CN104807999A - 一种胶体硒快速检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胶体硒快速检测试纸条。所述胶体硒快速检测试纸条是由底板、样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫五部分组成，其中反应垫上包被有检测带和控制带，结合垫上包被有与抗原或抗体结合的胶体硒。其中所用胶体硒是由胶体硒纳米颗粒和稳定剂组成，该稳定剂为多聚糖，例如羧甲基纤维素和阿拉伯树胶粉；所述胶体硒纳米颗粒呈均匀球形，粒径大小为40-100nm，稳定性良好。本发明制备的试纸条特异性强、灵敏度高、检测速度快、操作简便、携带容易、无需特殊设备、无需专业培训、结果清晰易辨。

Description

一种胶体硒快速检测试纸条

技术领域

一种胶体硒快速检测试纸条，属于生物学免疫层析方法的测定领域。

背景技术

快速检测试纸条的使用兴起于上世纪中后期，最早使用彩色胶体乳做信号探针，其色彩鲜艳，容易识别，但它易于凝集导致假阳性结果可能性增加；上世纪80年代胶体金则被引入试纸条的使用，其因稳定，结果可靠而被广泛应用，但是它的制备相对复杂，成本相对较高；上世纪90年代胶体硒也被引入快速检测试纸条，胶体硒灵敏度高，稳定性好并且制备更为简单，价格更为低廉。均匀、球形、粒径适宜且重悬性能良好的胶体硒是制备试纸条的前提条件，但是目前研究所制备的胶体硒不能完全满足上述要求，从而限制了成熟稳定胶体硒试纸条的发展，因此也阻碍了胶体硒在快速诊断领域的应用。

李志林等人（纳米硒的制备和表征，无机盐工业，2006；十二烷基硫酸钠模板法制备纳米硒，无机盐工业，2009）采用聚乙烯醇，十二烷基硫酸钠作为模板制备出平均粒径35nm左右的胶体硒，但形状不均一；史宏伟等人（PVA软模板法制备纳米硒，安徽大学学报自然科学版，2009）继续采用聚乙烯醇作为模板制备制备出无定性硒粒子；王红艳等人（葡苷聚糖模板法制备纳米硒，安徽大学学报自然科学版，2005）采用葡苷聚糖做模板制备出棒状、毛刷装、蝌蚪状以及球形胶体硒；张胜义等人（Synthesis of selenium nanoparticles in the presence of polysaccharides，Materials letters，2004）采用壳聚糖、羧甲基纤维素钠以及阿拉伯树胶制备出蝌蚪状、毛刷状、竹叶状以及球形胶体硒；虽然上述方法都制备出胶体硒，但是由于其形状不规则、大小不均一、重悬性不佳等原因，使得现有方法不能制备出形状规则，大小均一，重悬性良好的胶体硒，从而不能满足成熟稳定胶体硒快速检测试纸条的要求，因此也阻碍了胶体硒在快速诊断领域的应用。

本发明提供了一种胶体硒快速检测试纸条，该试纸条中的胶体硒由胶体硒纳米颗粒和多聚糖组成，该多聚糖可以是壳聚糖、阿拉伯树胶粉、羧甲基纤维素、葡聚糖以及聚乙烯醇。本发明还提供了一种胶体硒纳米颗粒溶液的制备方法，利用多聚糖作为模板，同时使用还原剂抗坏血酸还原氧化剂亚硒酸，从而制备出胶体硒纳米颗粒。该胶体硒制备方法克服了现有技术不能满足胶体硒颗粒均匀、球形、粒径适宜且重悬性能良好的困难，解决了成熟稳定胶体硒试纸条曾经遇到的难题。本发明经过对稳定剂的反复研究，筛选到效果良好，浓度考究，价格低廉的稳定剂及其在胶体硒中的含量要求，从而使得该胶体硒制备的试纸条能够稳定、灵敏的检测目的物。

发明内容

    本发明提供了一种胶体硒快速检测试纸条，该试纸条包括底板，样品垫，结合垫，反应垫和吸水垫五部分组成，其中反应垫上包被有控制带和检测带，结合垫上包被有结合了抗原或抗体的胶体硒，该胶体硒是由胶体硒纳米颗粒和多聚糖组成。

所述多聚糖可以为阿拉伯树胶粉、羧甲基纤维素、壳聚糖、聚乙烯醇和葡聚糖，优选羧甲基纤维素或阿拉伯树胶粉。

所述羧甲基纤维素浓度为0.01-0.1% m/v，优选0.04-0.08% m/v。

所述阿拉伯树胶粉浓度为0.1-1.0% m/v，优选0.2-0.6% m/v。

所述胶体硒的制备方法为：以羧甲基纤维素问稳定剂；                                                室温下于洁净的250ml烧杯中，加入98ml纯水和0.04-0.08g的羧甲基纤维素搅拌均匀； 分别加入1ml 1.6M 抗坏血酸和1ml 0.2M 亚硒酸，搅拌均匀； 搅拌均匀后继续反应10分钟，以保证反应完全即可。

以阿拉伯树胶粉为稳定剂； 室温下于洁净的250ml烧杯中，加入98ml纯水和0.2-0.6g的阿拉伯树胶粉搅拌均匀； 分别加入1ml 1.6M 抗坏血酸和1ml 0.2M 亚硒酸，搅拌均匀； 搅拌均匀后继续反应10分钟，以保证反应完全即可。

本发明公开的一种胶体硒快速检测试纸条制备基于抗原抗体免疫反应原理，同时可细分为竞争法和夹心法两种。但是无论是竞争法试纸条还是夹心法试纸条，均是由底板，样品垫，结合垫，反应垫和吸水垫五部分组成。胶体硒跟抗原抗体的结合，均是通过半胱氨酸的SH-，疏水作用，分子间吸引和范德华力等非共价键结合，其结合方式是相同的，因此适合于竞争法试纸条的胶体硒具有同样适合制备夹心法试纸条的特点，适合标记免疫球蛋白的胶体硒具有可以标记其他抗原或抗体的特点。因此，该胶体硒可用于标记各种大小分子抗原或者抗体，且稳定性和灵敏度不会受到影响。

    本发明提供的胶体硒具有均匀、球形、粒径适宜且重悬性能良好，制备简单、价格低廉的优势和特点，因此，采用该胶体硒制备的一种胶体硒快速检测试纸条具备了灵敏、稳定、快速等优势，解决了现有技术中的胶体硒不稳定、重悬性能不佳、粒径不均匀从而不能制备稳定成熟胶体硒试纸条等问题。另外在保证试纸条灵敏度、稳定性。在其余成本相等的同时，使得免疫探针的制备方法更为简单、成本更为低廉，胶体硒的制备成本较胶体金也大大降低。

附图说明

图1为本发明试纸条示意图；1为支撑板PVC板；2为样品垫；3为硒标结合垫，4为信号检测垫，4₁为检测带，4₂为控制带，5为吸水垫。

图2为本发明检测结果示意图。其中1为控制带，2为检测带；3显示两条带均显色，则被检样品中不含或者含有少量三聚氰胺；4控制带显色，检测带不显色，说明样品中含有至少50μg/L的三聚氰胺；5显示控制带不显色的情况，则试纸条失效。

图3为本发明试纸条检测液态奶样品结果图；C, 控制带；T, 检测带；1，预处理庄园纯牛奶样品；2-7，从左至右分别为终浓度1，5，10，50，100和500μg/L三聚氰胺的预处理庄园纯牛奶样品。

图4为本发明试纸条检测奶粉样品结果图；C, 控制带；T, 检测带；1，预处理Abbott奶粉样品；2-7，从左至右分别为终浓度1，5，10，50，100和500μg/L三聚氰胺的预处理Abbott奶粉样品。

图5为本发明试纸条检测动物食品样品结果图；C, 控制带；T, 检测带；1，预处理澳博动物食品样品；2-7，从左至右分别为终浓度5，10，50，100，200和500μg/L三聚氰胺的预处理澳博动物食品样品。

图6为本发明试纸条交叉反应结果图；C, 控制带；T, 检测带；1，预处理液态奶样品；2-5，从左至右分别为终浓度500μg/L的三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺、三聚氰胺二酰胺和三聚氰胺的预处理庄园纯牛奶样品。 

具体实施方式

以下提供具体实施例以实现本发明所述的一种胶体硒快速检测试纸条，但不限于这些实施例。

实施例一  胶体硒颗粒的制备

1、于干净250ml烧杯中加入98mL的去离子水，搅拌条件下加入0.2-0.6g 阿拉伯树胶粉，搅拌均匀。

搅拌条件下加入1mL 1.6M 的抗坏血酸水溶液和1mL 0.2M 的亚硒酸水溶液，继续搅拌10分钟，反应体系颜色会发生渐变，逐渐由淡黄色变为橘红色，且澄清透亮，反应完全后通过12000rpm，30min，使其粒径在40~100nm，球形不团聚。

2、于干净250ml烧杯中加入98mL的去离子水，搅拌条件下加入0.04-0.08g 羧甲基纤维素，搅拌均匀。

搅拌条件下加入1mL 1.6 的抗坏血酸水溶液和1mL 0.2M 的亚硒酸水溶液，继续搅拌10分钟，反应体系颜色会发生渐变，逐渐由淡黄色变为橘红色，且澄清透亮，反应完全后通过12000rpm，30min，形成均匀、粒径40-100nm，易于分离和重悬的胶体硒溶液。

实施例二三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的制备

    试纸条制备基于抗原抗体免疫反应原理，同时可细分为竞争法和夹心法两种。但是无论是竞争法试纸条还是夹心法试纸条，均是由底板，样品垫，结合垫，反应垫和吸水垫五部分组成。三聚氰胺是小分子，由于其只有一个抗原表位，因此三聚氰胺快速检测试纸条的制备只能选择竞争法；同时正是因为其选用竞争法制备，检测难度较夹心法更大，所以其检测更具有代表性。胶体硒跟抗原抗体的结合，均是通过半胱氨酸的SH-，疏水作用，分子间吸引和范德华力等非共价键结合，其结合方式是相同的，因此适合于竞争法试纸条的胶体硒具有同样适合制备夹心法试纸条的特点，适合标记免疫球蛋白的胶体硒具有可以标记其他抗原或抗体的特点。因此，该胶体硒可用于标记各种大小分子抗原或者抗体，且稳定性和灵敏度不会受到影响。

1、胶体硒颗粒标记鼠源抗三聚氰胺单克隆抗体

胶体硒分别加入终浓度为0.5-30μg/mL 的单克隆抗体（可于广州沃维生物科技有限公司公司购得），轻轻混匀10分钟，于透射电镜观察胶体硒被抗体包埋的程度，从而确定最佳标记量。

吸取5ml制备的胶体硒颗粒，用碳酸钾溶液调节适宜pH；

向上述胶体硒溶液中搅拌、缓慢加入鼠源抗三聚氰胺单克隆抗体，该标记量通按上述方法确定；

反应10分钟后，加入BSA以稳定体系，继续搅拌至标记完全；

制得的硒标单克隆抗体进行高速低温（12000rpm、4℃）离心30分钟，弃上清，沉淀用等体积含BSA和蔗糖的TBS缓冲液重悬，重复三次；若加入适量叠氮钠，则可4℃长期保存。

通过该标记方法可以将胶体硒与抗原或者抗体成功结合。

2、检测三聚氰胺胶体硒试纸条的组装

如图1所示，试纸条包括底板，样品垫，结合垫，反应垫和吸水垫五部分组成，其中反应垫上包被有控制带和检测带，结合垫上包被有结合了抗原或抗体的胶体硒。

将经过含BSA和Tween-20 10 mM pH 7.4的PBS活化的玻璃纤维，干燥备用；

在NC膜上适宜距离喷涂0.1-2.0mg/mL的三聚氰胺完全抗原检测带和0.5-2.0mg/mL的羊抗鼠IgG控制带，该完全抗原与抗体制备免疫小鼠所用完全抗原不同； 

将上述制备的胶体硒标记的鼠源抗三聚氰胺单克隆抗体喷于结合垫上，干燥备用；

于支撑垫PVC板上依次粘贴信号检测垫、硒标结合垫、样品垫和吸水垫，得试纸条，干燥条件保存备用。

实施例三 三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的性能检测

三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条结果判定方法（图2）：当三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的控制带和检测带均显色时，则被检样品中不含或者含有灵敏度以内的三聚氰胺；当三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的控制带显色，而检测带不显色时，则被检样品中含有灵敏度以上的三聚氰胺；无论检测带显色与否，只要控制带不显色，则三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条检测无效。

三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的性能检测实验：

向庄园纯牛奶、Abbott奶粉、澳博动物食品中加入不同浓度标准的三聚氰胺，通过三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条检测样品中三聚氰胺浓度，从而验证三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的有效性。

所用庄园纯牛奶、Abbott奶粉、澳博动物食品通过液质联用色谱鉴定其中三聚氰胺含量，鉴定结果为庄园纯牛奶、Abbott奶粉、澳博动物食品均为阴性样品。

1、庄园纯牛奶中三聚氰胺检测试验：于50mL离心管中加入10mL庄园纯牛奶和20mL蒸馏水混匀，并用配置好的2mg/mL标准三聚氰胺溶液逐级稀释获得分别含有0,1,5,10,50,100和500μg/L的标准三聚氰胺样品，供试纸条检测使用。

通过庄园纯牛奶中三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的检测结果（图3）可以看出，各个三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的控制带均显色，而检测带颜色则随着牛奶中三聚氰胺含量逐渐增加逐渐减弱，即检测不同浓度庄园纯牛奶中三聚氰胺颜色程度为：0 > 1 > 5 > 10 > 50μg/L；当庄园纯牛奶中三聚氰胺浓度大于等于50μg/L时，检测带不显色。

因此，三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条在检测庄园纯牛奶过程中，灵敏度可达到50μg/L，通过对稀释倍数的调节，则该试纸条对检测庄园纯牛奶灵敏度为150μg/kg。

2、Abbott奶粉中三聚氰胺检测试验：于50mL离心管中加入2g Abbott奶粉和40mL蒸馏水混匀，并用配置好的2mg/mL标准三聚氰胺溶液逐级稀释获得分别含有0,1,5,10,50,100和500μg/L的标准三聚氰胺样品，供试纸条检测使用。

通过Abbott奶粉中三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的检测结果（图4）可以看出，各个三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的控制带均显色，而检测带颜色则随着牛奶中三聚氰胺含量逐渐增加逐渐减弱，即检测不同浓度庄园纯牛奶中三聚氰胺颜色程度为：0 > 1 > 5 > 10 > 50μg/L；当庄园纯牛奶中三聚氰胺浓度大于等于50μg/L时，检测带不显色。

因此，三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条在检测Abbott奶粉过程中，灵敏度可达到50μg/L，通过对稀释倍数的调节，则该试纸条对检测Abbott奶粉灵敏度为1000μg/kg。

3、澳博动物食品中三聚氰胺检测试验：于50mL离心管中加入5g澳博动物食品和40mL蒸馏水混匀，静置30min取上清备用，并用配置好的2mg/mL标准三聚氰胺溶液逐级稀释获得分别含有0,10,20,50,100,200和500μg/L的标准三聚氰胺样品，供试纸条检测使用。

通过澳博动物食品中三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的检测结果（图5）可以看出，各个三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的控制带均显色，而检测带颜色则随着牛奶中三聚氰胺含量逐渐增加逐渐减弱，即检测不同浓度庄园纯牛奶中三聚氰胺颜色程度为：0 > 10 > 20 > 50 > 100μg/L；当澳博动物食品中三聚氰胺浓度大于等于100μg/L时，检测带不显色。

因此，三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条在检测澳博动物食品过程中，灵敏度可达到100μg/L，通过对稀释倍数的调节，则该试纸条对检测澳博动物食品灵敏度为800μg/kg。

根据上述三种不同样品中三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条实验结果可以得出以下结论：本发明三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条不仅可以灵敏、快速的检测样品中是否含有三聚氰胺，同时三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条结果清晰可辨。

4、庄园纯牛奶交叉反应试验：于250mL烧杯中加入50mL庄园纯牛奶和100mL蒸馏水混匀，并用配置好的2mg/mL标准三聚氰胺溶液逐级稀释获得含有0和500μg/L的标准三聚氰胺样品，同样的方法获得含有三聚氰胺同系物：三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺和三聚氰胺二酰胺样品，供试纸条检测使用。

通过庄园纯牛奶中三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条交叉反应试验的检测结果（图6）可以看出，各个三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的控制带均显色，只有检测含有三聚氰胺庄园纯牛奶的三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的检测带不显色，其他三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条的检测带均显色，且颜色强度相当。

因此，三聚氰胺胶体硒快速检测试纸条同三聚氰胺同系物三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺和三聚氰胺二酰胺没有交叉反应，可以特异性检测样品中的三聚氰胺。

结论：该试纸条特异性强、灵敏度高、检测速度快、操作简便、携带容易、无需特殊设备、无需专业培训、结果清晰易辨。 

Claims (6)

1.一种胶体硒快速检测试纸条；该试纸条包括底板，样品垫，结合垫，反应垫和吸水垫，其中反应垫上包被有控制带和检测带，结合垫上包被有结合了抗原或抗体的胶体硒，其特征在于：所述胶体硒含有胶体硒纳米颗粒和多聚糖。

2.根据权利要求1所述的一种胶体硒快速检测试纸条，其特征在于，所述多聚糖为羧甲基纤维素或阿拉伯树胶粉。

3.根据权利要求2所述的一种胶体硒快速检测试纸条，其特征在于，所述羧甲基纤维素浓度为0.01-0.1% m/v。

4.根据权利要求2所述的一种胶体硒快速检测试纸条，其特征在于，所述阿拉伯树胶粉浓度为0.1-1.0% m/v。

5.根据权利要求3所述的一种胶体硒快速检测试纸条，其特征在于，所述羧甲基纤维素浓度为0.04-0.08% m/v。

6.根据权利要求4所述的一种胶体硒快速检测试纸条，其特征在于，所述阿拉伯树胶粉浓度为0.2-0.6% m/v。