CN104783923A - 一种层层自组装的小口径组织工程血管及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种层层自组装的小口径组织工程血管及其构建方法。其主要包括构建壳聚糖/β-环糊精纳米缓释颗粒，包裹内皮祖细胞动员捕获分子；用电纺丝的方法将天然生物材料或者人工合成材料编织成人工血管，或采用去除抗原后的去细胞化同种或异种血管；组织工程血管的表面修饰，采用层层自组装的方式修饰包裹腺苷及其受体激动剂等捕获和动员分子的纳米颗粒到生物人工血管支架上。本发明能方便构建人工血管，能有效的控制药物的释放和降低药物的突释，同时具有优良的力学性能和临床实用性。可构建任意口径的血管,能体内诱导循环血内皮祖细胞动员和归巢。能快速促进人工血管内皮化，同时能长时程抑制平滑肌细胞病理性增殖所导致的血管狭窄、闭塞。

Description

一种层层自组装的小口径组织工程血管及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术，具体是关于一种纳米颗粒修饰的层层自组装生物人工血管及其构建方法。

背景技术

近几年，心血管疾病的发病率以及死亡率逐年升高，每年有大量的病人需要进行旁路移植手术，因此临床上对于直径小于6mm的组织工程血管需求量很高。但是小口径组织工程血管常常由于血栓形成以及内膜增生而导致移植手术失败。大量的研究表明内皮细胞具有抗血栓、抑制血小板的聚集和平滑肌细胞病理性增殖的功能，因此组织工程血管的早期快速内皮化是维持小口径组织工程血管移植后通畅的一个十分重要的因素。内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞，在缺血或者血管受损的情况下，可以从骨髓动员并归巢到相应部位，促进血管内皮的修复以及血管生成。因此，在组织工程血管的构建中选择合适的分子促进干细胞的动员，并能选择性的捕获血液中的内皮祖细胞是提高组织工程血管通畅率的一个重要研究靶点。

科学家通过在组织工程血管的内表面涂层抗体或者蛋白特异性捕获血液循环中的内皮祖细胞，在早期取得了较好的通畅效果。然而在移植后期出现了不同程度的内膜增生，甚至堵塞。究其原因，主要是因为组织工程血管内表面涂层的药物缓释时间较短，不能长时程的发挥功能。在移植后期药物释放完毕后，组织工程血管的局部微环境不适合归巢的内皮祖细胞的生存，但是可以刺激平滑肌的病理性增生。组织工程血管移植后都面临着高剪切力和高冲刷力的力学刺激，同时能快速的将物质推送到全身各个部位。因此对控释材料的安全性和稳定性具有特别高的要求。腺苷是一种内源性核苷，具有细胞保护和促进血管生成的作用。我们的研究发现腺苷可以促进内皮祖细胞动员归巢、促内皮祖细胞旁分泌和抑制平滑肌的病理性增殖等。然而目前还没有一种既安全又能稳定控制腺苷的释放，还能适合血液循环系统这个特殊环境应用的控释体系。

环糊精的研究经历了一百多年的时间，现已广泛的用于医药和生物技术等行业。β-环糊精分子具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，外侧由羟基构成，具有亲水性，而空腔内由于受到C-H键的屏蔽作用形成了疏水区，可以包裹各种化合物，具有很好的药物控释和生物可降解性等特点。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，可以通过氨基和羟基与腺苷或受体活化药物结合，目前也已经作为一种材料应用于药物制剂。研究表明β-环糊精和壳聚糖能够形成一个稳定的结合物，相对于单独的β-环糊精或者壳聚糖能更长时程的控制药物释放。

发明内容

本发明主要是针对现有技术的不足，提供一种能长时程控制药物释放，在早期在体动员和捕获内皮祖细胞的组织工程血管，促进血管快速内皮化，移植后期抑制内膜增生和血管狭窄，主要用于血管的取代治疗和冠状动脉搭桥。为实现本发明的上述目的而采用的技术方案，即构建一种能长时程控释又能促进早期快速内皮化的组织工程血管，其采用如下方法构建：

（1）控制药物释放的纳米缓释颗粒的制备：筛选具有内皮祖细胞动员捕获功能和微环境优化功能的药物，如腺苷及其A1，A2b,A2a,A3四个受体的激动剂等，筛选以及修饰合适的化合物，检测其对人体的安全性和不良反应。具体为：每80-100mg的β-环糊精与20-30mg的腺苷或腺苷A2a受体激动剂或腺苷A1受体激动剂或腺苷A2b受体激动剂或腺苷A3受体激动剂溶于20-30ml的去离子水中，获得溶液Ⅰ；每60-80mg的壳聚糖溶于1%的冰醋酸溶液，获得溶液Ⅱ；按照溶液Ⅱ与溶液Ⅰ3-5：1的比例混合，离心分离，获得纳米缓释颗粒。

（2）组织工程血管基质的构建：用异种或同种血管或皮肤组织提取胶原，然后去除胶原中的抗原，获得生物相容性良好的胶原；保留胶原的天然网状结构。

（3）血管的编织：将所述胶原和弹性材料按重量百分比60～80％：20～40％用电纺丝纺织方法编织血管支架；或将所述胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料按重量百分比50～70％：12～18％：1～5％：15～35％用电纺丝纺织方法编织血管支架；或采用人工合成材料编织血管支架。

（4）层层自组装方式构建组织工程血管：将所述纳米缓释颗粒与所述血管支架孵育24-48小时，充分洗涤后，继续用纳米缓释颗粒孵育24-48小时，PBS洗三次；然后用腺苷或腺苷A2a受体激动剂直接孵育24小时，PBS洗三次；再用EDC或者SPDP交联24小时；获得层层自组装的工程血管。

本发明获取的人源性生物胶原已去除抗原性，可控降解，可原位成型。具有良好的生物相容性，较好的力学性能。胶原是血管细胞外基质主要成分，同时胶原的三维空间结构具有较好的强度，是组成血管的重要成分。用于构建生物人工血管的胶原，在保持三螺旋结构的同时去除其抗原点—尾肽。这种材料为天然生物材料，来源广泛，无毒性，降解产物可被机体吸收，不对机体产生危害，制作简便，易于塑形，并在功能适应性、组织相容性、理化性能、生物降解性、造价等方面优于人工合成材料。

生物血管支架本身具有良好的细胞诱导性，进一步复合表面修饰物质后，为种子细胞粘附、增殖、分化、迁移及发挥抗凝血等功能提供较好的微环境。本发明中血管腔表面修饰有以下优点：实验表明一方面在移植早期表征的分子可以释放入血，进入骨髓促进内皮祖细胞的动员，同时表征在血管表面的分子可以通过受体-配体结合的方式捕获循环中增多的内皮祖细胞；另一方面血管表征的纳米材料可以长时程的控释分子的释放，促进局部微环境的优化，达到长时程通畅的功能。这种方法在早期促进快速内皮化的同时，同时还能优化局部的微环境。尚未有这些设想或实验结果的报道。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的内容作进一步说明。

1、纳米缓释颗粒的制备： 80-100mg的β-环糊精与20-30mg的腺苷等药物溶于20-30ml的去离子水中，室温搅拌24-48h。60-80mg的壳聚糖溶于1%的冰醋酸溶液，搅拌均匀后，搅拌均匀后，缓慢加入1-3%TPP溶液1-2ml，继续室温搅拌2-8个小时。按照壳聚糖溶液与β-环糊精与腺苷溶液3-5：1的比例混合，继续搅拌2-4小时后，20000g/min，4度下离心分离，蒸馏水洗三遍后，冷冻干燥。扫描电镜检测纳米缓释颗粒的形态，红外波谱扫描检测其包裹情况，结果可见纳米颗粒包含其中一个波峰与样品扫描波峰一致，说明纳米颗粒包含了相关样品，而对照组不含相应波峰。

2、组织工程血管基质的构建：在无菌条件下，取动物颈总动脉，用生理盐水将血液冲洗干净。在37℃，5%CO₂条件下用0.15%的胰酶消化40-180分钟。用RNA酶，DNA酶、脂肪酶去除核酸和脂肪，得到去除细胞和细胞外基质而保留血管胶原纤维和弹力纤维的血管基质材料。将8-12 mg/ml的胶原溶液孵育已经制备好的血管基质材料24小时，之后用5-20 mM 京尼平或EDC对孵育了胶原的血管基质材料进行交联，时间为24-48小时，然后用PBS清洗3-5次。用电纺丝纺织方法将获得的胶原和弹性材料复合，按重量百分比60％～80％：20％～40％，编织血管，或b、用电纺丝纺织方法将胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料复合，按重量百分比50％～70％：12％～18％：1％～5％：15％～35％，编织血管，所述弹性材料为弹性蛋白和丝素蛋白，重量百分比为25％～40％：60％～75％；或c、直接采用人工合成材料用电纺丝纺织方法编织血管；或用其他方法制备的血管基质材料包括人造血管表面按上述方法孵育胶原后交联备用。

3、层层自组装方式构建组织工程血管：

在制备血管基质材料并进行胶原表征基础上，孵育含药纳米缓释颗粒24-48小时后，用交联剂交联24-48小时，充分洗涤后，继续涂层胶原，37度孵育24-48小时，PBS洗三次；之后继续孵育含药纳米缓释颗粒，方法同前，再继续涂层胶原，经过前述方法处理后，采用筛选的药物分子（此处为腺苷或腺苷A2a受体激动剂或腺苷A1受体激动剂或腺苷A2b受体激动剂或腺苷A3受体激动剂）直接孵育，而不是纳米颗粒，经过24小时孵育，再用EDC或者SPDP处理24小时。获得层层自组装的工程血管。

4、动物实验

将制备好的组织工程血管分别移植到大鼠、犬和小型猪颈动脉，分别在第7天、第14天、一个月和六个月等不同时间点取材，取材前用多普勒超声检测血流量。HE染色和电镜检测血管内皮化情况，免疫荧光检测内皮细胞和平滑肌的长入。

下面举例进行说明，但本发明的应用不仅在于此。

实施例1.一种能通过介导能量代谢的在体动员捕获内皮祖细胞生物人工血管制备，按上述步骤2方法制备血管基质材料，将腺苷等药物按步骤1的方法包裹后，按步骤3进行表面修饰后，之后进行动物实验。

获得的生物人工血管分别移植到动物的颈动脉，14天经光镜及电镜检测，可见血管腔内皮祖细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，血管成功形成了自体的内皮化。1个月后进行HE染色、免疫荧光染色和电镜检测，可见血管内皮化良好，无显著的内膜增生和血栓形成，说明这种层层自组装的血管可以有效控制药物的释放，达到移植后期优化局部微环境的作用。通过这种方法制备的工程血管与对照组相比具有很好的通畅率。

实施例 2.一种能通过调控炎症反应促进内皮祖细胞动员和归巢的生物人工血管制备，按上述步骤2方法制备血管基质材料，将腺苷A2a受体激动剂按步骤1的方法包裹后，按步骤3进行表面修饰后，之后进行动物实验。14天经光镜及电镜检测，可见血管腔内皮祖细胞形态正常，密集排列，沿血管长轴分布，说明在上述条件下，血管成功形成了自体的内皮化。1个月后进行HE染色、免疫荧光染色和电镜检测，可见血管内皮化良好，无显著的内膜增生和血栓形成，血管单核细胞分布有利于血管再生，与对照组相比，实验组工程血管具有很高的通畅率，说明这种层层自组装的血管可以通过调控炎症反应促进血管的长期通畅。

Claims (4)

1. 一种层层自组装的小口径组织工程血管，其特征在于，其构建方法如下：

（1）控制药物释放的纳米缓释颗粒的制备：每80-100mg的β-环糊精与20-30mg的腺苷或腺苷A2a受体激动剂或腺苷A1受体激动剂或腺苷A2b受体激动剂或腺苷A3受体激动剂溶于20-30ml的去离子水中，获得溶液Ⅰ；每60-80mg的壳聚糖溶于1%的冰醋酸溶液，获得溶液Ⅱ；按照溶液Ⅱ与溶液Ⅰ3-5：1的比例混合，离心分离，获得纳米缓释颗粒；

（2）组织工程血管基质的构建：用异种或同种血管或皮肤组织提取胶原，然后去除胶原中的抗原，获得生物相容性良好的胶原；

（3）血管的编织：将所述胶原和弹性材料按重量百分比60％～80％：20％～40％用电纺丝纺织方法编织血管支架；或将所述胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料按重量百分比50％～70％：12％～18％：1％～5％：15％～35％用电纺丝纺织方法编织血管支架；或采用人工合成材料编织血管支架；

（4）层层自组装方式构建组织工程血管：将所述纳米缓释颗粒与所述血管支架孵育24-48小时，充分洗涤后，继续用纳米缓释颗粒孵育24-48小时，PBS洗三次；然后用腺苷或腺苷A2a受体激动剂直接孵育24小时，PBS洗三次；再用EDC或者SPDP交联24小时；获得层层自组装的工程血管。

2.根据权利要求1所述一种层层自组装的小口径组织工程血管，其特征在于：所述弹性材料包括弹性蛋白和丝素蛋白按，其重量百分比为25％～40％：60％～75％。

3.一种层层自组装的小口径组织工程血管的构建方法，包括如下步骤：

（1）控制药物释放的纳米缓释颗粒的制备：每80-100mg的β-环糊精与20-30mg的腺苷或腺苷A2a受体激动剂溶于20-30ml的去离子水中，获得溶液Ⅰ；每60-80mg的壳聚糖溶于1%的冰醋酸溶液，获得溶液Ⅱ；按照溶液Ⅱ与溶液Ⅰ3-5：1的比例混合，离心分离，获得纳米缓释颗粒；

（2）组织工程血管基质的构建：用异种或同种血管或皮肤组织提取胶原，然后去除胶原中的抗原，获得生物相容性良好的胶原；

（3）血管的编织：将所述胶原和弹性材料按重量百分比60％～80％：20％～40％用电纺丝纺织方法编织血管支架；或将所述胶原、壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料按重量百分比50％～70％：12％～18％：1％～5％：15％～35％用电纺丝纺织方法编织血管支架；或采用人工合成材料编织血管支架；

（4）层层自组装方式构建组织工程血管：将所述纳米缓释颗粒与所述血管支架孵育24-48小时，充分洗涤后，继续用纳米缓释颗粒孵育24-48小时，PBS洗三次；然后用腺苷或腺苷A2a受体激动剂直接孵育24小时，PBS洗三次；再用EDC或者SPDP交联24小时；获得层层自组装的工程血管。

4.根据权利要求3所述一种层层自组装的小口径组织工程血管的构建方法，其特征在于：所述弹性材料包括弹性蛋白和丝素蛋白按，其重量百分比为25％～40％：60％～75％。