CN104810230B - 相关光学和带电粒子显微镜 - Google Patents

Abstract

相关光学和带电粒子显微镜。本发明涉及装配有TEM柱和光显微镜（10）的相关光和电子显微镜（CLEM），所述光显微镜安装在TEM的物镜的极靴（8A、8B）之间。为了扩大针对增强的灵敏度的接受立体角而使用截短的透镜。应注意的是这并不意味着透镜示出像散（其并不是圆筒形透镜）。本发明还教导在样本（1）处于第一方向上的情况下使用光显微镜来制作第一图像。由于两个方向（312_x，312_y）上的透镜的不同NA，此图像将在一个方向上示出比在与之垂直的方向上更高的（衍射限制）分辨率。通过使样本旋转并制作第二图像，可以形成与在其中其示出低NA的方向上的图像中的任一个相比示出更好分辨率的组合图像。

Description

相关光学和带电粒子显微镜

技术领域

本发明涉及一种被装配成执行相关光学显微术和带电粒子显微术的装置，该装置包括：

· 带电粒子柱（column），示出用于沿着粒子光轴产生一束带电粒子的带电粒子源和包括用于使所述带电粒子束聚焦的两个极靴的磁性物镜，

· 样本位置，位于极靴之间，

·一种用于对位于样本位置处的薄平样本进行成像的光学显微镜，该光学显微镜示出了垂直于粒子光轴的光轴，

·样本保持器，用于将薄平样本保持在其中可以用粒子光轴对薄平样本进行成像的取向中和在其中薄平样本垂直于光轴的另一取向中，

本发明还涉及一种使用此类装置的方法。

背景技术

根据美国专利号US7,671,333已知此类装置。本已知专利描述了一种具有安装在其中样本所存在的平面中的可缩回扫描光学显微镜（SOM）的透射式电子显微镜（TEM），SOM的光轴垂直于且横断TEM的电光轴。通过使样本朝着光学显微镜倾斜，可以通过用扫描激光束来照射样本而实现荧光图像。此射束激发样本中的荧光标记。响应于所述激励，生成光子，其被光学透镜的物镜所收集且随后被检测。使得这些标记附着于例如组织的特定部分，作为其结果，荧光图像示出例如脂质层或特定酶等。此信息然后被用来限定用于TEM的感兴趣区域。

应注意的是在TEM中，不需要在样本垂直于TEM的粒子光轴的同时对其进行成像，而是常常以不同的角度成像，例如当制作断层照片时。在极端情况下，在样本相对于垂直位置以例如70度倾斜的同时对其进行成像。

还应注意的是还已知使用相关显微术，将来自光学和电子显微术的不同种类的信息组合。

值得提到的是在透射电子显微术中也使用标记，但是通常这些包括重金属（例如金或银簇（cluster）），在生物材料方面由于其高Z组成而形成对比。还已知例如金纳米粒子的使用，其充当荧光标记和重金属标记两者。

SOM的使用是相当昂贵的，并且非扫描显微镜的使用从金融角度来说将是优选的。然而，已知专利认为这是不切实际的，因为透镜杆（pole）之间的空间是有限的，并且安装在透镜杆之间的透镜必要地在其数值孔径（NA）方面被限制。

NA被定义为sin(θ)，其中θ是最大接受角，并且采取等于一的折射率（n＝1），如在空气和真空中的情况一样。

因此，已知专利针对使用没有色彩修正的简单透镜。

而且，即使SOM并未遭受色像差（chromatic aberration），由于与位置准确度有关的激发光束是单色的，所以等于0.61λ/NA的衍射限制分辨率极限受到透镜的NA的限制，如灵敏度一样，其与物镜的接受立体角成比例，因此与(NA)²成比例。

另一此类装置是具有由美国俄勒冈州Hillsboro的FEI公司出售的iCorr™的商售Tecnai™，如在产品数据表DS0126-12-2012“Tecnai™ with iCorr™, enablingcorrelative microscopy on the Tecnai TEM”中所描述的。此类仪器也称为相关光-光学和电子显微镜（CLEM）。此装置使用与透射式电子显微镜相结合的基于LED的荧光显微镜。在其中薄平样本垂直于光光轴（light optical axis）的第二取向上，光显微镜在反射和/或荧光模式下收集图像。此装置将标准、非扫描装备（set-up）用于荧光显微镜且因此需要消色差物镜。此类透镜比单色物镜更加复杂得多，并且物镜是15×/0.5 NA透镜，因为更大透镜（具有更高NA）并未安装在杆件之间。

0.5的此透镜的NA限制荧光显微镜的分辨率：衍射限制分辨率等于0.61λ/NA，其中，λ是光的波长。

由于物镜的接受立体角是受限的，所以灵敏度也是受限的（灵敏度与透镜所接受的立体角成比例，因此与NA²成比例）。

存在对一种具有改进光学显微镜的装置的需要，其在磁性透镜的杆件的物理约束内提供与高灵敏度组合的高分辨率。

发明内容

本发明旨在提供一种装配有此类改进光学显微镜的装置以及一种用于使用装配有此类改进光学显微镜的装置的方法，而不改变磁性透镜的杆件或所述杆件之间的距离。

为此，根据本发明的装置的特征在于光学显微镜具有物镜，其是非旋转对称的且被截短以安装在磁性物镜的杆件之间，并且平行于粒子光轴的尺寸小于垂直于粒子光轴的尺寸，从而在两个方向上示出不同的数值孔径以及由此的在两个方向上的不同分辨率，并且用于收集光的接受立体角大于安装在杆件之间的最大旋转对称透镜的接受角。

在下文中，透镜的NA(φ)可以是φ的函数，其中φ是垂直于光轴的透镜取向。因此，一个取向上的透镜的NA(φ)可以不同于另一取向上的同一透镜的NA。由于透镜被截短以安装在杆件之间，所以在平行于粒子光轴的方向上的NA将是最小NA，而与之垂直发生最大NA。

本发明是基于这样的理解，即旋转对称透镜的直径在物理上限制磁性透镜杆之间的接近（access）。较大直径仅在与样本位置具有较大距离的情况下是可能的，并且因此用较大的直径并未改善接受立体角（以及由此的灵敏度）。其也适用于分辨率。

发明人认识到通过例如通过对透镜的一部分进行截短来使得透镜非旋转对称或者使用卵形透镜，可能具有较大接受立体角（因此：灵敏度）以及在一个方向上比在另一方向上更高的衍射限制分辨率（与最大直径相关联的取向示出最高分辨率）。

应注意的是“非旋转对称”在这里意味着透镜的前表面并未示出旋转对称。本文并不旨在暗示透镜是示出并非旋转对称的焦距的透镜，诸如在圆筒形透镜的情况下发生的。

应注意的是通过限定在两个方向上具有不同NA(φ)的透镜，假设此透镜限定射束限制，并且如果其它光学元件呈现物理限制，则也将这些截短。

应注意的是美国专利申请公开号US2013/0119267A1公开了一种具有用以使激光束聚焦到样本上的光学部件的样本保持器。在其[0019]段中，其提到了也可以将这些部件用于阴极发光的检测。该光学系统被配置成与垂直于粒子束取向的样本一起工作。该公开并未公开在样本远离粒子束倾斜的同时用于样本的光学显微检查或成像的光学系统。

欧洲专利申请EP1724809A1公开了一种用以形成样本的光学图像的非球面（a-spherical）透镜。该光学系统被配置成与垂直于粒子束取向的样本一起工作。样本未被放置在粒子光学显微镜的物镜的杆件之间。

美国专利申请公开号US2008/0283777A1公开了又一光学系统，包括被配置成与垂直于粒子束取向的样本一起工作的反射镜/棱镜。样本未被放置在粒子光学显微镜的物镜的杆件之间。

在实施例中，样本保持器在第二取向上被装配成在垂直于光轴的平面中使样本旋转超过90度。

当制作一个图像时，由于两个方向上的物镜的NA方面的差异，图像将在一个方向上示出比在与之垂直的方向上更好的（衍射限制）分辨率。现在通过为装置装配可以在垂直于光轴的平面中使样本旋转超过90度的样本保持器，可以形成两个图像，每个在垂直于另一个的最佳分辨率的方向上具有其最佳分辨率。

通过将两个图像组合，可以形成具有比可用未截短透镜获得的分辨率更好的分辨率的图像。此类组合可以通过例如将每个图像的傅立叶变换相加且然后使用相加的傅立叶变换来重构图像而实现。这可以是相互垂直的两个图像的相加，而且也可以是在不同角度下的许多图像的相加。

应注意的是可以在傅立叶变换之前或者在傅立叶变换之后执行对准，但是明显地应在将图像组合之前完成。

技术人员将认识到的是本实施例还包括超过两个图像的成像、对准和组合，每个图像具有不同的取向。

在优选实施例中，带电粒子源是电子源且带电粒子束是电子束。

本实施例包括装配有透射式电子显微镜（TEM）柱、扫描透射式电子显微镜（STEM）柱或能够作为STEM和TEM柱（也被称为（S）TEM柱）进行操作的柱的装置。

在另一实施例中，光学显微镜的物镜是可缩回的。

通过使得透镜可缩回，透镜的玻璃表面在用粒子光束进行成像期间被从样本位置去除。从而，避免了非期望效果，诸如由于例如电子而引起的透镜表面的充电。还避免了可能导致降低的透镜透明度的透镜污染。

在又一实施例中，用薄导电透明层、更具体地一层氧化铟锡（ITO）来涂敷物镜的至少一部分。

通过使得面对带电粒子束的物镜的表面导电，避免了充电。

在本发明的一方面，根据本发明的使用装置的方法包括步骤：对样本进行定位，使得表面面对光学显微镜；以及用光学显微镜获得第一图像，其特征在于在获得第一图像之后，使样本在垂直于光轴的平面中旋转，并且用光学显微镜来获取第二图像；以及使第一和第二图像对准并组合以形成与第一图像在平行于粒子光轴的方向上示出的相比具有更高分辨率的图像。

在本方法的实施例中，旋转是超过90度的旋转。

在本方法的另一实施例中在使用光学显微镜获取图像之后且在用带电粒子柱获取图像之前使物镜缩回。

例如为了避免充电，优选地在形成带电粒子图像之前使光学显微镜的物镜缩回以避免由于透镜的充电而引起的射束扰动，并避免透镜上的污染。

在又一实施例中，组合包括形成每个图像的傅立叶变换，将傅立叶变换相加，并基于相加傅立叶变换而重构图像。

优选地，执行加权，使得图像中的每个中的高频信息被增强，使得在重构图像中，正确地表示高空间频率。

在又一实施例中，组合包括首先将图像相加且然后抑制每个的低频或首先抑制图像中的每个中的低频且然后将图像相加。

这具有与先前提到的傅立叶变换几乎相同的效果。可以通过用高通内核（highpass kernel）来处理图像而执行抑制。在组合（相加）图像中可以实现类似的结果。

在该方法的又一实施例中，该方法还包括使用粒子光学柱来获得图像。

优选地，此高分辨率图像（其可以是光学反射图像、荧光图像、拉曼图像等）的形成后面是使样本在垂直于粒子光轴的平面中旋转并用带电粒子柱来形成图像，更具体地电子光学图像。

附图说明

现在使用附图来进一步阐述本发明，其中相同的参考数字指的是对应特征。

为此：

图1示意性地示出了装配有光学显微镜的透射式电子显微镜的一部分，

图2示意性地示出了（从样本位置）到截短透镜的前视图，

图3A示意性地示出了磁性透镜的极靴之间的显微镜的镜筒（tubus）的侧视图，

图3B示意性地示出了垂直于粒子光轴的平面中的显微镜的镜筒的侧视图，以及

图4示出了供使用的方法的流程图。

具体实施方式

图1示出了粒子源2位于其中的真空室6。该粒子源沿着粒子光轴3生成例如以电子束的形式的一束粒子，其中电子具有例如300 keV的能量。电子束被围绕着粒子光轴布置的粒子光学透镜4A、4B操纵（聚焦）。

使用样本保持器5来将样本1定位到第一样本位置上，在那里，粒子束撞击在样本上。第一样本位置位于粒子光学物镜7的杆面8A、8B之间。

通过样本透射的电子束的一部分被例如荧光屏或CCD照相机（或另一原理的照相机）形式的检测器9上的粒子光学透镜4C、4D成像。而且可使用感光胶片来检测粒子。可使用其它检测器，诸如电子能量损失分光镜（EELS）。

光-光学显微镜10使得能够在样本处于样本位置上但向光-光学显微镜倾斜时观察样本。

如先前所述，样本通常是扁平的、非常薄的样本。对于高分辨率图像而言，样本常常小于100 nm厚，优选地甚至小于50 nm厚。此类样本是非常脆的，并且因此其被支撑在网格、例如铜网上，所述网格被安装在样本保持器5上。此类网格被本领域的技术人员称为TEM网格。

为了用粒子束来观察样本的感兴趣区域，用样本保持器5将该感兴趣区域带到粒子光轴上。在用粒子束观察样本的同时，样本的取向可以垂直于粒子光轴，但是对于诸如3D断层成像之类的某些技术而言，还可使样本相对于粒子光轴倾斜。

为了使得能够将样本定位成满足这些需要，样本保持器能够例如以3个平移和2个旋转自由度对样本进行定位，然而还已知具有更少或者甚至更多自由度的样本保持器。

可用来用粒子束对样本进行成像的所有样本位置/取向被称为第一样本位置。

光学显微镜10观察极靴（也称为杆面）8A、8B之间的位置。为了用光学显微镜来形成最佳图像，需要使样本倾斜至基本上垂直于光学显微镜的光轴的位置。

光学显微镜或至少最接近于粒子光轴的光学显微镜的那部分被可缩回地安装，并且可以在未用光学显微镜来观察样本时缩回以在样本周围提供更多空间。此附加空间可能是提供例如由其它类型的检测器对样本的接近所需要的，该其它类型的检测器诸如是一般已知的二次电子检测器、X射线检测器等，其可用来在用电子束照射样本时收集关于样本的信息。

应注意的是在此图中将样本保持器5和光学显微镜10描述为共享垂直于粒子光轴3的平面且被彼此相对地定位。这不是必要的，并且其中保持器和光学显微镜在平面中但间隔开例如90度或120度的实施例也是可能的。一个或两个元件示出并未垂直于粒子光轴的对称轴也是可能的。

图2示意性地示出了（如从样本位置看到的）到截短透镜的前视图。

图2示出了可以认为由具有外径204的圆形透镜形成的（玻璃）表面201。通过从此类透镜去除部分202和203，留下截短透镜201。直径d₁在垂直于粒子光学柱的粒子光轴3的平面中取向。直径d₂平行于粒子光轴取向。

应注意的是将安装在极靴之间的最大圆形透镜将具有等于d₂的，圆205的直径。容易地看到截短透镜的接受角和因此的灵敏度大得多。并且，在d1的方向上的截短透镜的NA比在d₂方向上的NA大得多，并且因此在d₁方向上的衍射限制分辨率比在d₂方向上的分辨率，或者是将安装在极靴之间的最大旋转对称透镜的分辨率好得多。

图3A示意性地示出了安装在极靴之间的光学显微镜的镜筒的视图。

图3A示意性地示出了形成粒子光学柱的磁性透镜（更具体地，TEM或STEM的磁性物镜）的一部分的两个极靴8A、8B。粒子（电子）沿着粒子光轴3行进。在光学显微镜的光轴308与第二取向上的粒子光轴3的交叉点上示出了样本1，在那里，其面对光学显微镜的物镜314。物镜314被安装在镜筒306中。此平面中的透镜的接受角是312_x。

图3B示意性地示出了垂直于粒子光轴3的平面中的光学显微镜的镜筒。

图3B示出了镜筒306、物镜314、样本1、光轴308以及与粒子光轴3的交叉点。并且示出了接受角312_y，其明显地大于图3A中所示的平面中的接受角312_x。由于不存在妨碍的极靴，所以这些在此图中是不可见的。

应注意的是在这里为了简单起见而将透镜314示为单一透镜。然而，为了形成具有消色差性能、减少的像差等的透镜，常常将此透镜形成为复合透镜。

图4示出了使用该装置的方法的流程图。

在步骤402中制备样本。这可包括使用超薄切片机来从厚的生物样品切割薄片、冷冻固定、生物样品的高压冻结、用离子束对一部分进行加工、从晶片挖掘薄片等。步骤402的结果是薄平样本，常常称为薄片。

在步骤404中，在样本位置处将样本插入装置中。这可涉及到将样本放置在TEM网格上，将网格插入TEM保持器中，并且然后将TEM保持器插入所述装置中。

在步骤406中，使样本在第二样本位置上、即在其中样本面对光学显微镜的物镜的位置上取向。

在步骤408中，用光学显微镜来获得第一图像。这可包括使样本暴露于光，作为其结果而发射二次辐射（常常是具有较长波长的光）。

在步骤410中，使样本在垂直于光学显微镜的光轴的平面中旋转。这可以是超过90度的旋转，但是尤其是当收集每个示出不同取向的许多图像时，还可以使用其它旋转角。

在步骤412中获得第二图像。

在可选步骤414和416中，使样本旋转并以该不同的角度获得另一图像。这些步骤可用来形成多个图像，每个示出不同取向。

在步骤418中，例如使用用于每个图像的傅立叶变换、所有这些傅立叶变换的相加、后面是导致最终图像的逆傅立叶变换或通过将图像相加并进行滤波来使先前获得的图像对准并将其组合。应注意的是可在图像上或在每个图像的傅立叶变换中执行对准。

在步骤420中，样本在第一样本位置上取向。

在步骤422中，制作具有粒子光学柱的图像。这可包括感兴趣区域搜索、低放大图像与从光学图像获得（使用例如荧光标记的位置）的数据的相关、以不同的倾斜角形成一系列图像以形成断层照片等。

应注意的是为了有改善的灵敏度，可在样本的背面处施加反射涂层。然而，这可能阻碍用粒子光学柱进行成像。因此可设想将反射镜放置在与其中放置光学显微镜的一侧相对的一侧上，由此使得反射图像可用。然而，应记住的是样本的图像或反射的图像是散焦的。

我们要求保护如下。

Claims (20)

1.一种用于执行相关光学显微术和带电粒子显微术的装置，该装置包括：

· 带电粒子柱，其包括用于沿着粒子-光轴产生一束带电粒子的带电粒子源；和包括用于使所述带电粒子束聚焦的两个极靴的磁性物镜；

· 样本位置，位于极靴之间，

· 光学显微镜，用于对位于样本位置处的薄平样本进行成像，该光学显微镜示出了垂直于粒子-光轴的光轴；以及

· 样本保持器，用于将薄平样本保持在其中可以用粒子-光轴对薄平样本进行成像的第一取向中以及在其中薄平样本垂直于光轴的第二取向中；

其中：

· 该光学显微镜具有非旋转对称且被截短以安装在磁性物镜的极靴之间的物镜，其中平行于粒子-光轴的尺寸小于垂直于粒子-光轴的尺寸，从而示出在两个方向上不同的数值孔径和由此的在两个方向上不同的分辨率；以及

· 用于收集光的接受立体角大于安装在极靴之间的最大旋转对称透镜的接受立体角。

2.权利要求1的装置，其中，所述样本保持器在第二取向上被装配成在垂直于光轴的平面中使样本旋转超过90度。

3.权利要求2的装置，其中带电粒子源是电子源并且带电粒子束是电子束。

4.权利要求2的装置，其中光学显微镜的物镜是可缩回透镜。

5.权利要求2的装置，其中光学显微镜的物镜的至少一部分被涂敷薄导电层。

6.权利要求1的装置，其中，所述带电粒子源是电子源且带电粒子束是电子束。

7.权利要求6的装置，其中光学显微镜的物镜是可缩回透镜。

8.权利要求1的装置，其中，所述光学显微镜的物镜是可缩回透镜。

9.权利要求1的装置，其中，光学显微镜的所述物镜的至少一部分被涂敷薄导电透明层。

10.权利要求9的装置，其中薄导电透明层包括氧化铟锡。

11.一种使用根据权利要求1的装置的方法，该方法包括步骤：

· 在样本位置上提供薄平样本（1）；

· 将样本定位于第二取向上；以及

· 用光学显微镜（10）来获得样本的第一图像，

其中：

· 在获得第一图像之后，使样本在垂直于光轴的平面中旋转，并且用光学显微镜来获取第二图像；

· 将第一和第二图像对准并组合以形成与在平行于粒子-光轴的方向上的第一图像所示出的相比具有更高分辨率的光学图像。

12.权利要求11的方法，其中，所述旋转是超过90度的旋转。

13.权利要求12的方法，其中，所述组合包括形成用光学显微镜获取的每个图像的傅立叶变换，将傅立叶变换相加，并基于相加的傅立叶变换而重构图像。

14.权利要求12的方法，其中，所述组合包括首先将用光学显微镜获取的图像相加并且然后抑制所述图像中的每个中的低频或者首先抑制所述图像中的每个中的低频且然后将所述图像相加。

15.权利要求12的方法，其中，所述方法还包括使用带电粒子柱来获得图像。

16.权利要求11的方法，其中，所述方法还包括使用带电粒子柱来获得图像。

17.权利要求16的方法，其中，在使用光学显微镜获取图像之后且在用带电粒子柱获取图像之前使物镜缩回。

18.权利要求17的方法，其中所述物镜的至少一部分被涂敷薄导电透明层并且薄导电透明层包括氧化铟锡。

19.权利要求11的方法，其中所述组合包括形成用光学显微镜获取的每个图像的傅立叶变换，将傅立叶变换相加，并基于相加的傅立叶变换而重构图像。

20.权利要求11的方法，其中，所述组合包括首先将用光学显微镜获取的图像相加并且然后抑制所述图像中的每个中的低频或者首先抑制所述图像中的每个中的低频且然后将所述图像相加。