CN104812403A - 弓形体属的减毒株用于预防或治疗隐孢子虫病的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明的目标在于从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种(Toxoplasma spp)或新孢子虫属物种(Neospora spp)的肉孢子虫科(Sarcocystidae)株系，其用于在哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科(Cryptosporidiidae)的顶复门动物相关的病理学状况之中使用。

Description

弓形体属的减毒株用于预防或治疗隐孢子虫病的用途
本发明涉及寄生虫减毒株用于预防或治疗与顶复门动物相关的病理学状况的用途。
顶复门动物是大多数地细胞内的专性寄生虫，其具有可以涉及数个宿主的生活史。这些寄生虫的门细分为几个科。
鼠弓形体(Toxoplasma gondii(T.gondii))属于肉孢子虫科(Sarcocystidae)。该原生动物以随着宿主和感染阶段而变化的三种感染形式存在：
●速殖子：在中间宿主(即所有恒温动物)和终宿主(即猫科动物，特别是猫)的细胞中无性繁殖的增殖和感染形式，
●慢殖子：包含在包囊中的该寄生虫的具有缓慢分裂和低代谢水平的形式，
●子孢子：包含在卵囊中的形式，其产生自该寄生虫在终宿主(即猫和其他猫科动物)的肠中的有性繁殖。
猫(该寄生虫的终宿主)通过摄入包含包囊(或速殖子，如果动物处于弓形体病的急性期)的被寄生的猎物或通过摄入卵囊而受到感染。在经由配子囊于猫科动物的肠中进行有性繁殖后，卵囊被散布到环境中。这些卵囊在外部环境中形成孢子，并且其致病性持续至少一年。在卵囊摄入后，所释放出的子孢子感染终宿主或中间宿主的肠细胞并转变为在生物体中散布的速殖子。在免疫系统的压力下，速殖子被包于包囊内，具有对于中枢神经系统、视网膜或肌肉的优先向性。摄入含包囊的组织是污染终宿主和中间宿主的第二个原因。在摄入包囊后，慢殖子被释放并感染肠上皮细胞，并且转变为在宿主中散布的速殖子。
鼠弓形体株系按照其体内毒力程度来进行分类：I型株系(即株系RH)是高毒力的，而II型(即株系ME49、76K或Pru)和III型(即株系CEP或M7741)株系是毒力较小的并且通常建立慢性感染。此外，鉴定出了许多不能归于这三种主要类型的非典型株系，尤其是在非洲和南美洲(Howe DK等人,1995,J.Infect.Dis.,171,1561-1566；Rajendran C等人,2011,Infect.Genet.Evol.,12,359-368；Mercier A等人,2010,PLoS Negl.Trop.Dis.,4,e876)。
最近，通过使编码蛋白TgMIC1和TgMIC3的两个基因无效而制作出了鼠弓形体(对弓形体病负有责任的寄生虫)的减毒活株系(EP1 703 914 B1和US 7,964,185 B2/Cérède等人,2005,J.Exp.Med.,201:453-63)。称为Toxo mic1-3 KO的该株系产生针对鼠弓形体的强烈且特异的免疫应答，并且使得能够在小鼠中(等人,2005,J.Infect.Dis.,194:1176-1183)和还有在母羊中(Mevelec等人,2010,Vet.Res.,41:49)预防以后感染的效应。还已经证明，体内毒力仅非常少地受到TgMIC1或TgMIC3的孤立失活的影响；相反地，通过这两种蛋白质的同时失活强烈地降低了体内毒力，这表明了这两种蛋白质的协同作用(Cérède等人,2005J.Exp.Med.,201:453-63)。
犬新孢子虫(Neospora caninum)是对新孢子虫病负有责任的细胞内寄生虫。它也属于肉孢子虫科。犬新孢子虫的生活史非常近似于鼠弓形体的生活史，具有两个不同的阶段：在终宿主(即犬科动物，特别是狗)中的有性阶段，其导致包含子孢子的卵囊的产生，所述卵囊被排到粪便中；和在中间宿主(即绵羊、山羊、牛、马科动物等)中的无性阶段，其导致速殖子的产生和随后包含慢殖子的包囊的产生。
更近来，获得了犬新孢子虫的减毒活株系，株系Neo ncmic1-3KO，其已通过同源重组而对于基因ncmic1和ncmic3而言被无效。在该株系中，用允许对于乙胺嘧啶的抗性的盒DHFR替代基因ncmic3，和用赋予寄生虫以对于氯霉素的抗性并使寄生虫发荧光的盒CAT-GFP替代基因ncmic1。该寄生虫不再表达蛋白NcMIC1和NcMIC3。已显示，该突变株具有感染和免疫原特性，从而赋予哺乳动物以针对新孢子虫病的有害效应的疫苗保护。
鼠弓形体和犬新孢子虫共同具有以多个步骤侵入宿主细胞的特殊过程，从而导致形成寄生泡，在所述寄生泡中寄生虫进行繁殖和发育。
隐孢子虫科(Cryptosporidiidae)是另一个属于顶复门的科，并且对隐孢子虫病负有责任，所述隐孢子虫病是极其常见的疾病，其通过存在于它们食物中的寄生虫的摄入而影响尤其是人和许多动物物种，包括农用动物(绵羊、山羊、牛等)。在这之后，寄生虫在肠中进行繁殖，首先按照无性方式，然后其次按照有性方式。被污染的个体排出并再次散布寄生虫，其因此污染了它们的环境(即牧场、水等)。
已经鉴定出了隐孢子虫科的数个物种，其中小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是最常见和最具毒力的一种。
在人中，隐孢子虫病是一种通常良性的疾病。然而，该疾病(其发病率每年增长，尤其在美国)的后果在幼儿和受到免疫抑制的人(特别是被HIV病毒感染的患者)中可能是极其严重的。因此，在这些群体内，隐孢子虫病是造成严重腹泻的原因，所述严重腹泻可以产生大量脱水，甚至如果没有适当的治疗，可以产生个体死亡。
在有免疫能力的成年动物中，隐孢子虫病也是良性的。相反地，在年龄为几天至几周并且其免疫系统未成熟的非常年幼的动物中，隐孢子虫病通常具有严重的后果。因此，隐孢子虫属物种(Cryptosporidum spp)，尤其是小隐孢子虫，被证实是新生动物腹泻的最常见的病因学因子，所述新生动物腹泻产生重大的生长迟缓，并且如果没有适当的治疗，对于动物来说可以是致命的。
新生动物腹泻对牛、绵羊和山羊的饲养者来说构成了持久不变的威胁，并且意味着巨大的经济损失，这是由于因生长迟缓、新生动物死亡、兽医介入以及治愈性治疗和补液的花费而引起的收入损失。新生动物腹泻的病因学经常是事实上对这些症状负有责任的多重的多种感染因子，尤其是轮状病毒、冠状病毒、BVDV病毒(牛病毒性腹泻病毒)、大肠杆菌(Escherichia coli)和当然还有小隐孢子虫。这些各种不同的感染因子在反刍动物的新生动物腹泻中的作用是难以估计的，因为很少进行诊断并且经常存在多重感染。然而，小隐孢子虫目前被认为是新生动物腹泻的主要因素(de Graaf等人,1999,Int.J.Parasitol.,29:1269-1287)。因此，在患有新生动物腹泻的小牛上进行的研究已表明，它们之中的40％被小隐孢子虫感染并且其中3/4不具有任何其他感染因子(位于布鲁塞尔的“兽医学和农业化学研究中心(Veterinary and Agrochemical Research Centre)”的数据)。
为了减少症状的强度和持续时间，已在各种不同的模型中评价了许多分子，但是没有一个给出令人满意的结果。因此，在家养反刍动物中，仅乳酸卤夫酮和巴龙霉素给出了令人感兴趣的结果，但并不允许寄生虫的完全控制(Chartier,2002,Le Point vétérinairePathologie ovine et caprine,112-117)。在人中，特别是对于治疗艾滋病患者，通常的治疗基于巴龙霉素(Humatin)或硝唑沙奈的使用。这两种分子具有相似的效力，但是硝唑沙奈被判断具有较低毒性。此外，最近制作出了对于鼠弓形体和犬新孢子虫的钙依赖性蛋白激酶特异的抑制剂(WO 2011/094628 A1)。它们尤其是属于吡唑并嘧啶类和咪唑并[1,5-α]吡嗪类的化合物。这些抑制剂影响所述寄生虫的侵入和增殖的能力，而不干扰宿主细胞的生物学活性。
总之，无论在人中还是在动物中，目前都不存在任何使得能够有效地对抗隐孢子虫病的特异性治疗，并且仅有基于严格卫生守则的预防使得能够减少摄入被小隐孢子虫污染的水或食物。
因此，对于用于在哺乳动物(尤其是具有未成熟或缺陷的免疫系统的哺乳动物)中预防和治疗隐孢子虫病的试剂存在着真正需要。事实上，由于感染可以在最初几天期间发生，新生动物具有处于发育过程中的免疫系统，这使得在年幼动物中的传统的疫苗接种方案是不可能的。因此，在高度地方性流行的地区中用杀死的寄生虫在新生小牛上进行的预防试验未显示任何显著的保护作用(Harp等人,1996,Am.J.Vet.Res.,57:1586-1588；Harp等人,1998,J.Dairy.Sci.81:289-294)。
然而，已证明，针对小隐孢子虫的免疫应答导致发展出Th1类型的保护性应答，其具有细胞因子IL-12和IFN-γ的大量产生。还证明，这些细胞因子能够减低感染的影响(Lacroix等人,2001,Infect.Immun.,69:1635-42)。
本发明的目标之一是提供免疫刺激剂，其能够在新生动物中诱导具有IL-12和IFNγ的产生的非特异性免疫应答。
本发明的另一个目标是提供免疫刺激剂，其能够限制小隐孢子虫对于哺乳动物(人或动物)的感染的效应。
本发明的另外一个目标是提供针对隐孢子虫病的预防性治疗，尤其是疫苗。
本发明的目标在于从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种(Toxoplasma spp)或新孢子虫属物种(Neospora spp)的肉孢子虫科株系，其用于在哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用。
本发明的目标在于从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自减毒弓形体属物种或减毒新孢子虫属物种的肉孢子虫科减毒株系，其用于在哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用。
本发明的目标在于从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其用于在哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用，所述株系具有相对于诱导与弓形体属物种或新孢子虫属物种相关的病理学状况的野生株而言减弱的毒力。
作为例子但这并不限制本发明的范围，顶复门动物的此类野生株可以通过RH类型的鼠弓形体的强毒株(对于弓形体病)或者NC1类型的犬新孢子虫的强毒株(对于新孢子虫病)来进行举例说明。
本发明的目标在于从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其用于在哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用，所述株系具有相对于强毒株(即具有与从其获得毒力减弱的株系的那个株系的毒力基本上相同的毒力的株系)而言减弱的毒力。
“免疫刺激”意指弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系诱导宿主免疫系统的早期激活的能力。该激活牵涉免疫系统的组分例如干扰素、细胞因子、吞噬细胞、NK细胞(天然杀伤细胞)、树突细胞和补体系统，其将会非特异地作用于所靶向的病原体。该免疫刺激并不基于适应性免疫的建立。
“预防”意指目的在于阻止疾病出现或蔓延的预防方法。它尤其涉及保护倾向于染上和发展出与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况的个体。这样的个体尤其为具有未成熟的免疫系统的新生动物或这具有免疫系统功能障碍的个体。它还涉及保护暴露于来自其环境的污染风险的哺乳动物。
“治疗”不仅意指病理学状况的进展的抑制，而且还意指与该病理学状况相关的症状的减轻。治疗的目的在于减小症状的幅度直至其完全消失，从而允许个体恢复正常的生理状态。
“哺乳动物”意指人类、某些农用或饲养动物和某些伴侣动物。
“弓形体属物种或新孢子虫属物种的减毒株”意指这样的弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系，其具有低于能够诱导病理学状况的鼠弓形体或犬新孢子虫野生株的毒力的减弱的毒力，但仍然保留了免疫原性能力以便能够在预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况中充当免疫原。毒力的减弱抗原要么可以产生自物种进化的自然过程，要么可以尤其通过本领域技术人员所熟知的分子生物学技术来诱导。无论其是天然来源的还是人工的结果，毒力的减弱都归因于毒力因子的表达不存在或者表达出一种或多种非功能性的或具有改变的功能的毒力因子。弓形体属物种或新孢子虫属物种的遗传型的体外修饰赋予该株系以突变型特征，与它所衍生自的野生株相比。寄生虫的野生株不仅具有免疫原性潜力，而且还是有毒力的，即它们能够诱导与弓形体属物种或新孢子虫属物种相关的病理学状况(即分别为弓形体病和新孢子虫病)，这使得它们不适合在本发明的背景下使用。弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系的毒力可以尤其通过体外细胞感染性测定法或者通过在动物中的感染性测定法来进行评价。
细胞感染性测试通过将速殖子放置在汇合细胞例如HFF细胞(人包皮成纤维细胞)或Vero细胞(经常用于产生鼠弓形体或犬新孢子虫的速殖子的细胞系)上来进行。所形成的泡的数目和在每个泡中寄生虫的数目通过显微镜观察来测定。关于在动物中的感染性测定法，向动物注射各种不同的株系并且随时间监测这些动物的存活(Cérède等人,2005)。
“与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况”意指由于被属于顶复门的原生动物，特别是属于隐孢子虫科(其包括隐孢子虫属(Cryptosporidium))的寄生虫感染而引起的疾病。已经提及了几十个隐孢子虫属的物种(Fayer R,2010,Exp.Parasitol.,124,90-7)。这些寄生虫能够入侵粘膜上皮。
根据一个特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述哺乳动物为新生动物。
本发明的目标在于从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其用于在新生哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用。
“新生动物”意指处于下述时刻的哺乳动物：从其出生的时刻直至其断奶，即直至所述哺乳动物变成能够自己进食和不再依赖母乳的时刻。将弓形体属物种或新孢子虫属物种的突变株用于在新生动物中预防和/或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况的主要优点是，刺激其未成熟的免疫系统以便通过合成抑制顶复门动物生长的分子来诱导非特异性免疫应答。
根据一个特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述哺乳动物为人类或动物。
本发明所涉及的动物主要是农用或饲养动物，其对于农产食品工业具有利益，但还涉及某些伴侣动物。
根据一个更特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述动物属于包括下列或由下列组成的组：绵羊、山羊、猪、牛、马科动物、骆驼科动物、犬科动物或猫科动物(Fayer,2004,Vet.Parasitol.,126,37-59)。
根据另一个实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系至少具有通过涉及基因mic1和/或mic3中的至少一个的遗传修饰而失活的粘附素MIC1和/或粘附素MIC3。
“粘附素MIC1和/或粘附素MIC3”意指微线体的蛋白质(也称为粘附素)MIC1和/或MIC3，其在顶复门的寄生虫在其宿主中的运动、迁移或侵入中发挥作用。这些蛋白质具有允许它们固着在宿主靶细胞上的结合模块。
“失活的粘附素”意指其功能在细胞内不再能够得到确保的粘附素。当它不产生时或者当它产生但不具有功能活性或具有降低的功能活性时，粘附素就是失活的。所述失活还涉及不再能够与其他蛋白质结合以形成复合物的粘附素。
“遗传修饰”意指在基因的核酸序列中实施的任何突变，其导致由该基因编码的蛋白质的表达不存在，或者导致表达出由该基因编码的蛋白质的非功能性或功能较低的形式。当其在体外施行时，该操作需要人工的介入。该突变可以由下列组成：基因或其编码区或其启动子区的全部或部分缺失，在基因的核苷酸序列中核苷酸的插入或置换。
“基因mic1”意指编码微线体的蛋白质MIC1(也称为粘附素MIC1)的基因。该蛋白质包含数个模块，其中包括特异地结合乳糖的结合结构域。蛋白MIC1还能够结合至宿主细胞的表面。
株系Toxo mic1 KO的详细的构建描述在文献US 7,946,185 B2和EP 1 703 914 B1中。株系Neo ncmic1 KO的详细的构建描述在本申请中。
“基因mic3”意指编码微线体的蛋白质MIC-3(也称为粘附素MIC3)的基因。该蛋白质进行同二聚体化，从而形成90kDa的复合物。MIC3包含EGF类型的结构域和凝集素类型的结构域。蛋白MIC3也能够结合至宿主细胞的表面。
株系Toxo mic3 KO的详细的构建描述在文献US 7,946,185 B2和EP 1 703 914 B1中。株系Neo ncmic3 KO的详细的构建描述在本申请中。
根据另一个特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系具有通过涉及mic1和mic3这两个基因的遗传修饰而失活的MIC1和MIC3这两种粘附素。
“涉及mic1和mic3这两个基因的遗传修饰”意指在基因mic1的核酸序列中和在基因mic3的核酸序列中实施的突变。该双突变导致蛋白MIC1和MIC3的表达不存在，或者导致表达出蛋白MIC1和MIC3的非功能性或功能较低的形式。弓形体属物种或新孢子虫属物种的这些突变株分别称为Toxo mic1-3 KO或Neo ncmic1-3 KO，并且具有相比于它们所衍生自的RH类型的鼠弓形体或NC1类型的犬新孢子虫的野生株而言大为减弱的毒力。但是，株系Toxo mic1-3 KO或Neo ncmic1-3 KO保留了强的免疫原性能力。株系Toxo mic1-3 KO的详细的构建描述在文献US 7,946,185 B2和EP 1 703 914 B1中。株系Neo ncmic1-3 KO的详细的构建描述在本申请中。
株系Toxo mic1-3 KO和Neo ncmic1-3 KO保留了其侵占靶组织的能力，而没有发展出由于向哺乳动物施用所述株系而引起的致病现象。基因mic1和mic3的无效不改变或很少改变这些株系的免疫原性潜力，但相对于强毒株(即具有与从其获得毒力减弱的株系的那个株系的毒力基本上相同的毒力的株系)而言，大大减低了其毒力。
向新生幼鼠接种株系Toxo mic1-3 KO导致细胞因子IL-12和IFN-γ的产生，并且有效地保护幼鼠免于以后被小隐孢子虫感染。
突变株Toxo mic1-3 KO有效地刺激由羔羊的肠系膜淋巴结细胞和脾细胞产生IL-12和IFN-γ，这确认了在该靶动物物种中使用该突变株作为免疫刺激剂的可能性。
根据一个特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述弓形体属物种或新孢子虫属物种分别为鼠弓形体(Toxoplasma gondii)或犬新孢子虫(Neospora caninum)。
根据另一个实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述株系的所述免疫刺激效应导致白介素-12(IL-12)的分泌，随后为干扰素-γ(IFN-γ)的分泌。
“白介素-12(IL-12)”意指由免疫细胞例如单核细胞、树突细胞和巨噬细胞所合成的细胞因子。该细胞因子在早期被分泌，并因此将会激活靶细胞(T细胞和天然杀伤细胞)，从而所述靶细胞则分泌IFN-γ。
“干扰素-γ(IFN-γ)”意指由被IL-12激活的CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和天然杀伤细胞(NK)所合成的细胞因子。生物体的细胞分泌IFN-γ将会使得能够产生针对小隐孢子虫的先天的保护性应答。由于所靶向的细胞系的多样性，因而该细胞因子将会具有多效活性。
“细胞因子”是指所有在免疫系统的发育和调节中所牵涉的分子。细胞因子是糖基化或非糖基化的蛋白质，其可以按照其生物学活性进行分类：
●促炎的：其中包括白介素(IL)和肿瘤坏死因子(TNF)，
●免疫调节的：其中包括白介素(IL)，
●效应的：其中包括干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)和趋化因子。
根据另一个更特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，白介素-12(IL-12)和干扰素-γ(IFN-γ)的所述分泌在使用所述弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系作为免疫刺激剂后3至9天开始。
根据一个更特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况为隐孢子虫病。
“隐孢子虫病”意指以下列为特征的病理学状况：痉挛、发热、疲劳、恶心类型的症状，和尤其是腹泻，其可以导致被小隐孢子虫或被隐孢子虫属的其他物种感染的哺乳动物脱水。隐孢子虫病主要影响哺乳动物的肠，但在受到免疫抑制的个体中也可以感染胆道和胰道以及呼吸道。侵染通过摄入存在于已污染了环境(水、土壤或生的食物)的被寄生的动物的排泄物中的卵囊而发生。症状在感染发生后两至十天出现，并且持续超过两周。该病理学状况的严重性随被感染的宿主的年龄，但更特别地随其免疫系统的状态而变化。在具有成熟且功能性的免疫系统的宿主中，隐孢子虫病对于其宿主的健康没有后果。相反地，非常年幼的、非常年老的或者具有未成熟或缺陷的免疫系统的宿主可以发展出隐孢子虫病的非常严重的形式。
“未成熟或缺陷的免疫系统”意指这样的免疫系统，对于所述免疫系统来说，一种或多种细胞谱系要么不存在，要么是缺陷的。免疫系统的未成熟是新生哺乳动物中的共同特点，其使得它们特别易受寄生虫感染。通过初乳实现的母体抗体的吸收在其免疫系统建立的时候赋予新生动物以一定程度的保护。免疫系统的未成熟或缺陷也可以产生自基因起源的病理学状况，尤其是在人中，例如维-奥(Wiskott-Aldrich)综合征，这是与X连锁淋巴细胞增生性综合征。该缺陷还可以由于被人免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起，或者由于与器官移植相关的治疗性治疗或者通过化学疗法或放射疗法来进行的某些癌症的医学救济而引起。具有未成熟或缺陷的免疫系统的哺乳动物被使得特别易受顶复门动物感染。
根据一个更加特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述对隐孢子虫病负有责任的隐孢子虫科的顶复门动物为至少一种从由下列组成的组中选择的顶复门动物：小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、牛隐孢子虫(Cryptosporidiumbovis)、安德森氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)、赖安氏隐孢子虫(Cryptosporidium ryanae)、鼠隐孢子虫(Cryptosporidiummuris)、普遍隐孢子虫(Cryptosporidium ubiquitum)、人隐孢子虫(Cryptosporidium hominis)、犬隐孢子虫(Cryptosporidium canis)、猫隐孢子虫(Cryptosporidium felis)、贝利氏隐孢子虫(Cryptosporidiumbaileyi)、火鸡隐孢子虫(Cryptosporidium meleagridis)或肖氏隐孢子虫(Cryptosporidium xiaoi)。
“小隐孢子虫、牛隐孢子虫、安德森氏隐孢子虫、赖安氏隐孢子虫、鼠隐孢子虫、普遍隐孢子虫、人隐孢子虫、犬隐孢子虫、猫隐孢子虫、贝利氏隐孢子虫、火鸡隐孢子虫或肖氏隐孢子虫”意指能够在大部分哺乳动物中引起水性质的肠病症的顶复门的原生动物。这些寄生虫尤其能够在具有未成熟或缺陷的免疫系统的绵羊、山羊、猪、牛、马科动物、骆驼、骆驼科动物、犬科动物、猫科动物或人中引起隐孢子虫病(Fayer,2004,Vet.Parasitol.,126,37-59)。
本发明还涉及具有通过涉及mic1和mic3这两个基因的遗传修饰而失活的MIC1和MIC3这两种粘附素的鼠弓形体或犬新孢子虫株系，其用于在哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用，所述与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况为隐孢子虫病。
本发明还涉及从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的鼠弓形体或犬新孢子虫株系，其用于在哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用，所述鼠弓形体或犬新孢子虫株系具有通过涉及mic-1和mic-3这两个基因的遗传修饰而失活的MIC-1和MIC-3这两种粘附素，并且所述与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况为隐孢子虫病。
本发明还涉及从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的鼠弓形体或犬新孢子虫株系，其用于在哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用，所述鼠弓形体或犬新孢子虫株系具有通过涉及mic1和mic3这两个基因的遗传修饰而失活的MIC1和MIC3这两种粘附素，并且按照20至109个速殖子向所述哺乳动物施用所述鼠弓形体或犬新孢子虫株系。
“速殖子”意指鼠弓形体或犬新孢子虫的快速复制形式。速殖子具有月牙形状，其大小变化为5-8×2-3μm。寄生虫的顶端部分包含参与寄生虫穿透入宿主细胞中的类锥体。微线体、棒状体和致密颗粒构成了速殖子的三种主要器官，速殖子还包含核、顶体(apicoplast)、高尔基体、内质网和类似于线粒体的细胞器。
确定为了哺乳动物的预防性治疗的速殖子的有效剂量使得能够限制对隐孢子虫病负有责任的致病因子的感染或传播。这样的治疗将可以由本领域技术人员依照哺乳动物的年龄和免疫学状态进行调整和/或重复，进行与需要一样多的次数。
速殖子与哺乳动物的接触不仅在具有隐孢子虫病所固有的症状的哺乳动物上而且在不具有隐孢子虫病的任何症状但与其他被小隐孢子虫或被能够诱导隐孢子虫病的其他隐孢子虫属物种感染的哺乳动物相接触的哺乳动物上是可实现的。
根据一个特别的实施方案，用于根据本发明的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系以从包括下列或由下列组成的组中选择的盖仑氏形式存在：液体悬浮体、固体或液体分散体、粉剂、糊剂或冻干物。
所述盖仑氏形式由本领域技术人员依照所选择的施用方式进行调整。可以设想所有传统的施用方式：通过肠胃外途径(静脉内、皮下、真皮内、肌内、腹膜内和鼻内)，或者通过肠途径。
根据一个更特别的实施方案，用于根据本发明的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系与至少一种其他抗原、或至少一种佐剂、或至少一种稳定剂、或至少一种防腐剂或者至少两种所述产品的混合物相联合，从而使得能够增强所述哺乳动物的免疫应答。
“抗原”意指源自寄生虫或除了弓形体属物种或新孢子虫属物种之外的其他致病因子的以其天然或突变形式的任何天然或重组蛋白质，其能够在哺乳动物中诱导细胞或体液免疫应答。弓形体属物种或新孢子虫属物种的突变株与这样抗原进行联合的目的是放大哺乳动物的免疫应答，并因此赋予它以更好的针对顶复门动物感染的保护。
“佐剂”意指能够加强和延长针对所靶向的抗原的免疫应答的任何物质。为了使得免疫应答更有效而牵涉的机制取决于所使用的佐剂。佐剂是本领域技术人员熟知的物质，其中尤其包括铝盐、角鲨烯、皂苷、细菌的组成成分或毒素或者某些蛋白质(蛋白胨、白蛋白、酪蛋白)。
“稳定剂或防腐剂”意指允许弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系在其包装内完好保存的化合物。
稳定剂或防腐剂是本领域技术人员熟知的物质，其中尤其包括碳水化合物(山梨糖醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、右旋糖酐、海藻糖)、极性有机溶剂例如DMSO(二甲亚砜)、聚山梨酯。
“增强免疫应答”意指免疫系统的各种不同途径的激活。在具有未成熟或缺陷的免疫系统的哺乳动物中，它涉及通过不同类别的细胞因子(例如干扰素或白介素)的合成增加来激活非特异性应答。在这些细胞因子之中，可以提及白介素-12(IL-12)，其将会激活CD4+或CD8+LT细胞以及NK。这些被激活的细胞自身将会分泌干扰素-γ(IFN-γ)，其在下述的免疫学机制中发挥作用：控制许多细胞内寄生虫的繁殖，如此从而阻止其在生物体内蔓延。在具有成熟的免疫系统的成年哺乳动物中，除了非特异性应答以外，免疫应答的增强还经过适应性免疫(响应于外来抗原而发生的特异性增殖)。
本发明还涉及用于在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：向所述哺乳动物施用从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的速殖子，从而使得能够诱导免疫应答。
本发明还涉及用于在新生哺乳动物中诱导免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：向所述新生哺乳动物施用从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的速殖子，从而使得能够诱导免疫应答。
“免疫应答”意指由抗原的识别和旨在消除所述抗原的反应构成的两个必要阶段。当抗原首次进入生物体中时，非特异性免疫应答被激活。它牵涉非克隆机制，因为它不需要特异的细胞克隆。通过该非特异性应答而产生的炎症反应将会导向适应性免疫。该应答牵涉特异地识别抗原的细胞，并且然后将会导致克隆扩充。该克隆扩充将会是非常有效的免疫应答和记忆应答(从抗原第二次进入生物体中起的特异性免疫应答)的根源。
根据一个特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述哺乳动物为新生动物。
根据一个更特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述哺乳动物为人类或动物。
根据一个更加特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述动物属于包括下列或由下列组成的组：绵羊、山羊、猪、牛、马科动物、骆驼科动物、犬科动物或猫科动物。
根据另一个实施方案，在根据本发明的方法中，所述选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系至少具有通过涉及基因mic1和/或mic3中的至少一个的遗传修饰而失活的粘附素MIC1和/或粘附素MIC3。
根据另一个特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系具有通过涉及mic1和mic3这两个基因的遗传修饰而失活的MIC1和MIC3这两种粘附素。
根据另一个更特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系分别为鼠弓形体或犬新孢子虫。
根据另外一个特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系诱导非特异性免疫应答，其尤其以IL-12和/或IFN-γ的分泌为特征。
本发明还涉及用于保护哺乳动物免于与隐孢子虫科的顶复门动物相关的寄生虫病的方法，所述方法包括下述步骤：向所述哺乳动物施用从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的速殖子，从而使得能够诱导针对所述寄生虫病的保护。
根据一个更特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述哺乳动物为新生动物。
根据一个更加特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述哺乳动物为人类或动物。
根据一个特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述动物属于包括下列或由下列组成的组：绵羊、山羊、猪、牛、马科动物、骆驼科动物、犬科动物或猫科动物。
根据一个特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系至少具有通过涉及基因mic1和/或mic3中的至少一个的遗传修饰而失活的粘附素MIC1和/或粘附素MIC3。
根据一个更特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系具有通过涉及mic1和mic3这两个基因的遗传修饰而失活的MIC1和MIC3这两种粘附素。
根据一个更特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述与隐孢子虫科的顶复门动物相关的寄生虫病为隐孢子虫病。
根据另一个更特别的实施方案，在根据本发明的方法中，所述对隐孢子虫病负有责任的隐孢子虫科的顶复门动物为至少一种从由下列组成的组中选择的顶复门动物：小隐孢子虫、牛隐孢子虫、安德森氏隐孢子虫、赖安氏隐孢子虫、鼠隐孢子虫、普遍隐孢子虫、人隐孢子虫、犬隐孢子虫、猫隐孢子虫、贝利氏隐孢子虫、火鸡隐孢子虫或肖氏隐孢子虫。
根据一个更加特别的实施方案，在根据本发明的方法中，向所述哺乳动物施用所述选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的所述速殖子通过肠途径或通过肠胃外途径来进行。
根据另外一个实施方案，在根据本发明的方法中，向所述哺乳动物施用所述选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的所述速殖子在所述哺乳动物暴露于对隐孢子虫病负有责任的隐孢子虫科的顶复门动物之前进行。
根据另外一个实施方案，在根据本发明的方法中，向所述哺乳动物施用所述选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的所述速殖子在所述哺乳动物暴露于对隐孢子虫病负有责任的隐孢子虫科的顶复门动物期间进行。
根据另外一个实施方案，在根据本发明的方法中，向所述哺乳动物施用所述选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的所述速殖子在所述哺乳动物暴露于对隐孢子虫病负有责任的隐孢子虫科的顶复门动物之后进行。
在上述的三个实施方案中，所述哺乳动物可以为新生动物。
下面的附图和实施例仅作为本发明的目标的举例说明而给出，它们无论如何不构成对本发明的限制。
附图描述
图1：该图图解说明了用于获得株系Neo ncmic1-3 KO的2个步骤的同源重组。同源重组的第一个步骤允许编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因整合到基因ncmic3的基因座处。用乙胺嘧啶来进行的选择使得能够扩增单突变株Neo ncmic3 KO。如此获得的株系Neoncmic3 KO用于同源重组的第二个步骤，其允许编码嵌合蛋白“氯霉素乙酰转移酶/绿色荧光蛋白”(CAT-GFP)的基因整合到基因ncmic1的基因座处。然后，用氯霉素来进行的选择使得能够扩增双突变株Neoncmic1-3 KO。
图2-A：该图是质粒pNcMic3KO-DHFR的示意图。该具有11,312个碱基对的质粒包含侧翼为与处于基因ncmic3侧翼的序列同源的区域(5HR-NcMic3和3HR-NcMic3)的选择基因DHFR、氨苄青霉素抗性基因(Amp)以及允许其线性化的限制位点Not I。
图2-B：该图是质粒pNcMic1KO-CAT-GFP的示意图。该具有10,069个碱基对的质粒包含侧翼为与处于基因ncmic1侧翼的序列同源的区域(3HR-NcMic1和5HR-NcMic1)的选择基因CAT-GFP、氨苄青霉素抗性基因(Amp)以及允许其线性化的限制位点Kpn I。
图3-A：该图显示了在犬新孢子虫野生株NC1中和在突变株Neoncmic3 KO中分别获得的PCR产物的电泳图谱，其中使用表II中的第1、2或3号PCR引物组，其相应于SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:10。
图3-B：该图显示了在犬新孢子虫野生株NC1中和在突变株Neoncmic3 KO中分别获得的PCR产物的电泳图谱，其中使用表II中的第4、5、6或7号PCR引物组，其相应于SEQ ID NO:11至SEQ IDNO:16。
图4-A：该图图解说明了通过免疫荧光法来进行的在犬新孢子虫野生株NC1中蛋白NcMIC3的检测的分析，其中使用特异地识别蛋白NcMIC3的抗体。在直接光下(图像A)或在荧光下(图像B)显现同一个显微镜视野。
图4-B：该图图解说明了通过免疫荧光法来进行的在犬新孢子虫突变株Neo ncmic3 KO中蛋白NcMIC3的检测的分析，其中使用特异地针对蛋白NcMIC3的抗体。在直接光下(图像A)或在荧光下(图像B)显现同一个显微镜视野。
图5：该图显示了在犬新孢子虫野生株NC1中、在突变株Neoncmic3 KO中和在突变株Neo ncmic1-3 KO中分别获得的PCR产物的电泳图谱，其中使用表VII中的第1至12号PCR引物组，其相应于SEQ ID NO:7至16和SEQ ID NO:21至30。
图6：该图图解说明了通过免疫荧光法来进行的在突变株Neoncmic3 KO(图像A和B)和Neo ncmic1-3 KO(图像C和D)中蛋白GFP的检测的分析，其中使用蛋白CAT-GFP的荧光特性。在直接光下(上面的图像A和C)或在荧光下(下面的图像B和D)显现同一个显微镜视野。
图7：图7图解说明了在幼鼠的血清中IgM类型的抗鼠弓形体抗体的含量测定。在血清中IgM类型的抗鼠弓形体抗体的含量测定在幼鼠通过腹膜内途径接受了20个株系Toxo mic1-3 KO的速殖子后3天(空心灰色正方形)或9天(实心黑色正方形)时进行。未接受任何株系Toxo mic1-3 KO的速殖子的幼鼠用作对照。
-在横坐标上：对照C57BL/6幼鼠(A)和用株系Toxo mic1-3 KO进行接种的C57BL/6幼鼠(B)的批次，
-在纵坐标上：在405nm处测量的吸光度值。
三只接受了20个株系Toxo mic1-3 KO的速殖子并在9天时处死的幼鼠通过其编号(4，5，6)出现在图7中。
图8-A：图8-A图解说明了在幼鼠的回肠中干扰素-γ(IFN-γ)的表达的测量。在幼鼠通过腹膜内途径接受了20个株系Toxo mic1-3 KO的速殖子后9天(实心黑色正方形)时，通过借助于特异性引物(SEQID NO:33至34)对从一段回肠中提取的总RNA进行定量PCR来测量编码IFN-γ的基因的表达水平。未接受任何株系Toxo mic1-3 KO的速殖子的幼鼠用作对照(空心灰色正方形)。
-在横坐标上：对照C57BL/6幼鼠(A)和用株系Toxo mic1-3 KO进行接种的C57BL/6幼鼠(B)的批次，
-在纵坐标上：“IFN-γ/HPRT”比例。
三只接受了20个株系Toxo mic1-3 KO的速殖子并在9天时处死的幼鼠通过其编号(4，5，6)出现在图8-A中。
图8-B：图8-B图解说明了在幼鼠的回肠中白介素-12(p40亚基)(IL-12p40)的表达的测量。在幼鼠通过腹膜内途径接受了20个株系Toxo mic1-3 KO的速殖子后9天(实心黑色正方形)时，通过借助于特异性引物(SEQ ID NO:31至32)对从一段回肠中提取的总RNA进行定量PCR来测量编码IL-12p40的基因的表达水平。未接受任何株系Toxo mic1-3 KO的速殖子的幼鼠用作对照(空心灰色正方形)。
-在横坐标上：对照C57BL/6幼鼠(A)和用株系Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激的C57BL/6幼鼠(B)的批次，
-在纵坐标上：“IL-12p40/HPRT”比例。
三只接受了20个株系Toxo mic1-3 KO的速殖子并在9天时处死的幼鼠通过其编号(4，5，6)出现在图8-B中。
图9：图9图解说明了在幼鼠的肠中Toxo mic1-3 KO的速殖子的存在的检测。在幼鼠通过腹膜内途径接受了20个株系Toxo mic1-3 KO的速殖子后9天时，通过在肠切片上的免疫组织学来进行Toxo mic1-3KO的速殖子的存在的检测。借助于抗-SAG-1的兔多克隆抗体和与异硫氰酸荧光素相偶联的抗兔二抗来进行免疫标记。
对于第4号(B)和第6号(D)幼鼠的肠显示出检测到鼠弓形体mic1-3 KO的速殖子。速殖子在第4号幼鼠(B)的肠肌中以白色点的形式出现。
第4号(C)和第6号(E)幼鼠的肠绒毛和肠肌的细胞的细胞核被Hoechst标记并且以白色点的形式出现。
图10：图10图解说明了通过在幼鼠的回肠中表面抗原SAG-1的表达而证明的鼠弓形体的存在。
由从一段回肠中提取的总RNA开始而获得的cDNA用作通过借助于特异性引物(SEQ ID NO:37至38)的PCR来扩增SAG-1的模板。在通过腹膜内途径接受了20个株系Toxo mic1-3 KO的速殖子(V)后3天(T1)或9天(T2)时，处死幼鼠。未接受任何株系Toxo mic1-3KO的速殖子的幼鼠用作对照(NV)。将PCR产物放置在琼脂糖凝胶上。
还从鼠弓形体野生株的基因组DNA开始(RH)和从突变株Toxomic1-3 KO的基因组DNA开始(KO)扩增了SAG-1。所述扩增产物用作SAG-1扩增产物的大小的参照。
幼鼠通过其编号(1，2，3，4，5，6)出现在图10中。
图11：图11图解说明了在幼鼠的肠中小隐孢子虫卵囊的计数。从置于含糖溶液中的肠研磨物的提取物开始，在Thoma池中进行小隐孢子虫卵囊的数目的点计。所述肠来自：
-用500,000个小隐孢子虫寄生虫进行攻击且在用小隐孢子虫进行攻击之前3天通过腹膜内途径接受了20个株系Toxo mic1-3 KO的速殖子的幼鼠(实心黑色正方形)，或
-用500,000个小隐孢子虫寄生虫进行攻击且未接受任何株系Toxo mic1-3 KO的速殖子的幼鼠(空心灰色正方形)。
在用小隐孢子虫进行感染后6天时，处死幼鼠。
-在横坐标上：用单独的小隐孢子虫进行感染的(C.p)或用Toxomic1-3 KO然后小隐孢子虫进行感染的(T.g+C.p)C57BL/6幼鼠的批次，
-在纵坐标上：在肠中小隐孢子虫卵囊的总数目。
图12：图12图解说明了在幼鼠的肠中小隐孢子虫卵囊的存在的检测。从置于含糖溶液中的肠研磨物的提取物开始，在Thoma池中进行小隐孢子虫卵囊的数目的点计。所述肠来自：
-用1,000,000个小隐孢子虫寄生虫进行攻击且在用小隐孢子虫进行攻击之前3天通过口服途径接受了20,000个株系Toxo mic1-3 KO的速殖子的幼鼠(实心黑色正方形)，或
-用1,000,000个小隐孢子虫寄生虫进行攻击且未接受任何株系Toxo mic1-3 KO的速殖子的幼鼠(空心灰色正方形)。
在用小隐孢子虫进行感染后7天时，处死幼鼠。
-在横坐标上：用单独的小隐孢子虫进行感染的(C.p)或用Toxomic1-3 KO然后小隐孢子虫进行感染的(T.g+C.p)C57BL/6幼鼠的批次，
-在纵坐标上：在肠中小隐孢子虫卵囊的总数目。
图13-A：图13-A图解说明了在源自羔羊和成年绵羊脾脏的单核细胞中白介素-12(IL-12)的含量测定。在体外用三种不同的鼠弓形体株系感染源自羔羊(灰色三角形)和成年绵羊(黑色正方形)脾脏的单核细胞样品：I型野生株(RH)、I型突变株Toxo mic1-3 KO(KO)和II型野生株(Pru)。未在体外进行感染的源自羔羊和成年绵羊脾脏的单核细胞用作对照(M)。
-在横坐标上：“RH”：I型鼠弓形体野生株，“KO”：株系Toxo mic1-3 KO，“Pru”：II型野生株，“M”：在没有刺激剂的情况下在体外培养的脾脏细胞(阴性对照)，
-在纵坐标上：IL-12的浓度(IU/ml)。
图13-B：图13-B图解说明了在源自羔羊和成年绵羊肠系膜淋巴结的单核细胞中白介素-12(IL-12)的含量测定。在体外用三种不同的鼠弓形体株系感染源自羔羊(灰色三角形)和成年绵羊(黑色正方形)肠系膜淋巴结的单核细胞样品：I型野生株(RH)、I型突变株Toxo mic1-3 KO(KO)和II型野生株(Pru)。未在体外进行感染的源自羔羊和成年绵羊肠系膜淋巴结的单核细胞用作对照(M)。
-在横坐标上：“RH”：I型鼠弓形体野生株，“KO”：株系Toxo mic1-3 KO，“Pru”：II型野生株，“M”：在没有刺激剂的情况下在体外培养的脾脏细胞(阴性对照)，
-在纵坐标上：IL-12的浓度(IU/ml)。
图13-C：图13-C图解说明了在源自羔羊和成年绵羊脾脏的单核细胞中干扰素γ(IFNγ)的含量测定。在体外用三种不同的鼠弓形体株系感染源自羔羊(灰色三角形)和成年绵羊(黑色正方形)脾脏的单核细胞样品：I型野生株(RH)、I型突变株Toxo mic1-3 KO(KO)和II型野生株(Pru)。未在体外进行感染的源自羔羊和成年绵羊脾脏的单核细胞用作对照(M)。
-在横坐标上：“RH”：I型鼠弓形体野生株，“KO”：株系Toxo mic1-3 KO，“Pru”：II型野生株，“M”：在没有刺激剂的情况下在体外培养的脾脏细胞(阴性对照)，
-在纵坐标上：IFNγ的浓度(ng/ml)。
图14：图14图解说明了在其出生后一天时用106个Toxo mic1-3KO的速殖子进行免疫刺激的羔羊(批次A–黑色正方形)的体重的演变，相比于未经免疫刺激的对照羔羊(批次B–灰色圆圈)而言。
-在横坐标上：在用Toxo mic1-3 KO刺激羔羊后经过的时间段(以天表示)，
-在纵坐标上：羔羊的体重(以千克表示)。
图15：图15图解说明了在用株系Toxo mic1-3 KO的总提取物对在其出生后一天时用106个Toxo mic1-3 KO的速殖子进行免疫刺激并在免疫刺激后15天时处死的羔羊(第1416–1418–1421和1424号羔羊)或对照羔羊(羔羊1428和1423)的脾脏的单核细胞进行再刺激后IFN-γ的产生。
-在横坐标上：“培养基”：在没有刺激剂的情况下在体外培养的脾脏细胞(对照-)，“Mic1-3 KO ET”：用株系Toxo mic1-3 KO的总寄生虫提取物进行再刺激的脾脏细胞，和“ConA”：用伴刀豆球蛋白A进行刺激的脾脏细胞(对照+)，
-在纵坐标上：IFN-γ的浓度(以ng/ml表示)。
图16：图16图解说明了从在其出生后一天时用106个Toxo mic1-3KO的速殖子进行免疫刺激并在免疫刺激后15天时处死的羔羊(第1416–1418–1421和1424号羔羊)或对照羔羊(羔羊1428和1423)的髂骨下和腘淋巴结细胞的离体培养开始而产生的IFN-γ的产生。
-在横坐标上：腘淋巴结细胞(A)和髂骨下淋巴结细胞(B)，
-在纵坐标上：IFN-γ的浓度(以pg/ml表示)。
图17：图17图解说明了在其出生后一天时用106个Toxo mic1-3KO的速殖子进行免疫刺激并用5×106个小隐孢子虫卵囊进行攻击的羔羊(黑色正方形)和仅经攻击的对照羔羊(灰色圆圈)的存活。存活曲线为卡-迈(Kaplan-Meier)类型的。
-在横坐标上：在用小隐孢子虫感染羔羊后经过的时间段(以天表示)，
-在纵坐标上：羔羊的存活(以％表示)。
图18：图18图解说明了在其出生后一天时用106个Toxo mic1-3KO的速殖子进行免疫刺激并用5×106个小隐孢子虫卵囊进行攻击的羔羊(黑色正方形)和仅经攻击的对照羔羊(灰色菱形)的日体重增益。
-在横坐标上：在用Toxo mic1-3 KO刺激羔羊后经过的时间段(以天表示)，
-在纵坐标上：羔羊的重量变化(以kg表示)。
平均体重增益(GMQ：日平均增益)表现了随时间的增加的速率，按照下述公式：体重GMQ＝d体重/d年龄。
图19：图19图解说明了在其出生后一天时用106个Toxo mic1-3KO的速殖子进行免疫刺激并用5×106个小隐孢子虫卵囊进行攻击的羔羊(黑色正方形)和仅经攻击的对照羔羊(灰色菱形)的平均小隐孢子虫卵囊排出/克排泄物。
-在横坐标上：在用小隐孢子虫感染羔羊后经过的时间段(以天表示)，
-在纵坐标上：小隐孢子虫卵囊的数目/克排泄物。
实验部分
为了制备对于基因ncmic1和ncmic3而言被无效的犬新孢子株系，进行了两个步骤的同源重组。同源重组的第一个步骤允许获得单突变体KO(株系Neo ncmic3 KO)。同源重组的第二个步骤在株系Neoncmic3 KO中进行以获得双缺失株系(Neo ncmic1-3 KO)(图1)。
实施例1：突变株Neo ncmic3 KO的构建
在增殖期期间犬新孢子虫的基因组的单倍性使得能够在单次同源重组中使基因无效。
所有所使用的犬新孢子虫株系NC1的速殖子在人成纤维细胞(HFF)中产生，所述人成纤维细胞在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的Dulbecco基本培养基(DMEM)中进行培养。在机械裂解宿主细胞并且于25G注射器中通过3次之后，收获速殖子。
a)质粒pNcMic3KO-DHFR的构建
质粒pNcMic3KO-DHFR(图2-A)包含选择基因DHFR(二氢叶酸还原酶)，其赋予对于乙胺嘧啶的抗性。将选择基因DHFR置于鼠弓形体的α-微管蛋白启动子(aTUB5启动子)的控制之下以允许该基因在寄生虫中表达。该异源启动子的效力先前已在犬新孢子虫中得到证明。该盒被与处于基因ncmic3侧翼的序列同源的区域(5HR-NcMic3和3HR-NcMic3)围绕。所述选择盒DHFR使得能够用乙胺嘧啶进行选择。
从犬新孢子虫株系NC1的基因组DNA开始通过PCR扩增出了基因ncmic3的5’UTR区。对于所述扩增，引物5HR NCmic3 F KpnI和5HR NCmic3 R ClaI(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)允许扩增出基因ncmic3的5’UTR区和产生被用于将片段5HR克隆到在质粒pT230 DHFR中的选择盒DHFR上游的两个限制位点(在PCR片段的5’处的KpnI和3’处的ClaI)。
从犬新孢子虫株系NC1的基因组DNA开始通过PCR扩增出了基因ncmic3的3’UTR区。对于所述扩增，引物3HR NCmic3 F XbaI和3HR NCmic3 R NotI(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)允许扩增出基因ncmic3的3’UTR区和产生被用于将片段3HR克隆到在质粒pT230 5HR-NcMic3-DHFR中的选择盒DHFR下游的两个限制位点(在PCR片段的5’处的XbaI和3’处的NotI)。引物的序列列出在下面的表I中。
表I：用于整合基因ncmic3的5’UTR和3’UTR序列的引物的列表。限制位点的序列加有下划线。
b)电穿孔和选择的条件
向悬浮在包含ATP(3mM)和谷胱甘肽(3mM)的电穿孔介质CYTOMIX(Van den Hoff等人,Nucleic Acid Research,6月11日,20(11):2902)中的5×107个犬新孢子虫NC1的速殖子添加50μg经纯化然后用NotI线性化的质粒pNcMic3KO-DHFR，并且在具有4mm间距的杯池中以800μL的体积在仪器BioRad上施行电穿孔(参数：2000V，50欧姆，25μF，具有两次电冲击)。
在电穿孔后，将速殖子放置在处于培养中的HFF细胞单层上。对于突变体的选择，在电穿孔后24小时更换培养基并补充以选择试剂(2μM乙胺嘧啶)。在该培养基中进行三次培养物传代。
在选择16天后，通过在96-孔平板的孔中HFF细胞的限度稀释来克隆具有抗性的寄生虫。在扩增后，寻找由寄生虫引起的裂解斑。将寄生虫移种，并且提取其基因组DNA以用于PCR分析。这些PCR分析应当确认所述转基因的整合，但还应当使得能够区别随机整合了该转基因的寄生虫与其基因ncmic3已通过同源重组而被有效消除的目的寄生虫。
c)PCR分析
从基因组DNA开始，进行了PCR，以便：
●研究用存在于同源序列上的第1号PCR引物组(HR NCmic3 F(SEQ ID NO:5)和HR NCmic3 R(SEQ ID NO:6))扩增出的DNA片段的大小。在转基因随机整合的情况下，扩增出具有2163bp和3824bp的两个DNA片段；而在同源重组的情况下，仅扩增出具有3824bp的片段。在野生株的情况下，仅扩增出具有2163bp的片段。
●用第2号PCR引物组(ORF NCmic3 F(SEQ ID NO:7)和ORF NCmic3 R(SEQ ID NO:8))来证实基因ncmic3的存在/不存在。
●和/或，用第3号PCR引物组(ORF DHFR F(SEQ ID NO:9)和ORF DHFR R(SEQ ID NO:10))来证实盒DHFR的存在/不存在。
引物的序列和源自各种不同PCR的扩增子的大小分别列出在下面的表II和表III中。
表II：用于用以确证突变株Neo ncmic3 KO的构建的各种不同PCR的引物的列表。
表III：用于确证突变株Neo ncmic3 KO的构建的各种不同PCR的扩增子的大小(以碱基对表示)。
PCR编号 Neo ncmic3 KO 犬新孢子虫(NC1)
1 3824 2163
2 - 850
3 504 -
4 - 3127
5 - 3374
6 2890 -
7 3258 -
PCR产物的电泳图谱呈现在在图3-A中。在所研究的克隆之中，某些克隆具有对于DHFR特异的条带(PCR 3)但没有对于ncmic3特异的条带(PCR 2)。对于这些克隆所进行的第1号PCR显现出对于克隆Neo ncmic3 KO特异的3824bp的条带。
用新的引物组对这些目的克隆进行了新的PCR分析。这些PCR(所谓的“整合PCR”)使得能够通过使用存在于基因组上在处于基因ncmic3侧翼的序列上游或下游的一个引物和存在于选择盒(基因dhfr)或目的基因(ncmic3)中的第二个引物来确证基因的KO(图3-B)。
在图3-B中，第4和5号PCR使得能够显示在ncmic3的基因座处ncmic3的存在。第4号PCR用引物组Integ NCmic3 F(SEQ ID NO:11)和ORF NCmic3 R2(SEQ ID NO:12)来进行。第5号PCR用引物组Integ NCmic3 R(SEQ ID NO:14)和ORF NCmic3 F2(SEQID NO:15)来进行。观察到对于犬新孢子虫野生株NC1存在条带，和对于突变株Neo ncmic3 KO这些条带不存在。在图3-B中，第6和7号PCR使得能够显示在ncmic3的基因座处DHFR的存在。第6号PCR用引物组Integ NCmic3 F(SEQ ID NO:11)和ORF DHFR R2(SEQ ID NO:13)来进行。第7号PCR用引物组Integ NCmic3 R(SEQ ID NO:14)和ORF DHFR F2(SEQ ID NO:16)来进行。注意到对于犬新孢子虫野生株NC1不存在条带，和对于株系Neo ncmic3KO存在条带。应当注意，对于第6号PCR，在大约1000bp处存在非特异的条带。
所有的PCR结果证明，确实已经发生了同源重组，并且突变株Neo ncmic3 KO确实已缺失了基因ncmic3。
d)免疫荧光分析
进行了免疫荧光分析。在免疫荧光分析之前24小时，将5×105个寄生虫放置在包含覆盖有HFF细胞的细胞层的覆盖片的p24的孔中。
将被寄生虫感染的细胞用1X PBS洗涤2次，然后用低聚甲醛(3.7％，在1X PBS中)固定30分钟。在用1X PBS进行3次洗涤后，将细胞用Triton溶液(0.1％，在1X PBS中)进行渗透化5分钟。在用1X PBS进行3次洗涤后，用1X PBS/10％FCS的溶液实施饱和步骤30分钟。然后，将细胞与在PBS/2％FCS的溶液中稀释的一抗一起温育1小时，洗涤3次，随后与在PBS/2％FCS的溶液中稀释的二抗一起温育1小时。在用1X PBS进行2次洗涤后，用Immu-Mount将盖玻片安放在载玻片上，并且在荧光显微镜下进行观察。
所使用的一抗为使得能够检测在寄生虫中蛋白NcMIC3的表达的抗体(一抗：兔的抗-mic3抗体；和商业的二抗：Alexa594，山羊抗兔，Life technologies ref.A-11012)。
对于犬新孢子虫野生株NC1，在寄生虫的顶极处观察到红色荧光，这揭示了蛋白NcMIC3的存在(图4A)，而对于突变株Neo ncmic3KO，在寄生虫的顶极处未观察到荧光，这证明了蛋白NcMIC3的不存在(图4B)。
实施例2：突变株Neo ncmic1 KO的构建
a)质粒pNcMic1KO-CAT-GFP的构建
质粒pNcMic1KO-CAT-GFP(图2-B)包含选择盒CAT-GFP，其编码同时允许对于氯霉素的抗性(CAT)和绿色荧光(GFP：绿色荧光蛋白)的融合蛋白。将所述选择盒CAT-GFP置于鼠弓形体的α-微管蛋白启动子的控制之下以允许该基因在寄生虫中表达。在所述盒的两侧，克隆了与处于基因ncmic1侧翼的序列同源的区域。
从犬新孢子虫株系NC1的基因组DNA开始通过PCR扩增出了基因ncmic1的3’UTR区。对于所述扩增，引物3HR NCmic1 F KpnI和3HR NCmic1 R HindIII(SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18)允许扩增出基因ncmic1的3’UTR区和产生被用于将片段3HR克隆到在质粒pT230 CAT-GFP中的选择盒CAT-GFP上游的两个限制位点(在PCR片段的5’处的KpnI和3’处的HindIII)。
从犬新孢子虫株系NC1的基因组DNA开始通过PCR扩增出了基因ncmic1的5’UTR区。对于所述扩增，引物5HR NCmic1 F BamHI和5HR NCmic1 R NotI(SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20)允许扩增出基因ncmic1的5’UTR区和产生被用于将片段5HR克隆到在质粒pT230 3HRNcMic1CAT-GFP中的选择盒CAT-GFP下游的两个限制位点(在PCR片段的5’处的BamHI和3’处的NotI)。引物的序列列出在下面的表IV中。
表IV：用于整合基因ncmic1的5’UTR和3’UTR序列的引物的列表。限制位点的序列加有下划线。
b)电穿孔和选择的条件
应当向悬浮在包含ATP(3mM)和谷胱甘肽(3mM)的电穿孔介质CYTOMIX(Van den Hoff等人,Nucleic Acid Research,6月11日,20(11):2902)中的5×107个NC1的速殖子添加50μg经纯化然后用KpnI线性化的质粒pNcMic1KO-CAT-GFP，并且应当在具有4mm间距的杯池中以800μL的体积在仪器BioRad上施行电穿孔(参数：2000V，50欧姆，25μF，具有两次电冲击)。
在电穿孔后，将速殖子放置在处于培养中的HFF细胞单层上。对于突变体的选择，将会在电穿孔后24小时更换培养基并补充以选择试剂(50μM氯霉素)。在该培养基中应当进行三次培养物传代。
在选择15天后，通过在96-孔平板的孔中HFF细胞的限度稀释来克隆具有抗性的寄生虫。在扩增后，寻找由寄生虫引起的裂解斑。将寄生虫移种，并且将会提取其基因组DNA以用于PCR分析。
c)PCR分析
引物的序列和源自各种不同PCR的扩增子的预期大小分别列出在下面的表V和表VI中。
表V：用于用以确证突变株Neo ncmic1 KO的构建的各种不同PCR的引物的列表。
表VI：用于确证突变株Neo ncmic1 KO的构建的各种不同PCR的扩增子的大小(以碱基对表示)。
PCR编号 Neo ncmic1 KO 犬新孢子虫(NC1)
1 3359 -
2 3421 -
3 - 3746
4 - 3046
5 - 449
6 472 -
实施例3：突变株Neo ncmic1-3 KO的构建
a)质粒pNcMic1KO-CAT-GFP的构建
质粒pNcMic1KO-CAT-GFP的构建描述在实施例2(2a)中。
b)电穿孔和选择的条件
向悬浮在包含ATP(3mM)和谷胱甘肽(3mM)的电穿孔介质CYTOMIX(Van den Hoff等人,Nucleic Acid Research,6月11日,20(11):2902)中的5×107个Neo ncmic3 KO的速殖子添加50μg经纯化然后用KpnI线性化的质粒pNcMic1KO-CAT-GFP，并且在具有4mm间距的杯池中以800μL的体积在仪器BioRad上施行电穿孔(参数：2000V，50欧姆，25μF，具有两次电冲击)。
在电穿孔后，将速殖子放置在处于培养中的HFF细胞单层上。对于突变体的选择，在电穿孔后24小时更换培养基并补充以选择试剂(50μM氯霉素)。在该培养基中进行三次培养物传代。
在选择15天后，通过在96-孔平板的孔中HFF细胞的限度稀释来克隆具有抗性的寄生虫。在扩增后，寻找由寄生虫引起的裂解斑。将寄生虫移种，并且提取其基因组DNA以用于PCR分析。
c)PCR分析
引物的序列和源自各种不同PCR的扩增子的大小分别列出在下面的表VII和表VIII中。
表VII：用于用以确证突变株Neo ncmic3 KO和Neo ncmic1-3 KO的构建的各种不同PCR的引物的列表。
表VIII：用于确证突变株Neo ncmic3 KO和Neo ncmic1-3 KO的构建的各种不同PCR的扩增子的大小(以碱基对表示)。
PCR编号 Neo ncmic1-3 KO 犬新孢子虫(NC1) Neo ncmic3 KO
1 3359 - -
2 3421 - -
3 - 3746 3746
4 - 3046 3046
5 - 3127 -
6 - 3374 -
7 2890 - 2890
8 3258 - 3258
9 - 449 449
10 472 - -
11 - 850 -
12 504 - 504
在图5中，第1号PCR用引物组Integ NCmic1 F(SEQ ID NO:21)和ORF CATGFP R(SEQ ID NO:22)来进行。第2号PCR用引物组ORF CATGFP F(SEQ ID NO:23)和Integ NCmic1 R(SEQ ID NO:24)来进行。第3号PCR用引物组Integ NCmic1 F(SEQ ID NO:21)和ORF NCmic1 R(SEQ ID NO:25)来进行。第4号PCR用引物组Integ NCmic1 R(SEQ ID NO:24)和ORF NCmic1 F(SEQ ID NO:26)来进行。第5号PCR用引物组Integ NCmic3 F(SEQ ID NO:11)和ORF NCmic3 R2(SEQ ID NO:12)来进行。第6号PCR用引物组Integ NCmic3 R(SEQ ID NO:14)和ORF NCmic3 F2(SEQ ID NO:15)来进行。第7号PCR用引物组Integ NCmic3 F(SEQ ID NO:11)和ORF DHFR R2(SEQ ID NO:13)来进行。第8号PCR用引物组Integ NCmic3 R(SEQ ID NO:14)和ORF DHFR F2(SEQ ID NO:16)来进行。第9号PCR用引物组ORF NCmic1 F2(SEQ ID NO:27)和ORF NCmic1 R2(SEQ ID NO:28)来进行。第10号PCR用引物组ORF CATGFP F2(SEQ ID NO:29)和ORF CATGFP R2(SEQ IDNO:30)来进行。第11号PCR用引物组ORF NCmic3 F(SEQ ID NO:7)和ORF NCmic3 R(SEQ ID NO:8)来进行。第12号PCR用引物组ORF DHFR F(SEQ ID NO:9)和ORF DHFR R(SEQ ID NO:10)来进行。
PCR产物的电泳分析显示，株系Neo ncmic1-3 KO不再具有基因ncmic1和ncmic3(孔3、4、5、6、9和11，图5)和确实具有基因dhfr和cat-gfp(孔1、2、7、8、10和12，图5)，如此确证了株系Neo ncmic1-3 KO的获得。所有的PCR结果证明，确实已经发生了同源重组，并且株系Neo ncmic1-3 KO确实已缺失了基因ncmic1和ncmic3。
d)免疫荧光分析
仅通过直接观察寄生虫的荧光来进行免疫荧光分析(图6)。
在直接光下显现所述两种突变株的寄生虫(图像A和C)。在荧光下显现同一个显微镜视野。仅在插入了盒CAT-GFP之后的突变株Neo ncmic1-3 KO中检测到由于重组嵌合蛋白CAT-GFP的表达而引起的绿色荧光(图像D)。相反地，不具有盒CAT-GFP的株系Neoncmic3 KO不表达蛋白CAT-GFP并因此不具有荧光(图像B)。
实施例4：通过突变体Toxo mic1-3 KO来对幼鼠进行免疫刺激
1-实验方案
1.1-动物
对于年龄为3天的C57BL/6幼鼠进行免疫刺激。在Nouzilly的INRA中心(Indre et Loire,France)获得和饲养这些幼鼠。在整个实验期间将幼鼠在具有封闭水平2的动物房中进行维持，以便最好地限制外部污染的风险。
1.2-鼠弓形体株系
1.2.1-株系Toxo mic1-3 KO
通过在人包皮成纤维细胞系(HFF)上的连续传代来维持其编码蛋白MIC1和MIC3的基因已被无效的鼠弓形体突变株(称为株系Toxo mic1-3 KO)，所述人包皮成纤维细胞系在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中进行培养。
1.2.2-株系RH
也通过在人包皮成纤维细胞系(HFF)上的连续传代来维持株系Toxo mic1-3 KO所衍生自的鼠弓形体野生株RH，所述人包皮成纤维细胞系在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中进行培养。
为了制备总寄生虫提取物，将株系RH的速殖子进行洗涤，以60瓦特/秒进行超声处理三次(10分钟)，并且在4℃下以2000g离心30分钟。浓缩上清液并进行等分。通过BCA测定法来测定浓度，其中使用BSA(牛血清白蛋白)作为标准。将等分试样贮存于-20℃。
1.3-免疫刺激
如下地处理年龄为3天的C57BL/6幼鼠的批次：
·六只幼鼠(批次A)用作未经疫苗接种的对照批次，
·六只幼鼠(批次B)接受突变体Toxo mic1-3 KO。
在第0天，批次A的幼鼠通过腹膜内途径接受20个株系Toxomic1-3 KO的速殖子。
在免疫刺激后第3天，处死每个批次的3只幼鼠以用于研究体液免疫应答、炎症反应和寄生虫血症。
在免疫刺激后第9天，处死每个批次的剩余的3只幼鼠以用于研究体液免疫应答、炎症反应和寄生虫血症。
1.4-体液免疫应答
通过经由ELISA评价在血清中抗鼠弓形体的特异性IgM抗体的出现的动力学，研究了体液免疫应答。
在感染后第3天和第9天，在处死幼鼠的时刻抽取血清。让抽取物在环境温度下放置10分钟以允许形成血凝块。通过将抽取物在+20℃下以2000rpm离心10分钟来回收血清。将上清液等分到干净的管中并贮存于-20℃。
将如上面所描述的那样而获得的鼠弓形体株系RH的总提取物用于将微量滴定板(Nunc)的平底孔敏化。将100μL提取物(浓度为10μg/mL，在50mM和pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中)放置到每个孔中。在+4℃下过夜后，在添加有0.05％Tween-20的PBS缓冲液(PBS-T)中进行三次洗涤。
通过在潮湿气氛中于37℃用具有4％BSA的PBS将平板温育1小时30分钟来使非特异性位点饱和。
放置100μL的在PBS-T中进行稀释的每个血清样品(1/50的稀释度)并且在潮湿气氛中于37℃温育1小时。
在两个系列的三次洗涤后，放置100μL的在PBS-T中以1/5000进行稀释的与碱性磷酸酶相偶联的抗小鼠IgM(PAL；Sigma)并且在潮湿气氛中于37℃温育1小时30分钟。进行两个新系列的三次洗涤。借助于100μL的在DEA-HCL中的1mg/mL的对硝基苯酚磷酸酯(PNPP)来进行揭示。
在10至20分钟的温育后，在波长下在平板阅读器(Wallac 1420 Multilabel计数器)上进行阅读。
按照对照批次的幼鼠的吸光度值(OD)来确定所采纳的阳性阈值：将它固定在0.23的OD，对于1/50的血清稀释度。
1.5-炎症反应的研究
通过扩增编码IL-12和IFN-γ的基因，通过定量PCR(qPCR)来量化在肠范围内幼鼠的炎症反应的分析。IL-12是响应于病原体侵入而产生的细胞因子，其刺激IFN-γ的分泌，IFN-γ是响应于在病原体感染位点处的炎症而由免疫细胞产生的细胞因子。
在第3天和第9天处死幼鼠后，取出肠并将回肠(盲肠上面1cm)用于通过qPCR来进行的分析。将组织在1mL(Invitrogen)中进行温育，然后在Thurax中进行研磨，在环境温度下温育5分钟，并且以12000g离心10分钟。在这之后，回收上清液并通过用移液管连续压送十来次来混匀。
一旦用解离开了核蛋白复合物，就用氯仿从DNA和蛋白质中分离出RNA。向上清液添加一毫升的氯仿并且将/氯仿混合物剧烈搅拌15秒，然后在环境温度下进行温育，和最后在4℃下以12000g离心15分钟。在离心后，将混合物分开为有机相(苯酚/氯仿，粉红色，下部相)、界面(白色纱状物，DNA和细胞碎片)和包含总RNA的水相(上部相)。
回收包含总RNA的水相，并且添加500μL异丙醇以使RNA沉淀。搅拌溶液，在环境温度下温育10分钟，并且在4℃下以12000g离心10分钟。分离出获得的粒状沉淀，然后用1mL 75％乙醇(在0.1％DEPC水中进行稀释并贮存于-20℃的无水乙醇)进行洗涤，搅拌，并且在4℃下以7500g离心10分钟。在冰中在化学通风橱下将粒状沉淀干燥10分钟。最后，将RNA收回在大约20μL的0.1％DEPC水中。
通过在1％琼脂糖凝胶上的电泳和通过计算在260nm的波长处的吸光度与在280nm的波长处的吸光度之间的直接比例来证实RNA提取的质量。该比例应当接近2。最后，借助于分光光度计来定量RNA提取的收率。
将两微克的RNA与1μL Oligo dT(Eurogentec，133pmol/μl)一起在11μL的最终体积中在65℃下温育10分钟，然后在冰中温育2分钟。一旦寡核苷酸dT固着在polyA尾上，就将RNA溶液与2μLdNTP(dATP，dTTP，dGTP，dCTP，每种20mM)、4μL逆转录酶缓冲液(5X Eurogentec；250mM Tris-HCL(pH 8.3)；375mM KCl；50mM DTT；15mM MgCl2)和0.4μL MuMLV(25U/μL；50mMTric-HCL(pH 8.3)；1mM EDTA，0.1％Triton X-100，0.1M NaCl；5mM DTT；50％(v/v)甘油)一起在20μL的最终体积中在37℃下温育1小时30分钟。然后，在85℃下抑制逆转录酶10分钟。
在本情况下，定量了在炎症反应期间表达的编码蛋白IL-12和IFN-γ的基因的表达。
为了进行扩增，对于IL-12，使用引物对SEQ ID NO:31(5'-CTCACATCTGCTGCTCCACAA-3')和SEQ ID NO:32(5'-GACGCCATTCCACATGTCACT-3')；对于检定IFNγ，使用引物对SEQ ID NO:33(5'-TCTTCTTGGATATCTGGAGGAA-3')和SEQ ID NO:34(5'-AGCTCATTGAATGCTTGGCGCTG-3')；和对于检定鼠类HPRT参照基因，使用引物对SEQ ID NO:35(5’-GGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3’)和SEQ ID NO:36(5’-GAGGGTAGGCTGGCCTATAG-3')。
将两微升的来自逆转录反应的稀释至1/10的cDNA与0.3μL 5’引物(25μM)、0.3μL 3’引物(25μM)、7.5μL Mix PCR(BioRad)一起在15μL的最终体积中进行温育。为PCR反应而选择的条件如下：1)在95℃下变性5分钟，2)在95℃下变性10秒，3)在62℃下配对和延伸15秒(对于IL-12、IFNγ和HPRT)，4)重复从步骤2开始的循环：39次，5)55℃至95℃的解链曲线，以证实二聚体的存在或不存在。
1.6-幼鼠的感染状态的研究
幼鼠的感染水平通过三种不同的技术来进行分析：1)在HFF细胞上速殖子的组织散布；2)在经感染的幼鼠的肠切片上的免疫组织学；和3)从批次A和B的幼鼠的回肠开始的PCR。
1.6.1-在HFF细胞上速殖子的组织散布
在器官放置前一周，按照1×104个细胞/孔将HFF细胞放置到24-孔平板中。将细胞在1mL的补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM细胞培养基中进行培养。
在处死后，取出批次1和2的幼鼠的脾脏并在2mL 1X PBS中进行研磨。在每个包含HFF细胞的孔中放置十微升的研磨物。在放置脾脏研磨物后24小时，用DMEM洗涤细胞，然后在每个孔中放置1mL干净的培养基。将细胞在37℃、5％CO2下进行温育直至检测到裂解斑，其揭示了Toxo mic1-3 KO的速殖子的存在。
1.6.2-在经感染的幼鼠的肠切片上的免疫组织学
将处死的幼鼠的肠盘绕成螺旋状(瑞士卷)，然后借助于围绕该瑞士卷进行弯曲并夹住的纸来将其保持处于该形状。将样品在4％低聚甲醛溶液(在1X PBS(pH＝7)中进行稀释)中进行固定，并且在4℃下温育8小时。然后，将组织在1X PBS中进行洗涤，然后在4℃下在干净的1X PBS中温育8小时。将该最后一个步骤重新再做一次。将组织在4℃下于在1X PBS中进行稀释并经过过滤的30％蔗糖溶液中温育8小时。最后，将组织转移到装满包埋介质OCT的合适大小的模子中。在OCT中温育5分钟后，将样品借助于干冰来进行冷冻并贮存于-80℃。
在这之后，借助于将样品保持在-20℃的恒冷切片机来进行肠样品的切割。制备出厚度为7μm的组织切片，然后通过静电力将其放置在载玻片上。将载玻片贮存于-80℃。
将组织切片的载玻片解冻，然后让其在环境温度下干燥1小时。将载玻片上的样品区域用具有疏水性墨水的自来水笔“Dakocitamation笔”来划出界限。在环境温度下和在潮湿的小室中，将肠的组织切片用50μL的1X PBS(没有Mg2+、Ca2+)、Triton X-100和1％BSA的溶液进行渗透化10分钟。通过抽吸来撤除渗透化溶液，并且在环境温度下和在潮湿的小室中将样品在50μL的1X PBS(没有Mg2+、Ca2+)、Triton X-100和10％BSA的溶液中饱和1小时。在抽吸出饱和溶液后，向每个样品放置50μL的在1X PBS(没有Mg2+、Ca2+)、Triton X-100和1％BSA的溶液中稀释至1/100的抗鼠弓形体SAG1的兔多克隆血清。在潮湿的小室中，将样品在4℃下温育8小时。在1X PBS(没有Mg2+、Ca2+)、Triton X-100和1％BSA的溶液中进行两次5分钟的洗涤。向每个样品放置50μL的在1X PBS(没有Mg2+、Ca2+)、Triton X-100和1％BSA的溶液中稀释至1/20的与异硫氰酸荧光素相偶联的猪抗兔抗体。在环境温度下，在潮湿的小室中，在经偶联的二抗存在下将样品温育1小时20分钟。在1X PBS(没有Mg2+、Ca2+)、Triton X-100和1％BSA的溶液中进行两次5分钟的洗涤，然后在无菌蒸馏水中进行最后一次样品洗涤。将载玻片进行干燥，然后在每个样品上放置一滴fluoromount G。最后，将样品安放在载玻片和盖玻片之间。
1.6.3-SAG-1的检测
从通过逆转录反应而获得的cDNA(参见第1.5节)开始来进行PCR。用引物SEQ ID NO:37(5’-CTGCACCACTTCATTATTTCTTCTG-3’)和SEQ ID NO:38(5’-ACTCACGCGACACAAGCTG-3’)，通过PCR来扩增对于寄生虫鼠弓形体特异的基因SAG-1。
将2μL cDNA与1μL 5’引物(10μM)、1μL 3’引物(10μM)、25μLGreen Master Mix(2X,Promega)一起在50μL的最终体积中进行温育。为PCR而选择的条件如下：1)在94℃下变性5分钟，2)在94℃下变性30秒，3)在60℃下配对30秒，4)在72℃下延伸1分钟，5)重复从步骤2开始的循环：34次，6)在72℃下延伸5分钟。在肠范围内寄生虫鼠弓形体的存在通过1001个碱基对的扩增片段来证实。
2-结果
2.1-在免疫刺激后体液应答的研究
在图7中显示了对于对照幼鼠和用株系Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激的幼鼠的这些批次的血清，在感染后第3天和第9天时的ELISA测试的结果。对照批次(A)的幼鼠在感染后第3天和第9天未发展出体液应答，这与用株系Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激的批次(B)的3只幼鼠中的2只相反，该2只幼鼠在感染后9天时产生了抗弓形体的IgM抗体，它们是第4号和第6号幼鼠。
2.2-在免疫刺激后炎症反应的研究
在图8-A和8-B中分别显示了在免疫刺激后第9天进行的编码IFN-γ的基因和编码IL-12的基因的表达的定量PCR检验的结果。对照批次(A)的幼鼠在感染后第9天未发展出炎症反应(IL-12和IFN-γ的分泌)。相反地，在免疫刺激后9天，第4、5和6号幼鼠具有显著高于对照批次的幼鼠的IL-12表达(图8-B)。同样地，用株系Toxomic1-3 KO进行免疫刺激的批次的3只幼鼠中的两只具有显著高于对照批次的幼鼠的IFN-γ表达(图8-A)，它们是第4号和第6号幼鼠。
2.3-幼鼠的感染状态的研究
2.3.1-在HFF细胞上脾脏的散布
在表IX中举例说明了在HFF细胞上脾脏的散布。在用来自对照批次的幼鼠的脾脏进行感染的HFF细胞中未检测到任何裂解斑。相反地，用来自用株系Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激的幼鼠的脾脏研磨物进行感染的HFF细胞具有裂解斑，这证明了速殖子存在于脾脏范围内。
此外，在HFF细胞上的速殖子的组织散布技术是半定量技术，其显示用株系Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激的批次的幼鼠具有不同的感染状态。第4号和第6号幼鼠看起来是感染程度最大的，因为它们具有最大的在脾脏中的寄生虫数目，接着是第5号幼鼠，其在脾脏中具有少得多的寄生虫(表IX)。
表IX：在人成纤维细胞(HFF)上器官的散布的光学显微镜分析的小结。所观察到的速殖子源自用株系Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激的幼鼠的脾脏，并且当它们移殖建群至HFF细胞时形成裂解斑。
2.3.2-免疫组织学
在图9中图解说明了幼鼠的肠的免疫组织学切片。
对于对照批次的幼鼠，在免疫组织学切片上未观察到任何速殖子。
第4号(B)和第6号(D)和第5号(数据未显示)幼鼠各自的肠切片(其用抗鼠弓形体的兔多克隆抗体进行了免疫标记)使得能够显现仅对于第4号幼鼠存在株系Toxo mic1-3 KO的速殖子(白色点)。
2.3.3-PCR
在图10中显示了PCR的结果。从源自回肠研磨物的DNA样品开始扩增出鼠弓形体的基因SAG1表示了Toxo mic1-3 KO的速殖子的存在(1001bp的扩增片段)。对于在第3天(T1)或第9天(T2)处死的对照批次(NV)的幼鼠，该半定量技术显示不存在条带。
对于用株系Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激的幼鼠(V)，在感染后3天时未检测到任何相应于基因SAG1的条带。在第9天，3只幼鼠中的两只具有1001个碱基对的DNA条带，其证明存在Toxo mic1-3KO的速殖子。在第4号和第6号幼鼠之间所观察到的条带强度是明显不同的。由于条带强度与存在于肠中的寄生虫的数目成正比，因而在感染后9天时，第4号幼鼠在肠范围内具有比第6号幼鼠更多的寄生虫。这些结果确认了通过免疫组织学所作出的观察结果。
实施例5：通过腹膜内途径用突变体Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激的幼鼠的针对隐孢子虫病的保护作用
1-实验方案
1.1-动物
对于年龄为3天的C57BL/6幼鼠进行免疫刺激。在Nouzilly的INRA中心(Indre et Loire)获得和饲养这些幼鼠。在整个实验期间将幼鼠在具有封闭水平2的动物房中进行维持，以便最好地限制外部污染的风险。
1.2-小隐孢子虫
从用107个小隐孢子虫卵囊感染的小牛的排泄物中获得小隐孢子虫的卵囊。粪便经历各种不同的处理直至获得经纯化的、无菌的、能够被用于细胞培养的寄生虫悬浮液。卵囊的操作在整个处理期间在4℃下进行以避免卵囊脱囊。
简而言之，在回收粪便后，将它们在淡水中进行稀释，然后通过100μm的过滤器，并且在4℃下以1900g离心10分钟。将获得的包含卵囊的粒状沉淀接纳在2％的重铬酸钾溶液(Prolabo,参考号26776290,CAS 7778-50-9)中，然后通过在4℃下以1900g离心10分钟来用冷水洗涤两次以去除重铬酸钾。在洗涤后，将球虫的粒状沉淀接纳在稀释至1/5的水和醚(乙醚，Carlo Erba,CAS n°60-29-7)的混合物中，然后再次在4℃下以1900g离心10分钟。去除包含脂肪和醚的上部相，并且回收粒状沉淀并接纳在冷水中(在通过20μm的过滤器后)。将两至三毫升的所获得的寄生虫悬浮液放置在从Sheather溶液(500g蔗糖、320ml水、0.2g叠氮化钠(Prolabo,CAS26628-22-8))开始制备的葡萄糖梯度上。在4℃下使该葡萄糖梯度以2000g离心20分钟后，形成两个卵囊环。回收这两个环并在冷水中洗涤数次。然后，将经纯化的卵囊灭菌。在4℃下以1900g离心10分钟后，将卵囊的粒状沉淀于在去离子水中稀释至10％的爪维尔(Javel)水(次氯酸钠(Sigma 239305-500ML滴度:4.5％活性氯))的溶液之中温育15分钟，然后在无菌1X PBS(从10X PBS开始进行稀释的：80g/升水的氯化钠，NaCl；2g/升的氯化钾，KCl；2g/升的磷酸二氢钾，KH2PO4；29g/升的磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O)中洗涤3次。将经纯化和灭菌的卵囊在载玻片上进行计数(5μL的卵囊溶液和495μL的孔雀石绿)，调整至2×108个卵囊/mL的浓度，等分到1.5mL管中，并贮存于4℃。
1.3-株系Toxo mic1-3 KO
通过在人包皮成纤维细胞系(HFF)上的连续传代来维持其编码蛋白MIC1和MIC3的基因已被无效的鼠弓形体突变株(称为株系Toxo mic1-3 KO)，所述人包皮成纤维细胞系在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中进行培养。
1.4-免疫刺激
如下地处理年龄为3天的C57BL/6幼鼠的批次：
·7只幼鼠(批次1)接受突变体Toxo mic1-3 KO，
·7只幼鼠(批次2)用作未经疫苗接种的对照批次。
在第0天，批次1的幼鼠通过腹膜内途径接受20个株系Toxomic1-3 KO的速殖子。
在免疫刺激后第3天，用500,000个小隐孢子虫寄生虫攻击批次1和批次2的幼鼠。
在感染后第9天，处死批次1和2的幼鼠以用于评价针对小隐孢子虫的保护作用。
1.5-幼鼠的感染状态的研究
通过前面所描述的在HFF细胞上速殖子的组织散布技术来分析幼鼠的感染状态。在器官放置前一周，按照1×104个细胞/孔将HFF细胞放置到24-孔平板中。将细胞在1mL的补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM细胞培养基中进行培养。在处死幼鼠后，取出每只幼鼠的脾脏并在2mL 1X PBS中进行研磨。在每个包含于1mL培养基中进行培养的HFF细胞的孔中放置十微升的研磨物。在放置脾脏研磨物后24小时，用DMEM洗涤细胞，然后每孔放置1mL干净的培养基。让细胞进行培养直至检测到裂解斑，其揭示了Toxo mic1-3 KO的速殖子的存在。
1.6-保护作用的研究：
通过对在肠中的卵囊进行计数来实施幼鼠的针对小隐孢子虫的保护作用的分析。一旦处死了幼鼠，就将肠回收，称重，放入1mL水(4℃)中并研磨20秒。将一百微升的研磨物添加至处于4℃的400μL含糖溶液(500g以粉末形式的糖、320mL蒸馏水、0.02％的叠氮化钠)中。在通过用移液管吸吹来使溶液均质化后，将20μL放置在THOMA池上。在卵囊数目点计之前，将载玻片在阴凉处保持15分钟以允许在含糖溶液中卵囊上升至表面。在肠中卵囊的总数目通过下述公式来计算：在肠中小隐孢子虫卵囊的总数目＝在THOMA载玻片上计数出的卵囊的数目×稀释系数×10,000×(1+幼鼠的肠的重量)。
2-结果
2.1-幼鼠的感染状态的研究
通过关于小隐孢子虫和鼠弓形体而言的寄生虫血症来评价了幼鼠的感染状态。关于小隐孢子虫而言的寄生虫血症通过在幼鼠的肠中所计数出的小隐孢子虫卵囊的总数目来进行测定。关于鼠弓形体而言的寄生虫血症通过在HFF细胞上幼鼠脾脏的散布来进行评价。关于小隐孢子虫和鼠弓形体而言的寄生虫血症呈现在表X中。
表X：用小隐孢子虫进行感染的幼鼠的批次(经小隐孢子虫感染的)和用鼠弓形体进行接种并用小隐孢子虫进行感染的幼鼠的批次(经鼠弓形体接种的+小隐孢子虫)的所观察到的关于小隐孢子虫而言和关于鼠弓形体而言的寄生虫血症的概览：t，速殖子；NR，未告知数据。与关于鼠弓形体而言的寄生虫血症相关的数目相应于在脾脏散布后在20μL的经感染的HFF细胞的上清液中所计数出的速殖子的数目。
仅用小隐孢子虫进行感染的幼鼠具有在5×105和1×106个卵囊之间变化的在肠中小隐孢子虫卵囊的总数目。
用株系Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激然后用小隐孢子虫进行感染的幼鼠具有在不同幼鼠之间可变的鼠弓形体寄生虫血症。对于具有最重大的鼠弓形体寄生虫血症的第2、3和7号幼鼠，在肠中小隐孢子虫卵囊的总数目为5×104至3.3×105个卵囊。这些结果证明了在Toxomic1-3 KO的寄生虫血症与小隐孢子虫感染的减少之间所存在的相关性。
2.2-保护作用的研究
幼鼠的保护状态显示在图11中。
在通过腹膜内途径用突变体Toxo mic1-3 KO进行疫苗接种的幼鼠的批次中，7只幼鼠中的3只具有显著减少了大约62％至94％的在肠中小隐孢子虫卵囊的总数目。这三只幼鼠是第2号、第3号和第7号幼鼠，它们在该组的所有幼鼠中显示出最高的鼠弓形体寄生虫血症。实施例6：通过口服途径用突变体Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激的幼鼠的针对隐孢子虫病的保护作用
1-实验方案
1.1-动物
对于年龄为3天的C57BL/6幼鼠进行免疫刺激。在Nouzilly的INRA中心(Indre et Loire)获得和饲养这些幼鼠。在整个实验期间将幼鼠在具有封闭水平2的动物房中进行维持，以便最好地限制外部污染的风险。
1.2-小隐孢子虫
从用107个小隐孢子虫卵囊感染的小牛的排泄物中获得小隐孢子虫的卵囊。粪便经历各种不同的处理直至获得经纯化的、无菌的、能够被用于细胞培养的寄生虫悬浮液。卵囊的操作在整个处理期间在4℃下进行以避免卵囊脱囊。
简而言之，在回收粪便后，将它们在淡水中进行稀释，然后通过100μm的过滤器，并且在4℃下以1900g离心10分钟。将获得的包含卵囊的粒状沉淀接纳在2％的重铬酸钾溶液(Prolabo,参考号26776290,CAS 7778-50-9)中，然后通过在4℃下以1900g离心10分钟来用冷水洗涤两次以去除重铬酸钾。在洗涤后，将球虫的粒状沉淀接纳在稀释至1/5的水和醚(乙醚，Carlo Erba,CAS n°60-29-7)的混合物中，然后再次在4℃下以1900g离心10分钟。去除包含脂肪和醚的上部相，并且回收粒状沉淀并接纳在冷水中(在通过20μm的过滤器后)。将两至三毫升的所获得的寄生虫悬浮液放置在从Sheather溶液(500g蔗糖、320ml水、0.2g叠氮化钠(Prolabo,CAS26628-22-8))开始制备的葡萄糖梯度上。在4℃下使该葡萄糖梯度以2000g离心20分钟后，形成两个卵囊环。回收这两个环并在冷水中洗涤数次。然后，将经纯化的卵囊灭菌。在4℃下以1900g离心10分钟后，将卵囊的粒状沉淀于在去离子水中稀释至10％的爪维尔(Javel)水(次氯酸钠，Sigma 239305-500ML滴度:4.5％活性氯)的溶液之中温育15分钟，然后在无菌1X PBS(从10X PBS开始进行稀释的：80g/升水的氯化钠，NaCl；2g/升的氯化钾，KCl；2g/升的磷酸二氢钾，KH2PO4；29g/升的磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O)中洗涤3次。将经纯化和灭菌的卵囊在载玻片上进行计数(5μL的卵囊溶液和495μL的孔雀石绿)，调整至2×108个卵囊/mL的浓度，等分到1.5mL管中，并贮存于4℃。
1.3-株系Toxo mic1-3 KO
通过在人包皮成纤维细胞系(HFF)上的连续传代来维持其编码蛋白MIC1和MIC3的基因已被无效的鼠弓形体突变株(称为株系Toxo mic1-3 KO)，所述人包皮成纤维细胞系在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中进行培养。
1.4-免疫刺激
如下地处理年龄为3天的C57BL6幼鼠的批次：
·4只幼鼠(批次1)接受突变体Toxo mic1-3 KO，
·4只幼鼠(批次2)用作未经处理的对照批次。
在第0天，批次1的幼鼠通过口服途径接受20,000个株系Toxomic1-3 KO的速殖子。
在免疫刺激后第3天，用1,000,000个小隐孢子虫寄生虫攻击批次1和批次2的幼鼠。
在免疫刺激后第10天，处死批次1和2的幼鼠以用于评价针对小隐孢子虫的保护作用。
1.5-幼鼠的感染状态的研究
通过前面所描述的在HFF细胞上速殖子的组织散布技术来分析幼鼠的感染状态。在器官放置前一周，按照1×104个细胞/孔将HFF细胞放置到24-孔平板中。将细胞在1mL的补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM细胞培养基中进行培养。在处死幼鼠后，取出每只幼鼠的脾脏并在2mL 1X PBS中进行研磨。在每个包含于1mL培养基中进行培养的HFF细胞的孔中放置十微升的研磨物。在放置脾脏研磨物后24小时，用DMEM洗涤细胞，然后每孔放置1mL干净的培养基。让细胞进行培养直至检测到裂解斑，其揭示了Toxo mic1-3 KO的速殖子的存在。
1.6-保护作用的研究：
通过对在肠中的卵囊进行计数来实施幼鼠的针对小隐孢子虫的保护作用的分析。一旦处死了幼鼠，就将肠回收，称重，放入1mL水(4℃)中并研磨20秒。将一百微升的研磨物添加至处于4℃的400μL含糖溶液(500g蔗糖、320mL蒸馏水、0.02％的叠氮化钠)中。在通过用移液管吸吹来使溶液均质化后，将20μL放置在THOMA载玻片上。在卵囊数目点计之前，将载玻片在阴凉处保持15分钟以允许在含糖溶液中卵囊上升至表面。在肠中卵囊的总数目通过下述公式来计算：在肠中小隐孢子虫卵囊的总数目＝在THOMA载玻片上计数出的卵囊的数目×稀释系数×10,000×(1+幼鼠的肠的重量)。
2-结果
2.1-幼鼠的感染状态的研究
在HFF细胞上脾脏的散布
在表XI中举例说明了在HFF细胞上脾脏的散布。
表XI：用小隐孢子虫进行感染的幼鼠的批次(经小隐孢子虫感染的)和用Toxo mic1-3 KO进行接种并用小隐孢子虫进行感染的幼鼠的批次(经鼠弓形体接种的+小隐孢子虫)的所观察到的关于小隐孢子虫而言和关于鼠弓形体而言的寄生虫血症的概览。
仅用小隐孢子虫进行感染的幼鼠具有在1.4×106和2.4×106个卵囊之间变化的在肠中小隐孢子虫卵囊的总数目。
用Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激然后用小隐孢子虫进行感染的幼鼠具有半定量地估计的鼠弓形体寄生虫血症。对于具有强的鼠弓形体寄生虫血症的第1和2号幼鼠，在肠中小隐孢子虫卵囊的总数目为2.6×105至4.8×105个卵囊。这些结果证明了在鼠弓形体mic1-3 KO的寄生虫血症与小隐孢子虫感染的减少之间所存在的相关性。
2.2-保护作用的研究
幼鼠的保护状态显示在图12中。
在通过口服途径用突变体Toxo mic1-3 KO进行疫苗接种的幼鼠的批次中，4只幼鼠中的两只具有显著减少了大约75％和87％的在肠中小隐孢子虫卵囊的总数目。它们是第1号和第2号幼鼠。
实施例7：在用突变体Toxo mic1-3 KO进行刺激后，来自成年或新生绵羊的脾细胞的IL-12和IFN-γ分泌的诱导和MLN细胞的IL-12分泌的诱导
1-实验方案
1.1-动物
在该实验过程中所使用的新生受试动物的肠系膜淋巴结和脾脏来自年龄为6-12天的法兰西岛品种的羔羊。直至处死，将羔羊与其母亲一起在密闭的羊舍(INRA-Nouzilly)中进行维持以便限制天然污染的风险。将它们通过电麻醉来进行麻醉，然后使其安乐死以收集各种不同的器官。仅配备有羊舍内部服装的动物饲养人员和实验者可以进入建筑物以避免环境污染，并且他们在进行淋浴后才可离开密闭区。所使用的器具和生物学材料在通过消毒浴后才可拿出，并且将粪水焚化。
在该实验过程中所使用的成年受试动物的肠系膜淋巴结和脾脏来自年龄为1至3年的法兰西岛品种的成年绵羊。
1.2-鼠弓形体株系
通过在人包皮成纤维细胞系(HFF)上的连续传代来维持野生株RH和Pru以及突变株Toxo mic1-3 KO，所述人包皮成纤维细胞系在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中进行培养。
1.3-目的细胞的分离
1.3.1-肠系膜淋巴结细胞
在使动物安乐死后尽可能快地取出肠系膜淋巴结，并转移入包含培养基(补充有2％胎牛血清(FCS)和1％青霉素/链霉素(P/S)的HBSS)的无菌取样管中。将包含样品的取样管保存在冰中直至到达研究实验室。
借助于事先经灭菌的镊子、剪刀或解剖刀将每个淋巴结除去脂肪。然后，将淋巴结放置在置于包含10mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的无菌培养皿底部的3cm×3cm的无菌(经高压灭菌的)尼龙布上。借助于5mL注射器的活塞来压破和撕碎淋巴结，以释放出包含在淋巴结中的细胞。将因此富含细胞的培养基借助于位于50mL管上面的60μm的无菌尼龙布来进行过滤，以回收富含经过滤的细胞的培养基。将这些最后的几个步骤如下地重做两次：在剩下的淋巴结碎块上添加10mL培养基。如前面所描述的那样，将淋巴结碎块压破、撕碎和过滤。将回收了富含细胞并经过滤的培养基的50mL管在4℃下以1600g离心15分钟。通过在4℃下以400g离心10分钟来用50mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)进行洗涤。在环境温度下，在两个50mL管中，将如此获得的粒状沉淀重悬浮在90mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的最终体积中。
将90mL的细胞悬浮液分成3份，以用于在Ficoll-Hypaque梯度中进行纯化。在每个包含15mL Ficoll-Hypaque的管中(总共3个管)小心地放置入30mL。将这3个富含细胞悬浮液的Ficoll-Hypaque管在环境温度下以1500g无制动地(减速2，加速5)离心30分钟。对于每个Ficoll-Hypaque管，获得由细胞碎片组成的上部相、位于细胞碎片与Ficoll相之间的界面处的由单核细胞组成的环和最后由红血球组成的下部相。回收这3个环(20mL/管)，并且将其分在两个50mL管中并用50mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的最终体积以700g洗涤10分钟。汇集所获得的单核细胞的粒状沉淀。通过以400g离心10分钟来用50mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)洗涤最终的粒状沉淀。将粒状沉淀接纳在5mL的RPMI，10％FCS，1％P/S，5×10-5Mβ-巯基乙醇中。将单核细胞保存在冰中，将一部分细胞用于进行计数和使用锥虫蓝的生存力观察(稀释至1/100的样品)。一旦计完数，就将细胞按照3×105个细胞/孔分配在96-孔平板中。
1.3.2-脾细胞的分离
在安乐死后尽可能快地取出脾脏并转移入包含培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的无菌取样管中。将包含样品的取样管保存在冰中直至到达研究实验室。
借助于事先经灭菌的镊子、剪刀或解剖刀将每个脾脏除去脂肪。然后，将脾脏放置在置于包含10mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的无菌培养皿底部的(经高压灭菌的)金属栅格上。借助于5mL注射器的活塞来压破和撕碎脾脏，以释放出包含在脾脏中的细胞。将因此富含细胞的培养基放置到50mL管中。将这些最后的几个步骤如下地重做两次：在脾脏碎块上添加5mL培养基。如前面所描述的那样，将脾脏碎块压破、撕碎。让回收了富含细胞的培养基的50mL管在4℃下沉降5分钟。在处于50mL管上面的60μm的尼龙布上过滤上清液。在剩下的沉降物上添加十毫升的培养基，并以相同的方式回收第二次上清液。将回收了两次上清液的50mL管在4℃下以400g离心30秒。回收上清液并在处于50mL管上面的60μm的无菌尼龙布上进行过滤。将该最后一个管在4℃下以400g离心10分钟。将如此获得的细胞粒状沉淀重悬浮在50mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的最终体积中。通过在4℃下以400g离心10分钟来进行洗涤。然后，在环境温度下，在3个具有50mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的管中，将粒状沉淀接纳在120mL的最终体积中。
将120mL的细胞悬浮液分成3份，以用于在Ficoll-Hypaque梯度中进行纯化。在每个包含15mL Ficoll-Hypaque的管中(总共4个管)小心地放置入30mL。将这4个富含细胞悬浮液的Ficoll-Hypaque管在环境温度下以1500g无制动地(减速2，加速5)离心30分钟。对于每个Ficoll-Hypaque管，获得由细胞碎片组成的上部相、位于细胞碎片与Ficoll相之间的界面处的由单核细胞组成的环和最后由红血球组成的下部相。回收这4个环(20mL/管)，并且将其分在三个50mL管中并用50mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的最终体积以700g洗涤10分钟。汇集所获得的单核细胞的粒状沉淀。通过以400g离心10分钟来用50mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)洗涤最终的粒状沉淀。将粒状沉淀接纳在5mL的RPMI，10％FCS，1％P/S，5×10-5Mβ-巯基乙醇中。将单核细胞保存在冰中，将一部分细胞用于进行计数和使用锥虫蓝的生存力观察(稀释至1/100的样品)。一旦计完数，就将细胞按照3×105个细胞/孔分配在96-孔平板中。
1.4-羔羊的肠系膜淋巴结单核细胞和脾细胞的刺激
一旦计完数，就将细胞按照3×105个细胞/孔分配在96-孔平板中。还将速殖子在Malassey载玻片上进行计数，形成粒状沉淀，并接纳在RPMI培养基，10％FCS，1％P/S中。调整速殖子(RH或KO)的溶液以获得3×106个速殖子/mL的浓度。刺激条件如下：3个单核细胞由一个速殖子来进行刺激。将寄生虫、淋巴结单核细胞和脾脏单核细胞在37℃下在具有5％CO2和95％湿度的恒温箱中进行培养。
在刺激后24小时，抽取淋巴结单核细胞的上清液和脾脏单核细胞的上清液，以用于通过ELISA技术来测定白介素-12和IFN-γ的含量。
1.5-通过ELISA技术来测定白介素-12的含量
用于测定白介素-12的含量的技术为在96-孔平板上的“夹心”类型的ELISA。固定在平板上的抗体(抗-IL-12)与存在于待测试的样品中的IL-12特异地反应。接着，在其与偶联至酶的具有相同特异性的抗体反应后，测量“抗原-抗体”的量。
各种不同试剂的所有稀释都在1X PBS，0.05％Tween 20和1％BSA中进行，除了对于捕获抗体外，其稀释在1X PBS中进行。
将50μL/孔的稀释至1/500的捕获抗体(小鼠抗牛白介素-12克隆CC 301,Serotec MCA1782EL,起始浓度：1000μg/mL)放置到ELISA平板(ELISA平板，Nunc maxisorp 442404)中，然后在4℃下温育过夜。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行三次洗涤。通过在环境温度下用200μL 1X PBS溶液，0.05％Tween20，1％BSA将平板温育1小时来饱和非特异性位点。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行三次洗涤。
如下地来制备系列阶点：以各种不同的浓度放置50μL的rovIL-12的标准系列阶点：16U/mL；8U/mL；4U/mL；2U/mL；1U/mL；0.5U/mL；0.25U/mL；0.125U/mL；0.0625U/mL；0.03125U/mL。平行地，按照50μL/孔放置样品(经刺激的单核细胞的上清液，经1/2稀释的)。将样品和标准系列阶点在环境温度下温育1小时。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行4次洗涤。
每孔放置50μL的稀释至1/500的经生物素化的检测抗体(小鼠抗牛白介素-12:生物素克隆CC 326(Serotec MCA2173B),起始浓度：500μg/ml)，在环境温度下持续一小时的温育时间。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行一系列的4次洗涤。
IL-12的揭示通过生物素亲和反应以及随后的在过氧化物酶与其底物之间的比色反应来进行：每孔放置50μL的稀释至1/2000的与过氧化物酶相偶联的经修饰的抗生物素蛋白(ExtrAvidine-过氧化物酶缀合(Sigma E2886))，并且在环境温度下温育20分钟。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行一系列的4次洗涤。借助于50μL/孔的过氧化物酶底物来进行揭示，所述过氧化物酶底物来自等体积混合的溶液A和B(TMB过氧化物酶底物Eurobio KPL溶液A 50-76-01和溶液B 50-65-00)。将底物溶液在环境温度下温育15分钟。在化学通风橱下每孔添加50μL的终止溶液(1M磷酸，sigma 43,080-1,CAS 7664-38-2)。
在波长λ＝450nm下进行平板的阅读。通过下述函数来测定标准曲线：随重组IL-12的浓度而变的OD值。使用标准曲线将所测得的样品的OD值转化为浓度。为了能够被考虑，样品应当给出处于标准曲线的线性部分中的OD。
1.6-通过ELISA技术来测定干扰素γ的含量
用于测定干扰素的含量的技术为在96-孔平板上的“夹心”类型的ELISA，其与在前一节中所描述的白介素-12的含量测定相当。固定在平板上的抗体(抗-IFNγ)与存在于待测试的样品中的IFNγ特异地反应。接着，在其与偶联至酶的具有相同特异性的抗体反应后，测量“抗原-抗体”的量。
各种不同试剂的所有稀释都在1X PBS，0.05％Tween 20和1％BSA中进行，除了对于捕获抗体外，其稀释在1X PBS中进行。
将50μl/孔的稀释至1/500的捕获抗体(小鼠抗牛干扰素γ克隆CC 330,Serotec MCA2112,起始浓度：1000μg/mL)放置到ELISA平板(ELISA平板，Nunc maxisorp 442404)中，然后在4℃下温育过夜。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行三次洗涤。通过在环境温度下用200μL 1X PBS溶液，0.05％Tween20，1％BSA将平板温育1小时来饱和非特异性位点。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行三次洗涤。
如下地来制备系列阶点：以各种不同的浓度放置50μL的重组牛IFNγ(Perbio Endogen robIFNGγ,起始浓度：30μg/ml)的标准系列阶点：4ng/mL；2ng/mL；1ng/mL；0.5ng/mL；0.25ng/mL；0.125ng/mL；0.0625ng/mL；0.03125ng/mL；0.015ng/ml。平行地，按照50μL/孔放置样品(经刺激的单核细胞的上清液，经1/2稀释的)。将样品和标准系列阶点在环境温度下温育1小时。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行4次洗涤。
每孔放置50μL的稀释至1/500的经生物素化的检测抗体(小鼠抗牛干扰素γ:生物素克隆CC 302(Serotec MCA1783B),起始浓度：500μg/ml)，在环境温度下持续一小时的温育时间。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行一系列的4次洗涤。
IFNγ的揭示通过生物素亲和反应以及随后的在过氧化物酶与其底物之间的比色反应来进行：每孔放置50μL的稀释至1/2000的与过氧化物酶相偶联的经修饰的抗生物素蛋白(ExtrAvidine-过氧化物酶缀合(Sigma E2886))，并且在环境温度下温育20分钟。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行一系列的4次洗涤。借助于50μL/孔的过氧化物酶底物来进行揭示，所述过氧化物酶底物来自等体积混合的溶液A和B(TMB过氧化物酶底物Eurobio KPL溶液A 50-76-01和溶液B 50-65-00)。将底物溶液在环境温度下温育15分钟。在化学通风橱下每孔添加50μL的终止溶液(1M磷酸，sigma 43,080-1,CAS 7664-38-2)。
在波长λ＝450nm下进行平板的阅读。通过下述函数来测定标准曲线：随重组IFNγ的浓度而变的OD值。使用标准曲线将所测得的样品的OD值转化为浓度。为了能够被考虑，样品应当给出处于标准曲线的线性部分中的OD。
2-结果
在图13-A、13-B和13-C中显示了由脾脏单核细胞所分泌的IL-12和IFN-γ的含量和由肠系膜淋巴结(MLN)单核细胞所分泌的IL-12的含量，所述脾脏单核细胞和肠系膜淋巴结单核细胞分离自年龄为6至12天的羔羊和年龄为1至3年的成年绵羊(它们用各种不同的寄生虫鼠弓形体株系进行刺激)。
在年龄为1至3年的绵羊中，当其在体外用鼠弓形体的突变株Toxo mic1-3 KO或者用鼠弓形体的野生株Pru和RH进行刺激时，由源自脾脏或肠系膜淋巴结的单核细胞来进行的IL-12产生是更高的。该观察结果在来自成年绵羊肠系膜淋巴结的细胞的情况下更明显。
在年龄为6至12天的羔羊中，当其在体外用寄生虫鼠弓形体进行刺激时，由源自脾脏或肠系膜淋巴结的单核细胞来进行的IL-12产生是更高的。当单核细胞在体外用突变株Toxo mic1-3 KO进行刺激时，IL-12的产生更加高。
在年龄为1至3年的绵羊中，当其在体外用鼠弓形体的突变株mic1-3 KO或者用鼠弓形体的野生株Pru和RH进行刺激时，由源自脾脏的单核细胞来进行的IFNγ产生不具有显著差异。
在年龄为6至12天的羔羊中，当其在体外用鼠弓形体的突变株mic1-3 KO或者用鼠弓形体的野生株Pru和RH进行刺激时，由源自脾脏的单核细胞来进行的IFNγ产生不具有显著差异。
由源自羔羊的单核细胞来进行的IL-12和IFN-γ产生比对于源自成年绵羊的单核细胞所观察到的那种高得多。
实施例8：用鼠弓形体突变体Toxo mic1-3 KO对新生羔羊进行的免疫刺激
1-实验方案
1.1-动物
所述免疫刺激在年龄为1天的新生羔羊上进行。在摄入初乳后，在密闭的羊舍(INRA-Nouzilly)中将羔羊与其母亲隔离以便限制天然污染的风险。将它们通过电麻醉来进行麻醉，然后使其安乐死以收集各种不同的器官。仅配备有羊舍内部服装的动物饲养人员和实验者可以进入建筑物以避免环境污染，并且他们在进行淋浴后才可离开密闭区。
1.2-株系Toxo mic1-3 KO
通过在人包皮成纤维细胞系(HFF)上的连续传代来维持其编码蛋白MIC1和MIC3的基因已被无效的鼠弓形体突变株(称为株系Toxo mic1-3 KO)，所述人包皮成纤维细胞系在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中进行培养。
1.3-免疫刺激
如下地处理年龄为一天的六只羔羊：
·4只羔羊(批次A)接受突变体Toxo mic1-3 KO，
·2只羔羊(批次B)用作未经疫苗接种的对照批次。
在第1天，批次A的羔羊通过皮下途径接受106个株系Toxomic1-3 KO的速殖子。在免疫刺激后，每日记录羔羊的体温和重量。
在免疫刺激后第15天，使羔羊安乐死以用于研究免疫应答和寄生虫血症。
1.4-目的细胞的分离
1.4.1-脾细胞的分离
在安乐死后尽可能快地取出脾脏并转移入包含培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的无菌取样管中。将包含样品的取样管保存在冰中直至到达研究实验室。
借助于事先经灭菌的镊子、剪刀或解剖刀将每个脾脏除去脂肪。然后，将脾脏放置在置于包含10mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的无菌培养皿底部的(经高压灭菌的)金属栅格上。借助于5mL注射器的活塞来压破和撕碎脾脏，以释放出包含在脾脏中的细胞。将因此富含细胞的培养基放置到50mL管中。将这些最后的几个步骤如下地重做两次：在脾脏碎块上添加5mL培养基。如前面所描述的那样，将脾脏碎块压破、撕碎。让回收了富含细胞的培养基的50mL管在4℃下沉降5分钟。在处于50mL管上面的60μm的尼龙布上过滤上清液。在剩下的沉降物上添加十毫升的培养基，并以相同的方式回收第二次上清液。将回收了两次上清液的50mL管在4℃下以400g离心30秒。回收上清液并在处于50mL管上面的60μm的无菌尼龙布上进行过滤。将该最后一个管在4℃下以400g离心10分钟。将如此获得的细胞粒状沉淀重悬浮在50mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的最终体积中。通过在4℃下以400g离心10分钟来进行洗涤。然后，在环境温度下，在3个具有50mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的管中，将粒状沉淀接纳在120mL的最终体积中。
将120mL的细胞悬浮液分成3份，以用于在Ficoll-Hypaque梯度中进行纯化。在每个包含15mL Ficoll-Hypaque的管中(总共4个管)小心地放置入30mL。将这4个富含细胞悬浮液的Ficoll-Hypaque管在环境温度下以1500g无制动地(减速2，加速5)离心30分钟。对于每个Ficoll-Hypaque管，获得由细胞碎片组成的上部相、位于细胞碎片与Ficoll相之间的界面处的由单核细胞组成的环和最后由红血球组成的下部相。回收这4个环(20mL/管)，并且将其分在三个50mL管中并用50mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的最终体积以700g洗涤10分钟。汇集所获得的单核细胞的粒状沉淀。通过以400g离心10分钟来用50mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)洗涤最终的粒状沉淀。将粒状沉淀接纳在5mL的RPMI，10％FCS，1％P/S，5×10-5Mβ-巯基乙醇中。将单核细胞保存在冰中，将一部分细胞用于进行计数和使用锥虫蓝的生存力观察(稀释至1/100的样品)。一旦计完数，就将细胞按照3×105个细胞/孔分配在96-孔平板中。
1.4.2-淋巴结细胞的分离
在使动物安乐死后尽可能快地取出位于注射位点附近的腘淋巴结和髂骨下淋巴结，并转移入包含培养基(补充有2％胎牛血清(FCS)和1％青霉素/链霉素(P/S)的HBSS)的无菌取样管中。将包含样品的取样管保存在冰中直至到达研究实验室。
借助于事先经灭菌的镊子、剪刀或解剖刀将每个淋巴结除去脂肪。然后，将淋巴结放置在置于包含10ml培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)的无菌培养皿底部的3cm×3cm的无菌(经高压灭菌的)尼龙布上。借助于5mL注射器的活塞来压破和撕碎淋巴结，以释放出包含在淋巴结中的细胞。将因此富含细胞的培养基借助于位于50mL管上面的60μm的无菌尼龙布来进行过滤，以回收富含经过滤的细胞的培养基。将这些最后的几个步骤如下地重做两次：在剩下的淋巴结碎块上添加10mL培养基。如前面所描述的那样，将淋巴结碎块压破、撕碎和过滤。将回收了富含细胞并经过滤的培养基的50mL管在4℃下以1600g离心15分钟。通过在4℃下以400g离心10分钟来用50mL培养基(HBSS；2％FCS；1％P/S)进行洗涤。将粒状沉淀接纳在5mL RPMI，10％FCS，1％P/S，5.10-5Mβ-巯基乙醇中。将粒状沉淀保存在冰中，将一部分细胞用于进行计数和使用锥虫蓝的生存力观察(稀释至1/100的样品)。一旦计完数，就将细胞按照3×105个细胞/孔分配在96-孔平板中。
1.5-在免疫刺激后炎症反应的研究
1.5.1-从脾细胞开始
一旦将脾脏单核细胞通过Ficoll Histopaque梯度进行了分离并按照3×105个细胞/孔分配在96-孔平板中，就将这些单核细胞在体外用30μg/ml的株系Toxo mic1-3 KO的总寄生虫提取物进行刺激。为了建立实验的阳性对照，将细胞用伴刀豆球蛋白A进行刺激。相反地，为了建立实验的阴性对照，将细胞在没有刺激剂的培养基中进行培养。在体外刺激后24小时之后，抽取上清液。
用于测定IFNγ的含量的技术为在96-孔平板上的“夹心”类型的ELISA。固定在平板上的抗体(抗-IFNγ)与存在于待测试的样品中的IFNγ特异地反应。接着，在其与偶联至酶的具有相同特异性的抗体反应后，测量“抗原-抗体”的量。
各种不同试剂的所有稀释都在1X PBS，0.05％Tween 20和1％BSA中进行，除了对于捕获抗体外，其稀释在1X PBS中进行。
将50μL/孔的稀释至1/500的捕获抗体(小鼠抗牛IFNγ克隆CC330,Serotec MCA2112,起始浓度：1000μg/mL)放置到ELISA平板(ELISA平板，Nunc maxisorp 442404)中，然后在4℃下温育过夜。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行三次洗涤。通过在环境温度下用200μL 1X PBS溶液，0.05％Tween 20，1％BSA将平板温育1小时来饱和非特异性位点。在添加有0.05％Tween20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行三次洗涤。
如下地来制备系列阶点：以各种不同的浓度放置50μL的rboIFNγ的标准系列阶点：4ng/mL；2ng/mL；1ng/mL；0.5ng/mL；0.25ng/mL；0.125ng/mL；0.0625ng/mL；0.03125ng/mL；0.015ng/mL。平行地，按照50μL/孔放置样品(经刺激的单核细胞的上清液)。将样品和标准系列阶点在环境温度下温育1小时。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行4次洗涤。
每孔放置50μL的稀释至1/500的经生物素化的检测抗体(小鼠抗牛IFNγ:生物素克隆CC 302(Serotec MCA1783B),起始浓度：500μg/ml)，在环境温度下持续一小时的温育时间。在添加有0.05％Tween20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行一系列的4次洗涤。
IFNγ的揭示通过生物素亲和反应以及随后的在过氧化物酶与其底物之间的比色反应来进行：每孔放置50μL的稀释至1/2000的与过氧化物酶相偶联的经修饰的抗生物素蛋白(ExtrAvidine-过氧化物酶缀合(Sigma E2886))的溶液，并且在环境温度下温育20分钟。在添加有0.05％Tween 20的1X PBS缓冲液(PBS-T)中进行一系列的4次洗涤。借助于50μL/孔的过氧化物酶底物来进行揭示，所述过氧化物酶底物来自等体积混合的溶液A和B(TMB过氧化物酶底物Eurobio KPL溶液A 50-76-01和溶液B 50-65-00)。将底物溶液在环境温度下温育15分钟。在化学通风橱下每孔添加50μL的终止溶液(1M磷酸，sigma 43,080-1,CAS 7664-38-2)。
在波长λ＝450nm下进行平板的阅读。通过下述函数来测定标准曲线：随重组IFNγ的浓度而变的OD值。使用标准曲线将所测得的样品的OD值转化为浓度。为了能够被考虑，样品应当给出处于标准曲线的线性部分中的OD。
1.5.2-从淋巴结细胞开始
将按照3×105个细胞/孔分配在96-孔平板中的淋巴结细胞在没有任何刺激剂的情况下进行培养，以便检测离体的细胞因子表达。在24小时之后抽取淋巴结细胞的上清液。通过上面所描述的ELISA技术来测定IFNγ的含量。
2-结果
2.1-实验的展开
在摄入初乳后，将羔羊与其母亲分开并用料斗式给料器系统进行喂养。将批次A的4只羔羊用新近产生的106个株系Toxo mic1-3 KO的速殖子进行免疫刺激。在接种了株系Toxo mic1-3 KO后，未看到任何严重的临床征候并且用株系Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激的羔羊具有与对照羔羊的体重增加类似的重量曲线(图14)。
在免疫刺激后15天时，使批次A和批次B的羔羊安乐死。
2.2-在免疫刺激后炎症反应的研究
在图15和16中呈现了从用鼠弓形体的总提取物再刺激的脾细胞开始和从髂骨下和腘淋巴结的细胞开始产生的IFN-γ的含量测定的结果。
对照组的羔羊(1423和1428)既未在脾脏范围内也未在髂骨下和腘淋巴结范围内发展出炎症反应(IFN-γ分泌)。
相反地，在免疫刺激后15天时，4只羔羊中的3只的髂骨下淋巴结细胞产生了IFN-γ。这些淋巴结位于注射位点下游，这与位于上游的腘淋巴结相反，对于所述腘淋巴结，我们未检测到IFN-γ的产生。
在用株系Toxo mic1-3 KO的总寄生虫提取物对脾细胞进行再刺激后确认了用株系Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激的羔羊的炎症反应，因为对于所述4只羔羊，我们诱导了IFN-γ的产生。还用伴刀豆球蛋白A刺激了脾细胞，所述伴刀豆球蛋白A是凝集素家族的蛋白质，其已知是T淋巴细胞的多克隆激活剂并且用作免疫细胞的刺激的阳性对照。
实施例9：通过皮下途径用突变体Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激的羔羊的针对隐孢子虫病的保护作用
1-实验方案
1.1-动物
所述免疫刺激在年龄为1天的新生羔羊上进行。在摄入初乳后，在密闭的羊舍(INRA-Nouzilly)中将羔羊与其母亲隔离以便限制天然污染的风险。
在实验结束时，将羔羊通过电麻醉来进行麻醉，然后使其安乐死以收集各种不同的器官。仅配备有羊舍内部服装的动物饲养人员和实验者可以进入建筑物以避免环境污染，并且他们在进行淋浴后才可离开密闭区。
1.2-小隐孢子虫
从用107个小隐孢子虫卵囊感染的小牛的排泄物中获得小隐孢子虫的卵囊。粪便经历各种不同的处理直至获得经纯化的、无菌的、能够被用于细胞培养的寄生虫悬浮液。卵囊的操作在整个处理期间在4℃下进行以避免卵囊脱囊。
简而言之，在回收粪便后，将它们在淡水中进行稀释，然后通过100μm的过滤器，并且在4℃下以1900g离心10分钟。将获得的包含卵囊的粒状沉淀接纳在2％的重铬酸钾溶液(Prolabo,参考号26776290,CAS 7778-50-9)中，然后通过在4℃下以1900g离心10分钟来用冷水洗涤两次以去除重铬酸钾。在洗涤后，将球虫的粒状沉淀接纳在稀释至1/5的水和醚(乙醚，Carlo Erba,CAS n°60-29-7)的混合物中，然后再次在4℃下以1900g离心10分钟。去除包含脂肪和醚的上部相，并且回收粒状沉淀并接纳在冷水中(在通过20μm的过滤器后)。将两至三毫升的所获得的寄生虫悬浮液放置在从Sheather溶液(500g蔗糖、320ml水、0.2g叠氮化钠(Prolabo,CAS26628-22-8))开始制备的葡萄糖梯度上。在4℃下使该葡萄糖梯度以2000g离心20分钟后，形成两个卵囊环。回收这两个环并在冷水中洗涤数次。然后，将经纯化的卵囊灭菌。在4℃下以1900g离心10分钟后，将卵囊的粒状沉淀于在去离子水中稀释至10％的爪维尔(Javel)水(次氯酸钠(Sigma 239305-500ML滴度:4.5％活性氯))的溶液之中温育15分钟，然后在无菌1X PBS(从10X PBS开始进行稀释的：80g/升水的氯化钠，NaCl；2g/升的氯化钾，KCl；2g/升的磷酸二氢钾，KH2PO4；29g/升的磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O)中洗涤3次。将经纯化和灭菌的卵囊在载玻片上进行计数(5μL的卵囊溶液和495μL的孔雀石绿)，调整至2×108个卵囊/mL的浓度，等分到1.5mL管中，并贮存于4℃。
1.3-株系Toxo mic1-3 KO
通过在人包皮成纤维细胞系(HFF)上的连续传代来维持其编码蛋白TgMIC1和TgMIC3的基因已被无效的鼠弓形体突变株(称为株系Toxo mic1-3 KO)，所述人包皮成纤维细胞系在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中进行培养。
1.4-免疫刺激
如下地处理两个批次的年龄为1天的雄性羔羊：
·8只羔羊(批次A)用作未经疫苗接种的对照批次，
·8只羔羊(批次B)接受突变体Toxo mic1-3 KO。
在第1天，批次B的羔羊通过腹膜内途径接受106个株系Toxomic1-3 KO的速殖子。
在感染后第7天，用5×106个小隐孢子虫卵囊攻击批次A和批次B的羔羊，并且在第31天处死羔羊。
1.5-保护作用的研究
为了分析通过用株系Toxo mic1-3 KO进行免疫刺激而产生的保护作用，研究了3个参数：
●存活率-死亡率
在用小隐孢子虫进行攻击后，在25天的持续时间期间(直至第31天)每日对羔羊进行监测。
●体重增加
每2-3天给批次A和批次B的羔羊称重以便评价其体重增加。
●卵囊的排出
从第9天至第22天每日回收羔羊的粪便并贮存于+4℃。在称重后，将26mg粪便材料在750μL水中进行稀释。添加4mL蔗糖溶液。在均质化后，将20μL放置在Thoma载玻片上并对卵囊进行计数。然后，用下述公式来计算所排出的卵囊的数目：N＝n×10,000×20(N：卵囊数目/g或/ml，n＝在池上计数出的卵囊的数目，20＝稀释度1/4×1/5)。
2-结果
2.1-实验的展开
在摄入初乳后，将羔羊与其母亲分开并用料斗式给料器系统进行喂养。批次B的3只羔羊和批次A的1只羔羊未成功进行适当喂养，并已被安乐死。由于所述安乐死在感染性攻击之前发生，因此在统计学上将这些动物从实验方案中移除。
2.2-保护作用的研究
●存活率-死亡率
由于小隐孢子虫感染，基本上对照批次(批次A)的四只羔羊被安乐死，这与经免疫刺激的批次(批次B)相反，在所述经免疫刺激的批次中没有任何羔羊在小隐孢子虫感染之后死亡(图17)。
●体重增加
在图18中呈现了批次A和批次B的羔羊的日重量增益(GMQ)。对于仅用小隐孢子虫进行攻击的批次A我们看到比对于用株系Toxomic1-3 KO进行免疫刺激且然后用小隐孢子虫进行攻击的批次B显著更低的GMQ。
●卵囊的排出
在羔羊排泄物中寄生虫载量的分析显示了对于用株系Toxomic1-3 KO进行免疫刺激的批次来说的一天的排出峰的变动，其中在小隐孢子虫感染后5天时观察到平均排出峰的70％的下降，相比于对于仅用小隐孢子虫进行攻击的对照批次来说在小隐孢子虫感染后4天时所观察到的平均排出峰而言(图19)。

Claims (15)

1.从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其用于在新生哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用。
2.用于根据权利要求1所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其中所述哺乳动物为人类或动物。
3.用于根据权利要求2所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其中所述动物属于包括下列或由下列组成的组：绵羊、山羊、猪、牛、马科动物、骆驼科动物、犬科动物或猫科动物。
4.用于根据权利要求1至3中任一项所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其中所述弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系至少具有通过涉及基因mic-1和/或mic-3中的至少一个的遗传修饰而失活的粘附素MIC-1和/或粘附素MIC-3。
5.用于根据权利要求1至3中任一项所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其中所述弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系具有通过涉及mic-1和mic-3这两个基因的遗传修饰而失活的MIC-1和MIC-3这两种粘附素。
6.用于根据权利要求4或5所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其中所述弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系分别为鼠弓形体(Toxoplasma gondii)或犬新孢子虫(Neospora caninum)。
7.用于根据权利要求1至6中任一项所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其中所述株系的免疫刺激效应导致白介素-12(IL-12)的分泌，随后为干扰素-γ(IFN-γ)的分泌。
8.用于根据权利要求7所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其中白介素-12(IL-12)和干扰素-γ(IFN-γ)的分泌在使用所述弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系作为免疫刺激剂后3至9天开始。
9.用于根据权利要求1至8中任一项所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其中所述与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况为隐孢子虫病。
10.用于根据权利要求9所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其中所述对隐孢子虫病负有责任的隐孢子虫科的顶复门动物为至少一种从由下列组成的组中选择的顶复门动物：小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、牛隐孢子虫(Cryptosporidium bovis)、安德森氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)、赖安氏隐孢子虫(Cryptosporidium ryanae)、鼠隐孢子虫(Cryptosporidium muris)、普遍隐孢子虫(Cryptosporidium ubiquitum)、人隐孢子虫(Cryptosporidium hominis)、犬隐孢子虫(Cryptosporidium canis)、猫隐孢子虫(Cryptosporidium felis)、贝利氏隐孢子虫(Cryptosporidiumbaileyi)、火鸡隐孢子虫(Cryptosporidium meleagridis)或肖氏隐孢子虫(Cryptosporidium xiaoi)。
11.用于根据权利要求6所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的鼠弓形体或犬新孢子虫株系，所述鼠弓形体或犬新孢子虫株系具有通过涉及mic-1和mic-3这两个基因的遗传修饰而失活的MIC-1和MIC-3这两种粘附素，其中所述与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况为隐孢子虫病。
12.从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的鼠弓形体或犬新孢子虫株系，其用于在哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用，所述鼠弓形体或犬新孢子虫株系具有通过涉及mic-1和mic-3这两个基因的遗传修饰而失活的MIC-1和MIC-3这两种粘附素，并且所述与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况为隐孢子虫病。
13.用于根据权利要求6所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的鼠弓形体或犬新孢子虫株系，所述鼠弓形体或犬新孢子虫株系具有通过涉及mic-1和mic-3这两个基因的遗传修饰而失活的MIC-1和MIC-3这两种粘附素，其中按照20至109个速殖子向所述哺乳动物施用所述鼠弓形体或犬新孢子虫株系。
14.用于根据权利要求1至12中任一项所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其中所述株系以从包括下列或由下列组成的组中选择的盖仑氏形式存在：液体悬浮体、固体或液体分散体、粉剂、糊剂或冻干物。
15.用于根据权利要求1至14中任一项所述的用途的从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其中所述株系与至少一种其他抗原、或至少一种佐剂、或至少一种稳定剂、或至少一种防腐剂或者至少两种所述产品的混合物相联合，从而使得能够增强所述哺乳动物的免疫应答。
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