CN104789608A - 一种促进微藻油脂积累的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进微藻油脂积累的培养方法，将微藻接种在培养基中培养，在所述培养基中添加N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液，添加所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液后所述培养基的pH值始终维持在9.0～10.0之间。本发明的培养方法可以提高微藻油脂产量，同时又不影响微藻的生物量。

Description

一种促进微藻油脂积累的培养方法
技术领域
本发明涉及藻类生物的培养技术，特别是涉及一种促进微藻油脂积累的培养方法。
背景技术
随着石油等化石燃料的日益枯竭以及其使用过程中所造成的环境问题，迫使人们开始寻求可持续发展的新能源以解决日益增加的能源需求以及日益恶化的环境问题，而生物柴油不但具有优良的环保特性和燃料性能，而且具有可再生性，已经成为未来能源发展的主方向。生物柴油的原料来源广泛，传统原料包括菜籽油、麻风树、文冠果、黄连木和废弃油脂等。与此相比，用藻类作为原料来生产生物柴油具有无可比拟的优越性，其油脂产率能比其它产油作物的油脂产率高出约两个数量级(Chisti Y.Biodiesel from microalgae[J].Biotechnology advances,2007,25(3):294-306；胡洪营,李鑫,于茵等译(美国能源部生物质项目署).藻类生物质能源-基本原理、关键技术与发展路线图.北京：科学出版社，2011,2-41)，而且可以大幅度节约耕地面积。藻类是高能量密度、可再生液态交通燃料的理想生物柴油原料，一方面，微藻分布广，易培养，生长周期短，生物量高，光合作用效率强，并且对生长环境的要求比较简单，能适应多种生长环境，可以避免对农业耕地的侵占并且能够吸收环境中的温室效应气体CO2。另一方面，微藻可以吸收水体中的氮、磷等营养元素，能有效地降低水体的富营养化，对环境具有很强的修复功能(刘建国,龙元薷,黄园,庞通，林伟，李凌.微藻生物柴油研究现状与发展策略[J].海洋科学,2013,37:10)。
微藻油脂的积累受诸多因素的影响，如氮源种类、氮源浓度、盐浓度、温度和光强等。目前大多采用营养元素缺失或外界环境胁迫的方法提高单个藻细胞的油脂含量，但油脂总产率却因生物量下降而下降，无法达到人们所期望的水平(Zhang TY,Wu YH,Zhu SF,Li FM,Hu HY,2013,Isolation and heterotrophiccultivation of mixotrophic microalgae strains for domestic wastewater treatment andlipid production under dark condition.Bioresource Technology,149:586–589；Cakmak T,Angun P,Demiray YE,Ozkan AD,Elibol Z,Tekinay T,2012,DifferentialEffects of Nitrogen and Sulfur Deprivation on Growth and Biodiesel FeedstockProduction of Chlamydomonasreinhardtii.Biotechnology and Bioengineering,8(109):1947–1957)。
在胁迫诱导微藻油脂积累的研究中，pH被认为是调控油脂合成的重要因子之一。Guckert等(Guckert JB,Cooksey KE,1990,Triglyceride accumulation andfatty acid profile changes in chlorella during high pH-induced cell cycle inhibition.Journal of Phycology,26:72–79)发现碱性pH值的胁迫诱导了小球藻中甘油三酯(TAG)的积累，但同时也会对微藻的生长产生了抑制。目前为止，尚且没有一种成熟的pH处理方法可以在提高油脂产量的同时，又不影响微藻的生物量。
发明内容
为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种促进微藻油脂积累的培养方法，其可以在提高微藻油脂产量的同时又不影响微藻的生物量。
本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
一种促进微藻油脂积累的培养方法，将微藻接种在培养基中培养，在所述培养基中添加N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)的缓冲液，添加所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液后所述培养基的pH值始终维持在9.0～10.0之间。
优选地，所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液是在将所述微藻接种到所述培养基时就添加到所述培养基。
优选地，在将所述微藻接种到所述培养基时，在所述培养基中加入Tris缓冲液，使所述培养基的pH值维持在7.8-8.5之间，然后在所述微藻的生长进入稳定期时在所述培养基中再添加所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液，使所述培养基的pH值始终维持在9.0～10.0之间。
优选地，所述N-环己基-2-氨基乙磺酸在所述培养基中的终浓度为30μM-30mM。
优选地，所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液是将N-环己基-2-氨基乙磺酸、去离子水和NaOH混合制成，所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液中所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的摩尔浓度为0.2M～5M。
优选地，所述微藻的培养条件为：8h～16h光照与8h～16h黑暗交替，温度17℃～24℃，光照强度为50μmol·m-2·s-1～200μmol·m-2·s-1。
优选地，在初始配制的培养基中，每1L所述培养基中包含如下组分：1mg～100mg NaNO3，1mg～50mg NaH2PO4·2H2O，1mg～50mg Na2EDTA，1mg～50mg FeCl3·6H2O，0.01μg～1mg CuSO4·5H2O，0.01μg～1mg ZnSO4·7H2O，0.01μg～1mg CoCl2·6H2O，0.01μg～1mg MnCl2·4H2O，0.0001μg～1mg Na2MoO4·2H2O，0.0001μg～1mg维生素B12，0.01μg～10mg维生素B1和0.0001μg～1mg维生素H。
优选地，所述微藻为褐指藻属。
优选地，所述微藻为三角褐指藻藻种。
本发明与现有技术对比的有益效果是：本发明在培养微藻的培养基中加入CHES缓冲液后能将培养基的pH值始终维持在9.0～10.0之间，一旦加入CHES缓冲液后，无需后期的pH值调节，操作简单易行，节约劳动成本，同时克服了碱性pH(直接用HCl和NaOH调节的)抑制微藻生长的缺陷，且本发明能有效提高微藻(尤其是海洋微藻)的细胞相对油脂含量(实验证明比未加CHES缓冲液的增加了1～5倍)和最终油脂含量(较未加CHES缓冲液的提高10％-40％)，本发明的培养方法，可以应用在微藻的大规模培养和微藻油脂工程藻的改良中。
附图说明
图1A是本发明实施例一中测得的1号对照组和2号处理组对比的细胞密度的曲线图；
图1B是本发明实施例一中测得的1号对照组和2号处理组对比的叶绿素含量的曲线图。
图2A是本发明实施例一中测得的1号对照组分别与3～5号处理组对比的细胞密度的曲线图。
图2B是本发明实施例一中测得的1号对照组分别与3～5号处理组对比的叶绿素含量的曲线图。
图3A～图3D’是本发明实施例二中利用激光共聚焦分别检测1号对照组与3～5处理组的尼罗红荧光强度的图。其中：图3A、3B、3C和3D分别是1号、3号、4号和5号在荧光下拍摄的图；图3A’、3B’、3C’和3D’分别是1号、3号、4号和5号在荧光拍摄的图与在白光下拍摄图的叠加。
图4A、4B、4C和4D是本发明实施例二中利用流式细胞仪分别检测1号、3号、4号和5号的尼罗红荧光强度的图。
图4E是根据利用流式细胞仪检测的1号、3号、4号和5号对比的尼罗红相对荧光强度柱状图。
图5本发明实施例二中测得的1号对照组与4～5处理组的油脂含量的柱状图。
具体实施方式
下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。需要说明的是：以下实施用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如微藻的叶绿素含量按照浮游植物分类荧光仪PHYTO-PAM说明书进行检测。所有原料均为市销商品。
本发明提供一种促进微藻油脂积累的培养方法，在一些具体实施方式中，包括如下步骤：将微藻在培养基中培养，在所述培养基中添加CHES的缓冲液，添加所述CHES的缓冲液后所述培养基的pH值始终维持在9.0～10.0之间。
在一个优选的实施方式中，所述CHES的缓冲液是在将所述微藻接种到所述培养基时就添加到所述培养基。
在另一个优选的实施例中，在将所述微藻接种到所述培养基时，在所述培养基中加入Tris缓冲液，使所述培养基的pH值维持在7.8-8.5之间，然后在所述微藻的生长进入稳定期时在所述培养基中再添加所述CHES的缓冲液，使所述培养基的pH值始终维持在9.0～10.0之间。
其中较优的是：
所述CHES的缓冲液在所述培养基中的终浓度为30μM-30mM，这样的浓度范围利于一次添加CHES缓冲液后就能维持培养基的pH始终在9.0～10.0之间。
所述CHES缓冲液是将CHES、去离子水和NaOH混合制成，所述CHES的缓冲液中所述CHES的摩尔浓度为0.2M～5M，也即先将CHES缓冲液配制成0.2M～5M的储存液备用，然后再将适量的CHES缓冲液加入培养基中。
所述微藻的培养条件为：8h～16h光照与8h～16h黑暗交替，温度17℃～24℃，光照强度为50μmol·m-2·s-1～200μmol·m-2·s-1。培养条件进一步优选12h光照与12h黑暗交替，温度19℃～23℃，光照强度150μmol·m-2·s-1。在每1L初始配制的培养基中包含如下组分：1mg～100mg NaNO3，1mg～50mg NaH2PO4·2H2O，1mg～50mg Na2EDTA，1mg～50mg FeCl3·6H2O，0.01μg～1mg CuSO4·5H2O，0.01μg～1mg ZnSO4·7H2O，0.01μg～1mg CoCl2·6H2O，0.01μg～1mg MnCl2·4H2O，0.0001μg～1mg Na2MoO4·2H2O，0.0001μg～1mg维生素B12，0.01μg～10mg维生素B1和0.0001μg～1mg维生素H，初始配制的培养基即是微藻还未接种且CHES或Tris缓冲液还未添加时配制的培养基，随着微藻生长的进行，培养基中的各组分的含量会有所变化。进一步优选的是，每1L培养基中包含如下组分：75mgNaNO3，5.65mg NaH2PO4·2H2O，4.16mg Na2EDTA，3.15mg FeCl3·6H2O，0.01mg CuSO4·5H2O，0.022mg ZnSO4·7H2O，0.01mg CoCl2·6H2O，0.18mgMnCl2·4H2O，0.006mg Na2MoO4·2H2O，0.0005mg维生素B12，0.1mg维生素B1和0.0005mg维生素H。
本发明的促进微藻油脂积累的培养方法尤其是指促进海洋微藻油脂积累的培养方法，以下以三角褐指藻藻种的培养为例，对本发明进行详细阐述。
实施例一：不同pH值处理组对海洋微藻生长生理状态的评价
在光照、温度、接种密度等一致的情况下(本例中：培养条件为12h光照与12h黑暗交替，温度21℃，光照强度150μmol·m-2·s-1。每1L初始配制的培养基中包含如下组分：75mg NaNO3，5.65mg NaH2PO4·2H2O，4.16mg Na2EDTA，3.15mg FeCl3·6H2O，0.01mg CuSO4·5H2O，0.022mg ZnSO4·7H2O，0.01mgCoCl2·6H2O，0.18mg MnCl2·4H2O，0.006mg Na2MoO4·2H2O，0.0005mg维生素B12，0.1mg维生素B1和0.0005mg维生素H。接种密度为0.5×106～1.0×106个/mL，本例中约为1.0×106个/mL)，控制单因子变量，即微藻培养基的pH值，接种时设置1～5号五种不同的pH值处理，其中1号作为对照组，3号～5号作为处理组，每组处理设置3个平行，并随机摆放培养瓶的位置以减少误差。
1号：不对培养基中的pH值进行改变，作为对照组。
2号：利用HCl/NaOH调节，使培养基的pH值维持在8.0，简写为Unbuffered8.0，每天需要人为调节。
3号：利用Tris缓冲液调节，使培养基的pH值维持在8.0，简写为Tris buffered8.0；
4号：利用CHES缓冲液调节，使培养基的pH值维持在9.5，简写为CHESbuffered9.5。
5号：接种时，添加Tris缓冲液，使培养基的pH值维持在8.0，进入稳定期时，再添加CHES缓冲液，使培养基的pH值维持在9.5，简写为Tris buffered8.0+CHES buffered9.5。
评价指标：(1)细胞密度：每天同一时间测1～5号的细胞密度，为了减少误差，每组处理设置3个平行，每个平行测3次细胞密度。采用血球计数板计数的方法，根据公式：细胞密度＝(N/80)×400×104，N代表80个网格单元中细胞的数目。(2)叶绿素含量：测量前将微藻样品暗适应15-20min，光照1s，按照浮游植物分类荧光仪PHYTO-PAM说明书进行检测。
多次实验结果表明，2号比较费时、费力，细胞密度、叶绿素含量较对照组明显降低(如图1A和1B所示)；3号、4号和5号的细胞密度、叶绿素含量较1号没有明显变化(如图2A和2B所示)，说明利用缓冲液体系不但省时省力，还不会抑制微的藻生长。
实施例二：不同pH值处理组对海洋微藻油脂含量的评价
仍采用实施例一中的1～5号五种不同的pH值处理。
评价指标：(1)利用油脂荧光染料尼罗红(NR，Sigma)的荧光强度来反映海洋微藻细胞的相对油脂含量，在200μL微藻细胞中，加入2μL的0.1mg/mL尼罗红溶液，黑暗处理20min，通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测尼罗红(NR，Sigma)的荧光强度，激光共聚焦显微镜测得的结果如图3A、3A’、3B、3B’、3C、3C’、3D和3D’所示，流式细胞仪检测的结果如图4A、4B、4C、4D和4E所示。(2)提取脂肪酸，提取方法参考经典方法(Zhi-Kai Yang,Ying-FangNiu,Yu-Han Ma,Jiao Xue,Meng-Han Zhang,Wei-Dong Yang,Jie-ShengLiu,Song-Hui Lu1,Yuanfang Guan* and Hong-Ye Li*.Molecular and cellularmechanisms of neutrallipid accumulation in diatom followingnitrogendeprivation.Biotechnology for Biofuels 2013,6:67)。最终油脂含量(干重)％＝抽提藻细胞总油脂重量/藻细胞干重*100％，如图5所示。
多次实验结果表明：1、与1号相比，3号的相对油脂含量相当于1号的1.8-2.5倍，4号的相对油脂含量相当于1号的2.6-3.2倍，所以较佳的是4号。2、5号采用两步法，将1号和4号、5号相比，4号和5号约是1号的3.0倍，但考虑到省时省力，由于5号需要在不同的生长时期加入不同的缓冲液，因此4号较5号优。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种促进微藻油脂积累的培养方法，其特征在于：将微藻接种在培养基中培养，在所述培养基中添加N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液，添加所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液后所述培养基的pH值始终维持在9.0～10.0之间。
2.如权利要求1所述的促进微藻油脂积累的培养方法，其特征在于：所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液是在将所述微藻接种到所述培养基时就添加到所述培养基。
3.如权利要求1所述的促进微藻油脂积累的培养方法，其特征在于：在将所述微藻接种到所述培养基时，在所述培养基中加入Tris缓冲液，使所述培养基的pH值维持在7.8-8.5之间，然后在所述微藻的生长进入稳定期时在所述培养基中再添加所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液，使所述培养基的pH值始终维持在9.0～10.0之间。
4.如权利要求1～3任意一种所述的促进微藻油脂积累的培养方法，其特征在于：所述N-环己基-2-氨基乙磺酸在所述培养基中的终浓度为30μM-30mM。
5.如权利要求4所述的促进微藻油脂积累的培养方法，其特征在于：所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液是将N-环己基-2-氨基乙磺酸、去离子水和NaOH混合制成，所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的缓冲液中所述N-环己基-2-氨基乙磺酸的摩尔浓度为0.2M～5M。
6.如权利要求1～3任意一项所述的促进微藻油脂积累的培养方法，其特征在于：所述微藻的培养条件为：8h～16h光照与8h～16h黑暗交替，温度17℃～24℃，光照强度为50μmol·m-2·s-1～200μmol·m-2·s-1。
7.如权利要求1～3任意一项所述的促进微藻油脂积累的培养方法，其特征在于：在初始配制的培养基中，每1L所述培养基中包含如下组分：1mg～100mgNaNO3，1mg～50mg NaH2PO4·2H2O，1mg～50mg Na2EDTA，1mg～50mgFeCl3·6H2O，0.01μg～1mg CuSO4·5H2O，0.01μg～1mg ZnSO4·7H2O，0.01μg～1mgCoCl2·6H2O，0.01μg～1mg MnCl2·4H2O，0.0001μg～1mg Na2MoO4·2H2O，0.0001μg～1mg维生素B12，0.01μg～10mg维生素B1和0.0001μg～1mg维生素H。
8.如权利要求1～3任意一项所述的促进微藻油脂积累的培养方法，其特征在于：所述微藻为褐指藻属。
9.如权利要求8所述的促进微藻油脂积累的培养方法，其特征在于：所述微藻为三角褐指藻藻种。
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