CN104797938A - 在新生儿的筛查中诊断半乳糖血症的方法 - Google Patents

在新生儿的筛查中诊断半乳糖血症的方法 Download PDF

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Abstract

公开通过在生命的5-7天之前测定GAL-1-P浓度诊断在来自新生儿的血液样品中的半乳糖血症的方法。除去干扰化合物允许使用质谱法筛查半乳糖血症的新生儿中的GAL-IP水平的更特定的且因此更精确的测定。当研究来自尚未实现GAL-IP的稳态的孩子的样品时(即在生命的5-7天之前)，这是至关重要的。

Description

在新生儿的筛查中诊断半乳糖血症的方法
发明领域
本发明公开通过测定在生命的5-7天之前采取的来自新生儿的血液样品中的GAL-1-P浓度诊断半乳糖血症的方法。
一般背景
半乳糖血症是危及生命的先天性代谢缺陷。其由酶半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GALT)中的缺陷引起。GALT在半乳糖的代谢中是重要的且其在半乳糖-1-磷酸(GAL-1-P)向葡萄糖-6-磷酸(GLC-6-P)的转化中催化重要步骤。在具有半乳糖血症的患者中该转化非常低或不存在，导致GAL-1-P及其代谢物的有害的水平。
在很多国家中半乳糖血症筛查是国家新生儿筛查项目的一部分。目前，酶活性测试(即Beutler测试)是用于半乳糖血症筛查的主要方法(BeutlerE,Baluda MC.A simple spot screening test for galactosemia.J Lab Clin Med1966；68:137-141)。Beutler测试的主要优点是其测量酶活性而不是代谢物浓度。主要缺点是其要求酶活性是完整无缺的。酶对热是敏感的且可以通过过多的热量被致使失活，因此导致假阳性。此外，Beutler测试需要属于其自身的样品。不可能使其与其他的筛查测试多路复用(multiplex)。
当筛查半乳糖血症时还可能使用代谢物作为生物标记物。使用质谱法筛查半乳糖血症基于的生物标记物先前已在WO0210740中被描述。简要地，升高的水平的磷酸己糖(hexose-monophosphate)被用作疾病的生物标记物。这基于半乳糖血症导致GAL-1-P的升高的水平的事实，所述GAL-1-P是磷酸己糖。理想地，筛查应当单独地基于GAL-1-P。然而，在质谱法(MS)中不可能区分不同类型的磷酸己糖。在质谱法测定之前使用液相色谱法(LC-MS)以便区分它们是可能的，但由于高的样品处理量的需求，这在新生儿筛查中是不切实际的。使用总的磷酸己糖作为生物标记物的合理性是在具有半乳糖血症的患者中GAL-1-P水平变得升高超过所有的其他磷酸己糖的水平。总的磷酸己糖的异常浓度明确地指示半乳糖血症。此方法在检测接收含有半乳糖的食物的患者上是有效的。母乳、牛奶以及基于奶的食物包含由通过1,1-葡萄糖苷键连接的半乳糖和葡萄糖单元组成的乳糖。其在消化道中迅速地转化为半乳糖和葡萄糖。因此正常饮食的新生儿暴露于高水平的半乳糖且如果他们患有半乳糖血症，他们的GAL-1-P水平将显著地增加。
然而，在出生时若干类型的磷酸己糖以低水平存在于新生儿中，主要是GLC-6-P。GLC-6-P的存在引起在总的磷酸己糖测定中的本底水平，这转而对筛查方法的特异性和灵敏性具有有害影响。为了使磷酸己糖方法适当地起作用，GAL-1-P的水平必须大体上超过GLC-6-P的水平以便能够检测阳性样品。虽然GAL-1-P的水平在具有半乳糖血症的患者中在出生时升高，但该水平仅在摄食包含半乳糖的食物若干天后显著地上升。通常，稳态在出生后3至5天之后获得。在取样之前必须使孩子已经摄食大量的半乳糖的事实是筛查中的主要缺点。在许多国家中新生儿筛查样品在3至5天之前采取，此外，某些新生儿具有喂食问题并且在较晚的时间达到稳态水平。
如早前所提到，GAL-1-P的水平在半乳糖血症患者中在出生时已经升高。如果由GLC-6-P的存在产生的本底可以被除去，在新生儿中筛查半乳糖血症将是可能的。本发明提供化学地消耗GLC-6-P而不影响GAL-1-P的手段，从而使得可以使用质谱法测量GAL-1-P而不依赖于取样时间筛查半乳糖血症。另外的优点是用MS的新生儿筛查允许多路复用，即在一个样品中可以组合若干筛查测试。
4.发明概述
本发明使得GAL-1-P水平的分析是更特定的。除去干扰化合物允许使用质谱法筛查半乳糖血症的新生儿中的GAL-1P水平的更特定的且因此更精确的测定。当研究来自尚未实现GAL-1P的稳态的孩子的样品时(即在生命的5-7天之前)，这是至关重要的。
5.发明的详细公开内容
本发明公开通过修饰磷酸己糖的羰基来测定来自新生儿的早期血液样品中的GAL-1-P浓度的方法。羰基的修饰通过氧化、还原或与胺反应进行。
羰基的还原优选地通过将硼氢化钠添加到样品中来实现且羰基的氧化优选地通过使样品与硝酸或托伦斯试剂或费林试剂反应来实现。羰基优选地通过使样品中的磷酸己糖与肼反应被修饰。肼选自N2H4、单甲基肼、1,1-二甲基肼、1,2-二甲基肼、异烟肼、异丙烟肼、肼苯哒嗪、苯乙肼、2,4-二硝基苯肼或苯肼。
来自新生儿的样品通常在出生后3-5天被收集，但根据目前的方法，样品仅在刚刚出生后可以被收集。血液样品中的GAL-1-P浓度优选地通过质谱法测量。
本发明基于在1位没有被修饰的所有的糖的化学消耗。单糖处于直链和环的形式之间的平衡。此平衡基于被称为正位异构化的过程，其中5位羟基与糖的1位形成键，产生在酮基位置和1位之间的氧桥(图1)。醛基随后形成羟基。在直链形式中糖是远远更有反应性的，因为酮基的氧比碳水化合物的其他的氧(当其作为羟基存在时)远远更有反应性。当将官能团添加到在1位(在1位修饰)的糖时，不再可能将其转化为直链形式且其被锁定在环的形式中。当糖被锁定在环的形式时其不再具有酮反应性。
在本发明中，允许主要与醛和酮反应但不与羟基反应的试剂在分析之前与样品反应。在1位没有被修饰的所有的糖将反应且形成其他的化合物。
这允许消耗GLC-6-P而不影响GAL-1-P的水平。这意味着在反应后GLC-6-P将不再存在于样品中。因此只有1-修饰的磷酸己糖将有助于测量总的磷酸己糖。本发明利用在1位被修饰的糖的羰基(即醛基或酮基)被保护以免化学反应的事实。使用的化学反应靶向羰基而不影响羟基中的氧。有可以被利用的大量的熟知的化学反应。其通常落在以下的类别中：对技术人员将是熟知的羰基的还原或氧化或与胺的反应。
羰基的还原，例如硼氢化钠还原。NaBH4将还原多种有机羰基，将酮和醛转化为醇。对醛和酮的金属氢化物还原和有机金属加成，二者均减小羰基碳的氧化态，且可被分类为还原。如注意的是，其通过强的亲核性物质在亲电性碳上的进攻进行。羰基化合物向醇或向烃的其他有用的还原可通过不同的机制发生。例如，氢化(Pt、Pd、Ni或Ru催化剂)、与乙硼烷的反应、以及通过在羟基或胺溶剂中的锂、钠或钾还原都已经被报告将羰基化合物转化为醇。然而，对于这种转换，络合的金属氢化物通常是优选的，因为其以高收率给出较清洁的产物。
羰基的氧化，例如硝酸、托伦斯试剂或费林试剂。羰基的碳原子具有相对高的氧化态。这反映在描述的大部分反应到现在为止未引起氧化态的改变(例如缩醛或亚胺形成)或产生还原(例如有机金属加成和脱氧)的事实。最常见和特色的氧化反应是将醛转化为羧酸。优选的氧化试剂是作为氧化剂的Ag(+)和Cu(2+)。
与胺的反应，例如席夫碱形成或与肼的反应。醛和酮与氨或1o-胺反应形成亚胺衍生物(也被称为席夫碱(具有C＝N官能的化合物))。用于修饰糖中的1位的羰基(即醛基或酮基)的优选的胺是肼(N2H4)，但可以使用任何的肼衍生物：多种被取代的肼是已知的，且若干种自然地发生。某些实例包括：
●单甲基肼，其中肼分子上的氢原子中的一个已被甲基(CH3)替换。由于肼分子的对称性，哪个氢原子被替换并不重要。
●1,1-二甲基肼(非对称的二甲基肼，UDMH)和1,2-二甲基肼(对称的二甲基肼)是其中两个氢原子被甲基替换的肼。
●异烟肼、异丙烟肼、肼苯哒嗪和苯乙肼是分子包含肼状结构的化合物。
●2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH)通常用于测试有机化学和临床化学中的酮和醛。
●苯肼，C6H5NHNH2，被发现的第一种肼。
这些反应产生具有不同分子质量的化合物且因此可以容易地通过质谱法被区分。这使得可以测定GAL-1-P的升高的水平而不依赖于半乳糖暴露。串联质谱法被广泛地用于新生儿筛查，这是由于在单个样品中可以同时分析各种各样的化合物的事实。这使得可以在单次分析中筛查大量的疾病。被引入到筛查的任何化学反应应该优选地不干扰对其他分析物的分析。为了实现这个，我们选择使用肼，然而任何羰基特定的试剂都可以用于改进半乳糖血症筛查其本身。
在新生儿筛查中，肼被广泛地用于使筛查酪氨酸血症成为可能。在这种情况下，肼被用于释放蛋白质结合的琥珀酰丙酮以便其可以通过质谱法被测定。这个方法的原因是在酪氨酸血症中产生过多的琥珀酰丙酮。升高的血液琥珀酰丙酮水平将是酪氨酸血症的吸引人的生物标记物，然而琥珀酰丙酮迅速地与血液中存在的大量的蛋白质反应。琥珀酰丙酮与蛋白质形成共价键。肼以如此的方式反应以破坏与蛋白质的键，因此释放琥珀酰丙酮。以这种方式，琥珀酰丙酮可以被用作生物标记物，不管其对蛋白质的反应性。肼的这个用途从根本上与我们在半乳糖血症筛查利用的用途不同。我们使用肼以降低干扰化合物的水平，然而在酪氨酸血症中的肼的功能是增加生物标记物的水平。
肼被认为不干扰用于新生儿筛查的其他的生物标记物。因此肼是用于半乳糖血症筛查的吸引人的试剂，因为其改进方法的灵敏性和选择性而不干扰其他的新生儿筛查分析物。
在串联质谱法中，分析物首先根据其质荷比(mass to charge ratio)被选择。其随后被碎裂且特定的碎片被检测。质荷比与碎片质量的组合被认为是过渡(transition)。使用过渡允许基于两种化学性质即分子质量和碎裂方式对化合物的特定的测定。由于所有的磷酸己糖具有相同的质量并且以相同的方式碎裂，不可能单独通过质谱法来区分不同的磷酸己糖(HMP)。使用在线液相色谱法，可以在质谱法之前分离HMP。以这种方式，可以区分各种HMP。然而，这是耗时间的且在新生儿筛查中是不切实际的。化学地消耗在1位未被修饰的所有的HMP(最重要地GLC-6P)增加方法的特异性而不需要色谱法。
本发明使得可以使用代谢物GAL-1-P作为疾病的生物标记物通过质谱法筛查半乳糖血症(不管暴露于半乳糖的水平)。在具有半乳糖血症的患者中GAL-1-P水平升高。然而，仅在暴露于半乳糖之后GAL-1-P水平上升到远远超过GLC-6-P水平。所有的HMP具有相同的质量并且以相同的方式碎裂(即具有相同的过渡)。因此，GLC-6P提供本底，所述本底掩饰在暴露于半乳糖之前存在的轻度升高。半乳糖的主要来源是乳糖，所述乳糖以高浓度存在于乳和乳制品中。当被摄食时，乳糖迅速地转化为葡萄糖和半乳糖。半乳糖血症患者通常在暴露于半乳糖的三至五天之后达到GAL-1P的稳态。因此，除非GLC-6P没有从样品中除去，否则使用GAL-1P质谱法筛查半乳糖血症仅在使用在5天后采取的样品的情况下是可行的。多种筛查项目在此时间之前采取样品。此外，未曾暴露于半乳糖(例如通过葡萄糖滴喂食，对乳过敏)的孩子不能被筛查。
通过添加与在1位未被修饰的所有HMP反应的试剂，除去由其他HMP引起的本底信号。化学反应引起化合物质量的改变并且还改变其如何碎裂。这意味着其将不再提供用于HMP的过渡的信号。这使得可以筛查半乳糖血症而不考虑半乳糖暴露和取样时间。
附图说明
图1：单糖的直链和环的形式之间的平衡。
图2：半乳糖的羰基的还原。
图3：半乳糖的羰基的氧化。
图4：半乳糖的与胺的反应。
图5：GAL-1-P的校准曲线。
实施例1
样品
使用的样品是滤纸上的干燥的血斑(DBS)。还可以使用血清、血浆或全血样品。使用的阳性是来自Danish新生儿筛查样品的生物样本库的DBS，且代表被包含在生物样本库中的所有已知的半乳糖血症病例。直到2008年底，新生儿筛查样品在第6-7天采取。在2009年中取样日期变为在出生后48小时至72小时。幸运地，样品中的三个是足够近期的以在早期取样时间被取样(在表1中用“*”标记)。分析来自被认为是半乳糖血症的杂合子、是半乳糖血症的纯合子和是半乳糖血症的阴性的患者的DBS。阴性的DBS既是正常样品也是来自具有其他紊乱的患者的样品。
标准品
在盐溶液(水中的0.9g/LNaCl)中制备包含57.1mmol/LGAL-1P的GAL-1P标准的标准溶液。该溶液被用于制备校准品。
校准品
将血液收集于包含EDTA的10mL的venoject管中。使血液冷却以便减少GALT活性。将280μL的标准品添加到1720μL的冷却的血液中，提供8mmol/L的GAL-1P的最终浓度。进行一组1比1的稀释，导致包含4mmol/L、2mmol/L、1mmol/L、0.5mmol/L、0.25mmol/L、0.125mmol/L和0.0625mmol/L的GAL-1P的血液。将每个的75μL移取至标准新生儿筛查滤纸上。选择的校准品的浓度范围以覆盖在半乳糖血症新生儿中通常发现的以及在正常新生儿中发现的范围。允许校准品在室温下干燥过夜。干燥后，将样品储存于4℃下。
提取缓冲液
制备两种不同的提取缓冲液，一种有肼且一种没有。包含1.3mmol/L的13C6-Gal-1P的两种提取缓冲液由80％的甲醇和20％的水组成。可以使用其他比率的甲醇-水。此外，可以使用乙腈-水以及若干种其他溶剂体系。可以使用在从1mmol/L至30mmol/L的范围中的浓度。由于使用肼作为试剂，提取浓度不是关键的，仅仅重要的是使用过量。
提取
3.2mm直径的圆盘从DBS穿孔到微量滴定板的孔中。将100μL的提取缓冲液添加到每个孔中。提取缓冲液的精确的量是不重要的，然而关键的是，在一组中将相同量的内标添加到每个样品中。这通过将相同量的提取缓冲液添加到所有孔中被容易地确保。在提取期间将样品在室温下温和地摇动。在提取后，将提取物转移到新的板中。该板在40℃至50℃下温育至少45分钟以允许肼反应发生。此时，提取物准备好用于分析。在这个实施例中所有样品被穿孔两次以便确保可再现的结果。一组样品用有肼的提取缓冲液提取且一组没有。这使得可以观察肼的效果。
分析
样品在配备有1525μLC-泵和2777C自动进样器的Water Quattro微型三重四极质谱仪上分析。系统使用ESI离子化探针以流动注入分析模式操作。注入30μL的样品。可以注入任何体积的提取物。监测到以下的过渡：Gal-1P的295.1/79.1及13C6-Gal-1P 265.1/79.1。
结果
图5中示出在整个浓度范围中是线性的校准曲线。Gal-1P杂合子的平均浓度是3.0(无肼)和3.5(有肼)。Gal-1P纯合子的平均浓度是1.4(无肼)和有肼1.5(有肼)。Gal-1P阴性的平均浓度是0.19(无肼)和0.01(有肼)。相当清楚的是，添加肼降低阴性样品的测量中的HMP的水平而没有影响阳性的水平。
在WO0210740中在正常样品和来自具有其他疾病的患者的样品中的HMP的中值浓度被发现在<0.10至0.94的范围内。来自半乳糖血症患者的样品被发现在2.6nmol/L至5.2nmol/L的范围内。这些样品还取自Danish新生儿筛查生物样本库。然而，在WO0210740中使用的所有样品具有5至7天的取样时间。因此，来自半乳糖血症患者的所有样品应该包含稳态水平。我们发现，在没有肼处理的情况下，来自半乳糖血症阴性的患者的的样品水平是可比较的。当使用肼处理时，来自非半乳糖血症患者样品中的HMP水平显著地下降且是<0.1nmol/L。这对于在第2至3天采取的阳性样品中的一个是至关重要的。样品Y38421具有0.59nmol/L(在肼处理下0.56nmol/L)的HMP浓度。在没有肼处理的情况下，此样品将恰好在正常范围内且将不可能从正常样品中辨别其。如果使用没有肼的串联MS筛查样品，这将导致假阴性。事实上，具有较迟的取样时间的三个样品也将被误分类为：PK93-1820225,PK96-1900262和PK98-1610299。它们都在0.94nmol/L以下且因此当不使用肼时在HMP的正常范围内。使用肼以消耗除GAL-1P之外的其他HMP化合物使得可以将这些样品辨别为阳性。还感兴趣的是，阴性样品中的一个(10DEC18R065)在没有肼处理的情况下具有2.0nmol/L的HMP浓度且因此将被认为远远超过正常范围。在肼处理之后，此样品具有不可测量的水平的HMP。在这种情况下，在没有肼处理的情况下样品将变为假阳性但在肼处理的情况下被正确地指定为阴性。
表1
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种通过用氧化、还原或与胺的反应修饰干扰的磷酸己糖的羰基来测定来自新生儿的早期血液样品中的GAL-1-P浓度的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述羰基的所述还原通过将硼氢化钠添加到所述样品中来实现。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述羰基的所述氧化通过使所述样品与硝酸、或托伦斯试剂或费林试剂反应来实现。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品与肼反应。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述肼选自N2H4、单甲基肼、1,1-二甲基肼、1,2-二甲基肼、异烟肼、异丙烟肼、肼苯哒嗪、苯乙肼、2,4-二硝基苯肼或苯肼。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其中来自新生儿的所述样品在早于所述新生儿出生后5天被收集。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述血液样品中的所述GAL-1-P浓度通过质谱法测量。

Claims (8)

1.一种通过修饰磷酸己糖的羰基来测定来自新生儿的早期血液样品中的GAL-1-P浓度的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述羰基通过氧化、还原或与胺的反应被修饰。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述羰基的所述还原通过将硼氢化钠添加到所述样品中来实现。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述羰基的所述氧化通过使所述样品与硝酸、或托伦斯试剂或费林试剂反应来实现。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品与肼反应。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述肼选自N2H4、单甲基肼、1,1-二甲基肼、1,2-二甲基肼、异烟肼、异丙烟肼、肼苯哒嗪、苯乙肼、2,4-二硝基苯肼或苯肼。
7.根据权利要求1-6所述的方法，其中来自新生儿的所述样品在早于所述新生儿出生后5天被收集。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述血液样品中的所述GAL-1-P浓度通过质谱法测量。
CN201380060296.XA 2012-12-03 2013-11-28 在新生儿的筛查中诊断半乳糖血症的方法 Active CN104797938B (zh)

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