CN104789479A - 一种新型黑曲霉固定化细胞的制备及其对黄曲霉毒素b1的降解作用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种经过紫外诱变的新型黑曲霉(Aspergillus niger)菌株FS-UV1，保藏编号CCTCC NO:M2013553，与凹凸棒及HSCAS制备而成的固定化细胞。该固定化细胞对黄曲霉毒素具有良好的降解效果，降解率达到95.3％；较原菌株提高了57.8％。

Description

一种新型黑曲霉固定化细胞的制备及其对黄曲霉毒素B1的降解作用
本发明涉及一种利用一株新型诱变黑曲霉FS-UV1及HSCAS和凹凸棒制备的固定化细胞。特别是一种对黄曲霉毒素B1具有良好降解效果的菌株。
背景技术
真菌毒素对食品尤其是对粮食的危害极大，真菌可在粮食作物田间生长及收获后储藏过程中毒素的生物合成及代谢。据联合国粮农组织估计,全世界谷物供应25％受真菌毒素污染而不能食用，对真菌毒素的防治成为保证食品安全刻不容缓的头等大事。而微生物防治具有安全、高效、经济、应用性强、环境友好型等优势，成为近年来备受推崇的防治方法。而真菌毒素中危害较大当属黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮以及呕吐毒素。研究表明多种细菌对黄曲霉毒素具有生物防治作用。如杆菌、伯克霍尔德菌、链霉菌、链球菌和乳酸菌等均可抑制产毒霉菌的生长，产毒作用。徐丹等已证实黑曲霉具有降解黄曲霉毒素B1的效果。早在19世纪初叶,人们发现,某些微生物细胞具有一种吸附在固体物质表面的天然倾向和特殊功能,并以这种方式被束缚,固定起来。当时,曾利用这种方式被吸附的微生物细胞,在滴滤反应系统内生产醋酸。此后,有人将类似的方法用于污水处理。从60年代开始,国际上固定化酶的研究迅速发展起来,到70年代,作为酶源的微生物菌体本身的固定化,即固定化微生物,也引起了人们极大的注意。所谓固定化技术,是指利用化学或物理手段将游离的细胞(微生物)或酶,定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术。包括固定化酶技术和固定化细胞技术。人们对一种较为理想的固定化载体有以下5个要求:a.具有高的载体活性,即固定化酶或微生物的活性回收率要高；b.材料容易获得；c.价格便宜；d.操作制备方便,能适用于大规模生产；e.有较高的机械强度,能较长时间使用和重复使用。目前，所采用的载 体主要有以下几种:琼脂、明胶、海藻酸量添加少量海藻酸钠和活性炭。固定化细胞技术已经在工业，医学，化学分析,环境保护,能源开发及理论研究等方面得到了广泛的应用。
发明内容
本发明提供了一株新型黑曲霉，已于2011年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2013553。
本发明提供了一种固定化细胞，该固定化细胞对黄曲霉毒素具有良好的降解效果，在降解后2h，降解率达到95.3％；较原菌株提高了57.8％，并缩短了降解时间。
所述诱变黑曲霉是经紫外诱变中分离得到，其保藏条件如下：从生长良好的固态平板培养基上接取3环诱变黑曲霉到摇瓶培养基中，28℃摇床(200rpm)培养36h，取0.65mL移入含有0.3mL无菌甘油的甘油管中，放入-70℃超低温冰箱保存。
所述固态平板培养基PDA为(w/v)：马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g、氯霉素0.1g、蒸馏水1L，自然pH，121℃高压灭菌15min。
所述液体发酵培养基PDB为(w/v)：马铃薯300g、葡萄糖20g、蒸馏水1L、自然pH、121℃高压灭菌15min。
所述诱变黑曲霉的培养条件为：将已保藏甘油管的诱变黑曲霉接入液体发酵培养基，28℃，130rpm，摇床培养36h。
将提纯过200目筛的HSCAS粉体与有机改性剂(CTAB)按照1:1比例混合，通过机械力化学法改性3h，然后在一定条件下干燥，研碎过筛，即可获得相应的HSCAS粉体。
将诱变黑曲霉接种到PDA固体培养基中，28℃，培养36h，取50ml生理 盐水洗下孢子，振荡均匀，形成单孢子悬浮液,制成108CFU/ml的菌悬液，称取不同质量的改性HSCAS及凹凸棒(w:v)分别为0.1％、0.3％、0.5％、1％，并在不同温度(10℃、20℃、25℃、30℃、40℃)，不同pH(4,6,8,10及自然pH)，磁力搅拌30min、50min。将固定化细胞用蒸馏水反复冲洗，将表面孢子冲洗干净，充分静置，最后将固定化细胞接种到30ml发酵液中，28℃，130rpm，摇床培养36h。向发酵液中加入0.05ppm AFB1比较黑曲霉及固定化细胞对AFB1的降解效果。
本发明利用经紫外诱变得到的新型黑曲霉FS-UV1与改性HSCAS及凹凸棒制备的对AFB1具有良好降解效果的固定化细胞，在降解时间为2h时，较原菌株对AFB1提高了57.8％；缩短了降解时间。制备的固定化细胞可应用于农产品，粮食以及饲料等领域中多种真菌毒素的降解中，达到降低黄曲霉毒素B1含量的目的。
附图说明
图1：新型黑曲霉FS-UV1-HSCAS固定化细胞制备条件优化。图中A，B，C分别为HSCAS-黑曲霉固定化细胞在不同pH，温度，HSCAS：发酵液(w:v)的吸附效果比较。
图2：新型黑曲霉FS-UV1-凹凸棒固定化细胞制备条件优化。图中A，B，C分别为凹凸棒-黑曲霉固定化细胞在不同pH，温度，凹凸棒：发酵液(w:v)的吸附效果比较。
图3：FS-UV1-HSCAS及FS-UV1-凹凸棒固定化细胞对黄曲霉毒素B1的降解效果比较。图中a为凹凸棒-黑曲霉固定化细胞，b为HSCAS-黑曲霉固定化细胞，c为黑曲霉FS-UV1
具体实施方式
实施例1：新型黑曲霉FS-UV1的制备
取50ml生理盐水洗下孢子，振荡均匀，形成单孢子悬浮液，制成108CFU/ml的菌悬液。取上述孢子悬液5ml经200w紫外照射5min，微波处在高档时加热80s。将诱变后的菌株接种于PDA培养基，在菌落上挑取适当孢子制成108CFU/ml菌悬液，接种到30ml发酵液中，28℃130rpm，摇床培养36h。吸取10ul发酵液在酪蛋白平板上进行复筛。通过菌落特征观察，个体形态观察，并将菌株的18S rDNA与GenBank数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中已知序列对比，发现其与黑曲霉(Aspergillus niger)同源性达100％。结合菌株的形态特征和分子生物学鉴定，可确定菌株为黑曲霉。本菌株已于2011年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2013553 
1)将筛选出来的黑曲霉菌株接种到PDA斜面培养基中28℃培养36h，取50ml生理盐水洗下孢子，振荡均匀，形成单孢子悬浮液。制成108CFU/ml的菌悬液。取上述孢子悬液5ml经200w紫外照射5min，微波处在高档时加热80s。
2)诱变后的菌株接种于PDA培养基，从菌落中挑取适当孢子制成108CFU/ml菌悬液，接种到30ml发酵液中，28℃培养36h。用打孔器在酪蛋白平板上打孔，吸取10ul发酵液滴入孔内。选取蛋白水解圈较大的菌株则为复筛得到的菌株。
实施例2：黑曲霉FS-UV1-凹凸棒固定化细胞的制备及条件优化
将诱变黑曲霉接种到PDA固体培养基中，28℃，36h，取50ml生理盐水洗下孢子，振荡均匀，形成单孢子悬浮液,制成108CFU/ml的菌悬液。称取不同质量的凹凸棒(w:v)分别为0.1％、0.3％、0.5％、1％并在不同温度(10℃、 20℃、25℃、30℃、40℃)，不同pH(4,6,8,10及自然pH)，磁力搅拌50min.并测定不同时间时560nm的吸光度。
实施例3：新型黑曲霉FS-UV1-HSCAS固定化细胞的制备及条件优化
将诱变黑曲霉接种到PDA固体培养基中，28℃，36h，取50ml生理盐水洗下孢子，振荡均匀，形成单孢子悬浮液,制成108CFU/ml的菌悬液。称取不同质量的凹凸棒(w:v)分别为0.1％、0.3％、0.5％、1％并在不同温度(10℃、20℃、25℃、30℃、40℃)，不同pH(4,6,8,10及自然pH)，磁力搅拌50min.并测定不同时间时560nm的吸光度。
实施例4：固定化细胞对AFB1的降解效果比较
1)新型黑曲霉FS-UV-凹凸棒固定化细胞对AFB1的降解
将复合诱变菌株FS-UV1及FS-UV1-凹凸棒固定化细胞接种到30ml发酵液中，28℃130rpm，摇床培养36h。向发酵液中加入0.05ppm黄曲霉毒素B1，从中吸取1ml并加入3ml三氯甲烷，萃取两次，氮气吹干，加入三氟乙酸100ul，正己烷200ul，衍生化30min，应用高效液相色谱法进行检测。色谱条件为C18柱6mm×150mm×5um；流动相乙腈：水＝20:80检测温度：30℃；流速：1ml/min；检测波长：激发波长：360nm；发射波长：440nm
2)新型黑曲霉FS-UV-HSCAS固定化细胞对AFB1的降解
将复合诱变菌株FS-UV1及FS-UV1-HSCAS固定化细胞接种到30ml发酵液中，28℃130rpm，摇床培养36h。向发酵液中加入0.05ppm黄曲霉毒素B1，从中吸取1ml并加入3ml三氯甲烷，萃取两次，氮气吹干，加入三氟乙酸100ul，正己烷200ul，衍生化30min，应用高效液相色谱法进行检测。色谱条件为C18柱6mm×150mm×5um；流动相乙腈：水＝20:80检测温度：30℃；流速：1ml/min；检测波长：激发波长：360nm；发射波长：440nm
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一株诱变得到的黑曲霉菌株，于2013年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2013553。其与凹凸棒、HSCAS(水合铝硅酸钠钙)制备成固定化细胞。
2.根据权利要求1所述固定化细胞，其特征在于该固定化细胞是利用在PDA培养基中培养48h的孢子与不同材料制备的。
3.权利要求2所述的固定化细胞，其特征在于所述固定化细胞是与凹凸棒、HSCAS制备的。
4.根据权利要求3所述的HSCAS是由机械力化学法制备的有机HSCAS粉体。
5.根据权利要求3所述的固定化细胞，其特征在于所述固定化细胞制备条件是凹凸棒、HSCAS对黑曲霉孢子吸附的饱和时间分别为40min，30min。
6.权利要求4中所述的固定化细胞其特征在于黑曲霉-凹凸棒的最优制备条件为0.1％(w:v)，20℃，pH为自然，磁力搅拌50min；黑曲霉-HSCAS的最优制备条件为1％(w:v)，40℃，pH为10，磁力搅拌30min。
7.根据权利要求1-6任一所述的固定化细胞应用于降解对毒素污染的花生粕。
8.根据权利要求1-7任一所述的固定化细胞在食品、饲料领域的应用。
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