CN104807931B

CN104807931B - 一种玉米胚根鞘内源激素检测方法

Info

Publication number: CN104807931B
Application number: CN201510000695.8A
Authority: CN
Inventors: 江绪文; 李贺勤
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2015-01-04
Filing date: 2015-01-04
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2035-01-04
Also published as: CN104807931A

Abstract

本发明涉及种子科学领域，特别是关于一种基于GC‑MS内标法玉米胚根鞘内源激素检测方法，它包括样品采集、样品浸提、纯化与富集、GC‑MS/SIM检测、后处理步骤；用“横竖剥”法采集胚根鞘组织样品；用80%甲醇（冷）浸提，萃取内源激素共8个步骤；用Sep‑Pak C18柱纯化富集样品共9个步骤；用GC‑MS Agilent DB‑17ms检测激素；通过优化测定条件等后处理获得激素含量。本发明基于GC‑MS内标法检测玉米胚根鞘8种内源激素含量，采用“横竖剥+浸提+固相萃取+ Agilent DB‑17ms”技术组合提高检测效果。本发明可应用于玉米种子萌发机理研究。

Description

一种玉米胚根鞘内源激素检测方法

技术领域

本发明涉及种子科学领域，特别是关于一种玉米胚根鞘内源激素检测方法。

背景技术

种子萌发是种胚从生命活动相对静止状态恢复到生理代谢旺盛的生长发育阶段。种子萌发过程伴随着各种生理生化变化过程，如：细胞的活化和修复、种胚的生长和合成代谢等。这些生理生化变化过程均离不开植物内源激素的参与。植物内源激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的微量有机物, 能从产生部位转移到作用部位, 在低浓度下就能调节植物的生长发育, 几乎参与了种子萌发的每一过程。玉米属一年生禾本科草本植物，是重要的农作物之一。玉米全基因组测序完成以来，它已成为一种研究禾本科作物种子萌发机理的模式植物。胚根鞘作为禾本科植物特有器官，相关研究表明，胚根鞘在增大伸长协助胚根突破种皮完成萌发等方面发挥重要作用，故探讨激素调节胚根鞘伸长机理对研究玉米种子萌发机理方面具有非常重要的意义。然而植物内源激素含量极低，性质不稳定，容易受其他次生代谢产物的干扰，此外胚根鞘组织非常小，采集量很少，而且不同植物样品内源激素提取方法存在差异，故不断摸索和优化玉米胚根鞘内源激素提取、纯化、检测方法和流程，提高胚根鞘内源激素检测精准度和效果对研究玉米种子萌发机理等方面非常关键。传统植株内源激素提取检测方法存在样品需要量大、易受环境影响、检测误差大、检测灵敏度低、溶剂消耗量大等问题。无法满足玉米种子萌发机理研究中胚根鞘内源激素超微定量定性检测的技术要求。

发明内容

针对上述问题，本发明目的是提供一种玉米胚根鞘内源激素检测方法，以提高玉米胚根鞘内源激素检测效率和精准度，实现内源激素含量的有效检测，满足玉米种子萌发机理研究需要，并为其他植物组织内源激素检测提供参考。

为实现上述目的，本发明基于GC-MS内标法，采用“横竖剥+浸提+固相萃取+ Agilent DB-17ms”技术组合提高玉米胚根鞘中8种内源激素（GA₁、GA₃、GA₄、IAA、JA、DHJA、cis-ABA和trans-ABA）检测效率和精准度。本发明采用以下技术方案：一种玉米胚根鞘内源激素检测方法，其包括如下步骤：（1）样品采集；（2）样品浸提；（3）纯化与富集；（4）GC-MS/SIM检测；（5）后处理。所述步骤（1）中，采用“横竖剥”法采集胚根鞘组织样品；所述步骤（2）中，采用80%甲醇（冷）浸提，萃取内源激素，包括研磨提取、低温静置、注入内标、抽滤、浓缩至水相、冻融除杂、离心取上清和萃取浓缩共8个步骤；所述步骤（3）中，采用固相萃取柱Sep-Pak C18柱进行样品纯化富集，包括试剂准备、Sep-Pak C18柱清洗、激素萃取、Sep-Pak C18柱重生、浓缩、甲酯化处理、转尖底试管、转毛细玻璃管和真空干燥共9个步骤。所述步骤（4）中，利用GC-MS Agilent DB-17ms进行激素检测；所述步骤（5）中，通过优化GC-MS检测条件、测量激素峰面积、计算内源激素含量、打印、保存等后处理获得激素含量。

本发明的有益效果是：基于GC-MS内标法，采用“横竖剥+浸提+固相萃取+Agilent DB-17ms”技术组合提高玉米胚根鞘中8种内源激素（GA₁、GA₃、GA₄、IAA、JA、DHJA、cis-ABA和trans-ABA）检测效率和精准度，实现玉米胚根鞘内源激素含量的有效检测。本发明可应用于玉米种子萌发机理研究，并为其他植物组织内源激素检测提供参考。

附图说明

图1为本发明的方法流程图。

图2为本发明的玉米胚根鞘样品采集示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。

如图1、图2所示，本发明基于GC-MS内标法，采用“横竖剥+浸提+固相萃取+ Agilent DB-17ms”技术组合提高玉米胚根鞘中8种内源激素（GA₁、GA₃、GA₄、IAA、JA、DHJA、cis-ABA和trans-ABA）检测效率和精准度。本发明涉及的玉米胚根鞘内源激素检测方法包括样品采集、样品浸提、纯化与富集、GC-MS/SIM检测、后处理步骤。

本发明涉及的玉米胚根鞘内源激素检测方法具体实施方式如下。

（1）样品采集：对玉米种子进行卷纸发芽，在采样时间点将萌发中的玉米种子取出，使用医用手术刀片在体式镜下采用“横竖剥”法采集胚根鞘组织样品。

（2）样品浸提：采用80%甲醇（冷）浸提，萃取内源激素共8个步骤。分别为：1）研磨提取：样品（鲜重0.2-0.5g）置洁净预冷的研钵中，加少量石英砂、极少量PVPP（1-3个小晶粒）和液氮，研磨，加入少许80％甲醇（冰），冰浴研磨至匀浆，用小玻棒将匀浆液转入100ml烧杯中，并用80％甲醇（冰）充分清洗研钵上的植物残留样品至烧杯中，以避免提取液流失；2）低温静置：将装有匀浆液的小烧杯连同插在其中的小玻棒用铝箔纸封口后，置4℃冰箱中静置12-24h，让激素充分渗出。注：烧杯上贴上标签防止样品混杂；3）注入内标：用100ul微量进样器向盛有样品的烧杯中注入相应定量的激素内标，在内标更换时，需将进样器反复吸打甲醇入废液缸30遍以上，注内标时需快速，以防针尖吸附内标小液滴，同时避免将激素内标打到烧杯壁上，影响测定结果。最后用插在烧杯中的小玻棒将提取液及激素内标搅匀；4）抽滤：安装好抽滤装置，打开抽气泵工作开关，在布氏漏斗中垫入相同规格的滤纸1-2层，用80％甲醇封边，将烧杯中的提取液倒在滤纸中部，避免碰到漏斗壁，用80％甲醇清洗烧杯3-5遍，清洗液也倒在滤纸中部。此外，用80％甲醇滴洗滤纸中的样品残渣若干次。充分抽滤后，先将皮管从抽滤瓶上拔下，后关电源，避免杂质入管进入抽滤瓶污染抽滤液，最后弃残渣；5）浓缩至水相：将滤液倒入鸡心瓶中（鸡心瓶口贴上标签防止样品混杂），用80％甲醇清洗抽滤瓶3遍并将清洗液也倒入鸡心瓶，然后在鸡心瓶中加入1滴浓氨水，以促进酸性离子进入水相。打开真空泵，将盛有滤液的鸡心瓶安装在旋蒸仪上，调整鸡心瓶使瓶底与水浴锅液面接触（水温不超过40℃，以避免鸡心瓶内液体沸腾，影响浓缩），设定旋转速度后开始减压浓缩，当冷凝管中液滴下降速度变慢或鸡心瓶内液体体积降为原体积的1/3-1/5时则表明甲醇已排净。浓缩结束后将鸡心瓶内液体移入10ml具塞玻璃试管中（试管中上部贴上标签防止样品混杂），并取少量超纯水将鸡心瓶内壁充分清洗，清洗液也倒入同一试管中，但试管内最终溶液体积应小于5ml，以方便后期配平离心；6）冻融除杂：将装有浓缩液的试管在-20℃条件下反复冻融3-5次，使液体中杂质充分冻融出来，结冻时间长短不影响检测结果。解冻时将试管放在低于40℃的温水或室温自来水中，解冻温度不能太高，避免造成试管破裂以及影响激素溶解效果。注：判断甲醇是否已除干净：取出已结冻的试管，打横观察，如果最顶端无流动液体则表明甲醇已除干净，否则需重新浓缩；7）离心取上清：向冻融处理后的试管中加入少量PVPP，充分摇匀，静置10-20min，以充分去除色素、酚类等物质。利用空的具塞玻璃试管加超纯水与样品试管配平，然后低温或室温离心20-30min（3000r/min）；8）萃取浓缩：离心完毕，将上清液用玻璃吸管吸出或直接缓慢倒入至新的试管中（转移中避免带入试管底部杂质），然后用2M HCl调上清液pH值至2.5-3.0。用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相至鸡心瓶中，冷冻处理，水相与有机相分层（鸡心瓶底会存在少量水相），用玻璃吸管插至水相，将其吸除，然后向鸡心瓶加1滴浓氨水，利用旋蒸仪水浴浓缩至干（35℃-40℃）。

（3）纯化与富集：采用固相萃取柱Sep-Pak C18柱纯化富集样品共9个步骤。分别为：1）试剂准备：准备0.1M HAC（乙酸）、甲醇、17％甲醇（甲醇：0.1M HAC=17：83）、40％甲醇（甲醇：0.1M HAC=40：60）、60％甲醇（甲醇：0.1M HAC=60：40）、氯仿和正乙烷7种试剂（按顺序将试剂依次摆放好，避免样品洗脱时试剂加错或加入顺序出现错误，影响激素分离结果），其中17％甲醇和40％甲醇用于GA₁、GA₃和IAA这3种激素的分离收集（第一阶段）；而40％甲醇和60％甲醇用于JA、DHJA、cis-ABA、trans-ABA和GA₄这5种激素的分离收集（第二阶段）；2）Sep-Pak C18柱清洗：设Sep-Pak C18柱短端为正方向，安装在已移去活塞的5ml玻璃注射器接头上，从注射器活塞入口处加入5ml甲醇后安置活塞，轻轻将活塞下推，使甲醇从Sep-Pak C18柱下端逐滴流出，完成洗柱。注：下柱液滴流速可加快；3）激素萃取：5ml纯甲醇洗柱后，用5ml 0.1M HAC洗柱，然后加入5ml溶有植物样品的0.1M HAC溶液（向浓缩至干的鸡心瓶内加不超过5ml的0.1M HAC充分摇匀）。注：溶有样品的HAC溶液需一滴一滴慢速通过Sep-Pak C18柱，让柱子能够充分吸收有效成分；进行“一弃四收两段”收集：利用Sep-Pak C18柱对不同激素进行分离分别收集到不同的25ml鸡心瓶中。经验收集口诀为：前‘3.5ml 17％甲醇’弃；后‘1.5ml 17％甲醇’收（第一阶段）；前‘2.5ml 40％甲醇’收（第一阶段）；后‘40％甲醇3.5ml’收（第二阶段）；60％甲醇3.0ml收（第二阶段）。注：如果只检测第一阶段中激素成分‘1.5ml 17％甲醇’不变，而‘2.5ml 40％甲醇’可变为‘3.0ml 40％甲醇’，但加入量不可过多，防止引入杂质，造成拖尾、柱效灵敏度下降等不利影响。我们总结为：只求能测，减少杂质。收集结束后用铝箔纸将鸡心瓶封口；4）Sep-Pak C18柱重生：为了节约检测成本可对Sep-Pak C18柱进行重生处理，将使用过的Sep-Pak C18柱长端安装在注射器接头上，依次加入5ml甲醇洗柱、5ml氯仿洗柱、5ml正已烷洗柱、5ml氯仿洗柱，当柱内颜色由黄或土黄色变为白色，则表明柱子已被清洗干净。保存，可循环使用；5）浓缩：向盛有目标激素样品的鸡心瓶（25ml）中加入1滴浓氨水（促进激素进入水相），然后接上旋蒸仪浓缩至干，浓缩时间约1-2h，真空泵内循环水需不断加冰、冰袋、冰瓶等以便加快浓缩速度；6）甲酯化处理：将浓缩后的鸡心瓶放在通风柜中，加入2滴甲醇，然后加入含CH₂N₂（重氮甲烷）的乙醚（冷）（稍微过量一点，若CH₂N₂量少则反应不充分，若观察到鸡心瓶内溶液中气泡减少且变黄，则说明样品已充分甲酯化）。甲酯化后，用N₂将鸡心瓶内溶液吹干。注：因CH₂N₂毒性大，应在通风柜中进行制备，CH₂N₂制备量根据实际检测样品量确定，现配现用。制备方法：取一定量 40% KOH溶液及少量无水乙醚（防止反应过于剧烈）置于具塞大试管中，加入约0.5g Methylnitrosourea（甲基亚硝基脲），将试管迅速塞住后，用双联球挤气将所产生的CH₂N₂气体导入乙醚中（盛装瓶冰浴）。7）转尖底试管：向挥发至干的鸡心瓶中加入少量乙醚溶解，并将乙醚溶液转至尖底试管中（约1.5ml左右），然后用N₂将尖底试管内乙醚吹干。注：乙醚溶解后的鸡心瓶底部含有一些吸附物不要处理掉，可用铝箔纸将鸡心瓶封口，置于-20℃下保存。一旦实验失败，还可以向鸡心瓶中再次加入乙醚溶解吸附物进行检测；8）转毛细玻璃管：向N₂吹干的尖底试管中加入200μl乙酸乙酯溶解样品，然后平分转移入两根毛细玻璃管中（每管约为100μl，毛细玻璃管中部贴上标签防止样品混杂），其中一根毛细玻璃管内的样品用于后期TMS化（三甲基硅烷化）处理；9）真空干燥：将装有乙酸乙酯溶液的毛细管垂直放在干燥器（盛有硅胶、五氧化二磷粉末等）内进行真空抽气泵抽气干燥。当毛细玻璃管中液面降至30μl左右，酒精灯加热软化封管。不需进行TMS化处理的即可直接上机检测。需进行TMS化处理的样品需等毛细玻璃管内液体完全挥发后，向毛细玻璃管中注入10μl BSTFA (双三甲基硅三氟乙酰胺)，酒精灯加热软化封管，在100℃下反应1h。

（4）GC-MS/SIM检测：利用GC-MS Agilent DB-17ms进行激素检测。气相色谱柱30 m×0.25 mm×0.25μm，载气为氦气，压力为130 kg/cm²，分表压力为0.31kg/cm²，流速0.8 mL /min。色谱柱采用程序升温，从起始温度50℃，以20℃/min 升至180℃后保持4 min，再以10℃/min升至290℃后保持15 min，250℃进样，不分流，进样体积1μl。质谱条件：离子轰击源70 eV，接口温度250℃，离子源温度200℃，发射电流150μA，检测器电压350 V，从m/z 29 -540全扫描，每0.5 s扫描1 次。

（5）后处理：优化GC-MS检测条件、测量激素峰面积、计算内源激素含量、打印、保存等后处理获得激素含量。

综上所述，本发明基于GC-MS内标法，采用“横竖剥+浸提+固相萃取+Agilent DB-17ms”技术组合提高玉米胚根鞘中8种内源激素（GA₁、GA₃、GA₄、IAA、JA、DHJA、cis-ABA和trans-ABA）检测效率和精准度。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明实施的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的设计精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种玉米胚根鞘内源激素检测方法，其特征在于：包括样品采集、样品浸提、纯化与富集、GC-MS/SIM检测、后处理步骤；选用色谱柱Agilent DB-17ms，可有效进行GA₁、GA₃、GA₄、IAA、JA、DHJA、cis-ABA和trans-ABA8种内源激素检测；气相色谱柱30 m×0.25 mm×0.25μm，载气为氦气，压力为130 kg/cm²，分表压力为0.31kg/cm²，流速0.8 mL /min；色谱柱采用程序升温，从起始温度50℃，以20℃/min 升至180℃后保持4 min，再以10℃/min升至290℃后保持15 min，250℃进样，不分流，进样体积1μl；质谱条件：离子轰击源70 eV，接口温度250℃，离子源温度200℃，发射电流150μA，检测器电压350 V，从m/z 29 -540全扫描，每0.5 s扫描1 次。

2.如权利要求1所述的一种玉米胚根鞘内源激素检测方法，其特征在于：采用“横竖剥”法采集胚根鞘组织样品。