ALDH低-DC。如图14A、B制备这些DC。如图15A所示，与用PBS治疗(P＝0.0261)；仅RT(P＝0.0227)或RT+ALDH低-DC疫苗接种(P＝0.0439)相比，RT和CSC-DC疫苗的组合显著降低肿瘤负荷。RT+CSC-DC疫苗接种的宿主的存活比未经治疗(PBS)的小鼠(P＜0.001)、仅经RT治疗的小鼠(P＝0.0004)或RT+ALDH低-DC接种的小鼠(P＝0.0042)显著更长(图15B)。
对C3H宿主中建立的SCC7肿瘤进行相似实验。第5天，以与治疗B6小鼠中的建立的D5肿瘤相同的时间表，用局部RT接着CSC-DC疫苗治疗SCC7皮下肿瘤。比较经历了放射疗法并接受了相等数量的DC的两个受试者组之间的疗效，所述DC用如图14C、D制备的ALDH高SCC7CSC(CSC-DC)裂解物以及ALDH低SCC7细胞(ALDH低-DC)裂解物脉冲。如图15C所示，与经历其他治疗的小鼠相比，经历RT+ALDH高-DC(CSC-DC)疫苗的小鼠中皮下肿瘤的生长受到显著抑制(相比于所有其他组P＜0.02)。总存活示出，仅RT和RT+ALDH低-DC二者都未能大幅延长小鼠的存活。然而，RT+ALDH高-DC疫苗显著改进存活(图15D，相比于所有其他组P＜0.005)。注意，用RT+ALDH高-DC疫苗治疗的小鼠具有优于RT+ALDH低-DC疫苗接种的小鼠的20.5天的存活(P＝0.0036)。这些结果显示，虽然仅RT和RT+ALDH低-DC疫苗未能介导肿瘤消退，但是如由显著的皮下肿瘤生长抑制以及总存活改进所证实，RT与后续的ALDH高CSC-DC接种显著增强疗效。综上，在局部肿瘤照射的设置中，在黑素瘤D5和鳞状细胞癌SCC7肿瘤模型二者中都观察到CSC-DC疫苗针对建立的肿瘤的体内抗肿瘤免疫性。
3.CSC-DC疫苗接种通过显著下调肿瘤细胞上CCR7和CCR10的表达并降低肺组织中CCL27、CCL28的产生来防止肺转移。
体内研究示出CSC-DC疫苗在局部放射疗法后治疗微转移性疾病以及建立的疾病的显著疗效。在黑素瘤D5和鳞状细胞癌SCC7模型中都观察到这样的CSC-DC疫苗赋予的抗肿瘤免疫性，并将其记录为显著的局部肿瘤生长抑制和总存活延长。原代肿瘤远距离转移至多种器官对肿瘤进展贡献大，并且是具有肿瘤的宿主死亡的主要原因(54，55)。Leung报道，远距离转移导致仅5％至10％的5年存活，以及黑素瘤患者6至10个月的中值存活(56)。该不良预后部分地反映了黑素瘤的独特肿瘤生物学，使其与其他晚期内脏实体器官肿瘤区分开来。晚期黑素瘤以不可预测的方式扩散，向任何器官部位的广泛转移，但是经常转移至皮肤、肺、脑、肝或小肠(56)。晚期的转移性黑素瘤基本一律是致命的(57，58)。相似地，头颈鳞状细胞癌的通常特征是远距离转移，据报道，其当前(at presentation)发生率从4.2％至23.8％变化，而尸检发生率高达57％(59)。远距离转移以及局部和区域性复发是导致患有头颈鳞状细胞癌的患者治疗失败和死亡的主要原因(60)。因此，远距离转移的早期检测具有重要的治疗性和预后性启示，并且对患有黑素瘤以及头颈鳞状细胞癌的患者的预后和治疗选择是关键的。
虽然本发明不限于任何具体机制，并且对机制的理解并非实施本发明所必需，但是情况是，突出ALDH高CSC-DC疫苗相对于ALDH低-DC或H-DC赋予的疗效的一个机制可涉及CSC-DC诱导的对肿瘤转移抑制的作用。为了测试该假说，在实验结束时收集肺，并检查D5转移性肺肿瘤负荷。在转移性D5模型中，与PBS、H-DC和ALDH低-DC疫苗治疗相比，ALDH高-DC疫苗显著抑制肿瘤向肺转移(P＜0.05，图16A)。在ALDH高-DC疫苗接种后，总共11只小鼠中的仅2只发展为肺转移，而用PBS或ALDH低-DC治疗的小鼠中有9只；用H-DC治疗的小鼠中有8只发展为肺转移(图16B)。进行H&E染色以验证肺转移。图16C中示出了代表性的肺转移图。从正常B6小鼠收集的肺组织图像充当对照。经历PBS治疗、H-DC或ALDH低-DC疫苗的小鼠都示出大的肿瘤损伤。相比之下，在从ALDH高CSC-DC疫苗接种的宿主收集的肺中未检测到肿瘤损伤(图16C)。
在治疗建立的疾病中实验结束时还收集肺，并且评估D5肿瘤至肺转移的负荷。与PBS、仅RT或RT+ALDH低-DC治疗相比，RT+ALDH高CSC-DC疫苗显著抑制肺转移(P＜0.05，图17A)。PBS治疗组中总共11只小鼠中的10只，仅RT治疗的组中的9只小鼠，RT+ALDH低-DC接种的组中的8只小鼠发展为肺转移(图17B)。然而，在RT+CSC-DC接种的组中，11只小鼠中的仅2只发展为肺转移(图17B)。图17C示出了代表性的肺转移的组织病理图。在从PBS或仅RT治疗的宿主收集的肺中观察到大量肿瘤损伤。经历RT+ALDH低-DC治疗的小鼠还示出肺中的多种肿瘤损伤。然而，在RT+ALDH高CSC-DC接种的组中未发现肿瘤损伤。
这些结果表明，CSC-DC接种在微转移和建立的疾病设置中都显著抑制肺转移的诱导。这与施用CSC-DC疫苗后存活显著延长有关(图14B和15B)。
肿瘤转移涉及趋化作用(61至63)。为了理解CSC-DC接种如何导致抑制肿瘤转移，检查了一些趋化因子受体及其相应配体的表达。为此，收集在微转移性疾病模型中生长的皮下D5肿瘤，并消化成单肿瘤细胞的混悬剂，然后通过流式细胞术检测所述混悬剂的趋化因子受体表达。在图18A中，观察到CSC-DC接种后CCR10表达的显著降低。与用PBS治疗(＞22％)或者用H-DC和ALDH低-DC接种(二者皆为约15％)相比，通过CSC-DC接种，D5肿瘤细胞上的CCR10表达显著降低至约3％(图18B)。还观察到，CSC-DC接种显著降低另一趋化因子受体CCR7的表达(图18C，相比于所有其他组P＜0.02)。虽然与PBS治疗对照相比H-DC和ALDH低-DC治疗示出对CCR7表达抑制的边际效应，但是CSC-DC接种将CCR7表达从＞25％显著降低至约10％(图18D)。
在建立的D5黑素瘤模型中，观察到RT+CSC-DC接种显著降低CCR10的表达(相比于所有其他组P＜0.01，图19A)。如图19B所示，与PBS对照(41.7％)相比，仅RT治疗(24.1％)或RT+ALDH低-DC疫苗(21.3％)中度地降低D5肿瘤细胞上的CCR10表达。然而，RT+ALDH高CSC-DC疫苗将D5肿瘤细胞上的CCR10表达显著降低至4％。还观察到RT+CSC-DC接种后CCR7表达的显著降低(相比于所有其他组P＜0.01，图19C)。在PBS、仅RT或RT+ALDH低-DC接种后，CCR7的表达分别为27.9％、16.4％和13.8％。RT+CSC-DC接种将D5肿瘤细胞上的CCR7表达显著降低至2.1％(图19D)。
同时，进行qRT-PCR以检测肺组织中相应趋化因子的表达。在微转移性疾病模型中(图20A至C)，CSC-DC接种的组与所有其他组之间CCL21的表达(CCR7的配体)没有显著差异(图20A)。然而，在ALDH高CSC-DC疫苗治疗后，趋化因子CCL27(图20B)和CCL28(图20C)对应的CCR10的表达都显著降低(相比于其他组P＜0.01)。在建立的D5黑素瘤模型(图20D至F)中，RT+CSC-DC疫苗显著(相比于所有其他组P＜0.02)下调收集自具有肿瘤细胞小鼠的肺组织中的CCL21(图20D)、CCL27(图20E)和CCL28(图20F)的表达。
这些数据提示，CSC-DC接种通过下调局部肿瘤细胞上CCR7和CCR10的表达以及通过降低它们的配体(例如肺组织中的CCL27和CCL28)的产生来抑制局部肿瘤的肺转移。
4.CSC-DC疫苗治疗降低原代肿瘤中ALDH高细胞的百分比
为了提供CSC-DC疫苗可诱导靶向CSC的抗-CSC免疫性的直接证据，在新鲜收集自经历了CSC-DC治疗的小鼠的皮下肿瘤中检查ALDH高细胞富集的群体，所述CSC-DC治疗在微转移性D5模型的治疗中单独进行或在治疗建立的D5模型中与RT组合进行。通过如之前描述的流式细胞术来鉴定ALDH高群体(31)。将用ALDEFLUOR+ALDH抑制剂DEAB孵育的肿瘤细胞用作对照，以设置门控(gate)。使用来自各组的多只小鼠来完成ALDEFLUOR测定，并用SE展示结果(图21A)。此外，混合来自各实验组的多只小鼠的肿瘤细胞，并生成代表性的流式细胞术图以显示各组中鉴定的ALDH高群体(图21B)。如在图21A中所示，在微转移性的D5模型中，与PBS、H-DC或ALDH低-DC治疗相比，CSC-DC接种显著降低ALDH高群体的百分比(分别地，P＝0.0002、P＝0.0002和P＝0.0029)。发现收集自CSC-DC治疗的小鼠的原代皮下肿瘤包含仅1.7％ALDH高细胞，这显著少于分别存在于PBS治疗的小鼠(13.4％)、H-DC接种的小鼠(7.5％)或ALDH低-DC接种的宿主(8.3％)的原代皮下肿瘤中的ALDH高细胞(图21B)。
在建立D5模型中，放射疗法(RT)提高经治疗的残余原代肿瘤中的ALDH高细胞的百分比(图21C、D)。然而，与PBS、仅RT或RT+ALDH低-DC接种(分别为P＝0.0018、P＝0.0018和P＝0.0096)相比，RT+CSC-DC接种显著降低ALDH高群体的百分比(图21C)。具体而言，发现与分别存在于经PBS治疗的小鼠(14.2％)、仅RT治疗的小鼠(20.5％)或RT+ALDH低-DC接种的宿主(12.8％)的原代肿瘤中的ALDH高细胞相比，收集自RT+CSC-DC接种的小鼠的原代皮下肿瘤包含显著更少(＜3％)的ALDH高细胞(图21D)。
5.CSC-DC疫苗治疗调节宿主持异性靶向CSC的体液应答。
如上文所示，单独使用或与RT组合使用以分别治疗微转移性的或建立的肿瘤的CSC-DC疫苗引发了针对局部肿瘤生长、远端转移的有效抗体肿瘤免疫性，并显著延长经治疗宿主的总存活。平行地发现，CSC-DC疫苗显著降低原代皮下肿瘤中ALDH高细胞的百分比。这些结果强烈地提示CSC-DC疫苗诱导的CSC靶向。
评价针对CSC的CSC-DC疫苗诱导的宿主体液免疫应答。在治疗实验结束时收集脾。经纯化的脾B细胞用LPS和抗-CD40进行体外活化，并收集上清液。为了测试CSC-DC疫苗引发的抗体产生的特异性，测试免疫上清液与ALDH高D5 CSC以及ALDH低非CSC的结合。如图22A所示，来自接受了CSC-DC治疗的小鼠的免疫上清液与ALDH高D5 CSC(60.8％)的结合比收集自经PBS治疗的小鼠(12.3％)；H-DC接种的小鼠(29.8％)或ALDH低-DC治疗的宿主(15.7％)的免疫上清液的结合有效得多。相比之下，收集自H-DC或ALDH低-DC接种的小鼠的免疫上清液与ALDH低非-CSC的结合(分别为45.8％和50.2％)显著多于收集自CSC-DC接种的小鼠(6.8％)或收集自PBS治疗的对照(18.8％)的免疫上清液的结合。图22B示出了多种结合测定的结果，显示由CSC-DC疫苗引发的B细胞产生的免疫上清液与ALDH高D5 CSC的结合比收集自所有对照组的上清液有效得多(相比于所有其他组P＜0.01)。相比之下，ALDH低-DC疫苗引发的免疫上清液与ALDH低非-CSC的结合与H-DC疫苗引发的免疫上清液的结合相似，但是显著多于PBS或CSC-DC疫苗引发的免疫上清液的结合(图22C)。
在建立的D5模型(图23A)中，与收集自PBS治疗的组(17.5％)、仅RT治疗的宿主(21.4％)或RT+ALDH低-DC接种的小鼠(25.1％)的上清液相比，RT+ALDH高CSC-DC疫苗引发的免疫上清液(76.6％)对ALDH高D5 CSC的结合显著更高。相比之下，对于与ALDH低D5细胞的结合，来自RT+ALDH低-DC疫苗治疗的小鼠(69.8％)的免疫上清液比收集自RT治疗的小鼠(21％)的免疫上清液或RT+ALDH高-DC疫苗引发的免疫上清液(23.8％)有效得多。重复实验示出，RT+ALDH高D5 CSC-DC疫苗引发的免疫上清液与ALDH高D5 CSC的结合显著高于相同的局部肿瘤照射设置中ALDH低-DC疫苗引发的免疫上清液(P＝0.0008，图23B)。相比之下，ALDH低-DC疫苗引发的免疫上清液与ALDH低D5细胞的结合比CSC-DC疫苗引发的免疫上清液高得多(P＝0.0004，图23C)。
为了评价CSC-DC疫苗引发的抗体结合至CSC的免疫结果，进行了抗体和补体依赖的细胞毒性(CDC)测定。图24A示出了来自微转移性的D5模型的结果。ALDH高CSC-DC疫苗引发的免疫上清液杀伤的ALDH高D5 CSC显著多于收集自其它组的免疫上清液(相比于所有其他组P＜0.001)。相比之下，收集自H-DC或ALDH低非-CSC接种治疗的宿主的免疫上清液导致显著的ALDH低D5细胞裂解，而来自ALDH高CSC-DC接种的宿主的免疫上清液示出ALDH低靶的最小裂解(图24A)。从建立的D5模型得到了相似的结果(图24B)。虽然由经历了RT+ALDH高CSC-DC疫苗的小鼠产生的免疫上清液介导显著更有效的ALDH高D5 CSC裂解(相比于所有其他组P＜0.0001)，但是仅RT或RT+ALDH低-DC疫苗引发的免疫上清液几乎未示出ALDH高D5 CSC的裂解。相比之下，RT+ALDH高CSC-DC接种的免疫上清液比RT+ALDH低-DC疫苗引发的免疫上清液杀伤显著更少的ALDH低D5细胞(图24B，P＜0.0001)。这些数据一起表明，单独使用或与RT组合使用以分别治疗为转移性或建立的癌症的ALDH高D5 CSC-DC疫苗可赋予宿主显著的抗-CSC免疫性。
传统的DC疫苗靶向表达已分化的肿瘤抗原的肿瘤。然而，由于肿瘤块的异质性特征，不表达这些已分化的肿瘤抗原的CSC可逃过免疫靶向。虽然在常规治疗后肿瘤负荷常常降低，但是肿瘤复发。这主要由于残余的CSC抵抗这些治疗。上述第一治疗模型设计成治疗微转移性疾病以检查使用CSC-DC疫苗来防止局部肿瘤生长、肺转移以及延长动物存活的益处。虽然传统的H-DC接种和对照ALDH低-DC轻度地抑制局部肿瘤生长并中度地延长存活，但是ALDH高CSC-DC疫苗通过抑制局部肿瘤生长和延长具有肿瘤的小鼠的存活显示出显著更有效的抗肿瘤免疫性。在测试的D5和SCC7肿瘤模型中情况确实如此。
一些研究已经显示，与非-CSC肿瘤细胞相比，CSC对化疗(8，1至17，64)和放射(65至67)是相对抵抗的。我们可发现根据建立的疾病中的肿瘤尺寸而判断的CSC-DC的疗效与其他治疗之间的最小差异，因为在建立的皮下肿瘤结节内肿瘤细胞的组分包含仅小部分的CSC。因此，在局部肿瘤照射的设置中评价CSC-DC的疗效。用局部放射对建立的肿瘤的初始治疗可导致非CSC肿瘤细胞的破坏，以及CSC百分比的升高。正是在该设置中，后续的CSC-DC接种可通过选择性地靶向残余肿瘤中的CSC从而具有治疗性。因此，在该实施例中，使用ALDH高CSC裂解物脉冲的DC疫苗作为对建立的肿瘤的放射疗法的附加策略。发现RT+黑素瘤D5ALDH高-DC(CSC-DC)显著抑制局部肿瘤生长、肺转移并延长动物存活。这些观察在第二模型鳞状细胞癌SCC7中得到证实。然后将话题集中于D5模型，以研究由单独使用或与RT组合使用CSC-DC疫苗分别治疗微转移性的和建立的D5而诱导的抗-CSC免疫性中可能涉及的潜在机制。
在该实施例中，CSC-DC疫苗的疗效与显著抑制的向肺的自发转移相关。癌转移是复杂的过程，并且涉及许多因素，其中趋化作用被认为在确定器官选择性的过程中起了关键作用。据许多研究报道，肿瘤细胞转移的优选位点由靶器官中趋化因子的表达水平以及恶性瘤细胞上相应的趋化因子受体的表达来确定。例如，过表达CCR10的B16细胞将抵抗宿主的免疫应答并导致肿瘤进展(75)。Wiley等提示，表达CCR7的B16细胞提高了向引流淋巴结的转移(77)。在该实施例中，收集自未治疗的小鼠的皮下原代D5肿瘤细胞表达高水平的CCR7和CCR10(20％至40％)。在微转移性的以及建立的D5模型中，CSC接种将这两个受体的表达显著降低至2％至10％。另一方面，在收集自微转移性的和建立的D5模型中的经历了CSC-DC疫苗的动物的肺组织中，CCL27和CCL28(CCR10的配体)的mRNA水平显著降低。此外，在建立的D5模型中，CSC-DC疫苗还降低RT设置中CCL21(CCR7的配体)的表达。虽然对理解和实施本发明不是必需的，但是情况可能是，趋化因子或趋化因子受体的表达可导致免疫耐受或免疫逃逸，进而导致肿瘤进展(76，78，79)。我们的数据提示，CCR10/CCL27和CCL28以及CCR7/CCL21之间的相互作用的降低在CSC-DC接种诱导的肿瘤转移预防中发挥了重要作用。
Zhao等最近发现，CCR7阳性的头颈鳞状细胞癌中的CCR7/NF-κB自分泌信号环路涉及PKCα(80)。Takekoshi等最近比较了表达CCR7的B16黑素瘤细胞(pLNCX2-B16)和过表达CCR7的B16细胞(CCR7-B16)，并发现在CCR7-B16肿瘤中LN转移极大增强(81)。对白细胞耗尽的pLNCX2-B16和CCR7-B16肿瘤细胞混悬剂的微阵列分析示出，一些与干扰素IFNγ信号通路有关的基因，例如，STAT1、CXCR 9-11、CCL5和CXCL10、MHC I和MHC II，在CCR7-B16肿瘤微环境中下调，这提示经CCR7的活化可下调对宿主抗肿瘤免疫性至关重要的通路(81)。据Wicha和colleagues报道，使用CXCR1特异性的封闭性抗体或小分子CXCR1抑制剂repertaxin对IL-8受体CXCR1封闭选择性地耗尽了CSC群体，并且CXCR1封闭经FASL/FAS信号传导对CSC生存力的影响由FAK/AKT/FOXO3A通路介导(28)。一般而言，趋化因子受体可通过以下复杂机制来活化例如丝裂原活化的蛋白激酶等下游效应子：配体依赖的隐性生长因子的活化；存活激酶的鸟苷三磷酸-结合，蛋白偶联的活化；或者例如ErbB家族成员等其他受体的反式活化(82)。该研究中，癌干细胞-DC疫苗诱导的CCR10/CCL27和CCL28以及CCR7/CCL21相互作用的下调中的分子以及生化信号通路仍然有待鉴定。这些趋化因子/趋化因子受体相互作用的封闭(例如，与抗-CCL27、抗-CCR10、抗-CCL28、抗-CCR7和/或抗-CCL21单克隆抗体)可导致原代皮下肿瘤向肺的转移受阻，并以此改进存活。
发现CSC与肿瘤转移和进展有关(54，83至85)。为了检测CSC确实被CSC诱导的免疫性靶向，测量CSC是否在治疗策略下存活。具体而言，检测残余的CSC数，以观察CSC-DC免疫治疗后CSC百分比是否变化。在转移性的D5模型中发现，与经PBS治疗的对照(～15％)相比，经历了CSC-DC疫苗的残余的原代皮下肿瘤中ALDH高CSC群体(＜2％)显著降低，并且显著低于经历了H-DC或ALDH低-DC治疗的动物的ALDH高CSC群体(7％至9％)。在建立的D5模型中，虽然发现与未经治疗的对照相比，RT治疗使原代皮下肿瘤中的CSC升高，在RT+CSC-DC接种后，ALDH高CSC的百分比从对照(～15％)显著降低至＜3％，这显著小于在用仅RT(～20％)或用RT+ALDH低DC接种(～12％)的治疗后的ALDH高CSC的百分比。这些结果还显示，CSC-DC疫苗可单独或在局部肿瘤照射设置中诱导直接的CSC靶向。
在某些实施方案中，与常规治疗组合的CSC-DC疫苗可为癌症患者提供更有效的治疗方法。例如，在局部复发和死亡高的手术切除肿瘤后施用CSC疫苗，或在新辅助化放射疗法或放射疗法以及手术后施用CSC疫苗可降低局部肿瘤复发以及远距离转移。
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以上说明中提及的所有出版物和专利都通过引用并入本文。本发明所描述的组合物和方法的多种改造和变化对本领域技术人员而言将是明显的，没有脱离本发明的范围和精神。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应理解，不应将所要求的本发明不适当地限制于这样的具体实施方案。事实上，所描述的用于实施本发明的方式的对于相关领域技术人员显而易见的多种改造预期落在本发明的范围内。
Claims (9)
1.ALDH高DC(ALDH高树突状细胞)和放射疗法的药剂在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述ALDH高树突状细胞是先前已经暴露于ALDH高癌干细胞裂解物的树突状细胞。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、脑癌、皮肤癌、鳞状细胞癌和结肠癌。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述药物还包括化疗剂。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述化疗剂选自表1。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述放射疗法包括外射束放射疗法。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述放射疗法包括内部放射疗法。
7.一种系统，其包括：
a)ALDH高DC(ALDH高树突状细胞)，以及
b)经配置用于内部放射癌疗法的放射性移植物。
8.一种系统，其包括：
a)ALDH高DC(ALDH高树突状细胞)，以及
b)经配置用于在外部放射癌疗法期间发射放射的装置。
9.一种组合物，其包含：ALDH高DC(ALDH高树突状细胞)，以及放射性核苷酸。
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