CN104797936A - 融合蛋白及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了致癌融合蛋白。本发明提供了用于治疗基于基因融合体的癌症的方法。

Description

融合蛋白及其方法
本申请要求2012年7月24日提交的美国临时专利申请号61/675,006的权益和优先权，其内容在此通过引用整体并入。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物在此通过引用整体并入。这些出版物的公开内容在此通过引用整体并入本申请。
本专利公开内容包含受版权保护的材料。版权拥有者不反对本专利文件或专利公开内容在美国专利商标局专利文档或记录中出现时被任何人传真复制，但是在其他情况下保留任何和全部版权权利。
政府支持
本发明根据美国国家癌症研究所授予的资助号R01CA101644和R01CA085628在政府支持下进行。政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
多形性胶质母细胞瘤(GBM)是脑癌的最常见形式并且是所有人癌症中最难治和致命的。目前的护理标准包括外科手术、化疗和放疗。然而，GBM的预后一贯保持很差。很少有可用的靶向疗法，并且没有一个特异性靶向GBM。
据估计，世界范围内可能携带FGFR-TACC基因融合体并且会受益于靶向抑制FGFR激酶活性的GBM患者目标群体相当于每年6,000名患者。
发明概述
本发明至少部分基于GBM中高表达类型的基因融合体的发现，所述基因融合体将FGFR基因的酪氨酸激酶结构域与TACC1或TACC3的TACC结构域结合。本发明至少部分基于FGFR-TACC融合体鉴别会受益于靶向抑制FGFR的酪氨酸激酶活性的GBM患者亚组的发现。胶质母细胞瘤患者和罹患基因融合体相关癌症(例如，上皮癌)的其他受试者中FGFR和TACC基因的融合体的鉴别是有用的治疗靶标。
本发明的一个方面提供了一种纯化的融合蛋白，其包含与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域。在一个实施方案中，所述FGFR蛋白是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGR4。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种纯化的融合蛋白，其包含与具有酪氨酸激酶结构域的多肽融合的转化型酸性卷曲螺旋(TACC)结构域，其中所述TACC结构域组成型地激活所述酪氨酸激酶结构域。在一个实施方案中，所述TACC蛋白是TACC1、TACC2或TACC3。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种纯化的融合蛋白，其包含与含有转化型酸性卷曲螺旋(TACC)的蛋白的TACC结构域5’融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域。在一个实施方案中，所述FGFR蛋白是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGR4。在另一个实施方案中，所述TACC蛋白是TACC1、TACC2或TACC3。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种由FGFR1-TACC1核酸编码的纯化的融合蛋白，其中FGFR1-TACC1包含与位于人染色体8p11上的TACC1的外显子7-13的组合5’剪接的位于人染色体8p11上的FGFR1的外显子1-17的组合，其中基因组断裂点出现在FGFR1的外显子1-17的任何一个和TACC1的外显子7-13的任何一个中。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种由FGFR2-TACC2核酸编码的纯化的融合蛋白，其中FGFR2-TACC2包含与位于人染色体10q26上的TACC2的任何外显子1-23的组合5’剪接的位于人染色体10q26上的FGFR2的任何外显子1-18的组合。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种由FGFR3-TACC3核酸编码的纯化的融合蛋白，其中FGFR3-TACC3包含与位于人染色体4p16上的TACC3的外显子8-16的组合5’剪接的位于人染色体4p16上的FGFR3的外显子1-16的组合，其中基因组断裂点出现在FGFR3的外显子1-16的任何一个和TACC3的外显子8-16的任何一个中。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种由FGFR3-TACC3核酸编码的纯化的融合蛋白，其中FGFR3-TACC3包含与位于人染色体4p16上的TACC3的外显子8-16的组合5’剪接的位于人染色体4p16上的FGFR3的外显子1-16的组合，其中基因组断裂点出现在FGFR3的内含子1-16的任何一个和TACC3的外显子8-16的任何一个中。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种由FGFR3-TACC3核酸编码的纯化的融合蛋白，其中FGFR3-TACC3包含与位于人染色体4p16上的TACC3的外显子8-16的组合5’剪接的位于人染色体4p16上的FGFR3的外显子1-16的组合，其中基因组断裂点出现在FGFR3的外显子1-16的任何一个和TACC3的内含子7-16的任何一个中。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种由FGFR3-TACC3核酸编码的纯化的融合蛋白，其中FGFR3-TACC3包含与位于人染色体4p16上的TACC3的外显子8-16的组合5’剪接的位于人染色体4p16上的FGFR3的外显子1-16的组合，其中基因组断裂点出现在FGFR3的内含子1-16的任何一个和TACC3的内含子7-16的任何一个中。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种编码上述融合蛋白的合成的核酸。
本发明的一个方面提供了一种纯化的FGFR3-TACC3融合蛋白，其包括SEQ ID NO：79、158、159、160或161。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种纯化的FGFR3-TACC3融合蛋白，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括来自SEQ ID NO：90的氨基酸730-758的至少3个连续氨基酸并且包括来自SEQ ID NO：92的氨基酸549-838的至少3个连续氨基酸。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种纯化的FGFR3-TACC3融合蛋白，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括SEQ ID NO：78。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种纯化的FGFR3-TACC3融合蛋白，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括SEQ ID NO：85、86、87或89的任何一个。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种纯化的FGFR1-TACC1融合蛋白，其包括SEQ ID NO：150。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种纯化的FGFR1-TACC1融合蛋白，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括来自SEQ ID NO：146的氨基酸746-762的至少3个连续氨基酸并且包括来自SEQ ID NO：148的氨基酸572-590的至少3个连续氨基酸。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种纯化的FGFR1-TACC1融合蛋白，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括SEQ ID NO：88。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种编码FGFR3-TACC3融合蛋白的纯化的DNA，其包括SEQ ID NO：94。在另一个实施方案中，所述纯化的融合蛋白基本不含其他人蛋白。
本发明的一个方面提供了一种编码FGFR3-TACC3融合蛋白的合成的核酸，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括来自SEQ IDNO：91的核苷酸2443-2530的至少9个连续框内核苷酸并且包括来自SEQ ID NO：93的核苷酸1800-2847的至少9个连续框内核苷酸。
本发明的一个方面提供了一种编码FGFR3-TACC3融合蛋白的合成的核酸，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括SEQ ID NO：1-77的任何一个。
本发明的一个方面提供了一种编码FGFR1-TACC1融合蛋白的合成核酸，其包括SEQ ID NO：151。
本发明的一个方面提供了一种编码FGFR1-TACC1融合蛋白的合成的核酸，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括来自SEQ IDNO：147的核苷酸3178-3228的至少9个连续框内核苷酸并且包括来自SEQ ID NO：149的核苷酸2092-2794的至少9个连续框内核苷酸。
本发明的一个方面提供了一种编码FGFR1-TACC1融合蛋白的合成的核酸，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括SEQ ID NO：83。
本发明的一个方面提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合纯化的融合蛋白，所述纯化的融合蛋白包含与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域。在一个实施方案中，所述FGFR蛋白是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。在另一个实施方案中，所述融合蛋白是FGFR-TACC融合蛋白。在一个另外的实施方案中，所述FGFR-TACC融合蛋白是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。在一些实施方案中，所述FGFR1-TACC1融合蛋白包含SEQ ID NO：150的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述FGFR3-TACC3融合蛋白包含SEQ ID NO：79、158、159、160或161的氨基酸序列。
本发明的一个方面提供了一种用于降低受试者中融合蛋白的表达水平或活性的组合物，所述融合蛋白包含与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，与药学上可接受的载体混合的所述组合物包含所述融合蛋白的抑制剂。在一个实施方案中，所述融合蛋白是FGFR-TACC融合蛋白。在另一个实施方案中，所述抑制剂包括特异性结合FGFR-TACC融合蛋白的抗体或其片段；特异性结合FGFR蛋白的小分子；特异性结合TACC蛋白的小分子；降低FGFR-TACC融合多肽的表达的反义RNA或反义DNA；特异性靶向FGFR-TACC融合基因的siRNA；或所列抑制剂的组合。在一个另外的实施方案中，所述FGFR蛋白是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。在一些实施方案中，所述FGFR-TACC融合蛋白是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。在其他实施方案中，所述特异性结合FGFR蛋白的小分子包括AZD4547、NVP-BGJ398、PD173074、NF449、TK1258、BIBF-1120、BMS-582664、AZD-2171、TSU68、AB1010、AP24534、E-7080、LY2874455或所列小分子的组合。
本发明的一个方面提供了一种用于降低有需要的受试者中融合蛋白的表达水平或活性的方法，所述融合蛋白包含与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域。在一个实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用治疗量的用于降低受试者中融合蛋白的表达水平或活性的组合物，所述融合蛋白包含与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域。在一个实施方案中，所述方法包括从受试者获得样本以确定受试者中FGFR融合分子的表达水平。在一些实施方案中，使样本与结合FGFR融合分子的物质例如抗体、探针、核酸引物等一起孵育。在一个实施方案中，检测或确定包括核酸测序、选择性杂交、选择性扩增、基因表达分析或其组合。在另一个实施方案中，检测或确定包括蛋白质表达分析，例如通过western印迹分析、ELISA或其他抗体检测方法。在一个另外的实施方案中，所述方法包括确定所述融合蛋白表达水平或活性与施用所述组合物之前的融合蛋白表达水平或活性相比是否降低，从而降低所述融合蛋白的表达水平或活性。在一个实施方案中，所述融合蛋白是FGFR-TACC融合蛋白。在一个另外的实施方案中，所述FGFR蛋白是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。在一些实施方案中，所述FGFR-TACC融合蛋白是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。在一个实施方案中，用于降低融合蛋白的表达水平或活性的组合物包含特异性结合FGFR-TACC融合蛋白的抗体或其片段；特异性结合FGFR蛋白的小分子；特异性结合TACC蛋白的小分子；降低FGFR-TACC融合多肽的表达的反义RNA或反义DNA；特异性靶向FGFR-TACC融合基因的siRNA；或所列抑制剂的组合。在一个另外的实施方案中，所述FGFR蛋白是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。在一些实施方案中，所述FGFR-TACC融合蛋白是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。在其他实施方案中，所述特异性结合FGFR蛋白的小分子包括AZD4547、NVP-BGJ398、PD173074、NF449、TK1258、BIBF-1120、BMS-582664、AZD-2171、TSU68、AB1010、AP24534、E-7080、LY2874455或所列小分子的组合。
本发明的一个方面提供了一种用于治疗有需要的受试者中基因融合体相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的FGFR融合分子抑制剂。在一个实施方案中，所述基因融合体相关癌症包括上皮癌。在一个实施方案中，所述基因融合体相关癌症包括多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠直肠癌。在一个实施方案中，所述方法包括从受试者获得样本以确定所述受试者中FGFR融合分子的表达水平。在一些实施方案中，使样本与结合FGFR融合分子的物质例如抗体、探针、核酸引物等一起孵育。在一个实施方案中，检测或确定包括核酸测序、选择性杂交、选择性扩增、基因表达分析或其组合。在另一个实施方案中，检测或确定包括蛋白质表达分析，例如通过western印迹分析、ELISA或其他抗体检测方法。在另一个实施方案中，FGFR融合蛋白包括与多肽融合的FGFR蛋白，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域。在一个实施方案中，所述融合蛋白是FGFR-TACC融合蛋白。在另一个实施方案中，所述抑制剂包括特异性结合FGFR-TACC融合蛋白的抗体或其片段；特异性结合FGFR蛋白的小分子；特异性结合TACC蛋白的小分子；降低FGFR-TACC融合多肽的表达的反义RNA或反义DNA；特异性靶向FGFR-TACC融合基因的siRNA；或所列抑制剂的组合。在一个另外的实施方案中，所述FGFR蛋白是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。在一些实施方案中，所述FGFR-TACC融合蛋白是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。在其他实施方案中，所述特异性结合FGFR蛋白的小分子包括AZD4547、NVP-BGJ398、PD173074、NF449、TK1258、BIBF-1120、BMS-582664、AZD-2171、TSU68、AB1010、AP24534、E-7080、LY2874455或所列小分子的组合。
本发明的一个方面提供了一种降低有需要的受试者中实体瘤的生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的FGFR融合分子抑制剂，其中所述抑制剂降低所述实体瘤的大小。在一个实施方案中，所述实体瘤包括多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠直肠癌。在一个实施方案中，所述方法包括从受试者获得样本以确定所述受试者中FGFR融合分子的表达水平。在一些实施方案中，使样本与结合FGFR融合分子的物质例如抗体、探针、核酸引物等一起孵育。在一个实施方案中，检测或确定包括核酸测序、选择性杂交、选择性扩增、基因表达分析或其组合。在另一个实施方案中，检测或确定包括蛋白质表达分析，例如通过western印迹分析、ELISA或其他抗体检测方法。在另一个实施方案中，FGFR融合蛋白包括与多肽融合的FGFR蛋白，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域。在一个实施方案中，所述融合蛋白是FGFR-TACC融合蛋白。在另一个实施方案中，所述抑制剂包括特异性结合FGFR-TACC融合蛋白的抗体或其片段；特异性结合FGFR蛋白的小分子；特异性结合TACC蛋白的小分子；降低FGFR-TACC融合多肽的表达的反义RNA或反义DNA；特异性靶向FGFR-TACC融合基因的siRNA；或所列抑制剂的组合。在一个另外的实施方案中，所述FGFR蛋白是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。在一些实施方案中，所述FGFR-TACC融合蛋白是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。在其他实施方案中，所述特异性结合FGFR蛋白的小分子包括AZD4547、NVP-BGJ398、PD173074、NF449、TK1258、BIBF-1120、BMS-582664、AZD-2171、TSU68、AB1010、AP24534、E-7080、LY2874455或所列小分子的组合。
本发明的一个方面提供了一种用于确定来自受试者的样本是否表现FGFR融合体的存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包括至少一个与FGFR融合体特异性杂交的寡核苷酸，或其部分。在一个实施方案中，所述寡核苷酸包括一组核酸引物或原位杂交探针。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO：162、163、164、165、166、167、168、169或所列寡核苷酸的组合。在一个实施方案中，所述引物仅当FGFR融合体存在时引发聚合酶反应。在另一个实施方案中，所述确定包括基因测序、选择性杂交、选择性扩增、基因表达分析或其组合。在一个另外的实施方案中，所述FGFR融合体是FGFR-TACC融合体。在一些实施方案中，所述FGFR是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。在其他实施方案中，所述FGFR-TACC融合体是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。
本发明的一个方面提供了一种用于确定来自受试者的样本是否表现FGFR融合蛋白存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合FGFR融合蛋白的抗体，所述FGFR融合蛋白包括SEQ ID NO：79、85、86、87、88、89、150、158、159、160或161，其中所述抗体仅当FGFR融合蛋白存在时识别所述蛋白。在一个实施方案中，所述抗体针对FGFR融合体，所述FGFR融合体包括SEQ ID NO：79、85、86、87、88、89、150、158、159、160或161。在一个另外的实施方案中，所述FGFR融合体是FGFR-TACC融合体。在一些实施方案中，所述FGFR是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。在其他实施方案中，所述FGFR-TACC融合体是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。
本发明的一个方面提供了一种用于检测人受试者中FGFR融合体的存在的方法。在一个实施方案中，所述方法包括从人受试者获得生物样本。在一些实施方案中，使样本与结合FGFR融合分子的物质例如抗体一起孵育。在另一个实施方案中，检测或确定包括核蛋白质表达分析，例如通过western印迹分析、ELISA或其他抗体检测方法。在一些实施方案中，所述方法还包括基于受试者的表达模式评估是否施用FGFR融合分子抑制剂。在另外的实施方案中，所述方法包括向受试者施用FGFR融合分子抑制剂。在另一个实施方案中，所述方法包括检测所述受试者中是否存在FGFR融合体。在一个实施方案中，所述检测包括通过以下方式来测量FGFR融合蛋白水平：使用针对SEQ ID NO：79、85、86、87、88、89、150、158、159、160或161的抗体的ELISA；使用针对SEQ ID NO：79、85、86、87、88、89、150、158、159、160或161的抗体的western印迹；质谱法、等电聚焦或所列方法的组合。在一些实施方案中，所述FGFR融合体是FGFR-TACC融合体。在其他实施方案中，所述FGFR是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。在其他实施方案中，所述FGFR-TACC融合体是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。
本发明的一个方面提供了一种用于检测人受试者中FGFR融合体的存在的方法。在一个实施方案中，所述方法包括从人受试者获得生物样本。在一些实施方案中，使样本与结合FGFR融合分子的物质例如探针、核酸引物等一起孵育。在其他实施方案中，检测或确定包括核酸测序、选择性杂交、选择性扩增、基因表达分析或其组合。在一些实施方案中，所述方法还包括基于受试者的表达模式评估是否施用FGFR融合分子抑制剂。在另外的实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用FGFR融合分子抑制剂。在另一个实施方案中，所述方法包括检测所述受试者中是否存在编码FGFR融合蛋白的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列包括SEQ ID NO：1-77、80-84或95-145的任何一个。在另一个实施方案中，所述检测包括使用杂交、扩增或测序技术来检测FGFR融合体。在一个另外的实施方案中，所述扩增使用包括SEQ ID NO：162、163、164、165、166、167、168或169的引物。在一些实施方案中，所述FGFR融合体是FGFR-TACC融合体。在其他实施方案中，所述FGFR是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。在其他实施方案中，所述FGFR-TACC融合体是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。
本发明的一个方面提供了一种在体外引发致癌转化的方法。所述方法包括(a)用FGFR-TACC融合DNA转导体外培养的细胞；和(b)确定所述细胞是否获得在锚定非依赖性条件下生长、形成多层病灶或其组合的能力。
本发明的一个方面提供了一种在体外引发致癌转化的方法。所述方法包括(a)用FGFR-TACC融合DNA转导体外培养的细胞；(b)用经转导的细胞注射小鼠；和(c)确定肿瘤是否在所述小鼠中生长。在一个实施方案中，所述注射是皮下或颅内注射。
本发明的一个方面提供了一种鉴别降低FGFR-TACC融合体的致癌活性的化合物的方法。所述方法包括(a)用FGFR-TACC DNA转导在体外培养的细胞；(b)使细胞与配体源接触有效的时段；和(c)确定所述细胞与在测试化合物不存在的情况下培养的细胞相比是否获得在锚定非依赖性条件下生长、形成多层病灶或其组合的能力。
附图简述
为了符合PCT专利申请的要求，本文提供的许多附图是最初以彩色生成的图像的黑白呈现。在以下描述和实施例中，彩色图表和图像以其黑白外观描述。最初的彩色版本可以参见Singh等人，Science(2012)，337(6099)：1231-5(包括可在Science网站上获得的在线形式的原稿中可得的附带补充信息)。为了PCT的目的，Singh等人，Science(2012)，337(6099)：1231-5的内容，包括附带的“补充信息”，通过引用并入本文。
图1A是显示在TCGA中反复参与基因融合体的基因的图表。仅展示了不同样本中参与至少三个基因融合体中的基因。
图1B显示通过GSC的完整转录组测序鉴别的FGFR3-TACC3基因融合体。显示了在断裂点上比对的76个分裂read(split-read)(分别是SEQ ID NO：2-77)。在断裂点预测的阅读框显示于上部(紫色的FGFR3核苷酸序列(左)和绿色的TACC3核苷酸序列(右)；SEQ IDNO：1)，在预测的阅读框下面有红色的FGFR3序列(左)和蓝色的TACC3(右)。在预测的阅读框上面显示对应于SEQ ID NO：1的推定氨基酸序列(SEQ ID NO：78)。
图1C显示通过GSC的完整转录组测序鉴别的FGFR3-TACC3基因融合体。在左侧，显示源自GSC和GBM的cDNA的FGFR3-TACC3-特异性PCR。在右侧，Sanger测序图谱显示阳性样本中在断裂点处的阅读框(SEQ ID NO：80)和融合蛋白的推定翻译(SEQ ID NO：85)。
图1D显示通过GSC的完整转录组测序鉴别的FGFR3-TACC3基因融合体。显示了FGFR3-TACC3蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：79)。对应于FGFR3或TACC3的残基分别以绿色或红色(加下划线)显示。融合蛋白使FGFR3的酪氨酸激酶结构域与TACC3的TACC结构域结合。
图1E显示通过GSC的完整转录组测序鉴别的FGFR3-TACC3基因融合体。显示了FGFR3外显子17与TACC3的内含子7的基因组融合体。在融合的mRNA中，FGFR3的外显子16与TACC3的外显子85’剪接。实心箭头指示融合体基因组引物的位置，其产生GSC-1123和GBM-1123中融合体特异性PCR产物。
图2A显示GBM中FGFR和TACC基因之间反复的基因融合体。具体地，显示了通过外显子组测序分析鉴别的FGFR3-TACC3基因融合体。显示了在四个TCGA GBM样本中比对FGFR3和TACC3基因的基因组断裂点的分裂read。对于TCGA-27-1835，SEQ ID NO：95显示了在断裂点处的阅读框(粗体)，而SEQ ID NO：96-107分别显示了基因组断裂点的比对。对于TCGA-19-5958，SEQ ID NO：108显示了在断裂点处的阅读框(粗体)，而SEQ ID NO：109-111分别显示了基因组断裂点的比对。对于TCGA-06-6390，SEQ ID NO：112显示了在断裂点处的阅读框(粗体)，而SEQ ID NO：113-131分别显示了基因组断裂点的比对。对于TCGA-12-0826，SEQ ID NO：132显示了在断裂点处的阅读框(粗体)，而SEQ ID NO：133-145分别显示了基因组断裂点的比对。
图2B显示GBM中FGFR和TACC基因之间反复的基因融合体。在左侧，显示来自GBM cDNA样本的FGFR3-TACC3的FGFR-TACC特异性PCR的凝胶。在右侧，Sanger测序图谱显示阳性样本中在断裂点处的阅读框(SEQ ID NO：81)和融合蛋白的推定翻译(SEQ IDNO：86)。
图2C显示GBM中FGFR和TACC基因之间反复的基因融合体。在左侧，显示来自GBM cDNA样本的FGFR3-TACC3的FGFR-TACC特异性PCR的凝胶。在右侧，Sanger测序图谱显示阳性样本中在断裂点处的阅读框(SEQ ID NO：82)和融合蛋白的推定翻译(SEQ IDNO：87)。
图2D显示GBM中FGFR和TACC基因之间反复的基因融合体。图表显示了来自Atlas-TCGA的四个GBM肿瘤中FGFR3和TACC3的联合异常表达。
图2E显示GBM中FGFR和TACC基因之间反复的基因融合体。CNV分析显示相同的四个Atlas-TCGA GBM样本中的FGFR3和TACC3基因的重排部分的显微放大。
图2F显示GBM中FGFR和TACC基因之间反复的基因融合体。在左侧，显示来自GBM cDNA样本的FGFR1-TACC1的FGFR-TACC特异性PCR的凝胶。在右侧，Sanger测序图谱显示阳性样本中在断裂点处的阅读框(SEQ ID NO：83)和融合蛋白的推定翻译(SEQ IDNO：88)。
图2G显示GBM中FGFR和TACC基因之间反复的基因融合体。在左侧，显示来自GBM cDNA样本的FGFR3-TACC3的FGFR-TACC特异性PCR的凝胶。在右侧，Sanger测序图谱显示阳性样本中在断裂点处的阅读框(SEQ ID NO：84)和融合蛋白的推定翻译(SEQ IDNO：89)。
图3A显示FGFR-TACC融合蛋白的转化活性。FGFR1-TACC1和FGFR3-TACC3诱导了Rat1A成纤维细胞的锚定非依赖性生长。在铺板之后14天从三个重复样本记录软琼脂集落数目。显示了代表性的显微照片。
图3B是显示来自用表达FGFR3-TACC3的Ink4A；Arf-/-星形细胞注射的小鼠的肿瘤的免疫荧光染色的显微照片，显示了神经胶质瘤特异性(巢蛋白、Oig2和GFAP)和增殖标志物(Ki67和pHH3)的阳性。通过表达FGFR-TACC融合体的Ink4A；Arf-/-星形细胞产生了皮下肿瘤。
图3C显示了用pTomo-shp53(n＝8)或pTomo-EGFRvIII-shp53(n＝7)(绿色线；黑白图像中的“浅灰色”)和pTomo-FGFR3-TACC3-shp53(n＝8，红色线；黑白图像中的“深灰色”)颅内注射的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。曲线上的点指示死亡(对数秩检验，p＝0.00001，pTomo-shp53对pTomo-FGFR3-TACC3-shp53)。
图3D显示了示出高级神经胶质瘤的组织学特征的晚期FGFR3-TACC3-shp53产生的肿瘤的苏木精和伊红染色的代表性显微照片。需要注意的是肿瘤细胞对正常脑的高度浸润。免疫荧光染色显示，神经胶质瘤和干细胞标志物(巢蛋白、Olig2和GFAP)、增殖标志物(Ki67和pHH3)和FGFR3-TACC3蛋白在FGFR3-TACC3-shp53脑肿瘤中广泛表达。F1-T1：FGFR1-TACC1；F3-T3：FGFR3-TACC3；F3-T3-K508M：FGFR3-TACC3-K508M。
图4A显示FGFR3-TACC3定位于纺锤体极，延迟有丝分裂进展并诱导染色体分离缺陷和FGFR3-TACC3融合体的非整倍性的组成型自磷酸化。用空白的慢病毒或表达FGFR3-TACC3或FGFR3-TACC3-K508M的慢病毒转导的Ink4A；Arf-/-星形细胞未经处理(0)或者用100nM FGFR抑制剂PD173074处理所示时间。使用所示抗体通过Western印迹分析磷酸化蛋白和总蛋白。
图4B显示FGFR3-TACC3定位于纺锤体极，延迟有丝分裂进展并诱导染色体分离缺陷。显示了Ink4A；Arf-/-星形细胞中FGFR3-TACC3的共聚焦显微镜分析的显微照片。z堆叠图像的最大密度投影显示覆盖代表性有丝分裂细胞的纺锤体极的FGFR3-TACC3(红色；黑白图像中“深灰色”)(上图)。在细胞分裂末期(下图)，FGFR3-TACC3定位于中体。α-微管蛋白(绿色；黑白图像中的“灰色”)，DNA(DAPI，蓝色；黑白图像中的“浅灰色”)。
图4C显示了用载体或FGFR3-TACC3转导的细胞的代表性荧光视频显微镜法的图。
图4D显示代表从核膜破裂(NEB)到细胞分裂末期开始和从NEB到核膜重建(NER)的时间分析的盒须图(Box and Whisker plot)。通过时差显微术(time-lapse microscopy)跟踪每种条件的50次有丝分裂，测量了有丝分裂的持续时间。
图4E显示FGFR3-TACC3定位于纺锤体极，延迟有丝分裂进展并诱导染色体分离缺陷。显示了具有染色体错分离的细胞的代表性图像。箭头指向染色体错排列、落后染色体和染色体桥。
图4F显示表达FGFR1-TACC1和FGFR3-TACC3的Rat1A中的分离缺陷的定量分析。F3-T3：FGFR3-TACC3；F3-T3-K508M：FGFR3-TACC3-K508M。
图5A显示用对照、FGFR3、TACC3或FGFR3-TACC3表达慢病毒转导的Rat1A细胞的染色体组型分析。有丝分裂中捕获细胞的染色体数分布并使用DAPI分析染色体组型。对于每种条件在100个中期细胞中计数染色体，以确定细胞群中染色体数的倍性和多样性。FGFR3-TACC3融合诱导了非整倍性。
图5B显示代表性染色体组型，并且图5C显示用对照或FGFR3-TACC3表达慢病毒转导的人星形细胞的染色体数的分布。对于每种条件在100个中期细胞中计数染色体，以确定细胞群中染色体数的倍性和多样性。
图5D显示对于每种条件在100个中期细胞中染色体数的定量分析，以确定细胞群中染色体数的倍性和多样性。(n＝3独立实验)。
图6A显示FGFR-TK活性的抑制校正由FGFR3-TACC3引发的非整倍性。上图是用对照或FGFR3-TACC3慢病毒转导并用媒介物(DMSO)或PD173470(100nM)处理5天的Rat1A细胞的染色体组型分析。下图显示细胞群内的染色体数的倍性和多样性由每种条件的100个中期细胞中的染色体数的定量分析来确定。
图6B显示FGFR-TK活性的抑制校正由FGFR3-TACC3引发的非整倍性。在表达FGFR3-TACC3的细胞中通过PD173470对姐妹染色单体过早分离(PMSCS)的校正。各图显示代表性的中期扩展。通过DAPI使DNA染色。图6C显示姐妹染色单体粘连缺失的中期的定量分析(n＝3；p＝0.001，用DMSO处理的FGFR3-TACC3对用PD173470处理的FGFR3-TACC3)。
图7A显示FGFR-TK活性的抑制阻抑由FGFR3-TACC3引发的肿瘤生长。用所示慢病毒转导并用递增浓度的PD173074处理三天的Rat1A的生长速率。通过MTT测定确定细胞生长。数据表示为平均值±标准误差(n＝4)。
图7B显示用PD173470以所示浓度处理所示时间的GSC-1123的生长速率。通过MTT测定来确定细胞生长。数据表示为平均值±标准误差(n＝4)。
图7C显示沉默FGFR3-TACC3融合体的生长抑制效果。在左侧，将GSC-1123细胞的平行培养物以一式三份转导。用表达非靶向shRNA(Ctr)或靶向FGFR3的shRNA序列(sh2，sh3，sh4)的慢病毒转导表达FGFR3-TACC3融合体的Rat1A细胞。感染后五天，将细胞以2×104个细胞/孔的密度一式三份地铺板，并在所示时间记录台盼蓝排除细胞的数目。用表达sh-3和sh-4(最有效的FGFR3沉默序列)的慢病毒感染使FGFR3-TACC3表达培养物的生长速率恢复至与用空载体转导的Rat1A的水平相当的水平。值是平均值±标准偏差(n＝3)。在右侧图中，将GSC-1123细胞用表达非靶向shRNA(sh-Ctr)的慢病毒或表达靶向FGFR3的sh-3和sh-4序列的慢病毒转导。使用FGFR3抗体对平行培养物进行western印迹分析以检测FGFT3-TACC3融合蛋白。显示β-肌动蛋白为用于加载的对照。
图7D显示FGFR抑制剂PD173074阻抑表达由FGFR3-TACC3的Ink4A；Arf-/-星形细胞产生的神经胶质瘤皮下异种移植物的肿瘤生长。在肿瘤建立之后(200-300mm3，箭头)，小鼠用媒介物或PD173074(50mg/kg)处理14天。值是平均肿瘤体积±标准误差(n＝7只小鼠每组)。
图7E是携带神经胶质瘤的小鼠在原位植入用FGFR3-TACC3转导的Ink4A；Arf-/-星形细胞之后的Kaplan-Meier分析。在肿瘤移植之后，将小鼠用媒介物(n＝9)或AZD4547(50mg/kg)(n＝7)处理20天(p＝0.001)。
图8显示用于从由9个GSC培养物产生的RNA-Seq数据鉴别融合转录物的TX-Fuse流程示意图。续图显示用于鉴别来自84个GBMTCGA肿瘤样本的DNA外显子组序列的基因融合体重排的Exome-Fuse流程。
图9显示通过9个GSC的RNA-seq鉴别的融合转录物的验证。Sanger测序图谱显示阳性样本中在断裂点处的阅读框和融合蛋白的推定翻译(右侧)。左侧显示进行的RT-PCR的凝胶。(A)POLR2A-WRAP53。(B)CAPZB-UBR4。(C)ST8SIA4-PAM。(D)PIGU-NCOA6。
图9E显示通过9个GSC的完整转录组测序鉴别的融合转录物。显示在POLR2A-WRAP53融合体的断裂点上比对的54个分裂read。在上部显示在断裂点处的预测阅读框，其中POLR2A序列为红色(左)并且WRAP53为蓝色(右)。在续页上，显示在CAPZB-UBR4融合体的断裂点上比对的48个分裂read。在上部显示在断裂点处的预测阅读框，其中CAPZB序列为红色(左)并且UBR4为蓝色(右)。在之后的续页上，显示在ST8SIA4-PAM融合体的断裂点上比对的29个分裂read。在上部显示在断裂点处的预测阅读框，其中ST8SIA4序列为红色(左)并且PAM为蓝色(右)。在之后的续页上，显示在PIGU-NCOA6融合体的断裂点上比对的17个分裂read(上部)。在上部显示在断裂点处的预测阅读框，其中PIGU序列为红色(左)并且NCOA6为蓝色(右)。还(下部)显示在IFNAR2-IL10RB融合体的断裂点上比对的6个分裂read。在上部显示在断裂点处的预测阅读框，其中IFNAR2序列为红色(左)并且IL10RB为蓝色(右)。
图10A显示GSC和GBM样本中融合转录物表达的分析和验证。通过来自RNA-seq数据的read深度测量表达。浅灰色圆弧指示融合在一起的转录物的预测组分。图表中描绘了总体read深度(蓝色；黑白图像中的“灰色”)和分裂插入深度(红色；黑白图像中的“深灰色”)，具有50-read增量和1800read的最大范围。注意融合事件中涉及的基因区域中极高的表达水平，特别是对于FGFR3-TACC3。
图10B显示GSC和GBM样本中融合转录物表达的分析和验证。上图，qRT-PCR显示GSC-1123中FGFR3-TACC3融合转录物中包括的FGFR3和TACC3mRNA序列的极高表达。下图，为了对比，还显示了GSC-0114中POLR2A-WRAP53融合体中包括的WRAP53mRNA的序列的表达。
图10C显示GSC-1123和GBM-1123中FGFR3-TACC3蛋白的表达。使用识别人FGFR3的N末端区域的单克隆抗体的western印迹分析显示GSC-1123中而非缺少FGFR3-TACC3重排的GSC培养物GSC-0331和GSC-0114中约150kD蛋白的表达。
图10D显示GSC和GBM样本中融合转录物表达的分析和验证。用肿瘤GBM-1123(上图)和缺少FGFR3-TACC3重排的GBM肿瘤的FGFR3抗体的免疫染色分析。FGFR3(红色；黑白图像中的“浅灰色”)，DNA(DAPI，蓝色；黑白图像中的“灰色”)。以低(左)和高(右)放大倍数拍照。
图10E显示通过来自GSC-1123的单克隆抗FGFR3抗体免疫沉淀的约150kD融合蛋白的MS/MS分析，鉴别定位于FGFR3的三个独特肽(FGFR3肽1、2和3)和定位于TACC3的C末端区域的三个肽(TACC肽1、2和3)。
图11A-C显示用对照慢病毒或表达FGFR3、TACC3、FGFR3-TACC3的慢病毒转导的Rat1A细胞(图11A)，其通过使用识别FGFR3的N末端(包括在FGFR3-TACC3融合蛋白中)或TACC3的N末端(不包括在FGFR3-TACC3融合蛋白中)的抗体的Western印迹分析。图11B显示与Rat1A中慢病毒表达的FGFR3-TACC3相比较，GSC-1123中内源性FGFR3-TACC3的定量Western印迹分析。图11C显示Rat1A中FGFR3-TACC3和FGFR3-TACC3-K508M的Western印迹分析。显示α-微管蛋白为用于加载的对照。
图11D-F显示FGFR3-TACC3融合构建体的表达分析(图11D)，GBM-1123(左上图)、BTSC1123(右上图)、由FGFR3-TACC3表达慢病毒诱导的小鼠GBM(左下图)和通过FGFR3-TACC3融合体转化的小鼠星形细胞的皮下异种移植物(右下图)的FGFR3免疫染色；FGFR3-TACC3，红色(黑白图像中的“浅灰色”)；DNA(DAPI)，蓝色(黑白图像中的“灰色”)。图11E显示图11D中所示肿瘤和细胞培养物中FGFR3-TACC3阳性细胞的定量。图11F显示小鼠星形细胞和FGFR3-TACC3诱导的小鼠GBM(mGBM-15和mGBM-17)中异位FGFR3-TACC3融合蛋白的定量Western印迹分析，与GBM1123中的内源表达相对比。显示β-肌动蛋白为用于加载的对照。F3-T3：FGFR3-TACC3。显示α-微管蛋白或β-肌动蛋白为用于加载的对照。
图12A显示western印迹。使用空慢病毒或表达FGFR3-TACC3的慢病毒转导的Ink4A；Arf-/-星形细胞不接触丝裂原，并保持未处理(时间0)或用浓度50ng/ml的FGF-2处理所示时间。使用所示抗体通过Western印迹分析磷酸化蛋白和总蛋白。显示α-微管蛋白为用于加载的对照。
图12B显示western印迹。使用空慢病毒或表达FGFR3-TACC3或FGFR3-TACC3-K508M的慢病毒转导的Ink4A；Arf-/-星形细胞不接触丝裂原，并保持未处理(时间0)或用所示浓度的FGF-1处理10分钟。使用所示抗体通过Western印迹分析磷酸化蛋白和总蛋白。显示β-肌动蛋白为用于加载的对照。
图12C显示western印迹。使用空慢病毒或表达FGFR3-TACC3或FGFR3-TACC3-K508M的慢病毒转导的Ink4A；Arf-/-星形细胞不接触丝裂原，并保持未处理(时间0)或用所示浓度的FGF-8处理10分钟。使用所示抗体通过Western印迹分析磷酸化蛋白和总蛋白。显示β-肌动蛋白为用于加载的对照。
图12D-F显示FGFR3-TACC3融合蛋白的有丝分裂定位。图12D显示使用FGFR3抗体免疫染色(红色；黑白图像中的“深灰色”)的中期代表性FGFR3-TACC3表达Ink4A；Arf-/-小鼠星形细胞的最大强度投影共聚焦图像。FGFR3-TACC3展示一个纺锤体极上部的不对称定位。图12E显示使用TACC3抗体免疫染色(红色；(黑白图像中的“深灰色”)的中期代表性TACC3表达Ink4A；Arf-/-小鼠星形细胞的最大强度投影共聚焦图像。TACC3染色与纺锤体微管一致。图12F显示使用FGFR3抗体免疫染色(红色；(黑白图像中的“深灰色”)的中期代表性FGFR3表达Ink4A；Arf-/-小鼠星形细胞的最大强度投影共聚焦图像。FGFR3不显示有丝分裂中的特异性染色模式。将细胞用α-微管蛋白共免疫染色(绿色；(黑白图像中的“浅灰色”)以使有丝分裂纺锤体可见。用DAPI复染DNA(蓝色；(黑白图像中的“灰色”)。以0.250μm间隔获得图像。在应用的实验条件下，FGFR3或TACC3的内源性水平是不可检测的。F3-T3：FGFR3-TACC3。
图13A显示FGFR3-TACC3蛋白诱导染色体错分离、染色单体粘连缺陷和有缺陷的纺锤体检查点。表达载体对照或FGFR3-TACC3的Ink4A；ARF-/-星形细胞中染色体分离缺陷的中期扩展的定量分析(上图)。表达FGFR3-TACC3或载体对照的Ink4A；Arf-/-星形细胞中染色体分离缺陷的显微镜成像分析。具有染色体错分离的细胞的代表性图像。箭头指向染色体错排列、落后染色体和染色体桥。
图13B-D显示表达FGFR3-TACC3的Ink4A；Arf-/-星形细胞(图13B)和Rat1A细胞(图13C)中姐妹染色单体过早分离(PMSCS)的代表性图像。左，各图显示代表性的中期扩展。右，具有姐妹染色单体粘连缺失的中期的定量分析。在三次独立实验中对每种条件在至少100个中期中记录Ink4A；Arf-/-星形细胞中具有PMSCS的有丝分裂数目。在Rat1A细胞的一式三份样本中记录具有PMSCS的有丝分裂数目。图13D是显示向用指定的慢病毒转导的Rat1A-H2B-GFP细胞添加噻氨酯哒唑持续所示持续时间的图表。通过在每个时间点定量有丝分裂中的H2B-GFP阳性细胞来确定每个时间点的有丝分裂指数。数据表示为平均值和标准偏差(n＝3)。F3-T3：FGFR3-TACC3。
图14A-B显示用表达FGFR3-TACC3融合体的慢病毒或空载体转导的人原代星形细胞的生长曲线。进行FGFR3-TACC3融合体介导的生长改变和RTK抑制剂对携带FGFR-TACC融合体的细胞的特异性作用的分析。图14A是显示通过在感染后7天(第1代)的MTT测定来确定用表达FGFR3-TACC3融合体的慢病毒或空载体转导的人原代星形细胞的细胞增殖的图表。值是平均值±标准偏差(n＝4)。p值：0.0033。图14是显示通过在感染后六周(第10代)的MTT测定来确定用表达FGFR3-TACC3融合体的慢病毒或空载体转导的人原代星形细胞的细胞增殖的图表。值是平均值±标准偏差(n＝4)。p值：0.0018。
图14C-D显示FGFR抑制剂对FGFR-TACC融合体表达细胞的特异性生长抑制作用。通过MTT测定确定细胞生长。用所示慢病毒转导的Rat1A细胞用BGJ398(图14C)或AZD4547(图14D)以所示浓度处理三天。值是平均值±标准误差(n＝4)。
图14E显示沉默FGFR3-TACC3融合体的生长抑制作用。(左)用表达非靶向shRNA(Ctr)的慢病毒或表达靶向FGFR3的sh-3和sh-4序列的慢病毒以一式三份转导GSC-1123细胞。感染五天之后，将细胞以2×104个细胞/孔的密度一式三份地铺板，并在所示时间记录台盼蓝排除细胞的数目。值是平均值±标准偏差(n＝3)。(右)对在感染后五天收集的平行培养物使用FGFR3抗体进行Western印迹分析以检测FGFT3-TACC3融合蛋白。β-肌动蛋白显示为用于加载的对照。(**：p值＝<0.005；***：p值＝<0.0001)。
图15显示用PD173074、NVP-BGJ398或AZD4547处理的细胞的存活曲线图。
图16显示通过GSC的完整转录组测序鉴别的FGFR3-TACC3基因融合体。直方图描述了跨越断裂点的每个正向和反向序列read的绝对频率。
图17显示FGFR3-TACC3的转化活性。FGFR3-TACC3诱导Rat1A成纤维细胞中锚定非依赖性生长(上图)和Ink4A；Arf-/-初级星形细胞中转化的表型(下图)。
图18显示FGFR3-TACC3的转化活性。显示了用pTomo-shp53(n＝8)、pTomo-FGFR3-TACC3-shp53(n＝8)和pTomo-EGFRvIII-shp53(n＝7)颅内注射的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。曲线上的各点指示死亡(对数秩检验，p＝0.025，pTomo-shp53对pTomo-FGFR3-TACC3-shp53)。
图19显示FGFR-TK活性的抑制校正由FGFR3-TACC3引发的非整倍性并阻抑由FGFR3-TACC3引发的肿瘤生长。显示了用所示慢病毒转导并用所示浓度的PD173470处理的Rat1A的短期生长抑制测定。细胞被处理三天。通过MTT测定确定细胞存活。误差线显示平均值±标准误差(n＝4)。
图20是用所示慢病毒转导并用PD173470以所示浓度处理四天的人星形细胞的生长抑制测定。通过MTT测定确定细胞活力。误差线显示平均值±标准误差(n＝4)。
图21是显示用所示慢病毒转导并用PD173470以所示浓度处理四天的人星形细胞的生长抑制测定的图表。通过MTT测定确定细胞活力。误差线显示平均值±标准误差(n＝4)。
图22显示短期生长抑制测定中Rat1A细胞的存活的图表。(上图表)将Rat1A细胞用所示ptomo构建体转导并用PD173074以所示浓度处理。细胞被处理三天。通过MTT测定确定细胞活力。误差线显示平均值±标准误差(n＝4)。在下图中，显示了western印迹照片。
图23显示FGFR-TK活性的抑制校正由FGFR3-TACC3引发的非整倍性并阻抑由FGFR3-TACC3引发的肿瘤生长。显示了用对照或FGFR3-TACC3慢病毒转导并用媒介物(DMSO)或PD173470(100nM)处理五天的Rat1A细胞的染色体组型分析的图表。
图24显示在颅内植入用FGFR3-TACC3转导的Ink4A；Arf-/-星形细胞之后追踪携带神经胶质瘤的小鼠的存活。在肿瘤移植之后，将小鼠用媒介物或AZD4547(50mg/kg)处理20天(媒介物，n＝7；AZD4547，n＝6；p＝0.001)。
图25显示FGFR3-TACC3融合蛋白的氨基酸序列中来自图10E的肽的位置，其以粉色(FGFR3；加下划线)和蓝色(TACC3；虚线)突出显示。
图26显示IDH突变体和FGFR3-TACC3阳性人GBM的Kaplan-Meier分析。对数秩检验p值：0.0169。
图27是显示在皮下注射用慢病毒转导的Ink4A；Arf-/-小鼠星形细胞之后诱导的肿瘤异种移植物的图片，所述慢病毒表达FGFR3-TACC3(上图A，右侧)或FGFR1-TACC1(下图B，右侧)融合体但没有空载体(上图，左侧)或在激酶结构域中携带K508M突变的FGFR3-TACC3(FGFR3-TACC3-K508M；下图，左侧)。
图28显示FGFR3-TACC3融合体的组成型自磷酸化。源自FGFR3-TACC3或RasV12诱导小鼠GBM的BTSC未经处理或者用500nM PD173074处理所示时间。使用所示抗体通过Western印迹分析磷酸化蛋白和总蛋白。显示β-肌动蛋白为用于加载的对照。
图29显示代表性FGFR3-TACC3表达Ink4A；Arf-/-小鼠星形细胞的Z堆叠共聚焦图像，显示为最大强度投影。将细胞用FGFR3(红色；黑白图像中的“深灰色”)和α-微管蛋白(绿色；(黑白图像中的“浅灰色”)免疫染色。DNA用DAPI复染(蓝色；(黑白图像中的“灰色”)。以0.250μm间隔获取图像。指示了图像系列的坐标。F3-T3：FGFR3-TACC3。
图30显示SKY染色体组型分析的实例，描绘了来自GSC-1123的相同培养物的两种不同细胞，示例说明了正在进行的CIN和非整倍性。表6报告了20种细胞的染色体组型分析的细节。
图31是使用Integrated Genomic Viewers软件显现的区段CNV数据的图示。三个膀胱尿路上皮癌携带FGFR3-TACC3基因融合体(黑色框)。红色指示扩增(A)，蓝色指示缺失(D)。
图32是使用Integrated Genomic Viewers软件显现的区段CNV数据的图示。一个乳腺癌携带FGFR3-TACC3基因融合体(黑色框)。红色指示扩增(A)，蓝色指示缺失(D)。
图33是使用Integrated Genomic Viewers软件显现的区段CNV数据的图示。一个结肠直肠癌携带FGFR3-TACC3基因融合体(黑色框)。红色指示扩增(A)，蓝色指示缺失(D)。
图34是使用Integrated Genomic Viewers软件显现的区段CNV数据的图示。一个肺鳞状细胞癌携带FGFR3-TACC3基因融合体(黑色框)。红色指示扩增(A)，蓝色指示缺失(D)。
图35是使用Integrated Genomic Viewers软件显现的区段CNV数据的图示。一个头颈鳞状细胞癌携带FGFR3-TACC3基因融合体(黑色框)。红色指示扩增(A)，蓝色指示缺失(D)。
发明详述
多形性胶质母细胞瘤(GBM)是成人脑肿瘤的最常见形式，占颅内肿瘤的12-15％和原发性脑肿瘤的50-60％。GBM是人癌症的最致命形式。癌症的成功靶向疗法的历史大大符合恶性血液病和近期一些类型的上皮癌中反复且致癌的基因融合体的失活。GBM是人癌症的最致命且难治的形式。针对GBM中常见遗传改变的靶向疗法没有改变疾病的差的临床结果，最可能是因为它们未能系统消除GBM的真正成瘾癌蛋白活性。GBM中还没有发现导致致癌基因融合体产生的反复的染色体重排。
GBM是人中待治疗癌症的最困难形式(1)。迄今为止，已经针对GBM中可能重要的致癌靶测试的治疗方法实现了有限的成功(2-4)。导致致癌融合体蛋白生成的反复的染色体易位被视为人癌症发病机理中的引发和成瘾事件，因此提供了癌症疗法的最希望的分子靶(5，6)。还没有在GBM中发现反复且致癌的基因融合体。染色体重排是恶性血液病的标志，但是近期，还在实体瘤亚组(乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠直肠癌)中发现它们(7，8)。其肿瘤携带这些重排的患者的重要且成功的靶向治疗介入源自功能性基因融合体的发现，特别是当易位涉及激酶编码基因(BCR-ABL，EML4-ALK)时(9，10)。
GBM的标志是强烈的染色体不稳定性(CIN)，其导致非整倍性(11)。CIN和非整倍性是癌症发病机理中的早期事件(12)。已经表明，靶向有丝分裂保真度的遗传改变可能是有丝分裂期间染色体错分离的原因，从而导致非整倍性(13，14)。
成纤维细胞生长因子受体(FGFR)是结合成纤维细胞生长因子蛋白家族成员的跨膜受体。FGFR的结构由以下组成：保护三个Ig样结构域的细胞外配体结合结构域、单跨膜螺旋结构域和具有酪氨酸激酶活性的细胞内结构域(Johnson,D.E.,Williams,E.T.Structural andfunctional diversity in the FGF receptor multigene family.(1993)Adv.Cancer Res，60：1–41)。
转化型酸性卷曲螺旋蛋白(TACC)通过将迷你纺锤体(Msp)/XMAP215蛋白募集到中心体而使微管稳定。癌症中已经涉及TACC。
从医学角度，FGFR-TACC融合体提供了GBM中首个“有诚意的(bonafide)”致癌成瘾的基因融合体，其鉴别在该疾病中长久以来是过时的。
DNA和氨基酸操纵方法及其纯化
除非另外指明，本发明各方面的实施可以采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些在本领域技术内。此类技术在文献中有充分解释。参见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，第3版，Sambrook编(2001)，Fritsch和Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，第I和II卷(D.N.Glover编，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Mullis等人美国专利号4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins编1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss,Inc.，1987)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；系列丛书，Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.，N.Y.)，具体为，Methods In Enzymology，第154和155卷(Wu等人编)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，Cold SpringHarbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Caner和Walker编，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986)；Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。本文引用的所有专利、专利申请和参考文献通过引用整体并入。
本领域技术人员可以若干种方式获得蛋白质，所述方式包括但不限于通过生化手段分离蛋白质或者通过基因工程方法表达编码目标蛋白质的核苷酸序列。
蛋白质由核酸(包括例如基因组DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA以及相应RNA的任何形式)编码。例如，其可以由基因的重组核酸编码。本发明的蛋白质可获自各种来源，并且可以根据本领域已知的各种技术产生。例如，编码蛋白质的核酸可以通过筛选DNA文库，或者通过从天然来源扩增而获得。蛋白质可以是其片段或部分。编码蛋白质的核酸可以通过重组DNA技术产生，并且此类重组核酸可以通过常规技术制备，包括化学合成、基因工程、酶促技术或其组合。例如，本发明的融合蛋白包含与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域。例如，本发明的融合蛋白包含与具有酪氨酸激酶结构域的多肽融合的转化型酸性卷曲螺旋(TACC)结构域，其中所述TACC结构域组成型地激活所述酪氨酸激酶结构域。FGFR1-TACC1多肽的一个实例是具有SEQ ID NO：150所示的氨基酸序列。FGFR3-TACC3蛋白的一个实例是由具有SEQ ID NO：94所示核苷酸序列的核酸编码的多肽。FGFR3-TACC3多肽的实例具有SEQ ID NO：79、158、159、160或161所示的氨基酸序列。
FGFR3基因的Genbank ID是2261。列出了FGFR3的三个同种型，例如具有Genbank登录号NP_000133(相应的核苷酸序列NM_000142)；NP_001156685(相应的核苷酸序列NM_001163213)；NP_075254(相应的核苷酸序列NM_022965)。
SEQ ID NO：90是FGFR3氨基酸序列，转录物变体1(NP_000133；806aa)。
SEQ ID NO：91是FGFR3核苷酸序列转录物变体1(NM_000142；4304 bp)。
TACC3基因的Genbank ID是10460。SEQ ID NO：92是TACC3氨基酸序列(NP_006333)(838aa)。
SEQ ID NO：93是TACC3核苷酸序列(NM_006342)(2847bp)：
SEQ ID NO：94是FGFR3-TACC3的核苷酸序列。
FGFR1基因的Genbank ID是2260。列出了FGFR1的八个同种型，例如具有Genbank登录号NP_001167534(相应的核苷酸序列NM_001174063)；NP_001167535(相应的核苷酸序列NM_001174064)；NP_001167536(相应的核苷酸序列NM_001174065)；NP_001167537(相应的核苷酸序列NM_001174066)；NP_001167538(相应的核苷酸序列NM_001174067)；NP_056934(相应的核苷酸序列NM_015850)；NP_075593(相应的核苷酸序列NM_023105)；NP_075594(相应的核苷酸序列NM_023106)；NP_075598(相应的核苷酸序列NM_023110)。
SEQ ID NO：146是的同种型10的FGFR1氨基酸序列，具有Genebank登录号NP_001167534(820aa)：
SEQ ID NO：147是同种型10的FGFR1核苷酸序列，具有Genebank登录号NM_001174063(5895bp)：
SEQ ID NO：185是同种型1的FGFR1氨基酸序列，具有Genebank登录号NP_075598(822aa)：
SEQ ID NO：186是的同种型1的FGFR1核苷酸序列，具有Genebank登录号NM_023110(5917bp)：
TACC1基因的Genbank ID是6867。列出了TACC1的三个同种型，例如具有Genbank登录号NP_006274(相应的核苷酸序列NM_001174063)；NP_001167535(相应的核苷酸序列NM_001174064)；NP_001167536(相应的核苷酸序列NM_001174065)。
SEQ ID NO：148是同种型1的TACC1氨基酸序列，具有Genebank登录号NP_006274(805aa)：
SEQ ID NO：149是同种型1的TACC1核苷酸序列，具有Genebank登录号NM_006283(7802bp)：
SEQ ID NO：150是FGFR1-TACC1融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：151是编码FGFR1-TACC1融合蛋白的核苷酸序列。
FGFR2基因的Genbank ID是2263。列出了FGFR2的八个同种型，例如，具有Genbank登录号NP_000132(相应的核苷酸序列NM_000141)；NP_001138385(相应的核苷酸序列NM_001144913)；NP_001138386(相应的核苷酸序列NM_001144914)；NP_001138387(相应的核苷酸序列NM_001144915)；NP_001138388(相应的核苷酸序列NM_001144916)；NP_001138389(相应的核苷酸序列NM_001144917)；NP_001138390(相应的核苷酸序列NM_001144918)；NP_001138391(相应的核苷酸序列NM_001144919)；NP_075259(相应的核苷酸序列NM_022970)。
SEQ ID NO：152是同种型1的FGFR2氨基酸序列，具有Genbank登录号NP_000132(821aa)：
SEQ ID NO：153是同种型1的FGFR2核苷酸序列，具有Genebank登录号NM_000141(4654bp)：
TACC2基因的Genbank ID是10579。列出了TACC2的四个同种型，例如具有Genbank登录号NP_996744(相应的核苷酸序列NM_206862)；NP_996743(相应的核苷酸序列NM_206861)；NP_996742(相应的核苷酸序NM_206860)；NP_008928(相应的核苷酸序列NM_006997)。
SEQ ID NO：154是同种型a的TACC2氨基酸序列，具有Genebank登录号NP_996744(2948aa)：
SEQ ID NO：155是同种型a的TACC2核苷酸序列，具有Genebank登录号NM_206862(9706bp)
SEQ ID NO：158是FGFR3-TACC3-1融合蛋白的氨基酸序列。粗体文本对应于FGF3蛋白：
SEQ ID NO：159是FGFR3-TACC3-2融合蛋白的氨基酸序列。粗体文本对应于FGF3蛋白：
SEQ ID NO：160是FGFR3-TACC3-3融合蛋白的氨基酸序列。粗体文本对应于FGF3蛋白：
SEQ ID NO：161是FGFR3-TACC3-4融合蛋白的氨基酸序列。粗体本文对应于FGF3蛋白：
FGFR4基因的Genbank ID是2264。列出了FGFR4的三个同种型，例如，具有Genbank登录号NP_002002(相应的核苷酸序列NM_002011)；NP_075252(相应的核苷酸序列NM_022963)；NP_998812(相应的核苷酸序列NM_213647)。
如本文使用的，“FGFR融合分子”可以是编码对应于包含以下的融合蛋白的多肽的核酸(例如，合成的、纯化的和/或重组的)：与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域；或者是编码包含以下的融合蛋白的核酸：与具有酪氨酸激酶结构域的多肽融合的转化型酸性卷曲螺旋(TACC)结构域，其中所述TACC结构域组成型地激活所述酪氨酸激酶结构域。其还可以是包含以下的融合蛋白：与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域；或者包含以下的融合蛋白：与具有酪氨酸激酶结构域的多肽融合的转化型酸性卷曲螺旋(TACC)结构域，其中所述TACC结构域组成型地激活所述酪氨酸激酶结构域。例如，FGFR融合分子可以包括FGFR1-TACC1(例如，包括SEQ ID NO：150所示的氨基酸序列，或者包括SEQ ID NO：88所示的核酸序列)、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3(例如，包括SEQ ID NO：79、158-160或161所示的氨基酸序列，或者包括SEQ ID NO：80-82、84、94-144或145所示的核酸序列)或者其他FGFR-TACC融合蛋白(例如，含有与TACC1、TACC2或TACC3的片段融合的其酪氨酸激酶结构域的FGFR4的N末端片段)。例如，FGFR融合分子可以包括含有FGFR1的融合体，所述融合体包含对应于Genbank登录号NP_001167534、NP_001167535、NP_001167536、NP_001167537、NP_001167538、NP_056934、NP_075593、NP_075594或NP_075598的氨基酸序列；或者含有FGFR1的融合体，所述融合体包含对应于Genbank登录号NM_001174063、NM_001174064、NM_001174065、NM_001174066、NM_001174067、NM_015850、NM_023105、NM_023106或NM_023110的核苷酸序列。例如，FGFR融合分子可以包括含有FGFR2的融合体，所述融合体包含对应于Genbank登录号NP_000132、NP_001138385、NP_001138386、NP_001138387、NP_001138388、NP_001138389、NP_001138390、NP_001138391或NP_075259的氨基酸序列；或者含有FGFR2的融合体，所述融合体包含对应于Genbank登录号NM_000141、NM_001144913、NM_001144914、NM_001144915、NM_001144916、NM_001144917、NM_001144918、NM_001144919或NM_022970的核苷酸序列。例如，FGFR融合分子可以包括含有FGFR3的融合体，所述融合体包含对应于Genbank登录号NP_000133、NP_001156685或NP_075254的氨基酸序列；或者含有FGFR3的融合体，所述融合体包含对应于Genbank登录号NM_000142、NM_001163213或NM_022965的核苷酸序列。例如，FGFR融合分子可以包括含有FGFR4的融合体，所述融合体包含对应于Genbank登录号NP_002002、NP_075252或NP_998812的氨基酸序列；或者含有FGFR4的融合体，所述融合体包含对应于Genbank登录号NM_002011、NM_022963或NM_213647的核苷酸序列。FGFR融合分子还可以包括与由表7所列基因的任何一个编码的蛋白质融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域。FGFR融合分子可以包括上述实例的变体，例如其片段。
表7.融合配偶体
核酸可以是任何类型的核酸，包括基因组DNA、互补DNA(cDNA)、重组DNA、合成或半合成的DNA、以及相应RNA的任何形式。cDNA是从信使RNA模板人工合成的DNA的形式，并且用于产生基因克隆。合成的DNA没有可以在细胞核酸中发现的修饰，包括但不限于组蛋白和甲基化。例如，编码FGFR融合分子的核酸可以包括编码这种蛋白质的重组核酸。核酸可以是人工产生的非天然存在的核酸(例如通过组装、切割、连接或扩增序列)。其可以是双链或单链的。
本发明还提供与FGFR融合分子互补的核酸。互补核酸可以在严格的杂交条件下与上述核酸序列杂交。严格的杂交条件的非限制性实例包括高于30℃、高于35℃、超过42℃的温度，和/或小于约500mM或小于200mM的盐度。技术人员可以通过改变温度、盐度和/或其他试剂例如SDS或SSC的浓度来调整杂交条件。
根据本发明，蛋白至变体可以包括氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰属于以下三类的一种或多种：取代、插入或缺失变体。插入可以包括单个或多个氨基酸残基的氨基和/或羧基末端融合以及序列内插入。插入通常是比氨基或羧基末端融合的那些更小的插入，例如1至4个残基的水平。缺失特征为去除来自蛋白质序列的一个或多个氨基酸残基。这些变体通常通过在编码蛋白质的DNA中核苷酸的位点特异性诱变来制备，从而产生编码该变体的DNA，并且之后在重组细胞培养物中表达DNA。
在一个实施方案中，FGFR融合分子包括由编码FGFR融合分子的核酸序列编码的蛋白质或多肽，所述核酸序列例如SEQ ID NO：80-82、84、94-144或145所示序列。在一些实施方案中，编码FGFR融合分子的核酸序列与SEQ ID NO：80-82、84、94-144或145具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％或约99％同一性。在另一个实施方案中，多肽可以例如通过糖基化和/或乙酰化和/或化学反应或偶联来修饰，并且可以含有一个或数个非天然或合成的氨基酸。FGFR融合分子的实例是具有SEQ ID NO：79、88、150、158-160或161所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，作为多肽的FGFR融合分子与SEQ ID NO：79、88、150、158-160或161具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％或约99％同一性。在另一个实施方案中，FGFR融合分子可以是FGFR融合蛋白的片段。例如，FGFR融合分子可以涵盖SEQ ID NO：79、88、150、158-160或161的至少约8个连续氨基酸的任何部分。该片段可以包含SEQ IDNO：79、88、150、158-160或161的至少约10个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约50个氨基酸、至少约60个氨基酸或至少约75氨基酸。片段包括约8至约100个氨基酸的所有可能的氨基酸长度，例如长度约10至100个氨基酸、约15至100个氨基酸、约20至100个氨基酸、约35至100个氨基酸、约40至100个氨基酸、约50至100个氨基酸、约70至100个氨基酸、约75至100个氨基酸或约80至100个氨基酸。片段包括约100至800个氨基酸的所有可能的氨基酸长度，例如长度约125至800个氨基酸、约150至800个氨基酸、约175至800个氨基酸、约200至800个氨基酸、约225至800个氨基酸、约250至800个氨基酸、约275至800个氨基酸、约300至800个氨基酸、约325至800个氨基酸、约350至800个氨基酸、约375至800个氨基酸、约400至800个氨基酸、约425至800个氨基酸、约450至800个氨基酸、约475至800个氨基酸、约500至800个氨基酸、约525至800个氨基酸、约550至800个氨基酸、约575至800个氨基酸、约600至800个氨基酸、约625至800个氨基酸、约650至800个氨基酸、约675至800个氨基酸、约700至800个氨基酸、约725至800个氨基酸、约750至800个氨基酸、或约775至800个氨基酸。
化学合成。可以使用本领域已知的化学方法整体或部分地合成编码FGFR融合分子的核酸序列。可选地，可以使用合成其氨基酸序列的化学方法产生多肽，例如通过使用固相技术的直接肽合成。可以使用手工技术或者通过自动化来进行蛋白合成。可以例如使用AppliedBiosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动合成。
任选地，可以使用生成全长分子的化学方法单独合成并组合多肽片段。例如，这些方法可用于合成本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白包含与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域。在另一个实施方案中，融合蛋白包含与具有酪氨酸激酶结构域的多肽融合的转化型酸性卷曲螺旋(TACC)结构域，其中所述TACC结构域组成型地激活所述酪氨酸激酶结构域。融合蛋白的一个实例是包含SEQID NO：150所示氨基酸序列的FGFR1-TACC1多肽。融合蛋白的一个实例是具有包含SEQ ID NO：79、158、159、160或161的氨基酸序列的FGFR3-TACC3多肽。
获得、纯化和检测FGFR融合分子。由核酸、例如编码FGFR融合分子或其变体的核酸编码的多肽可以通过从表达由所述核酸编码的蛋白质或多肽的人细胞纯化而获得。非限制性纯化方法包括尺寸排阻色谱、硫酸铵分级分离、离子交换色谱、亲和色谱和制备型凝胶电泳。
可以通过高效液相色谱(HPLC)例如离子交换色谱(IEX-HPLC)基本纯化合成的多肽。可以通过氨基酸分析或测序证实合成多肽，例如FGFR融合分子的组成。
可以使用其他构建来将编码要求保护的本发明的多肽/蛋白质的核酸序列与编码促进可溶性蛋白纯化的多肽结构域的核苷酸序列结合。此类纯化促进结构域包括但不限于允许在固定化金属上纯化的金属螯合肽例如组氨酸-色氨酸模块，允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域，和FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，Wash.)中使用的结构域。纯化结构域和由本发明核酸编码的多肽之间包含可裂解接头序列(即，对因子Xa或肠激酶特异性的那些序列(Invitrogen，San Diego，Calif.))也可用于促进纯化。例如，技术人员可以使用与目的核酸结合的编码在硫氧还蛋白或肠激酶裂解位点之前的6个组氨酸残基的表达载体。组氨酸残基促进通过固定化金属离子亲和色谱的纯化，而肠激酶裂解位点提供了用于纯化由例如FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3、其他FGFR-TACC、含FGFR或含TACC的核酸编码的多肽的手段。
可以通过本领域技术人员已知的各种程序鉴别含有编码FGFR融合分子的核酸并且随后表达所述核酸的宿主细胞。这些程序包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白生物测定或免疫测定技术，包括用于检测和/或定量核酸或蛋白质的基于膜、溶液或芯片的技术。例如，可以使用编码其的核酸的探针或片段通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增来检测编码FGFR融合分子的核酸的存在。在一个实施方案中，FGFR融合分子的核酸片段可以涵盖SEQ ID NO：80-82、84、94-144或145的至少约8个连续核苷酸的任何部分。在另一个实施方案中，所述片段可以包含SEQ ID NO：80-82、84、94-144或145的至少约10个连续核苷酸、至少约15个连续核苷酸、至少约20个连续核苷酸或至少约30个连续核苷酸。片段可以包括约8至约100个核苷酸的所有可能的核苷酸长度，例如长度约15至约100个核苷酸、或约20至约100个核苷酸。基于核酸扩增的测定涉及使用选自编码FGFR融合分子核酸的序列的寡核苷酸或FGFR融合分子核酸来检测含有编码蛋白质或所述蛋白质的多肽的核酸的转化子。
使用对多肽特异的多克隆或单克隆抗体检测和测量由核酸，例如编码FGFR融合分子的核酸编码的多肽表达的方案是本领域已知的。非限制性实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。可以使用利用对由核酸，例如编码FGFR融合分子的核酸编码的多肽上的两个非干扰表位具有反应性的单克隆抗体的基于双位点单克隆的免疫测定，或者可以使用竞争性结合测定。
标记和结合技术是本领域技术人员已知的，并且可用于各种核酸和氨基酸测定。用于生成用于检测与编码蛋白质例如FGFR融合分子的核酸序列相关的序列的标记的杂交或PCR探针的方法包括但不限于寡标记(oligolabeling)、缺口平移、末端标记或使用标记核苷酸的PCR扩增。可选地，可以将核酸序列例如编码FGFR融合分子的核酸克隆进用于生成mRNA探针的载体。此类载体是本领域已知的，可商业途径获得，并且可用于通过添加标记的核苷酸和适当的RNA聚合酶例如T7、T3或SP6而在体外合成RNA探针。可以使用许多商业途径可获得的试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech、Promega和US Biochemical)来进行这些程序。可用于方便检测的适当的报告分子或标记物包括放射性核素、酶和荧光、化学发光、或生色剂、以及底物、辅因子、抑制剂和/或磁性粒子。
片段可以是蛋白质，例如FGFR融合蛋白的片段。例如，FGFR融合分子的片段可以涵盖SEQ ID NO：79、88、150、158-160或161的至少约8个连续氨基酸。片段可以包含SEQ ID NO：79、88、150、158-160或161的至少约10个连续的氨基酸、至少约20个连续的氨基酸、至少约30个连续的氨基酸、至少约40个连续的氨基酸、至少约50个连续的氨基酸、至少约60个连续的氨基酸、至少约70个连续的氨基酸、至少约75个连续的氨基酸、至少约80个连续的氨基酸、至少约85个连续的氨基酸、至少约90个连续的氨基酸、至少约95个连续的氨基酸、至少约100个连续的氨基酸、至少约200个连续的氨基酸、至少约300个连续的氨基酸、至少约400个连续的氨基酸、至少约500个连续的氨基酸、至少约600个连续的氨基酸、至少约700个连续的氨基酸或至少约800个连续氨基酸。片段包括约8至100个氨基酸的所有可能的氨基酸长度，例如长度约10至约100个氨基酸、约15至约100个氨基酸、约20至约100个氨基酸、约35至约100个氨基酸、约40至约100个氨基酸、约50至约100个氨基酸、约70至约100个氨基酸、约75至约100个氨基酸或约80至约100个氨基酸。
细胞转染
用目的核酸序列转化的宿主细胞可以在适合于蛋白质表达和从细胞培养物回收蛋白质的条件下培养。可以根据使用的序列和/或载体在细胞内分泌或包含由转化细胞产生的多肽。可以设计含有核酸序列，例如编码FGFR融合分子的核酸的表达载体含有指导由核酸编码的可溶性多肽分子的分泌的信号序列。以下更详细描述细胞转化和培养方法。
可以使用真核表达载体转染细胞以产生由载体的核苷酸序列，例如编码FGFR融合分子的那些所编码的蛋白质。通过本领域已知的方法将表达载体引入适当宿主细胞，哺乳动物细胞可以含有表达载体(例如，含有以下核酸的表达载体：编码包含与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域的融合蛋白的核酸，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域；或编码包含与具有酪氨酸激酶结构域的多肽融合的转化型酸性卷曲螺旋(TACC)结构域的融合蛋白的核酸，其中所述TACC结构域组成型地激活所述酪氨酸激酶结构域)。
可以针对宿主细胞株调节插入序列表达或者以所需方式加工由核酸编码的表达多肽的能力来选择宿主细胞株。多肽的此类修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。裂解多肽的“前原”形式的翻译后加工还可用于促进校正插入、折叠和/或功能。具有针对翻译后活性特定细胞机器和特性机制的不同宿主细胞(例如，CHO、HeLa、MDCK、HEK293和WI38)可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC；10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209)并且可以被选择以确保外来蛋白质的正确修饰和加工。
可以通过本领域已知的许多技术将外源核酸引入细胞，所述技术例如脂质转染、显微注射、磷酸钙或氯化钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔。在近似电压和电容下进行电穿孔以使DNA构建体进入目的细胞(例如神经胶质瘤细胞(细胞系SF188)、神经母细胞瘤细胞(细胞系IMR-32、SK-N-SH、SH-F和SH-N)、星形细胞等)。其他转染方法还包括改良的磷酸钙沉淀、凝聚胺沉淀、脂质体融合和受体介导的基因递送。
将经基因工程改造的细胞可以是获自各种组织的原代和次生细胞，并且包括可以在培养中维持并繁殖的细胞类型。原代和次生细胞的非限制性实例包括上皮细胞、神经细胞、内皮细胞、胶质细胞、成纤维细胞、肌肉细胞(例如成肌细胞)角质形成细胞、血液的有形成分(例如，淋巴细胞、骨髓细胞)和这些体细胞类型的前体。
可以通过本领域技术人员已知的方法获得脊椎动物组织，所述方法包括穿刺活检或者获得目的原代细胞类型的组织来源的其他外科手术方法。在一个实施方案中，穿刺活检或去除(例如，通过抽吸)可用于获得癌细胞来源(例如，神经胶质瘤细胞、神经母细胞瘤细胞等)。使用本领域容易实施的方法，例如外植或酶消化(例如，使用酶，例如链霉蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、中性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)，可以从组织获得原代细胞的混合物。活检方法还已经描述于美国专利号7,419,661和PCT申请公布WO 2001/32840，其每一个在此通过引用并入本文。
原代细胞可以获自被施用基因工程改造的原代或次生细胞的个体。然而，原代细胞还可以获自相同物种的不同于受体的供体。所述细胞还可以获自另一物种(例如，兔、猫、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、狗、马、牛、鸟或猪)。原代细胞还可以包括来自贴附于组织培养基质(例如，烧瓶或培养皿)而生长或者在悬液中生长的纯化的脊椎动物组织来源的细胞；源自组织的外植体中存在的细胞；首次铺板的前述细胞类型的两者；和源自这些铺板细胞的细胞培养悬液。除了来自后续传代的细胞，次生细胞可以是从培养基质取出并再次铺板或传代的铺板的原代细胞。次生细胞可以传代一次或多次。这些原代或次生细胞可以含有具有编码FGFR融合分子的基因的表达载体。
细胞培养
可以使用关于培养的宿主细胞的各种培养参数。对哺乳动物细胞的适当培养条件是本领域熟知的(Cleveland WL,等人，J ImmunolMethods，1983，56(2)：221-234)或者可以由技术人员确定(参见例如，Animal Cell Culture：A Practical Approach第2版，Rickwood,D.和Hames,B.D.,编(Oxford University Press：New York，1992))。细胞培养条件可以根据选择的宿主细胞类型而变化。可以利用商业途径可获得的培养基。培养基的非限制性实例包括例如最低必需培养基(Minimal Essential Medium)(MEM,Sigma,St.Louis,Mo.)；Dulbecco改良的Eagles培养基(Dulbecco’s Modified Eagles Medium)(DMEM，Sigma)；Ham's F10培养基(Sigma)；HyClone细胞培养培养基(HyClone，Logan，Utah)；RPMI-1640培养基(Sigma)；和针对各种细胞类型配制的化学成分确定的(CD)培养基，例如，CD-CHO培养基(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)。
必要时可以用补充组分或成分补充细胞培养基，所述补充组分或成分包括必要或希望的适当浓度或量的可选组分。细胞培养培养基溶液提供了来自以下类别的一个或多个的至少一种组分：(1)能量来源，通常形式为碳水化合物，例如葡萄糖；(2)所有必须氨基酸，并且通常是二十个氨基酸的基本组加半胱氨酸；(3)以低浓度所需的维生素和/或其他有机化合物；(4)游离脂肪酸或脂质，例如亚油酸；和(5)微量元素，其中微量元素定义为可以通常是微摩尔范围的极低浓度所需的无机化合物或天然存在的元素。
培养基还可以选择性地补充来自以下类别任何一个的一个或多种组分：(1)盐，例如镁、钙和磷酸盐；(2)激素和其他生长因子，例如血清、胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；(3)蛋白质和组织水解产物，例如可以获自纯化的明胶、植物材料或动物副产物的胨或胨混合物；(4)核苷和碱基，例如腺苷、胸苷和次黄嘌呤；(5)缓冲剂，例如4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)；(6)抗生素，例如庆大霉素或氨苄青霉素；(7)细胞保护剂，例如普鲁兰尼克多元醇(pluronic polyol)；和(8)半乳糖。在一个实施方案中，可溶性因子可以添加至培养基。
在适合于培养的细胞类型的培养基中制备可用于本发明的哺乳动物细胞培养物。在一个实施方案中，细胞培养培养基可以是补充有来自哺乳动物来源的血清(例如，胎牛血清(FBS))的之前讨论的那些中的任何一种(例如，MEM)。在另一个实施方案中，培养基可以是维持宿主细胞生长的条件培养基。
可以从琼脂(例如Gey’s Agar)、水凝胶(例如基质胶、琼脂糖等；Lee等人,(2004)Biomaterials 25：2461-2466)或交联的聚合物形成三维培养。这些聚合物可以包括天然聚合物及其衍生物，合成聚合物及其衍生物，或其组合。天然聚合物可以是阴离子聚合物、阳离子聚合物、两亲聚合物或中性聚合物。阴离子聚合物的非限制性实例可以包括透明质酸、藻酸(藻酸盐)、角叉菜胶、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖和果胶。阳离子聚合物的一些实例包括但不限于壳多糖或聚赖氨酸。(Peppas等人,(2006)Adv Mater.18：1345-60；Hoffman,A.S.,(2002)Adv Drug Deliv Rev.43：3-12；Hoffman,A.S.,(2001)Ann NYAcad Sci 944：62-73)。两亲聚合物的实例可以包括但不限于胶原、明胶、血纤蛋白和羧甲基壳多糖。中性聚合物的非限制性实例可以包括葡聚糖、琼脂糖或普鲁兰多糖(pullulan)。(Peppas等人,(2006)AdvMater.18：1345-60；Hoffman,A.S.,(2002)Adv Drug Deliv Rev.43：3-12；Hoffman,A.S.,(2001)Ann NY Acad Sci 944：62-73)。
待培养的细胞可以含有引入的表达载体，例如质粒。可以通过转化、显微注射、转染、脂质转染、电穿孔或注射引入表达载体构建体。表达载体可以含有编码用于表达和产生的蛋白质的编码序列或其部分。含有编码产生的蛋白质和多肽的序列以及适当的转录和翻译控制元件的表达载体可以使用本领域技术人员熟知和实践的方法产生。这些方法包括合成技术、体外重组DNA技术和体内基因重组，这些描述于J.Sambrook等人，2001，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.和F.M.Ausubel等人，1989，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons,New York,N.Y。
FGFR融合分子抑制剂
本发明提供了降低受试者中FGFR融合分子表达水平或活性的化合物的使用方法。此外，本发明提供了使用化合物治疗基因融合体相关癌症的方法。在一个实施方案中，基因融合体相关癌症是上皮癌。在一个实施方案中，基因融合体相关癌症包括多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠直肠癌。
如本文使用的，“FGFR融合分子抑制剂”指与本发明的FGFR融合分子相互作用并且调节其活性和/或其表达的化合物。例如，所述化合物可以降低FGFR融合分子的活性或表达。所述化合物可以是FGFR融合分子(例如，FGFR融合分子抑制剂)的拮抗剂。FGFR融合分子抑制剂的一些非限制性实例包括肽(例如，组成FGFR融合分子的肽片段，或抗体或其片段)、小分子和核酸(例如特异性针对组成FGFR融合分子的核酸的siRNA或反义RNA)。FGFR融合分子的拮抗剂降低FGFR融合蛋白的量或活性持续时间。在一个实施方案中，融合蛋白包含与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白(例如，FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC)的酪氨酸激酶结构域，或者融合蛋白包含与具有酪氨酸激酶结构域的多肽融合的转化型酸性卷曲螺旋(TACC)结构域，其中所述TACC结构域组成型地激活所述酪氨酸激酶结构域。拮抗剂包括降低FGFR融合分子活性的蛋白质、核酸、抗体、小分子或任何其他分子。
术语“调节”在本文出现时指FGFR融合分子活性或表达的改变。例如，调节可以引起FGFR融合分子例如FGFR融合蛋白的蛋白质活性、结合特性或任何其他生物、功能或免疫性质的降低。
在一个实施方案中，FGFR融合分子抑制剂可以是结合蛋白质本身的FGFR融合蛋白的肽片段。
例如，FGFR融合多肽可以涵盖SEQ ID NO：79、88、150、158-160或161的至少约8个连续氨基酸的任何部分。该片段可以包含SEQ IDNO：79、88、150、158-160或161的至少约10个连续的氨基酸、至少约20个连续的氨基酸、至少约30个连续的氨基酸、至少约40个连续的氨基酸、至少约50个连续的氨基酸、至少约60个连续的氨基酸、至少约70个连续的氨基酸、至少约75个连续的氨基酸、至少约80个连续的氨基酸、至少约85个连续的氨基酸、至少约90个连续的氨基酸、至少约95个连续的氨基酸、至少约100个连续的氨基酸、至少约200个连续的氨基酸、至少约300个连续的氨基酸、至少约400个连续的氨基酸、至少约500个连续的氨基酸、至少约600个连续的氨基酸、至少约700个连续的氨基酸或至少约800个连续氨基酸。片段包括约8至约100个氨基酸的所有可能的氨基酸长度，例如长度约10至约100个氨基酸、约15至约100个氨基酸、约20至约100个氨基酸、约35至约100个氨基酸、约40至约100个氨基酸、约50至约100个氨基酸、约70至约100个氨基酸、约75至约100个氨基酸、或约80至约100个氨基酸。这些肽片段可以商业获得或者通过液相或固相合成方法合成(Atherton等人,(1989)Solid Phase Peptide Synthesis：a Practical Approach.IRL Press，Oxford，England)。FGFR融合肽片段可以从天然来源分离、通过基因工程改造或者化学方法制备。这些方法是本领域熟知的。
FGFR融合分子抑制剂可以是针对本发明的FGFR融合分子的蛋白质，例如抗体(单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或完全人抗体)或其结合片段。抗体片段可以是不同于全长形式的抗体形式，并且除了已经工程改造的抗体片段外还包括全长抗体内存在的部分或组分。抗体片段可以包括但不限于单链Fv(scFv)、双抗体、Fv和(Fab′)2、三抗体、Fc、Fab、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、四抗体、双官能杂合抗体、框架区、恒定区等(参见Maynard等人,(2000)Ann.Rev.Biomed.Eng.2：339-76；Hudson(1998)Curr.Opin.Biotechnol.9：395-402)。抗体可以商业途径获得，定制产生，或者根据现有技术确立的方法针对目的抗原合成(参见美国专利号6,914,128、5,780,597、5,811,523；Roland E.Kontermann和StefanDübel(编)，Antibody Engineering，第I和II卷,(2010)第2版，Springer；Antony S.Dimitrov(编)，Therapeutic Antibodies：Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology),(2009)，Humana Press；Benny Lo(编)Antibody Engineering：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),(2004)Humana Press，其每一个在此通过引用以其整体并入)。例如，针对FGFR融合分子的抗体可以商业途径获自Abcam、Santa Cruz Biotechnology、Abgent、R&D Systems、NovusBiologicals等。针对FGFR融合分子的人抗体(例如单克隆抗体、人源化抗体、完整人抗体的或嵌合抗体)可以是用于人的有用抗体治疗剂。在一个实施方案中，抗体或其结合片段针对SEQ ID NO：79、88、150、158-160或161。
编码FGFR融合分子的RNA的抑制可以有效调节FGFR融合分子的表达。抑制剂选自包括以下的组：siRNA；干扰RNA或RNAi；dsRNA；RNA聚合酶III转录的DNA；核酶；和反义核酸，其可以是RNA、DNA或人工核酸。
反义寡核苷酸(包括反义DNA、RNA和DNA/RNA分子)通过结合靶mRNA并防止蛋白质翻译而作用以直接阻断mRNA的翻译。例如，可以合成至少约15个碱基并且与编码FGFR融合分子的DNA序列的独特区域互补的反义寡核苷酸，例如通过常规的磷酸二酯技术(Dallas等人,(2006)Med.Sci.Monit.12(4)：RA67-74；Kalota等人,(2006)Handb.Exp.Pharmacol.173：173-96；Lutzelburger等人,(2006)Handb.Exp.Pharmacol.173：243-59)。反义核苷酸序列包括但不限于：吗啉代、2'-O-甲基多核苷酸、DNA、RNA等。
siRNA包括含有约15至约50个碱基对，例如约21至约25个碱基对并且具有与细胞内表达的靶基因或RNA相同或几乎相同的核苷酸序列的双链结构。siRNA包括通过标准的Watson-Crick碱基配对相互作用退火连接在一起的有义RNA链和互补反义RNA链。有义链包括与靶mRNA分子内含有的核酸序列基本相同的核酸序列。与靶mRNA内含有的靶序列“基本相同”指与靶序列相差约3％或更少的核酸序列。siRNA的有义和反义链可以包括两个互补的单链RNA分子，或者可以包括其中两个互补部分是碱基配对并且通过单链“发夹”区共价连接的单一分子。还参见McMnaus和Sharp(2002)Nat RevGenetics，3：737-47，以及Sen和Blau(2006)FASEB J.，20：1293-99，其完整的公开内容通过引用并入本文。
siRNA可以是通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同的改变的RNA。此类改变可以包括非核苷酸物质添加至例如siRNA的末端或者siRNA的一个或多个内部核苷酸，或者使siRNA对核酸酶消化抗性的修饰，或者用脱氧核糖核苷酸取代siRNA中的一个或多个核苷酸。siRNA的一条或两条链还可以包含3'突出。如本文使用的，3'突出指从双螺旋RNA链的3'末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。例如，siRNA可以包含长度从1至约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，或者长度从1至约5个核苷酸，或者长度从1至约4个核苷酸，或者长度从2至约4个核苷酸的至少一个3'突出。例如，siRNA的每条链可以包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3'突出。
siRNA可以化学或生物方式产生，或者可以从重组质粒或病毒载体表达(例如，参见美国专利号7,294,504和美国专利号7,422,896，其完整公开内容通过引用并入本文)。用于产生并测试dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Gewirtz的美国专利申请公开号2002/0173478、Hannon等人的美国专利号8,071,559和Tolentino等人的美国专利号7,148,342，其完整公开内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，针对组成FGFR融合分子的人核酸序列的siRNA可以针对SEQ ID NO：80-82、84、94-144或145的任何一个而产生。在另一个实施方案中，针对组成FGFR融合分子的断裂点的人核酸序列的siRNA可以针对SEQ ID NO：1-77、80-82、84-144或145的任何一个产生。在一个实施方案中，靶向FGFR3基因的发夹序列包括SEQ ID NO：183、184或185。
RNA聚合酶III转录的DNA含有启动子，例如U6启动子。这些DNA可以被转录以在细胞中产生小发夹RNA，其可以发挥siRNA或线性RNA的作用，可用作反义RNA。FGFR融合分子抑制剂可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、合成的核苷酸或者任何适当组合，使得靶RNA和/或基因得到抑制。此外，这些核酸形式可以是单链、双链、三链或四链的。(参见例如Bass(2001)Nature，411：428-429；Elbashir等人,(2001)Nature，411：494498；美国专利号6,509,154；美国专利申请公开号2003/0027783；和PCT公开号WO 00/044895、WO 99/032619、WO 00/01846、WO 01/029058、WO 00/044914)。
FGFR融合分子抑制剂可以是结合本文描述的FGFR融合蛋白并且破坏其功能的小分子。小分子是多组合成和天然的一般具有低分子量的物质。它们可以分离自天然来源(例如，植物、真菌、微生物等)，可以商业途径获得，和/或可作为文库或集合获得，或者合成。抑制FGFR融合蛋白的候选小分子可以通过根据现有技术确立的方法对组合文库进行计算机模拟筛选或高通量(HTP)筛选来鉴别(例如，参见Potyrailo等人,(2011)ACS Comb Sci.13(6)：579-633；Mensch等人,(2009)J Pharm Sci.98(12)：4429-68；Schnur(2008)Curr OpinDrug Discov Devel.11(3)：375-80；和Jhoti(2007)Ernst Schering FoundSymp Proc.(3)：169-85，其每一个在此通过引用以其整体并入)。大多数常规药物，例如阿司匹林、青霉素和许多化疗剂是小分子，可以商业途径获得，可以化学合成，或者可以获自下文描述的随机或组合文库(参见例如，Werner等人,(2006)Brief Funct.Genomic Proteomic5(1)：32-6)。
FGFR融合分子抑制剂的非限制性高，实例包括FGFR抑制剂AZD4547(参见Gavine等人,(2012)Cancer Res，72(8)；2045–56；还参见PCT申请公开号WO2008/075068，其每一个在此通过引用以其整体并入)；NVP-BGJ398(参见Guagnano等人,(2011)J.Med.Chem.，54：7066–7083；还参见美国专利申请公开号2008-0312248A1，其每一个在此通过引用以其整体并入)；PD173074(参见Guagnano等人,(2011)J.Med.Chem.，54：7066–7083；还参见Mohammadi等人,(1998)EMBO J.，17：5896–5904，其每一个在此通过引用以其整体并入)；NF449(EMD Millipore(Billerica，MA)目录号480420；还参见Krejci,(2010)the Journal of Biological Chemistry，285(27)：20644–20653，其在此通过引用以其整体并入)；LY2874455(ActiveBiochem；参见Zhao等人(2011)Mol Cancer Ther.(11)：2200-10；还参见PCT申请公开号WO 2010129509，其每一个在此通过引用以其整体并入)；TKI258(Dovitinib)；BIBF-1120(Intedanib-Vargatef)；BMS-582664(Brivanib alaninate)；AZD-2171(Cediranib)；TSU-68(Orantinib)；AB-1010(Masitinib)；AP-24534(Ponatinib)；和E-7080(Eisai)。FGFR融合分子抑制剂的非限制性实例包括TACC抑制剂KHS101(Wurdak等人,(2010)PNAS，107(38)：16542-47，其在此通过引用以其整体并入)。
用于本发明的FGFR融合分子抑制剂的结构包括但不限于：FGFR抑制剂AZD4547，
FGFR抑制剂NVP-BGJ398,
FGFR抑制剂PD173074,
FGFR抑制剂LY2874455
以及FGFR抑制剂NF449(EMD Millipore(Billerica，MA)目录号480420),
其他FGFR抑制剂包括但不限于：
用于本发明的FGFR融合分子抑制剂的结构包括但不限于TACC抑制剂KHS101，
评估和治疗性治疗
本发明提供了降低受试者中实体瘤生长的方法。肿瘤涉及但不限于多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠直肠癌。在一个实施方案中，所述方法包括检测获自受试者的样本中FGFR融合分子的存在。在一些实施方案中，使样本与结合FGFR融合分子的物质例如抗体、探针、核酸引物等一起孵育。在另外的实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的FGFR融合分子抑制剂，其中所述抑制剂降低实体瘤的大小。
本发明还提供了用于治疗或预防受试者中基因融合体相关癌症的方法。在一个实施方案中，基因融合体相关癌症包括上皮癌。在一个实施方案中，基因融合体相关癌症包括多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠直肠癌。在一些实施方案中，上皮癌包括膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺鳞状细胞癌、头颈鳞状细胞癌或所述上皮癌的组合。在一个实施方案中，所述方法包括检测获自受试者的样本中FGFR融合分子的存在，所述融合体的存在指示基因融合体相关癌症，并向有需要的受试者施用针对基因融合体相关癌症的治疗性治疗。在一些实施方案中，使样本与结合FGFR融合分子的物质例如抗体、探针、核酸引物等一起孵育。
本发明还提供了用于降低有需要的受试者中融合蛋白的表达水平或活性的方法，所述融合蛋白包含与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者获得生物样本。在一些实施方案中，使所述样本与结合FGFR融合分子的物质例如抗体、探针、核酸引物等一起孵育。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用治疗量的包含药学上可接受载体与本发明融合蛋白抑制剂的混合物的组合物。在另一个实施方案中，所述方法还包括确定融合蛋白表达水平或活性。在另一个实施方案中，所述方法还包括检测融合蛋白表达水平或活性与施用组合物之前的融合蛋白表达水平或活性相比是否降低，从而降低融合蛋白的表达水平或活性。在一些实施方案中，所述融合蛋白是FGFR-TACC融合蛋白。
要求保护的方法的每一个中的施用步骤可以包括药物施用，例如FGFR融合分子抑制剂(例如，包含特异性结合FGFR融合分子的抗体或其片段的药物组合物；特异性结合FGFR蛋白的小分子；特异性结合TACC蛋白的小分子；降低FGFR融合分子表达的反义RNA或反义DNA；特异性靶向编码FGFR融合分子的基因的siRNA；或其组合)。在一个实施方案中，待施用的治疗性分子包括FGFR融合分子的多肽，其包含SEQ ID NO：79、88、150、158-160或161的氨基酸序列的至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％，并且表现出降低此类蛋白质表达，从而治疗基因融合体相关癌症的功能。在另一个实施方案中，治疗性分子的施用降低与多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠直肠癌相关的实体瘤的大小。
在另一个实施方案中，待施用的治疗性分子包括针对组成FGFR融合分子的人核酸序列的siRNA。在一个实施方案中，siRNA针对SEQ ID NO：80-82、84、94-144、或145的任何一个。在另一个实施方案中，siRNA针对SEQ ID NO：1-77、80-82、84-144、或145的任何一个。在一个另外的实施方案中，待施用的治疗性分子包括抗体或其结合片段，其针对SEQ ID NO：79、88、150、158-160或161。在一些实施方案中，待施用的治疗性分子包括特异性结合FGFR蛋白的小分子，例如AZD4547、NVP-BGJ398、PD173074、NF449、TK1258、BIBF-1120、BMS-582664、AZD-2171、TSU68、AB1010、AP24534、E-7080或LY2874455。在其他实施方案中，待施用的治疗性分子包括特异性结合TACC蛋白的小分子，例如KHS101。
在一个实施方案中，本发明提供给定染色体坐标处染色体重排的检测。在另一个实施方案中，检测或确定包括核酸测序、选择性杂交、选择性扩增、基因表达分析或其组合。在另一个实施方案中，检测或确定包括蛋白质表达分析，例如通过western印迹分析、ELISA或其他抗体检测方法。
在一个实施方案中，生物样本包括神经细胞、血清、骨髓、血液、外周血液、淋巴结、脑脊髓液、尿液、唾液样本、口腔拭子、血清样本、痰样本、泪腺分泌样本、精液样本、阴道分泌样本、胎儿组织样本或其组合。
FGFR融合分子，例如，FGFR1、FGFR2、FGFR3或任何其他FGFR与TACC1、TACC2、TACC3或任何其他TACC之间的融合可以在DNA、RNA或多肽的水平确定。任选地，检测可以通过进行寡核苷酸连接测定、基于确认的测定、杂交测定、测序测定、等位基因特异性扩增测定、微量测序测定、解链曲线分析、变性高效液相色谱(DHPLC)测定(例如，参见Jones等人,(2000)Hum Genet.，106(6)：663-8)或其组合来确定。在一个实施方案中，通过对FGFR融合分子的全部或部分(例如，FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC核酸、或FGFR1、TACC1、FGFR2、TACC2、FGFR3、TACC3或其他FGFR或TACC核酸)进行测序或者通过FGFR融合分子的全部或部分(例如，FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC核酸或FGFR1、TACC1、FGFR2、TACC2、FGFR3、TACC3或其他FGFR或TACC核酸)的选择性杂交或扩增来进行检测。可以在融合鉴别步骤之前进行FGFR融合分子特异性扩增(例如，FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC核酸特异性扩增)。
本发明提供了检测罹患基因融合体相关癌症的受试者中染色体改变的方法。在一个实施方案中，染色体改变是本文描述的框内融合的转录物，例如FGFR融合分子。在一些实施方案中，染色体改变是染色体易位，例如FGFR融合分子。FGFR融合分子例如FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC核酸占据的染色体区域中的改变可以是单独或各种组合的基因座的编码和/或非编码区中突变、缺失、重排和/或插入的任何形式。突变可以包括点突变。插入可以涵盖基因座的编码或非编码部分的一个或数个残基的添加。插入可以包括基因座中1至50个碱基对的添加。缺失可以涵盖基因座的编码或非编码部分中一个、两个或多个残基的任何区域，例如从2个残基至整个基因或基因座。缺失可以影响较小区域，例如小于约50个连续碱基对的结构域(内含子)或重复序列或片段，尽管也可以发生较大缺失。重排包括序列倒位。FGFR融合分子例如FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC核酸占据的染色体区域中的改变可以导致氨基酸取代、RNA剪接或加工、产物不稳定、产生终止密码子、生成致癌融合蛋白、移码突变和/或截短的多肽生成。改变可以导致生成具有改变的功能、稳定性、靶向或结构的FGFR融合分子，例如由FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC核酸编码的一种。改变还可以引起蛋白质表达的减少或甚至增加。在一个实施方案中，FGFR融合分子占据的染色体区域中的改变可以包括染色体重排，导致生成FGFR融合分子，例如FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC融合体。该改变可以在DNA、RNA或多肽的水平确定。在另一个实施方案中，检测或确定包括核酸测序、选择性杂交、选择性扩增、基因表达分析或其组合。在另一个实施方案中，检测或确定包括蛋白质表达分析，例如通过western印迹分析、ELISA或其他抗体检测方法。在一个实施方案中，包括FGFR1易位的坐标包括chr8：38、268、656-38、325、363。在另一个实施方案中，包括FGFR2易位的坐标包括chr10：123、237、844-123、357、972。在一个另外的实施方案中，包括FGFR3易位的坐标包括chr4：1、795、039-1、810、599。而在另一个实施方案中，包括FGFR4易位的坐标包括chr5：176、513、921-176、525、126。在一个实施方案中，包括TACC1易位的坐标包括chr8：38、644、722-38、710、546。在另一个实施方案中，包括TACC2易位的坐标包括chr10：123、748、689-124、014、057。在一个另外的实施方案中，包括TACC3易位的坐标包括chr4：1、723、217-1、746、905。
本发明提供了一种用于治疗有需要的受试者中基因融合体相关癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括从受试者获得样本以确定受试者中FGFR融合分子的表达水平。在一些实施方案中，使样本与结合FGFR融合分子的物质例如抗体、探针、核酸引物等一起孵育。在另一个实施方案中，检测或确定包括核酸测序、选择性杂交、选择性扩增、基因表达分析或其组合。在另一个实施方案中，检测或确定包括蛋白表达分析，例如通过western印迹分析、ELISA或其他抗体检测方法。在一些实施方案中，所述方法还包括基于受试者的表达模式评估是否施用FGFR融合分子抑制剂。在另外的实施方案中，所述方法包括向受试者施用FGFR融合分子抑制剂。在一个实施方案中，基因融合体相关癌症包括上皮癌。在一个实施方案中，基因融合体相关癌症包括多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠直肠癌。在一些实施方案中，上皮癌包括膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺鳞状细胞癌、头颈鳞状细胞癌或所述上皮癌的组合。
在一个实施方案中，本发明提供了检测受试者，例如罹患基因融合体相关癌症的受试者中FGFR融合分子的改变的RNA表达的存在的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了检测受试者中FGFR融合分子存在的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者获得样本以确定受试者是否表达FGFR融合分子。在一些实施方案中，使样本与结合FGFR融合分子的物质例如抗体、探针、核酸引物等一起孵育。在其他实施方案中，检测或确定包括核酸测序、选择性杂交、选择性扩增、基因表达分析或其组合。在另一个实施方案中，检测或确定包括蛋白表达分析，例如通过western印迹分析、ELISA或其他抗体检测方法。在一些实施方案中，所述方法还包括基于受试者的表达模式评估是否施用FGFR融合分子抑制剂。在另外的实施方案中，所述方法包括向受试者施用FGFR融合分子抑制剂。改变的RNA表达包括改变的RNA序列的存在、改变的RNA剪接或加工的存在、或改变的RNA量的存在。这些可以通过本领域已知的各种技术来检测，包括对RNA的全部或部分进行测序，或者通过RNA的全部或部分的选择性杂交或选择性扩增。在一个另外的实施方案中，所述方法可以包括检测FGFR融合分子的存在或表达，所述FGFR融合分子例如由FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC核酸编码的FGFR融合分子。改变的多肽表达包括改变的多肽序列的存在、改变的多肽量的存在或改变的组织分布的存在。这些可以通过本领域已知的各种技术检测，包括通过测序和/或结合至特异性配体(例如抗体)。在一个实施方案中，检测包括使用northern印迹；针对SEQ ID NO：80-82、84、94-144或145的实时PCR和引物；核糖核酸酶保护测定；检测FGFR融合分子的杂交、扩增或测序技术，所述FGFR融合分子例如包括SEQ ID NO：80-82、84、94-144、或145的FGFR融合分子；或其组合。在另一个实施方案中，PCR引物包括SEQ ID NO：162、163、164或165。在一个另外的实施方案中，用于筛选FGFR融合分子，例如FGFR-TACC融合体的引物包括SEQ ID NO：166、167、168或169。在一些实施方案中，用于FGFR3-TACC3融合体的基因组检测的引物包括SEQ ID NO：170和171。
现有技术中已知的各种技术可用于检测或定量改变的基因或RNA表达或核酸序列，其包括但不限于杂交、测序、扩增和/或结合特异性配体(例如抗体)。其他适合的方法包括等位基因特异性寡核苷酸(ASO)、寡核苷酸连接、等位基因特异性扩增、Southern印迹(对于DNA)、Northern印迹(对于RNA)、单链构象分析(SSCA)、PFGE、荧光原位杂交(FISH)、凝胶迁移、夹持变性凝胶电泳、变性HLPC、解链曲线分析、异源双链分析、RNA酶保护、化学或酶促错配裂解、ELISA、放射免疫测定(RIA)和免疫酶促测定(IEMA)。
这些方法中的一些(例如SSCA和恒定梯度凝胶电泳(CGGE))基于改变序列存在导致的核酸的电泳迁移率的改变。根据这些技术，通过凝胶上迁移率的改变显现改变的序列。然后可以对片段测序以证实改变。一些其他方法基于来自受试者的核酸与特异性针对野生型或改变的基因或RNA的引物之间的特异性杂交。探针可以在悬液中或固定在基底上。可以标记探针以促进杂合体的检测。这些方法的一些适合评估多肽序列或表达水平，例如Northern印迹、ELISA和RIA。后面这些需要使用特异性针对多肽的配体，例如使用特异性抗体。
杂交。杂交检测方法基于用于检测核酸序列改变的互补核酸序列之间特异性杂合体的形成。检测技术涉及特异性针对野生型或改变的基因或RNA的核酸探针的使用，随后检测杂合体的存在。探针可以在悬液中或固定在基底或支持体上(例如，如核酸阵列或芯片技术中)。可以标记探针以促进杂合体的检测。在一个实施方案中，根据本发明的探针可以包括针对SEQ ID NO：80-82、84、94-144、或145的核酸。例如，来自受试者的样本可以与特异性针对编码FGFR融合分子的基因的核酸探针接触，并且可以随后评估杂合体的形成。在一个实施方案中，所述方法包括使样本与特异性针对FGFR融合分子的一组探针同时接触。而且，可以平行考察来自不同受试者的不同样本。
根据本发明，探针可以是与对应于FGFR融合分子的基因或RNA或基因或RNA的靶部分互补且特异性杂交的多核苷酸序列。有用的探针是与所述基因、RNA或其靶部分互补的那些。探针可以包括长度为8至1000个核苷酸，例如10至800、15至700、或20至500个核苷酸的单链核酸。也可以使用较长的探针。本发明的有用的探针是长度为8至500个核苷酸的单链核酸分子，其可以与对应于FGFR融合分子的基因或RNA的区域特异性杂交。
探针的序列可以源自本文提供的FGFR融合基因的序列。可以进行核苷酸取代以及探针的化学修饰。可以进行此类化学修饰以增加杂合体的稳定性(例如，插入基团)或者标记探针。标记的一些实例包括但不限于放射性、荧光、发光和酶促标记。
核酸杂交指南参见例如Sambrook编，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版)，第1-3卷，Cold Spring HarborLaboratory，1989；Current Protocols In Molecular Biology，Ausubel编John Wiley&Sons,Inc.，New York，2001；Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology:Hybridization With Nucleic Acid Probes,第I部分Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen编Elsevier,N.Y.,1993.
测序。可以使用本领域熟知的技术，使用自动化测序仪进行测序。可以对完整的FGFR融合分子或其特定结构域进行测序。
扩增。扩增基于用于起始核酸复制的互补核酸序列之间的特异性杂合体的形成。可以根据本领域已知的各种技术进行扩增，例如通过聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。这些技术可以使用可商业途径获得的试剂和方案进行。本领域有用的技术涵盖实时PCR、等位基因特异性PCR或基于PCR的单链构象多态性(SSCP)。扩增通常需要使用特异性核酸引物以起始反应。例如，用于扩增对应于FGFR融合分子的序列的核酸引物能够与在基因座靶区域侧面的基因座的一部分特异性杂交。在一个实施方案中，扩增包括使用针对SEQ IDNO：80-82、84、94-144、或145的正向和反向PCR引物。用于扩增来自FGFR融合分子(例如，FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC核酸)的序列的核酸引物；与FGFR融合分子的一部分特异性杂交的引物。在某些受试者中，FGFR融合分子的存在对应于具有基因融合体相关癌症的受试者。在一个实施方案中，扩增可以包括使用包含SEQ ID NO：80-82、84、94-144、或145的核苷酸序列的正向和反向PCR引物。
非限制性扩增方法包括例如聚合酶链式反应、PCR(PCR Protocols，A Guide To Methods And Applications，Innis编，AcademicPress，N.Y.，1990和PCR Strategies，1995，Innis编，Academic Press,Inc.，N.Y.)；连接酶链式反应(LCR)(Wu(1989)Genomics 4：560；Landegren(1988)Science 241：1077；Barringer(1990)Gene 89：117)；转录扩增(Kwoh(1989)PNAS 86：1173)；和自持序列复制(Guatelli(1990)PNAS 87：1874)；Qβ复制酶扩增(Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35：1477-1491)，自动化Q-β复制酶扩增测定(Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10：257-271)和其他RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario；还参见Berger(1987)Methods Enzymol.152：307-316；美国专利号4,683,195和4,683,202；和Sooknanan(1995)Biotechnology 13：563-564)。全部上述参考文献通过引用以其整体并入。
本发明提供了核酸引物，其中所述引物可以与患有基因融合体相关癌症的某些受试者中的FGFR融合分子的一部分互补且特异性杂交，所述FGFR融合分子例如FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC核酸(例如，DNA或RNA)。在一个实施方案中，基因融合体相关癌症包括多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠直肠癌。本发明的引物可以特异性针对FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC核酸(DNA或RNA)中的融合序列。通过使用此类引物，扩增产物的检测指示FGFR1和TACC1、FGFR2和TACC2、FGFR3和TACC3或其他FGFR和TACC核酸的融合体的存在。本发明的引物的实例可以是长度约5至60个核苷酸或者长度约8至约25个核苷酸的单链核酸分子。序列可以直接源自FGFR融合分子的序列，所述FGFR融合分子例如FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC核酸。完美互补性用于确保高特异性；然而，可以允许某些错配。例如，上述核酸引物或核酸引物对可用于检测受试者中基因融合体相关癌症存在的方法。在一个实施方案中，可以使用引物来检测FGFR融合分子，例如包括SEQ ID NO：80-82、84、94-144或145的引物；或其组合。在另一个实施方案中，PCR引物包括SEQ IDNO：162、163、164或165。在一个另外的实施方案中，用于筛选FGFR融合分子，例如FGFR-TACC融合体的引物包括SEQ ID NO：166、167、168或169。在一些实施方案中，用于FGFR3-TACC3融合体的基因组检测的引物包括SEQ ID NO：170和171。
特异性配体结合。如本文讨论的，编码FGFR融合分子的核酸或FGFR融合分子的表达还可以通过筛选由所述核酸编码的多肽的序列或表达水平的改变来检测。可以使用不同类型的配体，例如特异性抗体。在一个实施方案中，使样本与特异性针对由FGFR融合分子编码的多肽的抗体接触并随后确定免疫复合物的形成。可以使用用于检测免疫复合物的各种方法，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫酶促测定(IEMA)。
例如，抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体及其具有基本上相同的抗原特异性的片段或衍生物。片段包括Fab、Fab'2或CDR区。衍生物包括单链抗体、人源化抗体或多官能抗体。特异性针对由FGFR融合分子编码的多肽的抗体可以是选择性结合此类多肽的抗体。在一个实施方案中，产生针对由FGFR融合分子(例如FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC融合体)编码的多肽或其含有表位的片段的抗体。尽管可以发生对其他抗原的非特异性结合，但对靶多肽的结合以更高亲和力发生，并且可以可靠地区分于非特异性结合。在一个实施方案中，所述方法可以包括使来自受试者的样本与特异性针对FGFR融合分子的抗体接触，并确定免疫复合物的存在。任选地，可以使样本与涂覆有特异性针对FGFR融合分子的抗体的支持体接触。在一个实施方案中，可以使样本与特异性针对FGFR融合分子例如FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2、FGFR3-TACC3或其他FGFR-TACC的不同形式的各种抗体同时、或平行或顺序接触。
本发明还提供了诊断试剂盒，其包括用于检测来自受试者的样本中FGFR融合分子存在的产品和试剂。所述试剂盒可用于确定来自受试者的样本是否表现出FGFR融合分子的增加或是减少的表达。例如，根据本发明的诊断试剂盒包括特异性针对FGFR融合分子的任何引物、任何引物对、任何核酸探针和/或任何配体或任何抗体。根据本发明的诊断试剂盒可以进一步包括用于进行杂交、扩增、或抗原-抗体免疫反应的试剂和/或方案。在一个实施方案中，所述试剂盒可以包括与FGFR融合分子特异性杂交并且可以由FGFR融合分子引发聚合酶反应的核酸引物，所述FGFR融合分子包括SEQ ID NO：80-82、84、94-144或145或其组合。在一个实施方案中，可以使用引物检测FGFR融合分子，例如针对SEQ ID NO：80-82、84、94-144或145或其组合的引物。在另一个实施方案中，PCR引物包括SEQ ID NO：162、163、164、165、166、167、168或169。在一个另外的实施方案中，用于筛选FGFR融合分子，例如FGFR-TACC融合体的引物包括SEQ ID NO：166、167、168或169。在一些实施方案中，用于FGFR3-TACC3融合体的基因组检测的引物包括SEQ ID NO：170和171。在一些实施方案中，所述试剂盒包括特异性结合FGFR融合分子的抗体，所述FGFR融合分子包括SEQ ID NO：79、85-89、150、158-160或161，其中所述抗体仅当FGFR融合分子存在时识别该蛋白质。
可以在体外、离体或体内进行诊断方法。这些方法利用来自受试者的样本以评估FGFR融合分子的状态。所述样本可以是源自受试者的任何生物样本，其含有核酸或多肽。此类样本的实例包括但不限于流体、组织、细胞样本、器官、和组织活检。样本的非限制性实例包括血液、肝脏、血浆、血清、唾液、尿液或精液。样本可以根据常规技术收集并且直接用于诊断或储存。可以在进行所述方法之前处理样本，以提供或改善核酸或多肽用于测试的可用性。处理包括例如溶解(例如，机械、物理或化学)、离心。核酸和/或多肽可以通过常规技术预纯化或富集，和/或减少复杂性。还可以用酶或其他化学或物理处理来处理核酸和多肽以产生其片段。在一个实施方案中，使样本与试剂例如探针、引物或配体接触以评估FGFR融合分子的存在。可以在任何适当的装置例如板、管、孔或玻璃中进行接触。在一些实施方案中，在涂覆有试剂例如核酸阵列或特异性配体阵列的基底上进行接触。基底可以是固体或半固体基底，例如包括玻璃、塑料、尼龙、纸、金属或聚合物在内的任何支持体。基底可以具有各种形式和大小，例如载玻片、膜、珠粒、柱或凝胶。可以在适合在试剂和样本的核酸或多肽之间形成复合物的任何条件下进行接触。
核酸递送方法
可以通过使用载体例如病毒载体(例如，慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒)在离体、原位或体内，或者通过使用物理DNA转移方法(例如脂质体或化学处理)在离体实现核酸向活细胞的递送。适合于在体外将核酸向哺乳动物细胞转移的非限制性技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖和磷酸钙沉淀方法(参见例如，Anderson，Nature，1998)增刊392(6679)：25()。编码本发明的多肽的核酸或基因的引入还可以使用染色体外基质(瞬时表达)或人工染色体(稳定表达)来实现。还可以在本发明的治疗性组合物存在下离体培养细胞以增殖或产生类细胞中所需的作用或活性。然后可以将处理过的细胞为治疗目的体内引入。
核酸可以插入载体并用作基因治疗载体。许多病毒已经用作基因转移载体，包括乳多空病毒，例如SV40(Madzak等人,(1992)J GenVirol.73(Pt 6)：1533-6)、腺病毒(Berkner(1992)Curr Top MicrobiolImmunol.158：39-66；Berkner(1988)Biotechniques，6(7)：616-29；Gorziglia和Kapikian(1992)J Virol.66(7)：4407-12；Quantin等人,(1992)Proc Natl Acad Sci U S A.89(7)：2581-4；Rosenfeld等人,(1992)Cell.68(1)：143-55；Wilkinson等人,(1992)Nucleic AcidsRes.20(9)：2233-9；Stratford-Perricaudet等人,(1990)Hum Gene Ther.1(3)：241-56)、牛痘病毒(Moss(1992)Curr Opin Biotechnol.3(5)：518-22)、腺相关病毒(Muzyczka,(1992)Curr Top Microbiol Immunol.158：97-129；Ohi等人,(1990)Gene.89(2)：279-82)、疱疹病毒，包括HSV和EBV(Margolskee(1992)Curr Top Microbiol Immunol.158：67-95；Johnson等人,(1992)Brain Res Mol Brain Res.12(1-3)：95-102；Fink等人,(1992)Hum Gene Ther.3(1)：11-9；Breakefield和Geller(1987)Mol Neurobiol.1(4)：339-71；Freese等人,(1990)Biochem Pharmacol.40(10)：2189-99)和禽类逆转录病毒(Bandyopadhyay和Temin(1984)Mol Cell Biol.4(4)：749-54；Petropoulos等人,(1992)J Virol.66(6)：3391-7)、鼠类逆转录病毒(Miller等人(1992)Mol Cell Biol.12(7)：3262-72；Miller等人,(1985)J Virol.55(3)：521-6；Sorge等人,(1984)Mol Cell Biol.4(9)：1730-7；Mann和Baltimore(1985)J Virol.54(2)：401-7；Miller等人,(1988)J Virol.62(11)：4337-45)和人来源逆转录病毒(Shimada等人,(1991)J Clin Invest.88(3)：1043-7；Helseth等人,(1990)J Virol.64(12)：6314-8；Page等人,(1990)J Virol.64(11)：5270-6；Buchschacher和Panganiban(1992)J Virol.66(5)：2731-9)。
体内基因转移技术的非限制性实例包括用病毒(例如，逆转录病毒)载体的转染(参见美国专利号5,252,479，其通过引用以其整体并入)和病毒包衣蛋白-脂质体介导的转染(Dzau等人,(1993)Trendsin Biotechnology 11：205-210)，通过引用整体并入)。例如，裸DNA疫苗一般是现有技术已知的；参见Brower,(1998)NatureBiotechnology，16：1304-1305，其通过引用以其整体并入。可以通过例如静脉内注射、局部施用(参见例如，美国专利号5,328,470)或通过立体定向注射(参见例如，Chen,等人,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)将基因治疗载体递送至受试者。基因治疗载体的药物制品可以包括可接受稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包括其中包埋基因递送媒介物的缓释基质。可选地，当可以从重组细胞完整生成完整基因递送载体例如逆转录病毒载体时，药物制品可以包括生成基因递送系统的一种或多种细胞。
有关核酸递送方案和方法的综述，参见Anderson等人(1992)Science 256：808-813；美国专利号5,252,479、5,747,469、6,017,524、6,143,290、6,410,0106、511,847；和U.S.申请公开号2002/0077313，其全部通过引用以其整体并入本文。关于其他综述，参见Friedmann(1989)Science，244：1275-1281；Verma，Scientific American：68-84(1990)；Miller(1992)Nature，357：455-460；Kikuchi等人(2008)J Dermatol Sci.50(2)：87-98；Isaka等人(2007)Expert Opin Drug Deliv.4(5)：561-71；Jager等人(2007)Curr Gene Ther.7(4)：272-83；Waehler等人(2007)Nat Rev Genet.8(8)：573-87；Jensen等人(2007)Ann Med.39(2)：108-15；Herweijer等人(2007)Gene Ther.14(2)：99-107；Eliyahu等人(2005)Molecules 10(1)：34-64；和Altaras等人(2005)Adv Biochem Eng Biotechnol.99：193-260，其全部通过引用以其整体并入本文。
还可以控制释放系统递送FGFR融合核酸。例如，可以使用静脉内输注、可植入渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其他施用模式施用FGFR融合分子。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Sefton(1987)Biomed.Eng.14：201；Buchwald等人(1980)Surgery 88：507；Saudek等人(1989)N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(参见Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(编)，CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(编)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas,(1983)J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还参见Levy等人(1985)Science228：190；During等人(1989)Ann.Neurol.25：351；Howard等人(1989)J.Neurosurg.71：105)。而在另一个实施方案中，可以将控制释放系统置于靠近治疗靶，由此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson，Medical Applications of Controlled Release，同上，第2卷，第115-138页(1984))。其他控制释放系统在Langer的综述(Science(1990)249：1527-1533)中讨论。
药物组合物和治疗施用
可以将本发明抑制剂并入适合施用的药物组合物，例如抑制剂和药学上可接受的载体。
可以一次(例如，作为单一注射或沉积)向受试者施用本发明的FGFR融合分子或抑制剂。可选地，可以向有需要的受试者每日一次或两次施用FGFR融合分子或抑制剂，持续约2至约28天，或者约7至约10天的时段。还可以向受试者每日一次或两次施用FGFR融合分子或抑制剂，持续每年1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12次的时段，或其组合。而且，本发明的FGFR融合分子或抑制剂可以与另一种治疗剂联合施用。当剂量方案包括多次施用时，向受试者施用的FGFR融合分子或抑制剂的有效量可以包括在整个剂量方案中施用的基因产物的总量。
可以通过适合将FGFR融合分子或抑制剂递送至受试者细胞，例如癌细胞，例如多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠直肠癌的任何手段向受试者施用FGFR融合分子或抑制剂。例如，可以通过适合转染细胞的方法施用FGFR融合分子或抑制剂。针对真核细胞的转染方法是本领域熟知的，并且包括将核酸直接注射进入细胞的核或原核；电穿孔；脂质体转移或通过亲脂材料介导的转移；受体介导的核酸递送、生物弹道或颗粒加速；磷酸钙沉淀，和病毒载体介导的转染。
可以配制并施用本发明的组合物以减少与基因融合体相关的癌症，例如多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠直肠癌相关的症状，通过产生活性成分与受试者例如人或动物(例如，狗、猫或马)体内药剂作用部位接触的任何手段。它们可以通过可与药物联合使用的任何常规手段来施用，所述药物作为单独的治疗性活性成分或者与治疗性活性成分的组合。它们可以单独施用，但是一般与药物载体一起施用，所述药物载体基于选择的施用途径和标准药学实践来选择。
FGFR融合分子或抑制剂的治疗有效剂量可以取决于本领域技术人员或普通技术人员已知的许多因素。FGFR融合分子抑制剂的剂量可以例如根据正治疗的受试者或样本的身份、大小和状态而变化，还可根据组合物施用途径(如果适用)和实践者希望FGFR融合分子抑制剂对本发明的核酸或多肽的作用而变化。这些量可以容易地由技术人员确定。本文描述的治疗应用的任何一个可以应用至需要这种治疗的任何受试者，包括例如哺乳动物，例如狗、猫、牛、马、兔、猴、猪、绵羊、山羊或人。
根据本发明的药物组合物可以常规方式配制，使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂。可以针对多种施用途径配制本发明的治疗组合物，包括全身和表面或局部施用。技术和制剂一般可以参见Remmington's Pharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.,Easton,Pa(第20版，2000年)，其完整公开内容通过引用并入本文。对于全身施用，注射是有用的，包括肌肉内、静脉内、腹膜内和皮下。对于注射，本发明的治疗组合物可以配制为液体溶液，例如在生理相容缓冲液例如汉克斯溶液(Hank’s solution)或林格氏溶液(Ringer’ssolution)中。此外，治疗组合物可以配制为固体形式，并且在即将使用之前重新溶解或悬浮。还包括冻干形式。本发明的药物组合物特征为至少无菌和无热原。这些药物制剂包括用于人和兽用途的制剂。
根据本发明，药学上可接受的载体可以包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。用于药学活性物质的此类介质和试剂的使用是本领域熟知的。可以使用与活性化合物相容的任何常规介质或试剂。还可以将补充的活性化合物并入组合物。
为了本文讨论的治疗效果的任何一种，含有FGFR融合分子抑制剂的药物组合物可以与药学上可接受的载体联合施用。此类药物组合物可以包含例如针对FGFR融合分子的抗体或其变体，或FGFR融合分子的拮抗剂。组合物可以单独或与至少一种其他试剂例如稳定化合物组合施用，所述其他试剂可以在任何无菌生物相容的药物载体中施用，所述载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖和水。所述组合物可以向患者单独施用，或与其他药剂、药物或激素组合。
可以通过在适当溶剂中加入所需量的FGFR融合分子抑制剂(例如，多肽或抗体)与本文列举的成分之一或组合(根据需要)，随后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。一般而言，通过将活性化合物加入无菌媒介物来制备分散液，所述无菌媒介物含有基础分散介质和所需的来自本文列举的那些的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末情况下，有用的制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥，这从其之前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外所需成分的粉末。
在一些实施方案中，可以通过缓慢释放活性化合物以供透皮吸收的透皮递送系统应用FGFR融合分子抑制剂。渗透增强剂可用于促进条件培养基中活性因子的透皮渗透。透皮贴剂描述于例如美国专利号5,407,713；美国专利号5,352,456；美国专利号5,332,213；美国专利号5,336,168；美国专利号5,290,561；美国专利号5,254,346；美国专利号5,164,189；美国专利号5,163,899；美国专利号5,088,977；美国专利号5,087,240；美国专利号5,008,110；和美国专利号4,921,475。
“皮下”施用可以指刚好在皮肤之下(即，真皮之下)的施用。一般而言，皮下组织是容纳较大血管和神经的脂肪和结缔组织层。该层的大小在机体内和人与人之间变化。皮下施用可以涵盖皮下层和肌肉层之间的界面。当皮下层足够薄使得组合物中存在的因子可以从施用位置迁移或扩散时，该施用模式可以是可行的。因此，当利用皮内施用时，施用的组合物团块定位于靠近皮下层。
细胞聚集物(例如DP或DS聚集物)的施用不限于单一途径，但是可以涵盖通过多个途径的施用。例如，通过多个途径的示例性施用除了别的之外包括皮内和肌肉内施用、或者皮内和皮下施用的组合。多个施用可以是顺序或同时的。通过多个途径的其他应用模式对于技术人员是明显的。
在其他实施方案中，该植入方法对于一些受试者是一次性治疗。在本发明的其他实施方案中，将需要多个细胞治疗植入。在一些实施方案中，用于植入的细胞一般是受试者特异性的基因工程细胞。在另一个实施方案中，可以使用从不同物种或相同物种的另一个体获得的细胞。因此，使用此类细胞可能需要施用免疫抑制剂以防止植入细胞的排斥。此类方法也已经描述于美国专利号7,419,661和PCT申请公开号WO 2001/32840，并且在此通过引用并入。
配制本发明的药物组合物以与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入或摄入)、透皮(表面)、经粘膜和直肠施用。用于胃肠外、皮内或皮下应用的溶液或悬液可以包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。可以将胃肠外制品包封于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(当水溶性时)或分散液，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，适当载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应该是存在容易注射性的流体程度。其在生产和储存条件下必须是稳定的，并且必须被保存防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、药学上可接受的多元醇如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇及其适当混合物。可以例如通过使用包衣例如卵磷酯，在分散剂情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂来实现微生物作用的预防，所述试剂例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，组合物中包含等渗剂可能是有用的，所述等渗剂例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，使注射组合物的吸收延长。
可以通过在适当溶剂中加入所需量的本发明的抑制剂(例如，多肽或抗体或小分子)与本文列举的成分之一或组合(根据需要)，随后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。一般而言，通过将活性化合物加入无菌媒介物来制备分散液，所述无菌媒介物含有基础分散介质和所需的来自本文列举的那些的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末情况下，有用的制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥，这从其之前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外的所需成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以包封在明胶胶囊中或者压制成片剂。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可以并入赋形剂并且以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物还可以使用流体载体制备并随后吞咽。
可以包含药学相容性结合剂和/或佐剂材料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有以下成分或类似性质的化合物的任何一种：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如藻酸、羧甲基淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
还可以通过经粘膜或透皮手段全身施用。对于经粘膜或透皮施用，制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂一般是本领域公知的，并且包括例如用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂实现经粘膜施用。对于透皮施用，将活性化合物配制成本领域公知的软膏、油膏、凝胶或乳霜。
在一些实施方案中，施用的FGFR融合分子抑制剂的有效量是至少约0.0001μg/kg体重、至少约0.00025μg/kg体重、至少约0.0005μg/kg体重、至少约0.00075μg/kg体重、至少约0.001μg/kg体重、至少约0.0025μg/kg体重、至少约0.005μg/kg体重、至少约0.0075μg/kg体重、至少约0.01μg/kg体重、至少约0.025μg/kg体重、至少约0.05μg/kg体重、至少约0.075μg/kg体重、至少约0.1μg/kg体重、至少约0.25μg/kg体重、至少约0.5μg/kg体重、至少约0.75μg/kg体重、至少约1μg/kg体重、至少约5μg/kg体重、至少约10μg/kg体重、至少约25μg/kg体重、至少约50μg/kg体重、至少约75μg/kg体重、至少约100μg/kg体重、至少约150μg/kg体重、至少约200μg/kg体重、至少约250μg/kg体重、至少约300μg/kg体重、至少约350μg/kg体重、至少约400μg/kg体重、至少约450μg/kg体重、至少约500μg/kg体重、至少约550μg/kg体重、至少约600μg/kg体重、至少约650μg/kg体重、至少约700μg/kg体重、至少约750μg/kg体重、至少约800μg/kg体重、至少约850μg/kg体重、至少约900μg/kg体重、至少约950μg/kg体重、至少约1,000μg/kg体重、至少约2,000μg/kg体重、至少约3,000μg/kg体重、至少约4,000μg/kg体重、至少约5,000μg/kg体重、至少约6,000μg/kg体重、至少约7,000μg/kg体重、至少约8,000μg/kg体重、至少约9,500μg/kg体重或至少约10,000μg/kg体重。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。下文描述了示例性方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文描述的那些相似或等同的方法和材料。
本文提到的所有出版物和其他参考文献通过引用整体并入，如同明确且单独地指示每个单独出版物或参考文献通过引用并入。不承认本文引用的出版物和参考文献是现有技术。
实施例
下文提供了实施例以帮助对本发明的更全面理解。以下实施例示例说明制备和实施本发明的示例性方式。然而，本发明范围不限于这些实施例中公开的具体实施方案，这些实施例中公开的具体实施方案仅是为示例说明的目的，因为可以利用可选方法来获得相似的结果。
实施例1：胶质母细胞瘤中FGFR和TACC基因的转化和反复融合
癌症的成功靶向治疗的历史与在血液系统恶性肿瘤中和最近在一些类型上皮癌中的反复、致癌且成瘾的基因融合体的失活基本一致。多形性胶质母细胞瘤(GBM)是人癌症的最致命形式。这里，开发了一体化的基因融合体发现流程以检测来自完整外显子组序列的RNA-seq和基因组融合体的框内融合的转录物。将所述流程应用于人GBM揭示了反复的染色体易位，其使FGFR基因(FGFR1或FGFR3)的酪氨酸激酶结构域分别与TACC1或TACC3的TACC结构域框内融合。FGFR-TACC融合体的频率是97个GBM中3个(3.1％)。FGFR-TACC融合蛋白在被引入星形细胞或通过慢病毒介导的立体定向递送转导至成年小鼠脑时表现出强的致癌活性。FGFR-TACC融合蛋白错误定位于有丝分裂纺锤体极之上，具有组成型酪氨酸激酶活性并且以延迟的有丝分裂进程异常调控有丝分裂周期。受损的有丝分裂保真度触发了染色单体粘连缺陷、缺陷的纺锤体检查点激活、染色体错分离和蔓延的非整倍性。FGFR激酶的抑制校正了非整倍性，并且临床考察的特异性FGFR酪氨酸激酶抑制剂的口服施用阻止肿瘤生长并延长了携带颅内FGFR3-TACC3引发的神经胶质瘤的小鼠的存活。FGFR-TACC融合体鉴别了可能受益于FGFR的酪氨酸激酶活性的靶向抑制的GBM患者的亚组。
多形性胶质母细胞瘤(GBM)是人最难治疗的癌症形式(Ohgaki和Kleihues，2005)。迄今为止，已经针对GBM中可能重要的致癌驱动者测试的靶向治疗方法取得了有限的成功。(Lo，2010；Reardon等人，2010；van den Bent等人，2009)。导致致癌融合蛋白生成的反复染色体易位被视为人癌症发病机理中的引发和成瘾事件，由此提供了癌症治疗的最希望的分子靶标(Ablain等人，2011；Mitelman等人，2007)。导致反复且致癌基因融合体的染色体重排是血液系统恶性肿瘤的标志，并且最近还在实体瘤亚组(乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠直肠癌)中揭露了它们，但是还未在GBM中发现它们(Bass等人，2011；Prensner和Chinnaiyan，2009)。其肿瘤携带这些重排的患者的重要且成功的靶向治疗介入源于功能性基因融合体的发现，特别是当易位涉及激酶编码基因时(BCR-ABL，EML4-ALK)时(Druker，2009；Gerber和Minna，2010)
GBM的标志是蔓延的染色体不稳定性(CIN)，其导致非整倍性(Furnari等人，2007)。CIN和非整倍性是癌症发病机理中的早期事件(Cahill等人，1999)。已经表明，靶向有丝分裂保真度的遗传改变可能导致有丝分裂期间染色体错分离，导致非整倍性(Gordon等人，2012；Solomon等人，2011)。这里，描述了人GBM中反复且致癌基因融合体的第一种情况。得到的融合蛋白定位于有丝分裂细胞，破坏染色体分离的正常控制，并诱导非整倍性。还针对携带这些染色体重排的GBM患者的靶向治疗报告了使用FGFR酪氨酸激酶抑制剂的治疗策略。
FGFR和TACC基因的反复融合体的鉴别。为了鉴别GBM中产生功能融合蛋白并且是反复的基因组重排，根据表达转录物(RNA-seq)的大量平行配对末端测序的分析作为框内融合转录物发现的基因对也根据人GBM的基因组分析作为融合基因对出现。为此目的，设计了两个互补的基因融合体发现方法并应用于两个GBM队列。第一，TX-Fuse是用于从RNA-seq发现候选融合体转录物的算法(图8)。第二，Exome-Fuse从完整外显子组DNA序列检测融合基因(图8)。作为检测融合转录物的第一步骤，从携带原发性GBM的9名患者新鲜分离的神经胶质瘤干细胞样细胞(GSC)的短期培养产生RNA-seq数据。无血清条件下原发性GBM肿瘤的培养选择与大部分失去其发育身份的血清培养的神经胶质瘤细胞系相比保留密切反映原发性肿瘤特征的表型和基因型的细胞(Lee等人，2006)。因此，不受理论束缚，如果神经胶质瘤细胞携带由此导致GBM的最侵袭性标志的基因融合体，它们应该在GSC中选择。RNA-seq对每个GSC培养产生平均60,300,000配对read，其中超过80％定位于参考转录物组和基因组。TX-Fuse检测两个主要的证据来源：分裂read和分裂插入(参见Experimental Procedures)。TX-Fuse应用于来自9个GSC的RNA-seq数据组导致五个候选重排的发现(其全部在染色体内)，其产生了框内融合体转录物(表1)。
表1：来自9个GSC的RNA-Seq的预测框内融合蛋白
接下来，通过将Exome-Fuse应用至来自TCGA的84个GBM样本的配对末端外显子组DNA序列的数据集而在GBM中鉴别了导致基因融合体的基因组重排(表2)。
该分析检测了147个配对基因融合体，由此产生每个肿瘤平均1.75个基因融合事件(表3)。
FGFR和TACC基因家族在反复参与基因组融合的那些中明显富集，其中8个肿瘤携带FGFR重排并且7个肿瘤携带牵涉TACC基因的融合体(图1A)。TX-Fuse和Exon-Fuse结果的对比分析揭示FGFR3-TACC3是通过TX-Fuse鉴别为框内转录物或通过Exome-Fuse鉴别为基因组融合体的唯一融合对(表1、2和3)。
表2显示通过来自TCGA的84个GBM的Exome-fuse分析鉴别的反复基因融合体的融合断裂点信息。由于每个融合候选物中可能存在多个连接点，所以显示了所有断裂点的信息。列定义包括：样本＝TCGA样本ID，virtForSplitReads/virtRevSplitReads/virtTotSplitReads＝正向/反向/总分裂read数，splitInserts＝分裂插入数，dirA/dirB＝定位于基因A/B的分裂read部分的正向(1)或反向(0)方向，dirAB_matepair＝分裂read的配对方向，cosmicA+B＝COSMIC中记录的基因A+B的突变数。
表3.来自TCGA的84个GBM的Exome-fuse分析的反复基因融合体对
上表3显示来自TCGA的84个GBM的Exome-fuse分析的反复基因融合体对。如果具有至少两个分裂插入和至少两个分裂read，则被提名融合体候选物。为了进一步反复过滤名单，保持其中基因之一参与不同样本的至少两个融合体的任何融合体候选物。
为了实验验证从TX-Fuse产生的计算机预测，对跨融合体断裂点的PCR产物进行测序并验证5个框内融合体预测的每一个(图1和9)。在图1B中显示预测，并且在图1C中显示融合体的cDNA序列验证，其中最高read支持涉及GSC-1123中与TACC3框内融合的FGFR3。还在由其建立GSC-1123培养物的原发性GBM-1123肿瘤样本中检测了相同的FGFR3-TACC3融合体转录物(图1C)。扩增的cDNA含有残基1-758的FGFR3氨基末端部分与残基549-838的TACC3羧基末端部分融合产生的1,048个氨基酸的蛋白质的开放阅读框(图1D)。FGFR3是在结合至FGF配体之后转导细胞内信号的FGFR受体酪氨酸激酶(TK)家族的成员(Turner和Grose，2010)。TACC3属于进化上保守的TACC基因家族，所述TACC基因家族还包括TACC1和TACC2。TACC蛋白的独特特征是C末端存在卷曲螺旋结构域，称为TACC结构域。通过TACC结构域，TACC蛋白定位于中期的有丝分裂纺锤体，并且稳定微管纺锤体网络(Hood和Royle，2011；Peset和Vernos，2008)。在预测的融合蛋白中，FGFR3的细胞内TK结构域在TACC3的TACC结构域上游融合(图1D)。
GSC-1123中RNA-seq覆盖的外显子特异性基因表达分析证明融合体中涉及的FGFR3和TACC3外显子与融合事件中不包括的mRNA序列相比高度过表达(图10A)。定量RT-PCR显示，GSC-1123中融合FGFR3-TACC3外显子的表达显著高于其他GSC和正常脑(80至130倍，图10B)。不受理论束缚，功能上有意义的基因重排可以导致融合事件中涉及的基因的显著过表达(异常值)(Tomlins等人，2007；Tomlins等人，2005)。FGFR3-TACC3融合蛋白还在GSC-1123中和在原发性肿瘤GBM-1123中大量表达，如通过Western印迹和免疫组织化学显示的(图10C和10D)。在Western印迹上，FGFR3-TACC3融合蛋白以约150kD的大小迁移，并且免疫沉淀之后质谱揭示了与cDNA翻译预测一致的FGFR3和TACC3肽的存在(图10E)。使用PCR，基因组断裂点坐标定位于染色体4(对于FGFR3是#1,808,966，并且对于TACC3是#1,737,080，基因组构建GRCh37/hg19)，落入FGFR3外显子17和TACC3内含子7之内，其产生其中5’FGFR3外显子16与3’TACC3外显子8剪接的转录物。FGFR3和TACC3的DNA结合显示10个碱基的区域内的微同源性，该发现与之前针对人癌症中其他染色体重排的结果一致(Bass等人，2011；Stephens等人，2009)(图1E)。
推断的基因组融合体的实验验证集中于FGFR3-TACC3。Exome-Fuse鉴别了四个GBM样本中的FGFR3-TACC3基因融合体，其中断裂点总是跨FGFR3的内含子16(其在TK结构域编码区的下游)和TACC3的内含子7-10(其在TACC结构域的上游)(图2A，表4和5)。四个阳性TCGA GBM样本中，两个可获自TCGA中心供分子分析(TCGA-27-1835和TCGA-06-6390)，并且通过Sanger测序，确认其每一个携带与预测的基因组断裂点一致的框内融合体转录物(图2B和2C)。因此，FGFR3-TACC3融合蛋白的框总是导致将FGFR3的TK结构域并列于TACC3的TACC结构域上游。与GSC-1123和GBM-1123中FGFR3-TACC3的大量表达一致，TCGA肿瘤的mRNA表达分析揭示，四个FGFR3-TACC3阳性GBM展示FGFR3和TACC3显著的共异常表达(图2D)。反复的基因融合体可以伴随断裂点区域的局部拷贝数变化(CNV)(Wang等人，2009)。因此，TCGA数据组中SNP阵列的分析揭示了所有四个FGFR3-TACC3阳性GBM中FGFR3和TACC3基因的微扩增事件的存在(图2E)。
表5：支持来自ATLAS-TCGA外显子组集合的四个GBM样本中FGFR3-TACC3融合基因鉴别的分裂read的列表
表5(续)
FGFR3和TACC3基因在人染色体4p16中位置间隔48-Kb。FGFR和TACC家族的其他成员保留FGFR3和TACC3的紧密物理关联，其中FGFR1和TACC1在染色体8p11上配对，并且FGFR2和TACC2在染色体10q26上配对。不受理论束缚，祖先FGFR和TACC基因物理连接，并且该串联基因簇重复至少两次以产生标志哺乳动物进化的FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2和FGFR3-TACC3对(Still等人，1999)。FGFR基因中高度保守的TK结构域和TACC基因中TACC结构域连同其在FGFR3-TACC3重排中不变的融合体提示询问人GBM中是否存在其他染色体内FGFR-TACC融合体组合。
分别使用结合FGFR1、FGFR2和FGFR3的TK结构域的氨基末端编码区的上游PCR引物对以及结合TACC1、TACC2和TACC3基因的TACC结构域的羧基末端编码区的下游引物来筛选来自一组88个原发性GBM的cDNA。筛选导致两种其他情况(一个携带FGFR1-TACC1，一个携带FGFR3-TACC3)中染色体内FGFR-TACC融合体的鉴别，对应于总计97个GBM中的三个(3.1％)，包括GBM-1123情况。GBM-51中的FGFR1-TACC1融合体断裂点将FGFR1的外显子17与TACC1的外显子7框内结合，得到其中FGFR1的TK结构域与TACC1的TACC结构域上游融合的新蛋白(图2F)。相同结构在其中FGFR3的外显子16与TACC3的外显子10框内结合的GBM-22中也是保守的(图2G)。携带FGFR-TACC融合体的肿瘤没有一个具有IDH1或IDH2基因的突变，由此指示FGFR-TACC阳性GBM标志携带IDH突变的那些患者的独立亚组(表6)(Yan等人，2009)。FGFR-TK与七个携带FGFR-TACC重排的GBM的每一个中产生的TACC结构域恒定连接表明FGFR-TACC融合蛋白可以对脑中癌生成产生重要的功能结果。
表6.
时间＝存活(诊断后的天数)
Sarger＝通过基因组ONA的Sarger测序进行的分析
外显子组＝通过SAVI(关于变体鉴-别的统计学算法)进行的分析，SAVI是算法为检测癌症
Theof Medicine 2011年6月16日；384(24)：2305-15)
NA＝不可用
WT＝分别是IDH1和IDH2的R132和R172的野生型序列
FGFR-TACC融合体的转化活性。为了测试GBM中FGFR-TACC融合体的功能重要性，从GSC-1123克隆FGFR3-TACC3cDNA，并且制备表达FGFR3-TACC3、FGFR1-TACC1、激酶死亡FGFR3-TACC3蛋白(FGFR3-TACC3-K508M)、野生型FGFR3和野生型TACC3的重组慢病毒。用FGFR3-TACC3慢病毒转导Rat1A成纤维细胞和Ink4A；Arf-/-星形细胞导致融合蛋白以与GSC-1123中存在的那些相当的水平表达(图11)。已经在非转化细胞中重构了在GBM细胞中累积的FGFR-TACC蛋白的内源水平，确定其是否足以在体外和体内引发致癌转化。表达FGFR3-TACC3和FGFR1-TACC1的Rat1A细胞而非表达FGFR3-TACC3-K508M、FGFR3、TACC3或空慢病毒的那些细胞获得在软琼脂中以锚定非依赖性条件生长的能力(图3A)。相同的慢病毒在原代Ink4A；Arf-/-星形细胞中转导，随后皮下注射进入免疫缺陷小鼠，揭示了仅表达FGFR3-TACC3和FGFR1-TACC1的星形细胞形成肿瘤。用表达融合蛋白的星形细胞注射的小鼠100％出现肿瘤，并且是神经胶质瘤样损伤，其具有对Ki67、磷酸化组蛋白H3、巢蛋白、GFAP和Olig2的强阳性(图3B)。
接下来，确定FGFR3-TACC3融合蛋白在转导至直接进入免疫活性动物的脑的小量细胞时是否为致癌的。使用了最近描述的小鼠神经胶质瘤模型，其中脑肿瘤由小鼠脑中癌基因的慢病毒转导以及p53失活而引发(Marumoto等人，2009)。为了靶向成年NSC，将成年小鼠海马用表达FGFR3-TACC3蛋白的纯化慢病毒和针对p53的shRNA(pTomo-FGFR3-TACC3-shp53)立体定向转导。用FGFR3-TACC3转导的八只小鼠中的七只(87.5％)在240天内死于恶性脑肿瘤(图3C)。用表达GBM中最频繁的功能增益突变的慢病毒(组成型地激活EGFRvIII、pTomo-EGFRvIII-shp53)或pTomo-shp53对照慢病毒转导的小鼠中没有一只死亡或发展脑肿瘤的临床体征(图3C)。FGFR3-TACC3肿瘤是高级神经胶质瘤，其强烈倾向于侵袭正常脑并且对于神经胶质瘤干细胞标志物巢蛋白和Olig2以及神经胶质标志物GFAP染色呈阳性。它们还对于Ki67和磷酸化组蛋白H3呈高度阳性，由此展现快速肿瘤生长(图3D)。异种移植物和颅内肿瘤模型中FGFR3-TACC3的表达与人GSC和肿瘤中内源蛋白的表达相当(图11D、11E和11F)。
这些数据显示FGFR-TACC融合蛋白在两个独立细胞模型中具有转化活性，并且该活性不是个体FGFR和TACC基因的过表达的结果。它们还显示，FGFR3-TACC3蛋白直接转导至成年小鼠脑导致恶性神经胶质瘤的有效发展。
FGFR-TACC融合体干扰有丝分裂进程并诱导染色体错分离和非整倍性。为了阐明FGFR-TACC融合体驱动癌生成的机制，探索其是否激活下游FGFR信号传导。FGFR3-TACC3在配体FGF-1、FGF-2或FGF-8存在或不存在下未能超激活FGFR(pERK和pAKT)下游的典型信号传导事件(Wesche等人，2011)(图12A、12B和12C)。然而，FGFR3-TACC3展现了其TK结构域和衔接子蛋白FRS2的组成型磷酸化，两者都通过FGFR相关的TK活性特异性抑制剂PD173074(Mohammadi等人，1998)或K508M突变(图4A)而废止。因此，FGFR3-TACC3获得对于致癌转化必要的组成型激酶活性，但是该异常活性的下游信号传导不同于FGFR下游的典型信号传导事件。通过驱动融合蛋白的定位，TACC结构域可以产生全新的TK依赖性功能。TACC结构域是TACC蛋白定位于有丝分裂纺锤体所必要的(Hood和Royle，2011；Peset和Vernos，2008)。共聚焦成像显示FGFR3-TACC3设计了弧形结构，其弯折并包住中期纺锤体极，频繁展示对于两极之一的不对称性并且在细胞进入有丝分裂后期(末期和胞质分裂)时再定位于中间体(图4B和12D)。相反，TACC3的定位限于纺锤体微管并且不再定位于中间体(图12E)。野生型FGFR3在有丝分裂中缺乏离散定位模式(图12F)。
FGFR3-TACC3的有丝分裂定位指示其可能影响有丝分裂的保真度并且扰乱二倍体染色体内容物准确递送至子细胞，由此产生非整倍性。通过时差显微镜检查在载体转导且共表达组蛋白H2B-GFP的FGFR3-TACC3表达细胞中个体细胞的有丝分裂进展。与对照细胞相比，在表达FGFR3-TACC3的细胞中从核膜破裂到后期开始的平均时间增加。完成胞质分裂的困难进一步加剧了有丝分裂延迟(图4C和4D)。
接下来，确定了FGFR-TACC融合蛋白的表达是否诱导染色体分离缺陷。有丝分裂的定量分析揭示表达FGFR3-TACC3或FGFR1-TACC1的细胞表现出比对照细胞的染色体分离错误3至5倍的增加。融合蛋白触发的最频繁的有丝分裂异常是中期的错排染色体、后期的落后染色体和在子细胞中损害胞质分裂并产生微核的染色体桥(图4E、4F和13A)。中期-后期转变异常频繁导致有丝分裂细胞不能在用纺锤体毒素处理之后维持中期停止。相比于对照、FGFR3或TACC3表达细胞的少于3％，超过18％的表达FGFR3-TACC3的细胞展现了过早分离的姐妹染色单体(图13B和13C)。因此，表达融合蛋白的细胞不能在噻氨酯哒唑处理之后有效停止在中期(图13D)。
上述发现指示，FGFR3-TACC3融合蛋白的表达可以激发非整倍性。染色体组型分析揭示，与用空载体、FGFR3或TACC3转导的细胞相比，FGFR3-TACC3使非整倍性百分比增加超过2.5倍并且导致具有染色体计数宽分布的细胞累积(图5A)。因此，GSC-1123含有非整倍众数的染色体(49)并且表现染色体计数的宽分布，特征为60％偏离模式的中期扩展(表7)。
表7：通过SKY对来自GSC-1123培养物的20种细胞的染色体的分析
接下来，确定非整倍性是否是FGFR3-TACC3表达的直接结果以及是否在人二倍体神经细胞中诱导。在用FGFR3-TACC3慢病毒转导之后六天分析的原代人星形细胞表现出非整倍性率的5倍增加以及染色体计数的显著更广的分布(图5B、5C和5D)。与非整倍性对细胞适应性是有害的相一致，FGFR3-TACC3的急性表达损害了人星形细胞的增殖能力。然而，表达FGFR3-TACC3的人星形细胞的连续培养物导致超过对照细胞的增殖能力(图14A，14B)。因此，来自中枢神经系统的原代正常人细胞中FGFR3-TACC3的急性表达引起CIN和非整倍性，具有表现为较慢增殖的严重的适合度代价。
还确定了FGFR3-TACC3引起的CIN和非整倍性是否需要FGFR3的TK活性以及是否可以被校正。用PD173074处理拯救了FGFR3-TACC3引起的非整倍性超过80％，恢复了对照细胞典型的染色体计数的窄分布，并且极大校正了粘连缺陷(图6A、6B和6C)。综合起来，这些发现指示，由FGFR和TACC基因的重排引起的CIN和非整倍性是可逆的，并且表明特异性FGFR激酶抑制在表达FGFR-TACC融合蛋白的肿瘤细胞中可能是有价值的治疗策略。
FGFR-TACC融合蛋白是GBM中新的治疗靶。驱动基因改变触发了携带它们的癌细胞中的癌基因成瘾的状态，其可以在治疗上被开发利用。为了询问FGFR-TACC融合体是否为对FGFR-TK活性带来成瘾，分析了PD173074、AZD4547或BGJ398存在下的细胞生长，后者是处于临床考察的两个FGFR-TK的高特异性抑制剂(Gavine等人，2012；Guagnano等人，2011)。三种药物的每一种以<10nM的浓度抑制了表达FGFR3-TACC3和FGFR1-TACC1的细胞的生长，而它们在用载体、FGFR3、TACC3和FGFR3-TACC3-K508M突变体转导的细胞中以高达1μM的浓度是无效的。(图7A、14C和14D)。这些发现强调了对携带融合蛋白的细胞提高程度的FGFR激酶抑制的特异性。纳摩尔浓度的FGFR-TK抑制剂还废止了GSC-1123细胞的生长，所述GSC-1123细胞天然包含FGFR3-TACC3易位(图7B)。FGFR3shRNA对融合基因的靶向抑制了异常表达FGFR3-TACC3和GSC-1123的细胞的生长，这与FGFR3-TACC3的沉默效力成比例(图7C和14E)。
最后，确定了用PD173074治疗携带FGFR3-TACC3转化的星形细胞的神经胶质瘤异种移植物的小鼠是否抑制肿瘤生长。注射肿瘤细胞之后12天，所有动物中存在皮下肿瘤。将小鼠随机化分成2组并用PD173074或媒介物治疗。PD173074引发了对FGFR3-TACC3神经胶质瘤的有效生长抑制(图7D)。为了证实使用解剖学上更相关的模型的临床上有意义的FGFR-TK抑制剂的效力，针对表达颅内荧光素酶的FGFR3-TACC3驱动的神经胶质瘤异种移植物使用了处于临床考察(Gavine等人，2012)的一种化合物AZD4547FGFR抑制剂。在植入期之后，用AZD4547或媒介物处理携带肿瘤的动物。AZD4547的口服施用显著延长了存活(图7E)。综合起来，数据提供了基于FGFR抑制剂在携带FGFR-TACC重排的GBM中的临床试验的强大基本原理。
讨论
本工作已经确立，反复、致癌且成瘾的基因融合体鉴别了GBM患者亚组。FGFR-TACC融合体的功能表征指示，融合蛋白的组成型活性FGFR-TK和TACC结构域是瘤形成所必要的。TACC依赖性错定位至FGFR激酶的有丝分裂细胞导致组成型活性TK异常区域化至有丝分裂纺锤体极，由此提供有关融合蛋白引起的受损的有丝分裂保真度、染色体错分离和非整倍性的机械解释。
不受理论束缚，控制有丝分裂期间染色体分离的基因的突变可以解释高比率的CIN和非整倍性，其是大部分实体瘤特有的，包括GBM(Gordon等人，2012)。已经报道了人癌症中候选基因的突变失活的几个实例(Solomon等人，2011；Thompson等人，2010)。然而，还没有描述有丝分裂保真度的控制中因果牵涉的功能增益突变。这与引起CIN的潜在机制表现为显性性状的细胞融合实验的经典观察相冲突，指示CIN表型由功能增益事件而非基因失活引起(Lengauer等人，1997，1998)。FGFR-TACC基因融合体是起始CIN的新机制，并且提供了导致人癌症中非整倍性的显性突变的性质的线索。
由正常人星形细胞中融合蛋白触发的有丝分裂缺陷和非整倍性细胞群的快速出现，结合FGFR-TK活性的短期抑制之后非整倍性的校正，指示非整倍性是通过FGFR-TACC基因融合体的肿瘤诱导的关键事件。非整倍性本身的诱导对于细胞适应性是有害的(Sheltzer和Amon，2011)。成熟的肿瘤发生需要非整倍性和基因损伤之间的协同，其赋予生长优势并保护细胞免受非整倍性的有害作用(Coschi和Dick，2012；Holland和Cleveland，2009；Weaver和Cleveland，2009)。因此，FGFR-TACC融合体的有效肿瘤引发活性显示，新的癌蛋白具有生长促进信号传导功能，其补充有丝分裂保真度的损失，保证染色体组型改变(Sheltzer和Amon，2011)。
针对GBM中常见基因改变的靶向疗法没有改变疾病的差的临床结果，最可能是因为它们在系统上未能消除GBM真实成瘾癌蛋白活性。通过FGFR-TK抑制FGFR-TACC驱动的GBM促成的高特异性抗肿瘤作用和非整倍性校正提供了基于FGFR抑制剂在携带FGFR-TACC重排的患者中的临床试验的强大基本原理。本文报道的计算机化基因融合体发现流程检测了其他GBM情况，其中FGFR家族基因牵涉FGFR-TACC重排之外的其他基因融合体。因此，3.1％的频率可能低估了可能受益于FGFR-TK抑制的目标GBM患者群。
实验程序
GSC的细胞培养以及分离和维持。Rat1A、小鼠星形细胞Ink4A；Arf-/-和人星形细胞在补充有10％FBS的DMEM中培养。如所述进行GSC的分离和培养(Carro等人，2010)。对于用PD173074、AZD4547或BJG398的体外处理，将用载体对照、FGFR3、TACC3、FGFR-TACC融合体或FGFR3-TACC3-K508M感染的细胞接种于96孔板并用递增浓度的FGFR抑制剂处理。72-120小时之后，使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-联苯溴化四唑(MTT)测定来测量生长速率。数据表示为平均值±SD。通过在感染后5天将离散的神经胶质瘤球以2×104个细胞/孔铺板于12孔板而确定用FGFR3shRNA慢病毒感染的GSC-1123的增殖速率。通过获自一式三份独立感染的一式三份培养物中的台盼蓝排除来确定活细胞数目。每隔一天记录细胞数目。
DNA、RNA制备、基因组和实时定量聚合酶鏈鎖反應(qRT-PCR)。
使用基因组和RT-PCR进行融合体转录物的验证，使用在通过RNA-seq检测的配对末端read序列边缘内设计的正向与反向引物组合。如所述进行DNA、RNA制备和qRT-PCR(Carro等人，2010；Zhao等人，2008)。为了鉴别GBM组内新的融合体转录物，设计PCR引物对以在上游结合FGFR基因的TK结构域并在内部或下游结合TACC基因的卷曲螺旋结构域。使表达的融合体转录物变体经受直接测序以证实序列和框。以下包括引物序列。
皮下异种移植物和药物治疗。将用不同慢病毒构建体转导的Rat1A或Ink4A；Arf-/-星形细胞(5×105)悬浮于150μl PBS，连同30μl基质胶(Matrigel)(BD Biosciences)，并在无胸腺裸(Nu/Nu)小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)侧腹皮下注射。对于使用FGFR抑制剂的实验，使携带源自Ink4A；Arf-/-星形细胞的约200-300mm3皮下肿瘤的小鼠通过口服强饲法随机接收0.05M乳酸盐缓冲液(pH 5)中的50mg/kg PD173074，或者等体积的乳酸盐缓冲液。施用治疗三个循环，循环由四个连续日、随后两个休息日组成。使用测径器测量肿瘤直径，并使用公式：0.5×长度×宽度2估计肿瘤体积。数据表示为平均值±SE。当对照组中肿瘤达到允许的最大尺寸时处死小鼠。
正位移植和药物治疗。用FGFR3-TACC3慢病毒转导携带荧光素表达载体的Ink4A；Arf-/-星形细胞。使用立体定位框(相对于前囟点的坐标：前方0.5mm；侧方1.1mm；下方3.0mm)和26号Hamilton注射器在4-6周龄的雄性无胸腺裸(Nu/Nu)小鼠的侧尾壳核中注射2μl盐水中的1×103细胞。注射之后六天，小鼠经历使用Xenogen CCD装置的生物发光成像并通过口服强饲法随机接收1％Tween 80中50mg/kg AZD4547(治疗组)或等体积媒介物中DMSO(对照组)。每天施用AZD4547持续两个10天循环，间隔两天。每天监测小鼠并当出现神经症状时处死。使用DNA Statview软件包(AbacusConcepts，Berkeley，CA)生成Kaplan-Meier存活曲线。在Kaplan-Meier存活曲线上进行对数秩分析以确定统计学显著性。
慢病毒的颅内注射。根据IACUC委员会指南在4周龄的C57/BL/6J小鼠中进行FGFR3-TACC3-shp53、EGFRvIII-shp53或shp53pTomo慢病毒的颅内注射。简言之，使用立体定位框(相对于前囟点的坐标：后方1.45mm；侧方1.65mm；下方2.4mm)和26号Hamilton注射器将1.8μl PBS中纯化的慢病毒颗粒(1×109/ml)注射进入齿状回。每天监测小鼠并且当出现神经症状时处死。在组织病理学上并通过免疫荧光染色来分析小鼠脑。
组织学和免疫染色。如之前所述进行组织制备和对脑肿瘤的免疫组织化学以及免疫荧光染色(Carro等人，2010；Zhao等人，2009；Zhao等人，2008)。以下列出免疫染色和免疫印迹中使用的抗体。
克隆和慢病毒产生。慢病毒制备和感染如所述进行(Carro等人，2010)并且在扩展的实验程序中详细说明。
染色体组型分析。如在扩展的实验程序中详细描述的，在收集供染色体组型分析之前用秋水仙酰胺(20ng/ml)处理培养的细胞90分钟。检查中期中至少一百个细胞的染色体计数。记录细胞中的PMSCS，其中大部分姐妹染色体不再结合。进行具有Welch校正的双尾未配对t检验以对比平均值分析。
免疫荧光和活细胞显微术。对用PHEM(60mM Pipes，27mMHepes，10mM EGTA，4mM MgSO4，pH 7.0)中4％PFA固定的细胞进行免疫荧光显微术。使用1％Triton X-100透化细胞。通过抗α-微管蛋白抗体(Sigma)显现有丝分裂纺锤体。使用了与AlexaFluor-488/-594(Molecular Probes)偶联的二抗。以顺序方式进行用多个抗体的所有染色。通过DAPI(Sigma)使DNA染色。在Nikon A1RMP显微镜上进行荧光显微术。
从完整转录物组(RNA-seq)和外显子组测序鉴别基因融合体。使用Illumina HiSeq 2000对从9名GBM患者分离的GSC培养物提取的总RNA进行RNA测序，产生每个样本大约60,300,000配对read。使用具有改良的Mott修剪、初始种子长度32、最大编辑距离2和最大空位数目1的全局比对软件Burrows-Wheeler Aligner(BWA)(Li和Durbin，2009)，每个样本平均43,100，000个read适当定位于RefSeq转录物组，其余8,600,000定位于hg19基因组。认为其余14.3％配对read—包括未能定位于转录物组或基因组的那些，具有适当的正-反(F-R)取向、在预期插入尺寸之内并且具有最小软剪裁(read末端未定位的部分)—适合基因融合体分析。
构建新的计算机流程，称为TX-Fuse，其鉴别基因融合体存在的两个证据来源：1.分裂插入，其中配对的每个read完全定位于断裂点的一侧，和2.跨断裂点的个体分裂read。分裂插入容易从BWA定位检测。另一方面，分裂read要求较小核苷酸段的精确比对。为此目的，流程采用局部比对包BLAST，其具有字长20、同一性截止值95％、期望截止10-4和软过滤，以针对RefSeq转录物组定位原始配对的read。根据该程序，获得潜在分裂read的列表，其被过滤以确保给定read对中正确的F-R取向的情况下维持预测融合体转录物中的编码框。还使用Duplicated Genes Database和EnsemblCompara GeneTrees筛选出从旁系同源基因对产生的假阳性候选物(Vilella等人，2009)。使用来自HUGO Gene Nomenclature Committee(HGNC)数据库的列表(Seal等人，2011)和给定的较低优先级注释了候选列表中的假基因。对于每个其余的基因融合体候选物，基于预测的融合体转录物产生了虚拟参照，并且使用BLAST(具有字长16、同一性截止值85％、查询范围大于85％和期望截止值10-4)重新定位所有未定位的read，以获得分裂read和插入的最终计数。而且，计算虚拟参照的每个碱基的测序深度以确证参与基因融合体的每个基因的组分高度表达。
为了确立初始组基因融合体候选物的重现，修改基因融合体发现流程以产生EXome-Fuse，其探测来自TCGA的84个匹配GBM样本的配对read外显子组DNA测序的可用数据集中的融合体。为了增加基因融合体鉴别的灵敏度，使用BLAST比对通过BWA未定位的read与参与每个融合体候选物的基因对，针对分裂插入的字长为24，并且针对分裂read和分裂插入发现的字长为16。鉴于DNA中检测的断裂点不能直接指示转录RNA中得到的断裂点，对分裂插入取向没有做限制。对于分裂read，只需要作为其配对定位于相同基因的分裂read的组分维持F-R方向性。
TCGA GBM样本的共异常表达和CNV分析。Tomlins等人(Tomlins等人，2005)报道，来自显微阵列数据集的异常基因表达鉴别候选致癌基因融合体。Wang等人(Wang等人，2009)提出融合配偶体中基因内拷贝数异常的“断裂点原理”。结合两个原理(异常表达和基因内CNV)以鉴别来自Atlas-TCGA的GBM样本中的候选基因融合体。从在2011年12月1日可获得的TCGA公共数据门户下载基因组和表达数据集，其中TCGA数据类型、平台和分析的描述也是可获得的(2008)。特定的数据来源(根据数据水平和数据类型)如下：表达数据，“水平2”84个样本的每个探针组的标准化信号(Affymetrix HT_HG-U133A)；拷贝数数据，“水平1”4个FGFR3-TACC3基因融合体阳性样本的每个探针的原始信号(Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0)(肿瘤和匹配的正常对照)。
首先使用R3进行基因表达分析。计算中值绝对偏差(MAD)，并且然后根据以下公式将基因标记为异常：Zi,j＝0.6745(xi,j–平均值(xi))/MADi>3.5(Iglewicz和Hoaglin，1993)。如果两个目的基因(例如FGFR3和TACC3)展现异常行为(共异常)，则将样本鉴别为ECFS(表达候选融合体样本)。接下来，使用pennCNV分析ECFS的CNV(Wang等人，2007)。将肿瘤样本与其正常对照配对以获得对数比值，并且使用VEGA算法获得更准确的分段(Morganella等人，2010)。
染色体组型分析。将秋水酰胺处理的细胞经胰蛋白酶消化，以200x g离心7分钟，并且将细胞沉淀重悬于温的低渗溶液并且在37℃孵育13分钟。然后离心溶胀的细胞，并且将沉淀重悬于8ml Carnoy固定剂(3:1甲醇：冰醋酸)。离心细胞悬液并在Carnoy固定剂中洗涤两次。最后一次离心之后，将细胞重悬于0.5至1ml的新制备的固定剂以产生乳色细胞悬液。将数滴最终细胞悬液置于清洁载玻片上并风干。载玻片用DAPI染色并在荧光显微镜下分析中期。
克隆和慢病毒产生。使用慢病毒表达载体、pLOC-GFP(OpenBiosystems)和pTomo-shp53来克隆FGFR3、TACC3、FGFR3-TACC3、FGFR3-TACC3-K508M和FGFR1-TACC1。pTomo-shp53由InderVerma and Dinorah Friedman-Morvinski(Salk Institute，San Diego)馈赠。使用Phusion Site Direct Mutagenesis试剂盒(NEB，USA)产生FGFR3-TACC3-K508M突变体。针对FGFR3的MISSION shRNA克隆(pLKO.1慢病毒表达载体)购自Sigma。靶向FGFR3基因的发夹序列是-
5′-TGCGTCGTGCAGAACAAGTTT-3′(＃TRCN0000000372；Sh＃2)(SEQ IDNO：182)：
5′-GTTCCACTGCAAGGTGTACAG-3′(＃TRCN0000430673；Sh＃3)(SEQ IDNO：183)；
5′-GCACAACCTCGACTACTACAA-3′(＃TRCN0000000374；Sh＃4)(SEQ IDNO：184)。
基因组和mRNA RT-PCR。通过使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN)按照生产商说明书从细胞提取总RNA。通过使用Superscript III试剂盒(Invitrogen)按照生产商说明书逆转录500ng总RNA。使用逆转录之后获得的cDNA作为qPCR的模板。通过使用Thermo Scientific的Absolute Blue QPCR SYBR Green Mix，用Roche480热循环仪进行反应。将特定mRNA的相对量标准化为18S。结果提供为一式三份扩增的平均值±SD。
使用的引物是：
hFGFR3-RT-FW1：5’-GTAACCTGCGGGAGTTTCTG-3’(SEQ ID NO：162)；
hFGFR3-RT-REV1：5’-ACACCAGGTCCTTGAAGGTG-3’(SEQ ID NO：163)；
hTACC3-RT-FW2：5’-CCTGAGGGACAGTCCTGGTA-3’(SEQ ID NO：164)；
hTACC3-RT-REV2：5’-AGTGCTCCCAAGAAATCGAA-3’(SEQ ID NO：165)；
hWRAP53-RT-FW1：5’-AGAGGTGACCACCAATCAGC-3’(SEQ ID NO：180)；
hWRAP53-RT-REV1：5’-CGTGTCCCACACAGAGACAG-3’(SEQ ID NO：181)。
用于筛选FGFR-TACC融合体的引物是：
FGFR3-FW1：5’-CGTGAAGATGCTGAAAGACGATG-3’(SEQ ID NO：166)；
TACC3-REV1：5’-AAACGCTTGAAGAGGTCGGAG-3’(SEQ ID NO：167)；
FGFR1-FW1：5’-ATGCTAGCAGGGGTCTCTGA-3’(SEQ ID NO：168)；
TACC1-REV1：5’-CCCTTCCAGAACACCTTTCA-3’(SEQ ID NO：169)。
用于GBM-1123和GSC-1123中FGFR3-TACC3融合体的基因组检测的引物是：
基因组FGFR3-FW1：5’-ATGATCATGCCGGAGTGC-3’(SEQ ID NO：170)；
基因组TACC3-REV1：5’-GGGGGTCGAACTTGAGGTAT-3’(SEQ ID NO：171)。
用于验证通过RNA-seq检测的融合体的引物是：
POLR2A-FW1：5’-CGCAGGCTTTTTGTAGTGAG-3’(SEQ ID NO：172)；
WRAP53-REV1：5’-TGTAGGCGCGAAAGGAAG-3’(SEQ ID NO：173)；
PIGU-FW1：5’-GAACTCATCCGGACCCCTAT-3’(SEQ ID NO：174)；
NCOA6-REV1：5’-GCTTTCCCCATTGCACTTTA-3’(SEQ ID NO：175)；
ST8SIA4-FW1：5’-GAGGAGAGAAGCACGTGGAG-3’(SEQ ID NO：176)；
PAM-REV1：5’-GGCAGACGTGTGAGGTGTAA-3’(SEQ ID NO：177)；
CAPZB-FW：5’-GTGATCAGCAGCTGGACTGT-3’(SEQ ID NO：178)；
UBR4-REV1：5’-GAGCCTGGGCATGGATCT-5’(SEQ ID NO:179)。
共聚焦显微镜成像。对于固定细胞的免疫荧光，使用Nikon AlRMP和60×1.3油物镜利用0.25μm的乙光学间距记录图像并使用ImageJ软件(National Institute of Health)分析。对于活细胞分析，RatlA细胞用pLNCX-H2B逆转录病毒感染并用慢病毒载体转导，或者将FGFR3-TACC3融合体接种于玻璃底平皿中无酚红的DMEM中，随后是使用Nikon AlR MP生物站在37℃和5％CO2/95％空气下进行时差显微术。每4分钟记录具有1μm的Z-光学间距的图像，持续8小时。使用ImageJ软件(National Institute of Health)处理从早前期直至胞质分裂的未受激发的有丝分裂的图像。核膜破裂(NEB)的时间点被定义为显示染色质光滑外观损失的第一帧，并且后期是染色体向极移动变得明显时的第一帧。核膜重建(NER)被定义为显示核解聚的第一帧。
从来自至少50个记录细胞的图像序列计算盒须图。使用StatView软件(AbacusConcepts，Berkeley，CA)进行具有Welch校正的双尾未配对t检验以对比平均值分析。
免疫荧光。免疫荧光染色中使用的抗体和浓度是：
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实施例2-GBM中的融合
表8：软琼脂集落测定
细胞系 载体 FGFR3 TACC3 F1-T1融合体 F3-T3融合体 F3-T3-K508M融合体
Ratl 0 0 0 2253±10.0 1987±80 0
Balb 3T3 0 0 0 n.d. 45.5±89 n.d.
nd.：未进行
表9：皮下肿瘤异种移植物
nd.：未进行
表10：Rat1细胞中染色体数目的分析
表11：人星形细胞中染色体数目的分析
实施例3-其他癌症中的融合体
本发明人之前在实施例1中报道，3.1％的人胶质母细胞瘤携带FGFR3-TACC3和FGFR1-TACC1基因融合体。通过FGFR3和TACC3基因的重排部分的高特异性焦点微扩增事件的存在而鉴别了携带FGFR3-TACC3基因融合体的肿瘤(参见图2E)。因此，这些微扩增事件可用作FGFR3-TACC3基因融合体存在的特征性标志。根据从Atlas-TCGA项目产生的SNP阵列的拷贝数变化(CNV)分析询问其他类型的人肿瘤是否也携带FGFR3-TACC3基因融合体。使用利用Integrated Genomic Viewers软件显示的分段CNV数据进行该分析。该分析揭示，图31-35中显示的以下肿瘤展现FGFR3和TACC3的焦点微扩增事件，其指示FGFR3-TACC3基因融合体的存在(图31-35中，红色指示扩增(A)，蓝色指示缺失(D)；图31：膀胱尿路上皮癌；图32：乳腺癌；图33：结肠直肠癌；图34：肺鳞状细胞癌；图35：头颈鳞状细胞癌)。
综合起来，这些数据指示，胶质母细胞瘤中首次报道的相同FGFR3-TACC3基因融合体也在几种其他类型的人肿瘤中出现。因此，对于胶质母细胞瘤和其他上皮癌(例如本文讨论的人肿瘤)，FGFR-TACC基因融合体的鉴别还提供了用抑制FGFR-TACC基因融合体的药物治疗的新的诊断和治疗靶标。

Claims (71)

1.一种纯化的融合蛋白，其包含与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的所述酪氨酸激酶结构域。
2.一种纯化的融合蛋白，其包含与具有酪氨酸激酶结构域的多肽融合的转化型酸性卷曲螺旋(TACC)结构域，其中所述TACC结构域组成型地激活所述酪氨酸激酶结构域。
3.一种纯化的融合蛋白，其包含与含有转化型酸性卷曲螺旋(TACC)的蛋白的所述TACC结构域5’融合的FGFR蛋白的所述酪氨酸激酶结构域。
4.如权利要求1或3所述的纯化的融合蛋白，其中所述FGFR蛋白是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGR4。
5.如权利要求3所述的纯化的融合蛋白，其中所述TACC蛋白是TACC1、TACC2或TACC3。
6.一种由FGFR1-TACC1核酸编码的纯化的融合蛋白，其中FGFR1-TACC1包含与位于人染色体8p11上的TACC1的外显子7-13的组合5’剪接的位于人染色体8p11上的FGFR1的外显子1-17的组合，其中基因组断裂点出现在FGFR1的外显子1-17的任何一个和TACC1的外显子7-13的任何一个中。
7.一种由FGFR2-TACC2核酸编码的纯化的融合蛋白，其中FGFR2-TACC2包含与位于人染色体10q26上的TACC2的任何外显子1-23的组合5’剪接的位于人染色体10q26上的FGFR2的任何外显子1-18的组合。
8.一种由FGFR3-TACC3核酸编码的纯化的融合蛋白，其中FGFR3-TACC3包含与位于人染色体4p16上的TACC3的外显子8-16的组合5’剪接的位于人染色体4p16上的FGFR3的外显子1-16的组合，其中基因组断裂点出现在FGFR3的外显子1-16的任何一个和TACC3的外显子8-16的任何一个中。
9.一种由FGFR3-TACC3核酸编码的纯化的融合蛋白，其中FGFR3-TACC3包含与位于人染色体4p16上的TACC3的外显子8-16的组合5’剪接的位于人染色体4p16上的FGFR3的外显子1-16的组合，其中基因组断裂点出现在FGFR3的内含子1-16的任何一个和TACC3的外显子8-16的任何一个中。
10.一种由FGFR3-TACC3核酸编码的纯化的融合蛋白，其中FGFR3-TACC3包含与位于人染色体4p16上的TACC3的外显子8-16的组合5’剪接的位于人染色体4p16上的FGFR3的外显子1-16的组合，其中基因组断裂点出现在FGFR3的外显子1-16的任何一个和TACC3的内含子7-16的任何一个中。
11.一种由FGFR3-TACC3核酸编码的纯化的融合蛋白，其中FGFR3-TACC3包含与位于人染色体4p16上的TACC3的外显子8-16的组合5’剪接的位于人染色体4p16上的FGFR3的外显子1-16的组合，其中基因组断裂点出现在FGFR3的内含子1-16的任何一个和TACC3的内含子7-16的任何一个中。
12.一种合成的核酸，其编码如权利要求1、2、3、6、7、8、9、10或11所述的融合蛋白。
13.一种纯化的FGFR3-TACC3融合蛋白，其包括SEQ ID NO：79、158、159、160或161。
14.一种纯化的FGFR3-TACC3融合蛋白，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括来自SEQ ID NO：90的氨基酸730-758的至少3个连续氨基酸并且包括来自SEQ ID NO：92的氨基酸549-838的至少3个连续氨基酸。
15.一种纯化的FGFR3-TACC3融合蛋白，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括SEQ ID NO：78。
16.一种纯化的FGFR3-TACC3融合蛋白，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括SEQ ID NO：85、86、87或89的任何一个。
17.一种纯化的FGFR1-TACC1融合蛋白，其包括SEQ ID NO：150。
18.一种纯化的FGFR1-TACC1融合蛋白，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括来自SEQ ID NO：146的氨基酸746-762的至少3个连续氨基酸并且包括来自SEQ ID NO：148的氨基酸572-590的至少3个连续氨基酸。
19.一种纯化的FGFR1-TACC1融合蛋白，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括SEQ ID NO：88。
20.一种编码FGFR3-TACC3融合蛋白的合成的核酸，其包括SEQ ID NO：94。
21.一种编码FGFR3-TACC3融合蛋白的合成的核酸，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括来自SEQ ID NO：91的核苷酸2443-2530的至少9个连续框内核苷酸并且包括来自SEQ ID NO：93的核苷酸1800-2847的至少9个连续框内核苷酸。
22.一种编码FGFR3-TACC3融合蛋白的合成的核酸，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括SEQ ID NO：1-77的任何一个。
23.一种编码FGFR1-TACC1融合蛋白的合成的核酸，其包括SEQ ID NO：151。
24.一种编码FGFR1-TACC1融合蛋白的合成的核酸，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括来自SEQ ID NO：147的核苷酸3178-3228的至少9个连续框内核苷酸并且包括来自SEQ ID NO：149的核苷酸2092-2794的至少9个连续框内核苷酸。
25.一种编码FGFR1-TACC1融合蛋白的合成的核酸，其具有基因组断裂点，所述基因组断裂点包括SEQ ID NO：83。
26.一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合纯化的融合蛋白，所述纯化的融合蛋白包含与多肽融合的FGFR蛋白的酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的所述酪氨酸激酶结构域。
27.如权利要求26所述的抗体或抗原结合片段，其中所述FGFR蛋白是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。
28.如权利要求26所述的抗体或抗原结合片段，其中所述融合蛋白是FGFR-TACC融合蛋白。
29.如权利要求28所述的抗体或抗原结合片段，其中所述FGFR-TACC融合蛋白是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。
30.如权利要求29所述的抗体或抗原结合片段，其中所述FGFR1-TACC1融合蛋白包含SEQ ID NO：150的所述氨基酸序列。
31.如权利要求29所述的抗体或抗原结合片段，其中所述FGFR3-TACC3融合蛋白包含SEQ ID NO：79、158、159、160或161的氨基酸序列。
32.一种用于降低受试者中融合蛋白的表达水平或活性的组合物，所述融合蛋白包含与多肽融合的FGFR蛋白的所述酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的所述酪氨酸激酶结构域，与药学上可接受的载体混合的所述组合物包含所述融合蛋白的抑制剂。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述融合蛋白是FGFR-TACC融合蛋白。
34.如权利要求32所述的组合物，其中所述抑制剂包括特异性结合FGFR-TACC融合蛋白的抗体或其片段；特异性结合FGFR蛋白的小分子；特异性结合TACC蛋白的小分子；降低FGFR-TACC融合多肽的表达的反义RNA或反义DNA；特异性靶向FGFR-TACC融合基因的siRNA；或其组合。
35.如权利要求32所述的组合物，其中所述FGFR蛋白是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。
36.如权利要求33所述的组合物，其中所述FGFR-TACC融合蛋白是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。
37.如权利要求34所述的组合物，其中所述特异性结合FGFR蛋白的小分子包括AZD4547、NVP-BGJ398、PD173074、NF449、TK1258、BIBF-1120、BMS-582664、AZD-2171、TSU68、AB1010、AP24534、E-7080、LY2874455或其组合。
38.一种用于降低相应需要的受试者中融合蛋白的表达水平或活性的方法，所述融合蛋白包含与多肽融合的FGFR蛋白的所述酪氨酸激酶结构域，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的所述酪氨酸激酶结构域，所述方法包括：
(a)向所述受试者施用治疗量的如权利要求32所述的组合物；和
(b)确定所述融合蛋白表达水平或活性与施用所述组合物之前的融合蛋白表达水平或活性相比是否降低，
从而降低所述融合蛋白的表达水平或活性。
39.一种用于治疗有需要的受试者中基因融合体相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的FGFR融合分子抑制剂。
40.一种降低有需要的受试者中实体瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的FGFR融合分子抑制剂，其中所述抑制剂降低所述实体瘤的大小。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述基因融合体相关癌症包括多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠直肠癌。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述实体瘤包括多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠直肠癌。
43.如权利要求39或40所述的方法，其中所述FGFR融合蛋白包括与多肽融合的FGFR蛋白，所述多肽组成型地激活所述FGFR蛋白的所述酪氨酸激酶结构域。
44.如权利要求38、39或40所述的方法，其中所述融合蛋白是FGFR-TACC融合蛋白。
45.如权利要求39或40所述的方法，其中所述抑制剂包括特异性结合FGFR-TACC融合蛋白的抗体或其片段；特异性结合FGFR蛋白的小分子；特异性结合TACC蛋白的小分子；降低FGFR-TACC融合多肽的表达的反义RNA或反义DNA；特异性靶向FGFR-TACC融合基因的siRNA；或其组合。
46.如权利要求38或43所述的方法，其中所述FGFR蛋白是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述FGFR-TACC融合蛋白是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。
48.如权利要求45所述的方法，其中所述特异性结合FGFR蛋白的小分子包括AZD4547、NVP-BGJ398、PD173074、NF449、TK1258、BIBF-1120、BMS-582664、AZD-2171、TSU68、AB1010、AP24534、E-7080、LY2874455或其组合。
49.一种用于确定来自受试者的样本是否表现FGFR融合体的存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包括至少一个与FGFR融合体特异性杂交的寡核苷酸，或其部分。
50.如权利要求49所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸包括一组核酸引物或原位杂交探针。
51.如权利要求49所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸包括SEQID NO：162、163、164、165、166、167、168、169或其组合。
52.如权利要求50所述的试剂盒，其中所述引物仅当FGFR融合体存在时引发聚合酶反应。
53.如权利要求49所述的试剂盒，其中所述确定包括基因测序、选择性杂交、选择性扩增、基因表达分析或其组合。
54.一种用于确定来自受试者的样本是否表现FGFR融合蛋白的存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合FGFR融合蛋白的抗体，所述FGFR融合蛋白包括SEQ ID NO：79、85、86、87、88、89、150、158、159、160或161，其中所述抗体仅当FGFR融合蛋白存在时识别所述蛋白。
55.如权利要求54所述的试剂盒，其中所述抗体针对FGFR融合体，所述FGFR融合体包括SEQ ID NO：79、85、86、87、88、89、150、158、159、160或161。
56.如权利要求49或54所述的试剂盒，其中所述FGFR融合体是FGFR-TACC融合体。
57.如权利要求49或54所述的试剂盒，其中所述FGFR是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。
58.如权利要求55所述的试剂盒，其中所述FGFR-TACC融合体是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。
59.一种用于检测人受试者中FGFR融合体的存在的方法，所述方法包括：
(a)从所述人受试者获得生物样本；和
(b)检测所述受试者中是否存在FGFR融合体。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述检测包括通过以下方式来测量FGFR融合蛋白水平：使用针对SEQ ID NO：79、85、86、87、88、89、150、158、159、160或161的抗体的ELISA；使用针对SEQ ID NO：79、85、86、87、88、89、150、158、159、160或161的抗体的western印迹；质谱法、等电聚焦或其组合。
61.一种用于检测人受试者中FGFR融合体的存在的方法，所述方法包括：
(a)从人受试者获得生物样本；和
(b)检测所述受试者中是否存在编码FGFR融合蛋白的核酸序列。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述核酸序列包括SEQ IDNO：1-77、80-84或95-145的任何一个。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述检测包括使用杂交、扩增或测序技术来检测FGFR融合体。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述扩增使用包括SEQ IDNO：162、163、164、165、166、167、168或169的引物。
65.如权利要求59或61所述的方法，其中所述FGFR融合体是FGFR-TACC融合体。
66.如权利要求59或61所述的方法，其中所述FGFR是FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4。
67.如权利要求65所述的方法，其中所述FGFR-TACC融合体是FGFR1-TACC1、FGFR2-TACC2或FGFR3-TACC3。
68.一种在体外引发致癌转化的方法，所述方法包括：
(a)用FGFR-TACC融合DNA转导体外培养的细胞；和
(b)确定所述细胞是否获得在锚定非依赖性条件下生长、形成多层病灶或其组合的能力。
69.一种在体外引发致癌转化的方法，所述方法包括：
(a)用FGFR-TACC融合DNA转导体外培养的细胞；
(b)用所述经转导的细胞注射小鼠；和
(c)确定肿瘤是否在所述小鼠中生长。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述注射是皮下或颅内注射。
71.一种鉴别降低FGFR-TACC融合体的致癌活性的化合物的方法，所述方法包括：
(a)用FGFR-TACC DNA转导在体外培养的细胞；
(b)使细胞与配体源接触有效的时段；和
(c)确定所述细胞与在所述测试化合物不存在的情况下培养的细胞相比是否获得在锚定非依赖性条件下生长、形成多层病灶或其组合的能力。
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