CN104805507A

CN104805507A - 噬菌体展示文库及其应用和制备方法

Info

Publication number: CN104805507A
Application number: CN201410043528.7A
Authority: CN
Inventors: 钟南; 陈刚; 刘珂
Original assignee: Precise And Tiny Zhi Guang Bioisystech Co Ltd In Hangzhou
Current assignee: Hangzhou Kang Wanda Medical Technology Co., Ltd.
Priority date: 2014-01-29
Filing date: 2014-01-29
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2034-01-29
Also published as: CN104805507B

Abstract

本发明提供一种噬菌体展示文库及其应用和制备方法。所述噬菌体展示文库包含一系列各自独立地具有三维结构的抗体性多肽，所述多肽中的每一者均包含具有抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域的重链、以及具有抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域的轻链，其特征在于：所述抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有强随机突变性位点，所述强随机突变性位点是位于所述多肽三维结构表面上的用于结合靶抗原的且非保守性的位点，所述强随机突变性位点是由强随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述强随机突变简并密码子不包括终止密码子。本发明的噬菌体展示文库同时具有多样性和筛选高效性。

Description

噬菌体展示文库及其应用和制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域。具体而言，本发明涉及一种噬菌体展示文库、该文库在筛选特异性识别靶抗原的抗体中的用途以及制备该文库的方法；本发明还涉及编码该噬菌体展示文库所展示的多肽的DNA组合物、用于构建所述噬菌体展示文库的噬菌体质粒组合物、含有该噬菌体质粒组合物的宿主细胞库、用于构建所述噬菌体展示文库的引物及其用途以及包括所述噬菌体展示文库的试剂盒。

背景技术

噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。噬菌体属于单链DNA病毒，包括F1、fd和M13三类。噬菌体DNA能够在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，同时可分泌出大量成熟的噬菌体颗粒。噬菌体的单链DNA长约7000bp，不同类型的噬菌体的一级结构极为相似，基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白，与噬菌体展示密切相关的是二种不同的结构蛋白pⅢ和pⅧ。噬菌体单链DNA被包裹在由大约2700-3000个主要衣壳蛋白pⅧ组成的管状结构中。另外，次要衣壳蛋白pⅢ通过与大肠杆菌的F菌毛结合而引起感染，其是噬菌体感染宿主所必需的。

噬菌体展示平台已经发展成熟，其通过将目标蛋白融合在pIII蛋白基因中的适当位置，从而在噬菌体表面展示目标蛋白(参见文献“Bass,S.,Proteins,8:309(1990);Lowman and Wells,Methods:A Companion toMethods in Enzymology,3:205(1991)”)。由于融合有目标基因的pIII蛋白基因处于低表达状态且野生型pIII蛋白仍在表达，因此能够很好地维持噬菌体的感染性。与此相关的专利文献如：美国专利No.5,723,286、美国专利No.5,432,018、美国专利No.5,580,717、美国专利No.5,427,908和美国专利No.5,498,530。

利用噬菌体文库筛选针对靶蛋白、多肽或小分子的多肽或蛋白的技术已被广泛研究（参见文献“Tonikian,R.,Nature protocols,2:1368(2007)”）。其基本思路为：将设计好的噬菌体文库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，用洗脱的噬菌体感染宿主细胞，之后繁殖扩增，进行下一轮孵育洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。通过噬菌体ELISA，可从富集噬菌体输出文库中挑选出来具有期望结合特性的单克隆噬菌体。

噬菌体展示技术可以产生包含10¹⁰种以上不同展示蛋白的文库，这与人体所能产生的抗体总数相近，从而使基于此技术的抗体筛选成为可能。然而，由于抗体的互补决定区全部可随机产生10⁷⁰种以上的变化，因此，科学地设计抗体的噬菌体展示文库将是决定筛选成功率和效率的关键因素。在这方面，已经有很多研究成果（例如，参见文献“TomLinson,Nature Biotech.(2000),18:989-994”、“Barbas,PNAS9113809(1994)”、“Yelton,D E,J.Immunology,15511994(1995)”、“Jackson,J.R.,J.Immunology,15413310(1995)”和“Hawkins,R E,J.Mol.Biology,2261889(1992)”)。

但以上研究针对的是常规抗体的筛选，所得抗体针对的表面决定簇随机，并且对抗原的功能性、致病性点突变不敏感、无法识别；并且在构建噬菌体文库时，通常需要首先经过免疫动物的步骤，费时费力。

美国专利文献No.7985840B2和No.2013/0244883A1公开了一种噬菌体文库，以及制备该噬菌体文库的方法。该方法对抗体CDR结构域中的溶剂可及且多样性的位点采用了简并密码子突变，从而不需进行常规的免疫动物等步骤即可达到足够的多样性。然而，这些方法都没有区分抗体中用于识别靶抗原的核心结合区和次要识别区，而是对轻链CDR1、CDR2结构域和重链CDR1、CDR2结构域都采用了突变性较弱的弱随机突变简并密码子，只对抗体轻链和重链CDR3结构域采用了突变性较强的强随机突变简并密码子，并且该强随机突变简并密码子包括终止密码子。因此，该方法所制备的噬菌体文库的多样性对针对突变抗原的抗体筛选没有优势，并且由于其使用了包括终止密码子的强随机突变，该文库所展示的抗体中的稳定性抗体的比例较低，这导致该噬菌体文库的筛选效率较低。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种噬菌体展示文库、该文库在筛选特异性识别靶抗原的抗体中的用途以及制备该文库的方法；本发明还涉及编码该噬菌体展示文库所展示的多肽的DNA组合物、用于构建所述噬菌体展示文库的噬菌体质粒组合物、含有该噬菌体质粒组合物的宿主细胞库、用于构建所述噬菌体展示文库的引物及其用途以及包括所述噬菌体展示文库的试剂盒。

具体而言，本发明提供了：

（1）一种噬菌体展示文库，包含一系列各自独立地具有三维结构的抗体性多肽，所述多肽中的每一者均包含具有抗体性重链CDR1结构域、抗体性重链CDR2结构域和抗体性重链CDR3结构域的重链、以及具有抗体性轻链CDR1结构域、抗体性轻链CDR2结构域和抗体性轻链CDR3结构域的轻链，其特征在于：所述抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有强随机突变性位点，所述强随机突变性位点是位于所述多肽三维结构表面上的用于结合靶抗原的且非保守性的位点，所述强随机突变性位点是由强随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述强随机突变简并密码子不包括终止密码子。

（2）根据（1）所述的噬菌体展示文库，其中所述抗体性多肽的氨基酸序列采用Chothia编号系统编号时，所述强随机突变性位点为：所述抗体性重链CDR1结构域的第33位氨基酸，所述抗体性重链CDR2结构域的第50、52、56、58位氨基酸，所述抗体性重链CDR3结构域的第95至（95+k）位氨基酸，所述抗体性轻链CDR1结构域的第30、31位氨基酸，所述抗体性轻链CDR2结构域的第50位氨基酸，以及所述抗体性轻链CDR3结构域的第91至（91+j）位氨基酸；其中k为3至14的整数，j为3至6的整数。

（3）根据（1）或（2）所述的噬菌体展示文库，其中所述抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有弱随机突变性位点，所述弱随机突变性位点是溶剂可及且非保守性的位点，其是由弱随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述弱随机突变简并密码子不编码破坏所述多肽三维结构稳定性的氨基酸。

（4）根据（3）所述的噬菌体展示文库，其中所述弱随机突变性位点各自所包括的氨基酸包括：在天然鼠源抗体相应位点处的出现频率至少为65%的氨基酸和/或出现频率之和至少为65%的氨基酸。

（5）根据（3）所述的噬菌体展示文库，其中所述抗体性多肽的氨基酸序列采用Chothia编号系统编号时，

所述抗体性重链CDR1结构域包含连续氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9，其中X1至X9依次对应所述Chothia编号系统的第27至第35位，X7为由强随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种，X1、X2、X4、X5、X8和X9为由弱随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种，X3任选地为由弱随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种；

所述抗体性重链CDR2结构域包含连续氨基酸序列Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12，其中Y1至Y12依次对应所述Chothia编号系统的第50至52、52A、53至60位，Y1、Y3、Y8和Y10为由强随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种，Y5至Y7、Y12为由弱随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种，Y4和Y9任选地为由弱随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种；

所述抗体性重链CDR3结构域各自独立地包含连续氨基酸序列(Z1)_m-Z2-Z3，其中第1个Z1对应所述Chothia编号系统的第95位，Z2和Z3依次对应所述Chothia编号系统的第101位之前倒数第2位和第101位之前倒数第1位，m为4至15的整数，Z1为由强随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种，Z2和Z3各自独立地为由弱随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种；

所述抗体性轻链CDR1结构域包含连续氨基酸序列x1-x2-x3-x4-x5-x6，其中x1至x6依次对应所述Chothia编号系统的第27至32位，x4和x5为由强随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种，x1至x3为由弱随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种，x6任选地为由弱随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种；

所述抗体性轻链CDR2结构域包含连续氨基酸序列y1-y2-y3-y4-y5-y6-y7，其中y1至y7依次对应所述Chothia编号系统的第50至56位，y1为由强随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种，y2、y4至y7为由弱随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种；以及

所述抗体性轻链CDR3结构域各自独立地包含连续氨基酸序列z1-z2-(z3)_n-z4-z5，其中z1、z2和第1个z3依次对应所述Chothia编号系统的第89至91位，z4和z5依次对应所述Chothia编号系统的第97位之前倒数第2位和第97位之前倒数第1位，n为4至7的整数，z3为由强随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种，z1和z5各自独立地为由弱随机突变简并密码子编码的氨基酸中的任意一种。

（6）根据（5）所述的噬菌体展示文库，其中所述强随机突变简并密码子选自NNY和NVY。

（7）根据（5）所述的噬菌体展示文库，其中：

X1为由简并密码子TWY编码的任意一种氨基酸，X2为由简并密码子DCN编码的任意一种氨基酸，X3为由简并密码子HTY编码的任意一种氨基酸，或者为Phe，X4为由简并密码子WCY编码的任意一种氨基酸，X5为由简并密码子RRY编码的任意一种氨基酸，X6为Tyr，X7为由简并密码子NNY编码的任意一种氨基酸，X8为由简并密码子RTR编码的任意一种氨基酸，X9为由简并密码子MRY编码的任意一种氨基酸；

Y1为由简并密码子NNY编码的任意一种氨基酸，Y2为Ile，Y3为由简并密码子NVY编码的任意一种氨基酸，Y4为由简并密码子YCN或HMY编码的任意一种氨基酸，或者为Pro，Y5为由简并密码子DRY或RGY编码的任意一种氨基酸，Y6为由简并密码子RVY或RSY编码的任意一种氨基酸，Y7为由简并密码子RGY或KVY编码的任意一种氨基酸，Y8为由简并密码子NNY编码的任意一种氨基酸，Y9为由简并密码子AYY编码的任意一种氨基酸，或者为Thr，Y10为由简并密码子NNY编码的任意一种氨基酸，Y11为Tyr，Y12为由简并密码子VMY编码的任意一种氨基酸；

Z1为由简并密码子NNY编码的任意一种氨基酸，Z2为由简并密码子KMY编码的任意一种氨基酸，Z3为由简并密码子WTS编码的任意一种氨基酸；

x1为由简并密码子SAR或MRW编码的任意一种氨基酸，x2为由简并密码子RRY或VRC编码的任意一种氨基酸，x3为由简并密码子DTA编码的任意一种氨基酸，x4为由简并密码子NNY编码的任意一种氨基酸，x5为由简并密码子NNY编码的任意一种氨基酸，x6为由简并密码子KMY或DMY编码的任意一种氨基酸，或者为Tyr；

y1为由简并密码子NNY编码的任意一种氨基酸，y2为由简并密码子RCY或RYY编码的任意一种氨基酸，y3为Ser，y4为由简并密码子AVM或AMY编码的任意一种氨基酸，y5为由简并密码子CKN编码的任意一种氨基酸，y6为由简并密码子BMY编码的任意一种氨基酸，y7为由简并密码子AST编码的任意一种氨基酸；以及

z1为由简并密码子CWR编码的任意一种氨基酸，z2为Gln，z3为由简并密码子NNY编码的任意一种氨基酸，z4为Pro，z5为由简并密码子YWY编码的任意一种氨基酸。

（8）一种噬菌体质粒组合物，包含一系列噬菌体质粒，该质粒各自独立地包含位于复制子和启动子下游的DNA，所述DNA各自独立地编码一种具有三维结构的抗体性多肽，所述多肽中的每一者均包含具有抗体性重链CDR1结构域、抗体性重链CDR2结构域和抗体性重链CDR3结构域的重链、以及具有抗体性轻链CDR1结构域、抗体性轻链CDR2结构域和抗体性轻链CDR3结构域的轻链，其特征在于：所述抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有强随机突变性位点，所述强随机突变性位点是位于所述多肽三维结构表面上的用于结合靶抗原的且非保守性的位点，所述强随机突变性位点是由强随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述强随机突变简并密码子不包括终止密码子。

（9）根据（8）所述的噬菌体质粒组合物，其中所述噬菌体质粒还各自独立地包含位于所述DNA下游的、编码噬菌体pIII蛋白C端结构域的DNA，并且其中所述多肽与所述噬菌体pIII蛋白C端结构域构成融合蛋白。

（10）根据（8）所述的噬菌体质粒组合物，其中所述DNA中的一种具有如序列1所示和序列2所示的DNA序列。

（11）一种引物组合物，其包含分别如序列5-24所示的DNA序列。

（12）（11）所述的引物组合物在用于构建（1）至（7）中任意一项所述的噬菌体展示文库中的用途。

（13）一种宿主细胞库，其包含一系列宿主细胞，该宿主细胞各自独立地含有（8）至（10）中任意一项所述的噬菌体质粒组合物中的任意一种噬菌体质粒，其中所述宿主细胞为能够被噬菌体感染的细胞。

（14）（1）至（7）中任意一项所述的噬菌体展示文库在筛选特异性识别靶抗原的抗体中的用途，优选地，所述靶抗原包括野生型抗原和点突变抗原。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

本发明通过对已知的抗原-抗体复合物进行结构分析，并且比对统计已知天然抗体的氨基酸序列，确定了抗原-抗体复合物中的抗体的溶剂可及且非保守性的氨基酸位点，并且在这些氨基酸位点中，确定了对抗体识别结合靶抗原起关键作用的核心结合区和起次要作用的相关识别区，对该核心结合区采用了能够覆盖所有氨基酸类型（例如非极性芳香族疏水氨基酸、非极性脂肪族疏水氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸和极性不带电氨基酸）的强随机突变简并密码子编码，并且在该强随机突变简并密码子中去除了终止密码子。这样，本发明构建的噬菌体展示文库具有高度多样性，能够筛选出可识别点突变抗原的抗体；同时，由于本发明所采用的强随机突变简并密码子不包括终止密码子，使得所表达的多肽能够折叠形成稳定的具有抗体功能的蛋白，因此本发明的噬菌体展示文库中稳定性抗体所占的比例得到最大化。由此，本发明既保证了所构建的噬菌体展示文库的多样性，又保证了其筛选高效性。

此外，本发明的噬菌体展示文库的多样性和高效性直接取决于所述简并密码子的设计，因此，在制备该噬菌体展示文库时，不需要进行常规的免疫动物等步骤，省时省力。

附图说明

图1示出本发明一个实施方案中用于构建噬菌体展示文库的质粒图谱的图。

图2示例性示出16F6抗体Fab片段的三维结构的俯视图；其中深色部分为Fab重链，浅色部分为Fab轻链，实体球示出将采用强随机突变的氨基酸残基，并且标出了在16F6抗体中这些氨基酸残基的名称及其在chothia编号系统中的位置编号，点状球示出将采用弱随机突变的氨基酸残基。

图3示例性示出16F6抗体Fab片段的三维结构的一个侧面的侧面观图；其中深色部分为Fab重链，浅色部分为Fab轻链，实体球示出将采用强随机突变的氨基酸残基，点状球示出将采用弱随机突变的氨基酸残基。

图4示例性示出16F6抗体Fab片段的三维结构的另一个侧面的侧面观图；其中深色部分为Fab重链，浅色部分为Fab轻链，实体球示出将采用强随机突变的氨基酸残基，点状球示出将采用弱随机突变的氨基酸残基。

图5示出利用本发明一个实施方案的噬菌体展示文库筛选特异性识别Kras-G12R点突变抗原的单克隆抗体的ELISA检测结果的图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

为了解决上述现有技术中所存在的问题，并且提供一种同时具有高度多样性和筛选高效性的噬菌体展示文库，本发明对抗原-抗体复合物（例如，埃博拉病毒糖蛋白与抗体16F6的复合物结构（pdb ID：3VE0））进行了结构分析，并且比对统计了已知天然抗体的氨基酸序列，从而确定了所述抗原-抗体复合物中的抗体的溶剂可及且非保守性的氨基酸位点，并且在这些氨基酸位点中，确定了对抗体识别结合靶抗原起关键作用的核心结合区和起次要作用的相关识别区，所述核心结合区包括核心结合表面，该核心结合表面由抗体重链和轻链的CDR3结构域中的位于抗体三维结构表面上的用于结合靶抗原且非保守性的氨基酸组成。所述核心结合区还包括抗体重链和轻链的CDR1和CDR2结构域中的位于抗体三维结构表面上的用于结合靶抗原且非保守性的氨基酸，这些氨基酸相邻于（即，紧挨着）所述核心结合表面，与核心结合表面一起构成所述核心结合区。由于核心结合区的氨基酸对识别结合靶抗原起关键的作用，本发明的发明人对这些氨基酸采用了能够覆盖所有氨基酸类型（例如非极性芳香族疏水氨基酸、非极性脂肪族疏水氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸和极性不带电氨基酸）的强随机突变简并密码子编码。此外，因为终止密码子会导致CDR1，CDR2和CDR3结构域表达终止，从而不能获得具有完整的CDR1，CDR2和CDR3结构域的多肽，进而影响该多肽形成功能性抗体，因此发明人在该强随机突变简并密码子中排除了终止密码子。

由此，本发明提供了一种噬菌体展示文库，包含一系列各自独立地具有三维结构的抗体性多肽，所述多肽中的每一者均包含具有抗体性重链CDR1结构域、抗体性重链CDR2结构域和抗体性重链CDR3结构域的重链、以及具有抗体性轻链CDR1结构域、抗体性轻链CDR2结构域和抗体性轻链CDR3结构域的轻链，其特征在于：所述抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有强随机突变性位点，所述强随机突变性位点是位于所述多肽三维结构表面上的用于结合靶抗原的且非保守性的位点，所述强随机突变性位点是由强随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述强随机突变简并密码子不包括终止密码子。

在本文中，术语“抗体性多肽”是指该多肽为具有抗原识别能力的氨基酸序列，该氨基酸序列例如为含有CDR1、CDR2和CDR3结构域的蛋白，优选为抗体的抗原结合（Fab）片段，也可以为全长抗体。

在述及抗体性重链CDR（包括CDR1、CDR2和CDR3）结构域和抗体性轻链CDR（包括CDR1、CDR2和CDR3）结构域时，术语“抗体性”是指所述CDR结构域的空间结构与天然抗体的CDR结构域的空间结构相同或基本上相同。“基本上相同”是指该CDR结构域在本发明所述强随机突变性位点和/或弱随机突变性位点处发生了由本发明所述的强随机突变密码子或弱随机突变简并密码子引入的突变，突变后的氨基酸与天然抗体在相应位置处的氨基酸不同从而引起构象变化。

术语“强随机突变性位点”是指该位点由强随机突变简并密码子编码。术语“强随机突变”是本领域常用的术语，是指该突变能够引入10-15种不同的氨基酸，从而涵盖非极性芳香族疏水氨基酸、非极性脂肪族疏水氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸和极性不带电氨基酸。

术语“弱随机突变性位点”是指该位点由弱随机突变简并密码子编码。术语“弱随机突变”是本领域常用的术语，是指该突变能够引入2-9种不同的氨基酸，优选2-6种不同氨基酸。

在本文中，术语“简并密码子”是指根据表1所示的IUPAC简并核苷酸命名规则，能够编码多种氨基酸的多种密码子。

表1.IUPAC简并核苷酸命名规则

IUPAC核苷酸密码子	碱基名称
		A	腺嘌呤
C	胞嘧啶
		G	鸟嘌呤
T(或U)	胸腺嘧啶(或尿嘧啶)
		R	A或G
Y	C或T
		S	G或C
W	A或T
		K	G或T
M	A或C
		B	C或G或T
D	A或G或T
		H	A或C或T
V	A或C或G
		N	任何碱基
.或-	缺口

在本文中，在提及噬菌体展示文库时，“多样性”是指该噬菌体展示文库所展示的抗体性多肽的氨基酸序列多样，使得能够筛选出可特异性识别点突变靶抗原的抗体，特别是单克隆抗体。

在本发明中，对抗原-抗体复合物进行结构分析、以及对已知天然抗体的氨基酸位点进行比对和统计可以采用计算机软件进行，例如：Pymol0.99和Geneious6.1等。

优选地，在本发明的噬菌体展示文库所展示的抗体性多肽中，当所述抗体性多肽的氨基酸序列采用Chothia编号系统编号时，所述强随机突变性位点为：所述抗体性重链CDR1结构域的第33位氨基酸，所述抗体性重链CDR2结构域的第50、52、56、58位氨基酸，所述抗体性重链CDR3结构域的第95至（95+k）位氨基酸，所述抗体性轻链CDR1结构域的第30、31位氨基酸，所述抗体性轻链CDR2结构域的第50位氨基酸，以及所述抗体性轻链CDR3结构域的第91至（91+j）位氨基酸；其中k为3至14的整数，j为3至6的整数。

优选地，所述强随机突变简并密码子选自NNY和NVY。

进一步优选地，为了进一步提高噬菌体展示文库的多样性，同时保证所展示的能够形成有效抗体的抗体性多肽的比例满足筛选高效性，发明人还对所述抗体中起次要抗原识别作用的相关识别区采用了弱随机突变简并密码子编码。

所述相关识别区包括抗体重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3结构域中其它的溶剂可及且非保守性的氨基酸位点（所述核心结合区以外的氨基酸）。发明人针对这些位点，统计了已知的天然鼠源抗体在与该位点相对应的位点处所出现的氨基酸，从而确定了这些位点处的可变氨基酸，并且根据该统计结果设计了弱随机突变简并密码子，使得在这些位点处能够尽可能地出现所述可变氨基酸，同时避免出现可能影响抗体结构稳定性的氨基酸。

因此，优选地，在所述噬菌体展示文库所包含的抗体性多肽中，所述抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有弱随机突变性位点，所述弱随机突变性位点是溶剂可及且非保守性的位点，其是由弱随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述弱随机突变简并密码子不编码破坏所述多肽三维结构稳定性的氨基酸。

优选地，所述弱随机突变性位点各自所包括的氨基酸包括：在天然鼠源抗体相应位点处的出现频率至少为65%（更优选75%，更加优选85%）的氨基酸和/或出现频率之和至少为65%（更优选75%，更加优选85%）的氨基酸。

优选地，在本发明所述的噬菌体展示文库中，所述抗体性多肽的氨基酸序列采用Chothia编号系统编号时，

所述Chothia编号系统是本领域已知的抗体氨基酸序列编号系统，例如可参见网页http://www.bioinf.org.uk/abs/#chothianum。

优选地，所述强随机突变简并密码子选自NNY和NVY。

更优选地，X1为由简并密码子TWY编码的任意一种氨基酸，X2为由简并密码子DCN编码的任意一种氨基酸，X3为由简并密码子HTY编码的任意一种氨基酸，或者为Phe，X4为由简并密码子WCY编码的任意一种氨基酸，X5为由简并密码子RRY编码的任意一种氨基酸，X6为Tyr，X7为由简并密码子NNY编码的任意一种氨基酸，X8为由简并密码子RTR编码的任意一种氨基酸，X9为由简并密码子MRY编码的任意一种氨基酸；

上文所述的核心结合区和相关识别区在抗体三维结构中的位置如图2-4所示。上文所述的强随机突变性位点和弱随机突变性位点、在天然鼠源抗体相应位点处的氨基酸出现频率、以及所采用的简并密码子在表2和表3中示例性地列出。

在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的噬菌体展示文库包含这样的抗体性多肽，所述多肽各自独立地包含具有抗体性重链CDR1结构域、抗体性重链CDR2结构域和抗体性重链CDR3结构域的重链、以及具有抗体性轻链CDR1结构域、抗体性轻链CDR2结构域和抗体性轻链CDR3结构域的轻链，并且所述抗体性重链和轻链的CDR结构域在表2和表3所示出的各个位点处（所示的位点编号采用Chothia编号系统），分别为由所示出的简并密码子编码的氨基酸中的任意一种。

表2.天然抗体轻链互补决定区统计及简并密码子设计

注：“97-2”是指位于Chothia编号系统第97位氨基酸前面两位的氨基酸；

“97-1”是指位于Chothia编号系统第97位氨基酸前面一位的氨基酸。

表3.天然抗体重链互补决定区统计及简并密码子设计

注：“101-2”是指位于Chothia编号系统第101位氨基酸前面两位的氨基酸；

“101-1”是指位于Chothia编号系统第101位氨基酸前面一位的氨基酸。

本发明的另一个方面提供了一种构建本发明所述的噬菌体展示文库的方法，包括：

1）确定抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域、以及重链CDR1、CDR2和CDR3结构域中溶剂可及且非保守性的位置，并且在所述位置中确定轻链CDR3结构域和重链CDR3结构域中位于抗体三维结构表面上的用于结合靶抗原的位点，所述位点构成抗体的核心结合表面，并且确定重链和轻链的CDR1和CDR2结构域中的位于抗体三维结构表面上的相邻于（即，紧挨着）所述核心结合表面的用于结合靶抗原的位点，这些位点与所述核心结合表面一起构成抗体的核心结合区，将该核心结合区作为强随机突变性位点；

2）分别根据所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域、以及重链CDR1、CDR2和CDR3结构域的DNA序列设计PCR引物，该引物具有针对所述强随机突变性位点设计的强随机突变简并密码子，但所述强随机突变简并密码子不包括终止密码子；

3）将包含所述抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3结构域、以及重链的CDR1、CDR2和CDR3结构域的核苷酸序列的DNA转化成dU-ssDNA，利用所述引物，以该dU-ssDNA为模板进行合成，获得一系列包含抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域、以及抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域的核苷酸序列的简并性DNA。

确定抗体中的溶剂可及的位点、用于结合靶抗原的位点、位于抗体的三维结构表面上的位点、以及相邻于某位点的位点等是本领域已知的技术。例如，可以通过分析抗原-抗体复合物来实现。所述抗原-抗体复合物可以为（例如）埃博拉病毒糖蛋白与抗体16F6形成的复合物（pdb ID：3VE0））。确定非保守性的位点可以通过（例如）比对和统计已知抗体的氨基酸序列来实现。

步骤3）中所述作为模板的包含所述抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3结构域、以及重链的CDR1、CDR2和CDR3结构域的核苷酸序列的DNA优选位于噬菌体质粒中。

优选地，所述步骤1）还包括，将所述抗体重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3结构域中其它的溶剂可及且非保守性的位点（所述核心结合区以外的氨基酸）作为弱随机突变性位点，针对所述弱随机突变性位点，统计已知的天然抗体在与该位点相对应的位点处所出现的氨基酸，从而确定这些位点处的可变氨基酸。

优选地，在所述步骤2）中，所述PCR引物具有针对所述弱随机突变性位点设计的弱随机突变简并密码子，所述弱随机突变简并密码子编码所述可变氨基酸，但不编码破坏所述抗体三维结构稳定性的氨基酸。

此外，优选的是，所述包含所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域、以及重链CDR1、CDR2和CDR3结构域的核苷酸序列的DNA位于一种噬菌体质粒上的复制子和启动子下游，并且与编码噬菌体pIII蛋白C端结构域的DNA（如序列39所示）串接；所获得的所述简并DNA序列为一系列噬菌体质粒。还优选的是，所述方法还包括将所述一系列噬菌体质粒转化入能够被噬菌体感染的宿主细胞中。

在本文中，术语“串接”是指，编码不同蛋白的DNA之间没有终止密码子，使得该不同的蛋白能够通读，从而表达为融合蛋白。

优选地，所述引物分别如序列5-24所示。

在本发明的一个具体的实施方案中，构建本发明所述的噬菌体展示文库的方法包括以下依次进行的步骤：

I）提供依次包含复制子、启动子、如序列1所示（16F6抗体轻链）的DNA序列、如序列2所示（16F6抗体重链）的DNA序列、和编码噬菌体pIII蛋白C端结构域的DNA（如序列39所示）的噬菌体质粒；

II）将该噬菌体质粒转化入dut-/ung-大肠杆菌中；

III）利用辅助噬菌体超感染该大肠杆菌；

IV）在含有尿嘧啶核苷的培养基中培养步骤III）获得的大肠杆菌；

V）提取噬菌体中的环状脱氧尿嘧啶单链DNA；

VI）分别利用如序列5-24所示的引物对该单链DNA进行退火及填充反应，从而提供相应的环状双链DNA；

VII）将该环状双链DNA转化入dut+/ung+大肠杆菌中，从而获得本发明所述的噬菌体展示文库。

本发明的另一个方面提供了一种DNA组合物，包含一系列分离的DNA，该DNA各自独立地编码本发明所述的抗体性多肽。

具体而言，所述DNA各自独立地编码一种具有三维结构的抗体性多肽，所述多肽中的每一者均包含具有抗体性重链CDR1结构域、抗体性重链CDR2结构域和抗体性重链CDR3结构域的重链、以及具有抗体性轻链CDR1结构域、抗体性轻链CDR2结构域和抗体性轻链CDR3结构域的轻链，其特征在于：所述抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有强随机突变性位点，所述强随机突变性位点是位于所述多肽三维结构表面上的用于结合靶抗原的且非保守性的位点，所述强随机突变性位点是由强随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述强随机突变简并密码子不包括终止密码子。

本发明的又一个方面提供了一种噬菌体质粒组合物，包含一系列噬菌体质粒，该质粒各自独立地包含位于复制子和启动子下游的编码本发明所述的任意一种多肽的DNA。

具体而言，所述噬菌体质粒各自独立地包含位于复制子和启动子下游的DNA，所述DNA各自独立地编码一种具有三维结构的抗体性多肽，所述多肽中的每一者均包含具有抗体性重链CDR1结构域、抗体性重链CDR2结构域和抗体性重链CDR3结构域的重链、以及具有抗体性轻链CDR1结构域、抗体性轻链CDR2结构域和抗体性轻链CDR3结构域的轻链，其特征在于：所述抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有强随机突变性位点，所述强随机突变性位点是位于所述多肽三维结构表面上的用于结合靶抗原的且非保守性的位点，所述强随机突变性位点是由强随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述强随机突变简并密码子不包括终止密码子。

优选地，所述DNA中的一种具有如序列1（16F6抗体轻链）所示和序列2（16F6抗体重链）所示的DNA序列。16F6抗体轻链和重链的氨基酸序列分别如序列3和序列4所示。

优选地，所述噬菌体质粒还各自独立地包含位于所述DNA下游的、编码噬菌体pIII蛋白C端结构域的DNA（如序列39所示），并且所述多肽与所述噬菌体pIII蛋白C端结构域构成融合蛋白，从而使所述多肽展示在噬菌体的外表面。

在本发明中，所述复制子优选为F1origin（如序列37所示）；所述启动子优选为phoA（如序列38所示）。

在本发明中，所述噬菌体质粒优选为图1所示的噬菌体质粒，其DNA序列如序列40所示。该噬菌体质粒可由pUC19（可得自NewEngland Biolabs，cat.No.N3041S）改造而成：即，克隆或合成（例如委托南京金斯瑞生物技术有限公司克隆或合成）以下基因：F1origin（如序列37所示）、phoA启动子（如序列38所示）、具有stII信号肽和Flag标签的16F6抗体Fab片段（如序列36所示）、和pIII蛋白C端结构域的DNA序列（如序列39所示)，以phoA启动子替代pUC19中的lac启动子，然后在phoA启动子的上游插入F1origin，在phoA启动子的下游依次插入具有stII信号肽和Flag标签的16F6抗体Fab片段、以及pIII蛋白C端结构域的DNA序列，最终获得如序列40中所示的噬菌体质粒pUC-PD16F6，其包括插入的F1origin以及Fab-pIII融合蛋白表达模块。

本发明的噬菌体质粒还可各自独立地包含其它的序列，如还可以包含终止序列。另外，表达载体还可以具有选择性标记，例如抗生素（例如羧苄青霉素、氯霉素、卡那霉素等）抗性基因的形式，从而能够使携带这些质粒的细胞被筛选出来。

本发明所述的噬菌体质粒可用于构建本发明所述的噬菌体展示文库。

本发明的又一个方面提供了一种宿主细胞库，其包含一系列宿主细胞，该宿主细胞各自独立地含有所述的噬菌体质粒组合物中的任意一种噬菌体质粒，其中所述宿主细胞为能够被噬菌体感染的细胞，例如大肠杆菌。

可以用本发明所述的噬菌体质粒转化宿主细胞。将噬菌体质粒转化入细胞可以通过本领域已知的任意技术实现，所述技术包括但不限于：标准细菌转化、磷酸钙共沉淀或电穿孔，其中电穿孔最优选。

本发明的又一个方面提供了一种引物组合物，所述引物各自独立地以抗体（例如16F6抗体）的轻链CDR1、CDR2或CDR3结构域、或重链CDR1、CDR2或CDR3结构域的DNA序列为设计模板，并且包含相应的针对抗体轻链或重链CDR1、CDR2或CDR3结构域的随机突变性位点所设计的随机突变简并密码子。在各个所述引物中，在所述随机突变简并密码子的两端，分别为与所述抗体DNA序列的相应位置互补的核苷酸，并且每端优选具有15-18个这样的核苷酸。

优选地，所述引物组合物包含分别如序列5-24所示的DNA序列。

本发明所述的引物可以通过化学合成来获得，例如可以由南京金斯瑞生物技术有限公司来合成和确认。

本发明所述的引物组合物可以用于构建本发明所述的噬菌体展示文库，或者可以用于扩增本发明所述的DNA组合物。

在本发明的又一个方面中，所述噬菌体展示文库可以用于筛选特异性识别靶抗原的抗体。所述靶抗原可以为野生型抗原和点突变抗原。

在一个实施方案中，本发明的噬菌体展示文库可以筛选出[对点突变抗原的识别能力（例如ELISA试验中的信号强度）]与[对野生型抗原的识别能力]之比达到10倍以上的抗体。

可以采用本领域已知的方法利用噬菌体展示文库筛选针对野生型或点突变抗原的特异性抗体。例如，该方法可以参见文献“Proc.Natl.Acad.Sci.USA106,3071-6.(2009)”。

本发明的又一个方面提供了一种用于筛选能够特异性识别靶抗原的抗体或抗体片段的试剂盒，其包括本发明所述的噬菌体展示文库。所述试剂盒还可以包括用于筛选抗体的其它试剂，例如，固定化试剂，如链亲和素、中性链亲和素（neutravidin）等。

实施例

材料：

LB培养基（液体配方：细菌培养用胰蛋白胨10g、细菌培养用酵母提取物5g、NaCl5g，5M NaOH（约0.2mL）调节pH值至7.0，加水定容至1L；固体配方：液体配方+15g/L琼脂）。

2YT培养基(液体配方：16g胰蛋白胨、10g酵母提取物、5gNaCl加水配置成1L培养基；固体配方：每1L2YT液体培养基中加入12g琼脂粉)。

SOC培养基：（Life technologies，cat.no.15544-034）。

抗生素：50mg/L羧苄青霉素（Sigma，cat.no.C1389）、25mg/L卡那霉素（Fisher，cat.no.AC61129）、10mg/L四环素（Sigma，cat.no.T7660）、10mg/L氯霉素（Sigma，cat.no.C0378）、0.25mg/L尿嘧啶核苷（Sigma，cat.no.U3750）。

感受态细胞CJ236（Takara，9053）、感受态细胞SS320（Lucigen，cat.no.60512）、感受态细胞E.coli DH5α（Takara,cat.no.9057）、感受态细胞E.coli BL21(DE3)-pRARE2（Life technologies，cat.no.C6060-03）。

辅助噬菌体M13K07（Fisher scientific，cat.no.50-811-731）。

PEG/NaCl(20%PEG-8000(w/v)，2.5M NaCl，混合后灭菌保存)。

Glycerol biotech，等级>99.7%(Bioshop,cat.no.GLY001.404)、PMSF（sigma，cat.no.P7626-25G），

试剂盒：QIAGEN SPIN M13试剂盒（QIAGEN，cat.no.27704）、QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，cat.no.28104）、QIAprep SpinMiniprep试剂盒（Qiagen，cat.no.27173）。

生物酶：T4多聚核苷酸激酶（New England Biolabs，cat.no.B0201S）、T7DNA聚合酶（New England Biolabs，cat.no.M0274S）、DpnI(New England Biolabs，cat.no.R0176L)、In-Fusion HD EcoDryCloning kits（Clontech，cat.no.638909）、PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶（Agilent Technologies，cat.no.600670）、BseR1（New EnglandBiolabs，cat.no.R0581S）。

dNTP、ATP和DTT：dNTP（dATP、dCTP、dGTP和dTTP各10mM，Fermentas，cat.no.R0192）、ATP（Life technologies，cat.no.18330-019）、DTT（Life technologies，cat.no.D1532）。

1.0M Tris-HCl,pH11.0，按照（分子克隆实验指南，第三版）中所记载的方法配制。

Ni-NTA填料（QIAGEN,cat.no.30250）。

E.coli OmniMAX^TM2T1Phage-Resistant(T1R)(Invitrogen，GrandIsland，NY)。

Nunc MaxiSorp96孔和384孔平底盘(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)。

磷酸盐缓冲液(PBS)(137mM NaCl,3mM KCl,8mM Na₂HPO₄,1.5mM KH₂PO₄，调节pH至7.4，灭菌保存)。

咪唑（Sigma，cat.no.I0125-5kg）。

PB溶液(1×PBS，0.5%牛血清蛋白(BSA))。

Safe DNA凝胶染液(Invitrogen，Grand Island,NY)。

TAE溶液(40mM Tris-acetate，1.0mM EDTA，调节pH至8.0，灭菌保存)。

TAE/琼脂糖胶(TAE溶液，1.0%(w/v)琼脂糖，1:10000(v/v)Safe DNA凝胶染液)。

实施例1：构建鼠源抗体噬菌体展示文库

高纯度dU-ssDNA的获得

1.在100μL CJ236大肠杆菌感受态细胞中加入1μL pUC-PD16F6质粒DNA，并置于冰上30分钟。

2.放置42℃水浴锅中，热击90秒后迅速将大肠杆菌转移到冰水中放置2分钟。

3.向热击后的CJ236中加入600μL2YT培养基，放于摇床中，37℃、220rpm下复苏培养60分钟。

4.用少量菌液涂布LB（含有50mL/L羧苄青霉素）板，37℃培养过夜以获得完全分离的单菌落。

5.次日挑取单菌落接种于1mL2YT(含有50mg/L羧苄青霉素和30mg/L氯霉素)培养液中37℃摇床培养2小时。

6.加入辅助噬菌体M13K07超感染，并加入50mg/L卡那霉素，之后37℃继续摇床培养6小时。

7.将活化后的1mL菌液转入30mL2YT（含有50mg/L羧苄青霉素、50mg/L卡那霉素和0.25mg/L尿嘧啶核苷）培养基中，37℃震荡培养过夜。

8.次日离心（8000转，温度4℃）沉淀菌体，上清用PEG/NaCl沉淀噬菌体，然后使用QIAGEN SPIN M13试剂盒提取含dU单链DNA（即，dU-ssDNA），以此方法获得20ug高纯度dU-ssDNA。

杂双链CCC-dsDNA的合成

9.取序列5-24所示的每种寡核酸链0.6ug，分别加T4多聚核苷酸激酶磷酸化1小时，反应体系为：2μL10×TM buffer、2μL10mMATP、1μL100mM DTT，2μL T4多聚核苷酸激酶(10U/μL)和总量0.6ug的突变寡核酸，加水至总体积20μL。

10.在20μg步骤8中所提纯的dU-ssDNA中，加入25μL10×TMbuffer和步骤9中磷酸化的每种（每一突变位点需寡核苷酸链总量0.6ug）寡核酸链，加水至250μL。90℃加热3分钟，接着50℃加热5分钟，然后室温（20-22℃）放置5分钟。使磷酸化的寡核酸链退火结合至dU-ssDNA模板。

11.在退火后的混合物中加入10μL10mM ATP、25μL40mMdNTP、15μL100mM DTT、5μL T4DNA连接酶(400U/μL)和3μL T7DNA聚合酶(10U/μL)，室温反应过夜。利用T7DNA聚合酶和T4DNA连接酶合成CCC-dsDNA（闭合环状双链DNA）：

12.使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化所述DNA，收率在20ug以上。

电转构建噬菌体表面展示抗体文库

13.将从步骤13中获得的20ug CCC-dsDNA置于冰水混合物中冷却，同时化冻350μL感化态大肠杆菌SS320和0.2cm电转杯。

14.混合DNA和感化态SS320后转入电转杯，于2.5kV、125Ω、50μF电转条件下转化SS320，随后加入预热至37℃的1mL SOC到电转杯。

15.混合后的转化产物转入25mL SOC培养液中37℃震荡培养30分钟。

16.10倍梯度稀释（最高稀释度为10⁸倍），将5ul各梯度稀释的菌液涂布于LB(含有50mg/L羧苄青霉素)培养板上，37℃过夜培养。选择培养板上的菌落均独立分布的稀释倍数，清点菌落数，以计算所构建文库的容量。

17.将电转化后的菌液转入500mL2YT(含有50mg/L羧苄青霉素和25mg/L卡那霉素)中，37℃震荡过夜，离心沉淀菌体，PEG/NaCl沉淀上清，获得噬菌体展示的Fab抗体文库。长期保存于-80℃冰箱中。

实施例2：野生型抗原和点突变抗原的获得

1.以Mammalian Gene Collection（MGC）（http://mgc.nci.nih.gov）中Kras（NP_004976.2）蛋白的基因序列（如序列31所示）为模板，以序列25和26所示的寡核苷酸为引物，配制25μL PCR反应体系，该体系为：100ng DNA模板、2.5μL Pfu DNA聚合酶缓冲液（AgilentTechnologies公司）、0.5μL Pfu DNA聚合酶（Agilent Technologies公司）、200μmol dNTPs、0.2μmol正向引物、0.2μmol反向引物，加无菌水补足体积25μL。进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性3分钟，然后进行28个循环（每个循环为：95℃变性，30秒；55℃退火，30秒；68℃延伸，1分钟/kb），然后68℃延伸20分钟。

2.利用内切酶BseR1（New England Biolabs公司）酶切处理p28BIOH-LIC载体（具有N端Avi标签和C端6×His标签）（GenBankaccession EF442785)，反应体系为：10ug载体DNA加入15μL BseRI和60μL BseR1内切酶缓冲液（New England Biolabs公司），加入无菌水补充至600μL。反应条件为：在37℃下，反应2h。

3.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，向25μL PCR产物中加入1μL DpnI酶，37℃下温浴1h，以去除甲基化的模板DNA。

4.利用QIAprep Spin Miniprep试剂盒（即质粒提取试剂盒）分别纯化酶切载体和PCR产物，然后使其进行连接反应。反应体系为：在一管In-Fusion（Clontech，cat.no.638909）酶中分别加入2μL酶切纯化后的p28BIOH-LIC载体(50ng/μL)和3μL PCR产物(100ng/μL)，反应条件为37℃半小时。

5.将连接产物转化进入大肠肝菌E.coli DH5α感受态细胞中，反应步骤为：在100μL E.coli DH5α感受态细胞中加入1μL连接产物，并置于冰上30分钟。放置42℃水浴锅中，热激90秒后迅速将E.coliDH5α感受态细胞转移到冰水中放置2分钟。向热激后的E.coli DH5α感受态细胞中加入600μL LB培养基，放于摇床中，37℃、220rpm下复苏培养60分钟，将复苏后的感受态细胞涂于含有5%蔗糖和25mg/L卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中培养过夜。

6.从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有5mL含有25mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm下生长过夜。次日，进行菌落PCR鉴定，反应体系为：0.5uL菌液、1μL Pfu DNA聚合酶缓冲液（Agilent Technologies）、0.1μL Pfu DNA聚合酶（AgilentTechnologies）、100μmol dNTPs、0.2μmol正向引物、0.2μmol反向引物，加无菌水补足体积10μL。进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性3分钟，然后进行25个循环（每个循环为：95℃变性，30秒；55℃退火，30秒；72℃延伸，1分钟/kb），然后72℃延伸20分钟。取出0.5mL菌落PCR鉴定为阳性的单克隆菌液保存菌种（加入15%甘油）于-80℃，剩余的使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒提取质粒，送DNA测序（南京金斯瑞生物科技有限公司），经以上步骤获得了表达野生型Kras蛋白的质粒。

7.以步骤6中获得的Kras（氨基酸1-166）蛋白表达质粒为模板，利用Quick change sit-directed mutagenesis kit（点突变试剂盒）（AgilentTechnologies）中所述的方法设计引物，引物序列如27、28（G12R）和29、30（G13R）所示，进行PCR反应，反应体系为：20ng DNA模板、2.5μL Pfu DNA聚合酶缓冲液（Agilent Technologies）、0.5μL PfuDNA聚合酶（Agilent Technologies）、200μmol dNTPs、0.2μmol正向引物、0.2μmol反向引物，加无菌水补足体积25μL。反应程序为：95℃预变性3分钟，然后进行18个循环（每个循环为：95℃变性，30秒；55℃退火，30秒；68℃延伸，1分钟/kb），然后68℃延伸20分钟，由此获得Kras G12R（如序列32所示）和G13R（如序列33所示）点突变序列。

8.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，将25μL PCR产物与1μLDpnI酶混合，37℃下温浴1h，以去除模板DNA。按照步骤5，将15μL经DpnI酶消化后的PCR产物转化入大肠肝菌E.coli DH5α感受态细胞中，并将转化后的感受态细胞涂于含有25mg/L卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中培养过夜。

9.从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有5mL含有25mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm下生长过夜。次日，进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系为：0.5uL菌液、1μL Pfu DNA聚合酶缓冲液（Agilent Technologies）、0.1μL Pfu DNA聚合酶（AgilentTechnologies）、100μmol dNTPs、0.2μmol正向引物、0.2μmol反向引物，加无菌水补足体积10μL。反应程序为：95℃预变性3分钟，然后进行25个循环（每个循环为：95℃变性，30秒；55℃退火，30秒；72℃延伸，1分钟/kb），然后72℃延伸20分钟。取出0.5mL菌落PCR鉴定为阳性的单克隆菌液保存菌种（加入15%甘油）于-80℃，剩余的使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒提取质粒，送DNA测序，由此获得表达Kras G12R和G13R点突变蛋白的质粒。

10.将步骤6和步骤9中所获得的三种融合质粒（Kras野生型，KrasG12R，KrasG13R）分别转化进入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-pRARE2菌株中，并将转化后的感受态细胞分别涂于含有25mg/L卡那霉素和30mg/L氯霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中培养过夜。

11.从LB平板中分别挑取含有步骤10中所述的三种质粒的单克隆，并分别接种于50mL含有25mg/L卡那霉素和30mg/L氯霉素的LB培养基中，在37℃，220rpm/分钟的条件下生长过夜。次日，分别取40mL过夜生长的菌液接种于2L含有25mg/L卡那霉素和30mg/L氯霉素的LB培养基中，37℃条件下，在摇床中生长至OD600约为1时，降温至18℃，并用IPTG（1mM）诱导蛋白表达，18℃生长18小时后，分别收取细胞并各自保存于-80℃以备用。

12.分别利用200ml含有20mM Tris-HCl（pH7.5）、300mMNaCl、5%甘油、1mM PMSF的细胞裂解液重悬步骤11中所述的三种冻存细胞。重悬后，分别于冰上超声波（Virtis408912，Virsonic）破碎细胞（100W，工作5秒，间歇7秒，共进行10分钟）。继而使用BeckmanJLA-16.250转子在16000rpm/分钟、4℃下离心50分钟，分别收集上清液。

13.亲和层析纯化：分别将上清液与分别用细胞裂解液平衡好的2mLNi-NTA填料（QIAGEN）在4℃下混合1小时，然后利用亲和层析法进行纯化。首先分别使用50mL含有20mM Tris-HCl（pH7.5）、500mM NaCl、10mM咪唑的缓冲液清洗结合有野生型和点突变Kras融合蛋白的Ni-NTA填料，继而分别用15mL含有20mM Tris-HCl（pH7.5）、500mM NaCl、250mM咪唑的洗脱液洗脱野生型和点突变Kras融合蛋白。

14.利用FPLC系统进一步通过分子筛纯化步骤13中得到三种Kras融合蛋白：经过亲和层析纯化的Kras野生型和两种突变型融合蛋白通过FPLC（fast-protein liquid chromatography system）纯化系统（GE Healthcare Life Sciences），利用HiLoad16/60Superdex75Prep Grade分子筛柱（GE Healthcare Life Sciences）纯化，流动相为20mM Tris-HCl（pH7.5）、200mM NaCl和1mM DTT。最后得到了纯度为95%以上的野生型Kras融合蛋白（即，野生型Kras抗原）和点突变KrasG12R，KrasG13R融合蛋白（其中KrasG12R即实施例3中使用的点突变Kras抗原）。

15.所得到的纯蛋白样品经质谱及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱验证。

实施例3：基于负筛表面决定簇特异性结合的抗体筛选

1.在Nunc MaxiSorp96孔平底盘的一列中的8个孔中加入100μL5μg/mL的溶于PBS中的neutravidin（以下简称“NA”，得自ThermoScientific公司），固定2小时，置于4℃条件下缓慢摇动过夜。（针对每一种靶抗原筛选使用一列8个孔，其中，最后一个孔作为对照孔，对照孔用以比较加与不加靶抗原状态下所得到的洗脱噬菌体的量）。将该96孔平底盘作为筛选盘。

同时，按照相同的方法固定一个负筛盘（Nunc MaxiSorp96孔平底盘）。与筛选盘对应，同样使用一列8个孔。

2.倒掉筛选盘和负筛盘中的溶液，在每个孔中加入200μL PB溶液作为封闭液，室温下缓慢摇动，封闭1小时。

3.倒掉筛选盘和负筛盘中的PB溶液后，用PT溶液（PBS，0.05%Tween20）冲洗4次。

4.在负筛盘结合了NA的8个孔中加入100μL的含有0.3μM野生型Kras抗原（WT抗原）的PBT溶液（PBS，0.05%Tween20，0.5%BSA），并在室温下轻摇孵育1小时。

在筛选盘中，结合了NA的8个孔中除对照孔外，每个孔中各加入100μL的含有0.3μM上述点突变Kras抗原的PBT溶液，并在对照孔中加入100μL的含有0.3μM WT抗原的PBT溶液，室温下轻摇孵育1小时。

（1ug NA可以结合61.4pmol生物素，所以，由于抗原上有生物素标签，100μL5ug/mL的NA可以结合100μL0.3μM的抗原）

5.除去两种盘中的剩余溶液，并利用PT溶液冲洗4次。

6.在负筛盘结合了NA的每个孔中加入100μL的含有噬菌体文库的PBT溶液，并在室温下轻摇孵育1小时。

同时，在筛选盘中结合了NA的每个孔中加入100μL的含有10μM生物素（Sigma：B4501-100MG）的PBT溶液（包括对照孔），并在室温下轻摇孵育1小时。

7.收集负筛盘的每个孔中的噬菌体文库溶液，分别放入1.5mL离心管中，并加入野生型Kras抗原至抗原浓度为1μM。

8.倒掉筛选盘中的生物素溶液，并利用PT溶液冲洗4次。

9.将步骤7获得的离心管中的溶液转移到筛选盘中结合了NA的每个孔里，并在室温下轻摇孵育1小时。

10.倒掉筛选盘中的剩余噬菌体溶液并用PT溶液冲洗10次。

11.在筛选盘结合了NA的每个孔中加入100μL100mM的HCl溶液，并在室温下轻摇孵育5分钟，以洗脱结合在其上的噬菌体。收集其中除对照孔以外每个孔中的HCl洗脱溶液至1.5mL离心管中；同时，从对照孔中单独收集HCl洗脱溶液至另一个1.5mL离心管中。然后在每一个1.5mL离心管中加入1/8体积的pH为11的1.0MTris-HCl以中和pH。

12.取一半体积的从突变抗原固定的孔中收集的含有洗脱噬菌体的溶液，加入10倍体积的含有E.coli OMNI Max^TM2细胞（OD₆₀₀为0.6-1.0）的2YT/tet（四环素10ug/ml）培养液中，37℃条件下在200RPM摇床上孵育30分钟。

13.进行10倍系列稀释以确定富集比：在一新的96孔平底盘的第一列的每一个孔中各加入90μL2YT。在一列8个孔的第一个孔中加入10μL上述洗脱的噬菌体，充分混合。随后从第一个孔转移其中的10μL至同一列的下一个孔中，重复此过程至同一列的最后一个孔。相对应的，在另一96孔平底盘的一列8个孔的每一个孔中各加入90μL的对数生长中期的E.coli OMNI Max^TM2细胞，从梯度稀释的平底盘转移10μL噬菌体到对应的孔中，充分混合，37℃条件下孵育半小时。从不同稀释浓度的孔中取5μL接种于含有carb（羧苄青霉素50ug/ml）的LB平板中，以用于确定洗脱噬菌体的数量，37℃条件下孵育过夜。对每个菌斑中的噬菌体的数量进行计数。

14.向步骤12中的培养液中加入终浓度为10¹⁰/mL的M13K07辅助噬菌体，并在37℃条件下在200RPM摇床上孵育30分钟。

15.转移步骤14的噬菌体溶液至30mL含有50ug/ml carb和25ug/ml kan（卡那霉素）抗生素的2YT培养基中，并在37℃条件下在200RPM摇床上孵育过夜。

16.次日，4℃条件下5000RPM离心10分钟以除去菌体，获得上清。

17.转移上清至新的离心管中，并加入1/5体积的PEG/NaCl，在冰上孵育20分钟。

18.4℃条件下13000RPM离心20分钟，除去上清；4000RPM继续离心1分钟以除去剩余上清。

19.利用1mL的PBT溶液重悬噬菌体并转移至1.5mL的离心管中。

20.4℃条件下13000RPM离心5分钟以除去未溶解的物质，并转移上清至新的1.5mL的离心管中。

21.重复筛选过程（步骤1-20）3次。收集第3和4次的噬菌体，并按照步骤13，在含有carb抗生素的LB平板中筛选单克隆用于噬菌体ELISA实验。

实施例4：噬菌体结合ELISA分析实验

1.Nunc MaxiSorp384孔平底盘的每2×2的四个孔为一组，在每个孔中加入30μL的含有5ug/mL的neutravidin的PBS溶液，4℃固定过夜。

2.在96孔深孔盘中，每孔孵育1mL含有carb、M13K07（终浓度10¹⁰pfu／ml）的2YT培养基并分别接种实施例3步骤21中筛选所得到的不同的单克隆菌落，37℃条件下在200RPM摇床上孵育过夜。

3.次日，在384孔平底盘的每个孔中加入60μL的PB溶液室温封闭1至1.5小时。

4.在384孔平底盘的每一组的第一个孔中加入30μL含有0.3μM野生型Kras抗原的PBT溶液；在每一组的第二个孔中加入30μL含有0.3μM点突变抗原KrasG12R的PBT溶液；在每一组的第三个孔中加入30μL含有0.3μM KrasG13R的PBT溶液；在每一组的第四个孔中加入30μL PBT溶液，轻摇孵育1小时。

5.除去盘中的溶液，并利用PT溶液冲洗4次。

6.4000RPM离心96孔深孔盘中的培养过夜的菌液10分钟，获得噬菌体上清。

7.利用PBT溶液10倍稀释噬菌体上清。

8.转移30μL稀释的噬菌体上清至384孔平底盘的每一孔中。使每一个展示单克隆抗体的噬菌体分别与野生型Kras抗原、点突变抗原KrasG12R、对照点突变抗原KrasG13R和BSA充分结合。

9.室温下轻摇孵育1小时。

10.利用PT溶液冲洗8次

11.每孔加入30μL利用PBT溶液稀释5000倍的HRP标记的抗M13抗体。

12.室温下轻摇孵育30分钟。

13.利用PT溶液冲洗8次

14.在每孔中加入30μL新鲜配置的TMB底物（得自Kirkegaard

&Perry Laboratories,Gaithersburg,MD公司），显色5-10分钟。

15.每孔加入30μL的1.0M H₃PO₄溶液终止反应，并利用酶标仪（Synergy^TMMx Multi-Mode Microplate Reader）在450nm光谱下读反应盘。

16.对比每一组中的点突变抗原和WT抗原的信号强弱，对所得单克隆进行评估。

结果显示（如图5，所示4个信号从左至右依次为Kras WT、KrasG12R、KrasG13R和Neutravidin，分别对应步骤4中所述孔1-4），筛选得到对点突变抗原KrasG12R具有高度特异性的抗体（代号为7E08，其轻链和重链的DNA序列分别如序列34和35所示），其ELISA信号强度超过对野生型抗原Kras的10倍以上，并且也远远高于突变抗原KrasG13R。

Claims

1.一种噬菌体展示文库，包含一系列各自独立地具有三维结构的抗体性多肽，所述多肽中的每一者均包含具有抗体性重链CDR1结构域、抗体性重链CDR2结构域和抗体性重链CDR3结构域的重链、以及具有抗体性轻链CDR1结构域、抗体性轻链CDR2结构域和抗体性轻链CDR3结构域的轻链，其特征在于：所述抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有强随机突变性位点，所述强随机突变性位点是位于所述多肽三维结构表面上的用于结合靶抗原的且非保守性的位点，所述强随机突变性位点是由强随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述强随机突变简并密码子不包括终止密码子。

2.根据权利要求1所述的噬菌体展示文库，其中所述抗体性多肽的氨基酸序列采用Chothia编号系统编号时，所述强随机突变性位点为：所述抗体性重链CDR1结构域的第33位氨基酸，所述抗体性重链CDR2结构域的第50、52、56、58位氨基酸，所述抗体性重链CDR3结构域的第95至（95+k）位氨基酸，所述抗体性轻链CDR1结构域的第30、31位氨基酸，所述抗体性轻链CDR2结构域的第50位氨基酸，以及所述抗体性轻链CDR3结构域的第91至（91+j）位氨基酸；其中k为3至14的整数，j为3至6的整数。

3.根据权利要求1或2所述的噬菌体展示文库，其中所述抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有弱随机突变性位点，所述弱随机突变性位点是溶剂可及且非保守性的位点，其是由弱随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述弱随机突变简并密码子不编码破坏所述多肽三维结构稳定性的氨基酸。

4.根据权利要求3所述的噬菌体展示文库，其中所述弱随机突变性位点各自所包括的氨基酸包括：在天然鼠源抗体相应位点处的出现频率至少为65%的氨基酸和/或出现频率之和至少为65%的氨基酸。

5.根据权利要求3所述的噬菌体展示文库，其中所述抗体性多肽的氨基酸序列采用Chothia编号系统编号时，

6.根据权利要求5所述的噬菌体展示文库，其中所述强随机突变简并密码子选自NNY和NVY。

7.根据权利要求5所述的噬菌体展示文库，其中：

8.一种噬菌体质粒组合物，包含一系列噬菌体质粒，该质粒各自独立地包含位于复制子和启动子下游的DNA，所述DNA各自独立地编码一种具有三维结构的抗体性多肽，所述多肽中的每一者均包含具有抗体性重链CDR1结构域、抗体性重链CDR2结构域和抗体性重链CDR3结构域的重链、以及具有抗体性轻链CDR1结构域、抗体性轻链CDR2结构域和抗体性轻链CDR3结构域的轻链，其特征在于：所述抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有强随机突变性位点，所述强随机突变性位点是位于所述多肽三维结构表面上的用于结合靶抗原的且非保守性的位点，所述强随机突变性位点是由强随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述强随机突变简并密码子不包括终止密码子。

9.根据权利要求8所述的噬菌体质粒组合物，其中所述噬菌体质粒还各自独立地包含位于所述DNA下游的、编码噬菌体pIII蛋白C端结构域的DNA，并且其中所述多肽与所述噬菌体pIII蛋白C端结构域构成融合蛋白。

10.根据权利要求8所述的噬菌体质粒组合物，其中所述DNA中的一种具有如序列1所示和序列2所示的DNA序列。

11.一种引物组合物，其包含分别如序列5-24所示的DNA序列。

12.权利要求11所述的引物组合物在用于构建权利要求1-7中任意一项所述的噬菌体展示文库中的用途。

13.一种宿主细胞库，其包含一系列宿主细胞，该宿主细胞各自独立地含有权利要求8-10中任意一项所述的噬菌体质粒组合物中的任意一种噬菌体质粒，其中所述宿主细胞为能够被噬菌体感染的细胞。

14.权利要求1-7中任意一项所述的噬菌体展示文库在筛选特异性识别靶抗原的抗体中的用途，优选地，所述靶抗原包括野生型抗原和点突变抗原。