CN104789540A - 基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型pcr促进剂、制备方法及其应用 - Google Patents

基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型pcr促进剂、制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104789540A
CN104789540A CN201510203578.1A CN201510203578A CN104789540A CN 104789540 A CN104789540 A CN 104789540A CN 201510203578 A CN201510203578 A CN 201510203578A CN 104789540 A CN104789540 A CN 104789540A
Authority
CN
China
Prior art keywords
triphosphoric acid
lytic enzyme
deoxyuridine
deoxyuridine triphosphoric
acid lytic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510203578.1A
Other languages
English (en)
Inventor
刘喜朋
杜飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Foresight Biotechnology (shanghai) Co Ltd
Original Assignee
Foresight Biotechnology (shanghai) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foresight Biotechnology (shanghai) Co Ltd filed Critical Foresight Biotechnology (shanghai) Co Ltd
Priority to CN201510203578.1A priority Critical patent/CN104789540A/zh
Publication of CN104789540A publication Critical patent/CN104789540A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/01—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1)
    • C12Y306/01023—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1) dUTP diphosphatase (3.6.1.23)

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体为一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂、制备方法及其应用。本发明中将脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出特异性水解dUTP，不水解dCTP、dTTP、dATP和dGTP；同时其95℃下酶活性半衰期不低于30分钟的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为蛋白型PCR促进剂。本发明的有益效果在于：其PCR促进剂为蛋白型PCR促进剂，通用性好，活性高，热稳定性好，可以用作各种商品化高保真型DNA聚合酶的促进剂，能提高PCR扩增产量2-6倍，并改善DNA片段有效扩增长度。

Description

基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种新的PCR促进剂制备与应用技术，尤其涉及一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂制备与应用技术，属于基因工程技术领域。
背景技术
PCR技术的出现使得体外快速制备特定DNA分子成为可能，目前广泛应用于各种核酸扩增与检测领域，极大地促进了核酸诊断技术、现代基因工程、重组蛋白质工程的发展。由于PCR的扩增产量、DNA有效扩增长度等受多种因素的影响，目前开发了多种改善PCR性能的技术。这些技术主要包括优化PCR反应体系组分，例如通过加入二甲基亚砜(DMSO)、优化镁离子浓度等。目前这些技术能够在一定程度上改善PCR性能，但也存在通用性、重复性差等问题，特别是更换目的基因片段后，通常需要重新优化这些PCR反应条件。
作为PCR技术的核心试剂，DNA聚合酶性能的改良是PCR的核心。由于基于热循环的PCR，高温会使PCR反应底物之一脱氧胞嘧啶核苷三磷酸(dCTP)水解脱氨，生成脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)，脱氧尿嘧啶核苷三磷酸会被DNA聚合酶掺入合成的DNA分子中，掺入DNA中的尿嘧啶碱基严重抑制DNA聚合酶活性，最终降低DNA有效扩增长度和扩增产量。另一方面，插入DNA的脱氧尿嘧啶碱基还会与鸟嘌呤配对，导致颠换型碱基突变。然而传统型PCR改良剂对这些问题无能为力。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶(dUTPase)的蛋白型PCR促进剂、制备方法及其应用；本发明中的蛋白型PCR促进剂具有通用性广、综合性能优良等特点。该蛋白型PCR促进剂不仅能显著提高多种商品化DNA聚合酶的PCR产量，还可以增加PCR扩增片段有效扩增长度。
本发明蛋白型PCR促进剂的作用原理主要在于：脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶能将脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解成脱氧尿嘧啶核苷酸，阻止尿嘧啶核苷酸掺入合成的DNA分子中，从而消除DNA中尿嘧啶对DNA聚合酶的抑制作用，提高PCR产量和DNA有效扩增长度。
本发明的技术方案具体如下。
本发明提供一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的重组表达质粒
基于嗜热微生物基因组信息，设计其编码的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因，在此基础上，修改优化脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶编码基因的稀有密码子，采用全基因合成技术合成嗜热菌株的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因，并将该基因克隆到原核表达载体pET28，构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒；
(2)重组表达脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶
将构建的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶诱导表达；
(3)亲和纯化表达的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶
离心收集诱导表达脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，加热失活大肠杆菌自身蛋白，离心收集含有脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶；
(4)检测脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的酶活性和热稳定性，筛选出蛋白型PCR促进剂
将纯化后脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出特异性水解dUTP，不水解dCTP、dTTP、dATP、dGTP；同时其95度下酶活性半衰期不低于30分钟的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为蛋白型PCR促进剂。
本发明中，步骤(1)中，所述嗜热微生物包括火球菌(Pyrococcus furiosus)、詹氏产甲烷古菌(Methanococcus jannaschii)、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)等嗜热微生物。
本发明中，步骤(2)中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将耐热型脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达菌株培养至OD600＝0.4-1.0，再加入0.5mM诱导剂IPTG在37℃温度下培养3小时或22℃温度下培养12小时进行诱导表达。
本发明中，步骤(3)中，所述非变性蛋白裂解液的组成如下：20mM pH值为8.0的Tris-HCl,,300mM NaCl,0.5mM DTT，10vol％甘油。
本发明还提供一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂。
本发明中，所述蛋白型PCR促进剂为火球菌、詹氏产甲烷古菌、敏捷气热菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶，其中：火球菌、詹氏产甲烷古菌或敏捷气热菌的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4～6所示；编码火球菌、詹氏产甲烷古菌、敏捷气热菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的基因序列依次如SEQ ID NO:1～3所示。
本发明还进一步提供基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂的应用。该蛋白型PCR促进剂应用于B型DNA聚合酶的PCR反应体系中。该B型DNA聚合酶为Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶或Vent DNA聚合酶等。
本发明检测脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶对PCR的促进作用的具体方法如下：在B型DNA聚合酶催化的PCR反应体系中加入脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶，扩增目标基因。利用1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，测定脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为蛋白型PCR促进剂对PCR的改良效果。
与现有技术相比，本发明具有显著进步，其可用于改善PCR扩增效果，可以大大提高PCR扩增产量，特别适用于长片段DNA的PCR扩增反应，具体如下：
(1)通用性好，由于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶针对DNA中尿嘧啶碱基对DNA聚合酶活性的抑制缺陷，进行改良设计；因此能够显著改善多种DNA聚合酶的PCR扩增性能，并不局限于某一DNA聚合酶，能够显著改良多种商品化DNA聚合酶的PCR扩增产量和DNA有效扩增长度。
(2)脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶不仅能够增加PCR扩增产量，还能够增加DNA有效扩增长度，特别适用于长片段DNA的PCR扩增。
(3)操作条件简单，无需优化，直接使用。化学型PCR促进剂的最优浓度等需要优化，尤其是化学型PCR促进剂的最优浓度仅适用于某一DNA扩增反应。目的DNA扩增反应改变后，需要重新优化化学型PCR促进剂最优浓度，操作繁琐，通用性差。脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶蛋白型PCR促进剂通用性极高，对所有DNA扩增反应均适用，且不需要优化促进剂浓度，所有PCR扩增反应采用相同浓度的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶。
(4)脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶为蛋白型PCR促进剂，除了能够增加PCR产量和DNA有效扩增长度外，还可以减少碱基突变，提高扩增的目的基因的保真性。
附图说明
图1是火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶对各种核苷酸三磷酸的水解效率图。
图2是火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的热稳定性图。
图3是火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶对Pfu DNA聚合酶催化PCR的促进作用图示。
图4是詹氏产甲烷古菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶对KOD DNA聚合酶催化PCR的促进作用图示。
图5是敏捷气热菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶对Vent DNA聚合酶催化PCR的促进作用图示。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本发明的限定。
实施例1火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的制备
第一步，设计合成火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因，并插入pET28表达载体，构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的重组表达质粒。重组火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶N端带有来源于pET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化。
火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
第二步，重组表达火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶。将火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达菌株。将表达菌株培养至OD600＝0.6，加入0.5mM诱导剂IPTG，在37℃温度下培养3小时，诱导火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶表达。
火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组蛋白的氨基酸序列(氮端→碳端)如SEQID NO:4所示。
第三步，火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶亲和纯化。将步骤二诱导后的大肠杆菌离心收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,300mM NaCl,0.5mMDTT，10vol％甘油)。超声波破碎菌体，70℃温度下加热失活大肠杆菌蛋白，离心收集含有火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的菌体裂解上清液。利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶。
第四步，检测火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的酶活性和热稳定性。利用脱氧尿嘧啶核苷三磷酸和4种正常的脱氧核苷三磷酸(dCTP、dTTP、dATP、dGTP)作为底物，加入火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶，测定5种核苷三磷酸的水解程度。具体水解结果见图1。结果表明火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶特异性水解脱氧尿嘧啶核苷三磷酸，而对正常脱氧核苷三磷酸不具有水解活性。
在此基础上，检测火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的热稳定性。将火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶在不同温度保温30分钟，然后测定其剩余的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶活性大小。火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组蛋白的热稳定性结果见图2，结果表明其在95℃保温30分钟后的剩余活性大于60％，其能够在PCR热循环条件下水解脱氧尿嘧啶核苷三磷酸。
实施例2火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为PCR促进剂的应用
利用纯化的火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为PCR促进剂，改善Pfu DNA聚合酶催化的PCR反应。扩增目的基因为大肠杆菌核酸酶IV基因，PCR反应缓冲液：20mMTris-HCl(pH 8.8),10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,0.1mg/mL BSA,0.1％(v/v)Triton X-100,2mM MgSO4；其它组分为0.2mM dNTP，0.3μM引物，20ng大肠杆菌基因组DNA，2.5单位Pfu DNA聚合酶。PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图片见图3，结果表明火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶使PCR扩增产量增加2-3倍。
实施例3詹氏产甲烷古菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为PCR促进剂的应用
按照实施例1的工艺，制备詹氏产甲烷古菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶，该蛋白氨基酸序列(氮端→碳端)如SEQ ID NO:5所示，编码该酶蛋白的基因序列如SEQ ID NO:2所示。利用纯化的詹氏产甲烷古菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为PCR促进剂，改善KOD DNA聚合酶催化的PCR反应。扩增目的基因为大肠杆菌内切核酸酶III基因，PCR反应缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 8.8),10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,0.1mg/mL BSA,0.1％(v/v)Triton X-100,2mM MgSO4；其它组分为0.2mM dNTP，0.3μM引物，10ng大肠杆菌基因组DNA，2.5单位KOD DNA聚合酶。PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图片见图4，结果表明詹氏产甲烷古菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶使PCR扩增产量增加2倍。
实施例4敏捷气热菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为PCR促进剂的应用
按照实施例1的工艺，制备敏捷气热菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶，该蛋白氨基酸序列(氮端→碳端)如SEQ IDNO:6所示，编码该酶蛋白的基因序列如SEQ ID NO:2所示。利用纯化的敏捷气热菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为PCR促进剂，改善Vent DNA聚合酶催化的PCR反应。扩增目的基因选择长片段基因——大肠杆菌DNA聚合酶I基因，PCR反应缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 8.8),10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,0.1mg/mL BSA,0.1％(v/v)Triton X-100,2mM MgSO4；其它组分为0.2mM dNTP，0.3μM引物，20ng大肠杆菌基因组DNA，2.5单位Vent DNA聚合酶。PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图片见图5，结果表明敏捷气热菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶使长度为2.8kb的大肠杆菌DNA聚合酶I基因的PCR扩增产量约增加5-6倍。

Claims (8)

1.一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的重组表达质粒
基于嗜热微生物基因组信息，设计其编码的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因，在此基础上，修改优化脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶编码基因的稀有密码子，采用全基因合成技术合成嗜热菌株的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因，并将该基因克隆到原核表达载体pET28，构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒；
(2)重组表达脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶
将构建的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶诱导表达；
(3)亲和纯化表达的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶
离心收集诱导表达脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，加热失活大肠杆菌自身蛋白，离心收集含有脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶；
(4)检测脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的酶活性和热稳定性，筛选出蛋白型PCR促进剂
将纯化后脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出特异性水解dUTP，不水解dCTP、dTTP、dATP和dGTP；同时其95℃下酶活性半衰期不低于30分钟的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为蛋白型PCR促进剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述嗜热微生物包括火球菌、詹氏产甲烷古菌和敏捷气热菌。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将耐热型脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达菌株培养至OD600＝0.4-1.0，再加入0.5mM诱导剂IPTG在37℃温度下培养3小时或22℃温度下培养12小时进行诱导表达。
4.如权利要求1～3之一所述的制备方法得到的基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂。
5.如权利要求4所述的蛋白型PCR促进剂，其特征在于，其为火球菌、詹氏产甲烷古菌或敏捷气热菌的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶，其中：火球菌、詹氏产甲烷古菌或敏捷气热菌的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4～6所示；编码火球菌、詹氏产甲烷古菌、敏捷气热菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的基因序列依次如SEQID NO:1～3所示。
6.如权利要求1～3之一所述的制备方法得到的基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂的应用。
7.如权利要求6所述的基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂的应用，其特征在于，所述蛋白型PCR促进剂应用于B型DNA聚合酶的PCR反应体系中。
8.如权利要求7所述的基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂的应用，其特征在于，所述B型DNA聚合酶为Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶或Vent DNA聚合酶。
CN201510203578.1A 2015-04-24 2015-04-24 基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型pcr促进剂、制备方法及其应用 Pending CN104789540A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510203578.1A CN104789540A (zh) 2015-04-24 2015-04-24 基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型pcr促进剂、制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510203578.1A CN104789540A (zh) 2015-04-24 2015-04-24 基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型pcr促进剂、制备方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104789540A true CN104789540A (zh) 2015-07-22

Family

ID=53554734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510203578.1A Pending CN104789540A (zh) 2015-04-24 2015-04-24 基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型pcr促进剂、制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104789540A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105176946A (zh) * 2015-09-16 2015-12-23 苏州旷世骏弛生物科技有限公司 一种尿嘧啶dna糖苷酶、制备方法及其应用
CN109439682A (zh) * 2018-10-26 2019-03-08 苏州博睐恒生物科技有限公司 利用dU和古菌DNA聚合酶的基因克隆的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102766611A (zh) * 2012-07-12 2012-11-07 昆明理工大学 硫化叶菌病毒脱氧尿苷焦磷酸酶和编码这种酶的多核苷酸

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102766611A (zh) * 2012-07-12 2012-11-07 昆明理工大学 硫化叶菌病毒脱氧尿苷焦磷酸酶和编码这种酶的多核苷酸

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOGREFE,H.H.等: ""AY066005.1"", 《GENBANK》 *
HOLLY H. HOGREFE 等: ""Archaeal dUTPase enhances PCR amplifications with archaeal DNA polymerases by preventing dUTP incorporation"", 《PANS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105176946A (zh) * 2015-09-16 2015-12-23 苏州旷世骏弛生物科技有限公司 一种尿嘧啶dna糖苷酶、制备方法及其应用
CN109439682A (zh) * 2018-10-26 2019-03-08 苏州博睐恒生物科技有限公司 利用dU和古菌DNA聚合酶的基因克隆的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105176946A (zh) 一种尿嘧啶dna糖苷酶、制备方法及其应用
CN101228268A (zh) Rna扩增和/或rna标记用的rna依赖的rna聚合酶，方法及试剂盒
CN103266103A (zh) 用于扩增核糖核酸的方法及分析该方法中rna或dna模板的方法
EP1224295A1 (en) Method and compositions for improved polynucleotide synthesis
WO2022222920A1 (zh) 一种新型高温Argonaute蛋白的表征及应用
CN113201578B (zh) 一种新型高温Argonaute蛋白TpsAgo表征及应用
Oh et al. Complete genome sequence of Erythrobacter litoralis HTCC2594
CN106754825B (zh) 提高比活的α-淀粉酶BaAmy突变体及其编码基因和应用
CN104789540A (zh) 基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型pcr促进剂、制备方法及其应用
CN114561374A (zh) 一种新型嗜热核酸内切酶突变体及其制备方法和应用
CN115335536A (zh) 用于即时核酸检测的组合物和方法
CN110527708A (zh) 一种区分dna中5-甲基化胞嘧啶和5-羟甲基化胞嘧啶的方法
CN106755041A (zh) 一种低温型细菌dna连接酶的制备方法及其应用
CN106929495B (zh) 提高比活的α-淀粉酶BasAmy突变体及其编码基因和应用
CN114645033B (zh) 一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用
CN110117583B (zh) 热稳定和比活提高的植酸酶ecappa突变体及其基因和应用
CN106520814A (zh) 一种热稳定性核酸酶及其制备方法
CN106754823A (zh) 一种尿嘧啶dna糖苷酶的制备方法及其应用
CN107058264B (zh) 比活提高的α-淀粉酶JcAmy突变体及其编码基因和应用
Kaplan et al. Recombinant production of Thermus aquaticus single-strand binding protein for usage as PCR enhancer
CN101228273A (zh) 新的核糖核酸内切酶
CN117210433B (zh) 超速高保真兼并逆转录dna聚合酶和基于该酶的基因扩增、逆转录方法以及试剂
RU2809366C1 (ru) Способ получения большого фрагмента Bst-полимеразы (варианты)
Yan et al. Characterization of a family I-liked alkaline-resistant inorganic pyrophosphatase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus for rapid determination of sugar nucleotidyltransferase at high temperature
CN117417919A (zh) 一种热敏感尿嘧啶dna糖苷酶及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150722

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication