CN104771783A - 一种抗血栓形成和内膜增生的小口径生物人工血管 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术，具体是一种抗血栓形成和内膜增生的小口径生物人工血管。首先利用脱细胞材料和天然高分子材料复合的关键技术，通过多种方式有效偶联神经因子作为功能分子对血管支架进行修饰。进一步通过体内构建的策略，将神经营养因子修饰的小口径工程血管在体移植，在体克服血液动力学的冲刷和压力，主动捕获循环中的内皮祖细胞，并进一步诱导捕获的内皮祖细胞原位分化为内皮细胞，加快血管移植物内皮化的进程和质量。并促进滋养毛细血管生成，促进血管植入物在体重塑，从而有效发挥抗血栓形成和内膜增生的效果，提高小口径生物人工血管移植后的通畅率。构建临床可用于冠脉搭桥、血液透析、脑血管替换等的“现用型”小口径组织工程血管。

Description

一种抗血栓形成和内膜增生的小口径生物人工血管

技术领域

本发明涉及生物工程技术，具体是关于将神经营养因子创新性用于修饰生物人工血管，构建一种具有抗血栓形成和内膜增生功能的生物人工血管。

背景技术

据 WHO 最新统计,全球心血管疾病的发病率和死亡率逐年攀升。心血管疾病已经超过肿瘤成为严重威胁着人类健康的杀手,每年有17.3 千万人死于心血管疾病。使得血管移植物的临床需求在全球范围内日益增大。外周血管闭塞或损伤替代、冠状动脉旁路移植、血液透析动静脉造瘘等都需要小口径血管移植物。现在肝、肾、肺等复杂器官构建以及大段骨缺损修复等都需要血管化,移植后血管的再通往往是影响构建器官能否存活并宿主化的关键,因而小口径血管的移植和构建也是复杂器官构建的关键科学问题之一。人体自身非必需血管的长度和直径极为有限,用人工材料构建小直径血管不易成型,同时很难做到顺应性相匹配。而且合成材料血管植入物移植后1年中,血栓形成和内膜增生的发生率在 40%-60%。Niklason 等科学家提出自体动静脉、PTFE合成血管移植物已经是上世纪血管搭桥的选择。而构建不需要体外种植内皮细胞的“现用型” 组织工程血管才是未来发展的方向。但是小口径组织工程血管(<6mm)移植后由于早期血栓形成、中远期内膜增生、钙化等问题一直制约着其进一步的临床运用。因此构建一种能够抗血栓形成和内膜增生的生物人工血管迫在眉睫。

研究表明，通过促进内皮祖细胞（EPCs）的动员和迁移分化可促进血管损伤后的内皮化。EPCs主要存在于骨髓中，在血管内皮细胞损伤或局部缺血的情况下从骨髓动员出来并且归巢到血管受损部位或缺血局部分化为内皮细胞替代凋亡的内皮细胞，促进血管再内皮化和血管新生，进而减少内膜增生，减少血栓形成，降低血管的再狭窄率。因此，体内诱导自体内皮祖细胞的捕获和归巢为促进组织工程血管和人工血管的自体内皮化提供了新的机遇。

由于在生物体内，血管和神经总是伴行的，血管和神经的生长方式非常相似，它们循着相同的迁移路线，相互依赖，血管的活动和营养受神经调节。目前在构建血管组织工程时尚未引入神经调节因素，这种因素对构建功能完整的组织工程血管起何种促进作用尚不得而知。神经营养因子是重要的神经因素，对血管内皮维持正常功能有重要作用。神经生长因子（NGF）作为神经营养因子家族的重要一员，它对促进神经元生长和神经损伤后修复发挥着重要作用。有研究发现它也可以促进内皮细胞的增殖和生长，与毛细血管、以及小动静脉血管的发生有关。NGF与内皮细胞上的TrkA结合可以触发内皮细胞的增殖、迁移，并上调内皮细胞粘附分子的表达，促进血管发生。但是，NGF是否能够促进EPCs的动员、归巢从而推进组织工程血管的内皮化还不清楚。

冠状动脉和劲内外动脉都要受第十对脑神经迷走神经分支的支配。迷走神经在颈部发出喉上神经和颈心支，分布于颈内动脉并参与构成心丛，继续发支构成左右冠状动脉丛，支配左右冠状动脉。迷走神经发自脑部延髓橄榄后沟中部，据研究报道，延髓部富含脑源性神经生长因子BDNF。BDNF作为神经营养因子家族成员，是脑源性神经营养因子。已有研究发现BDNF不仅对神经生长和突触的可塑性有重要作用，而且在整个围血管形成期作用于心脏、骨骼肌和大动脉等特定器官组织。但是，BDNF是否对构建用于冠状动脉和颈动脉替代的小直径组织工程血管通畅率有影响，目前尚不清楚。

 神经肽（NP）是一种由多个氨基酸组成的多肽，广泛存在于中枢和外周神经系统，也对血管舒缩、内皮细胞和平滑肌细胞的增殖有调控作用。其中神经肽Y(NPY)诱导碱性成纤维生长因子（bFGF）及血管内皮生长因子（VEGF）等下游介质的表达来对血管发挥调节作用。NPY同时能让缺血组织的血管实现再通。上调NPY、Y2/Y5受体和DPPIV的表达，形成新的毛细血管，在阻塞的动脉形成新的肌动脉，NPY通过这种方式改善血流及患肢功能。但是神经肽是否能调控小直径生物人工血管的体内构建，尚不清楚。

发明内容

本发明针对小口径生物人工血管的巨大需求和面临的难题，首次将神经营养因子用于修饰生物人工血管。在技术上解决因子有效偶联并保持活性的技术难题，在功能上通过诱导内皮祖细胞主动捕获来促进内皮化，发挥抗血栓形成和内膜增生的关键作用。提供一种临床上血液透析、外周血管替代、冠脉搭桥可用的“现用型”小口径生物人工血管。为实现本发明的上述目的而采用的技术方案，即构建一种抗血栓形成和内膜增生的小口径生物人工血管，包括以下步骤：（1）制备血管基质材料：①以天然脱细胞血管基质材料作为支架材料，利用该支架材料采用传统制备生物人工血管支架的方法制备生物人工血管支架；或②采用胶原蛋白、蚕丝丝素或聚乳酸构成单组分的静电纺丝，或利用胶原蛋白/蚕丝丝素、蚕丝丝素/聚乳酸或胶原蛋白/聚乳酸构成双组分的静电纺丝，采用电纺丝技术制备生物人工血管支架；或③采用3D打印技术打印出生物人工血管支架。

（2）修饰血管基质材料：用70%-90%的N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯、0.5%-5%d弹性蛋白、10%-20%d胶原、0.05%-0.1%d肝素及0.005%-0.05%d RGD孵育所述生物人工血管支架。

（3）偶联神经营养因子：通过3-(2-吡啶二硫代)丙酸 N-琥珀酰亚胺酯或壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物或环糊精，与神经营养因子偶联经步骤（2）处理的生物人工血管支架，从而得到生物人工血管。

以上技术方案可以按照如下原理进行更具体地描述：

1、小口径血管支架材料的质量控制：①以天然脱细胞血管材料作为支架材料，采用有效的病毒灭活措施确保动物源性生物材料的安全性。在此基础上通过高效温和的脱细胞方法，有效脱去细胞，并通过酶法有效去除DNA、RNA等免疫原性成分，同时保留血管的弹力纤维、胶原纤维等细胞外基质的活性和功能。采用惯用的制备生物人工血管支架的方法制备出具有良好生物相容性，有效去除免疫原性，小口径（＜6mm）生物人工血管支架。②低温酶解除去异种动物来源的抗原，得到三螺旋结构的Ⅰ型胶原。成功制备高纯度具有光交联特性的生物胶原，以医用生物胶原为前驱体而生产制备已完全达到静电纺丝和血管材料要求。利用高纯度、高分子量的蚕丝丝素，进行胶原蛋白、蚕丝丝素及聚乳酸的单组分静电纺丝和胶原蛋白/蚕丝丝素、蚕丝丝素/聚乳酸、胶原蛋白/聚乳酸双组分静电纺丝。根据生物胶原与蚕丝丝素不同的溶解特性，经多次改进实验方法，实现将生物胶原与蚕丝丝素蛋白混纺的技术。③筛选可降解和高生物相容性的高分子物质，制备能快速成型的粉末状材料，根据临床需求可3D打印出任何口径和任何长度的生物人工血管支架。

2、血管支架材料的修饰：针对传统脱细胞支架材料力学性能不强的难题，采用N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯，0.5%-5%d弹性蛋白、10%-20%d胶原、0.05%-0.1%d肝素及0.005%-0.05%d RGD肽复合，运用快速成型技术制备成具有良好力学特性、适于原位血管再生的可控降解材料体系。

3、功能分子的有效偶联及表征： NGF是一个多功能多肽分子。针对NGF包含α、β、γ三个亚单位，活性区是β亚单位， 由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体。药用鼠源性NGF与人体NGF的结构具有高度的同源性，生物效应也无明显的种间特异性，现在广泛用于临床。通过3-(2-吡啶二硫代)丙酸 N-琥珀酰亚胺酯对神经因子进行偶联，加NGF与胶原分子有效偶联。并通过免疫荧光染色技术表征血管腔面所偶联到的NGF分子的数量和密度。BDNF 分子单体是由119 个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肽，主要由β折叠和无规N-级结构组成，含有3 个二硫键，为一种碱性蛋白质，分析表明BDNF 的氨基酸序列有相当一部分与NGF相同。同样采用3-(2-吡啶二硫代)丙酸 N-琥珀酰亚胺酯对神经因子进行偶联，BDNF与胶原分子有效偶联。并通过免疫荧光染色技术表征血管腔面所偶联到的BDNF分子的数量和密度。筛选可降解和高生物相容性的材料，如壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）或者环糊精等，将NPY通过化学交联、冷冻干燥或者紫外交联的方法制备出能快速成型的粉末状材料，进行3D打印。

本发明中神经因子修饰的小口径生物人工血管具有抗血栓形成和内膜增生的作用：首次发现NGF能够促进内皮祖细胞的动员和归巢，并诱导内皮祖细胞向内皮细胞分化。BDNF能够促进早期内皮祖细胞旁分泌从而诱导周围正常内皮细胞迁移并进一步诱导晚期内皮祖细胞归巢。在此基础上本发明所构建的神经营养因子修饰的生物人工血管能够主动捕获血液中循环的内皮祖细胞，并且诱导内皮祖细胞原位内皮化。内皮层发挥抗血小板聚集、抗内膜增生等生物功能，从而保持小口径生物人工血管通畅，并且具有明显的抗血栓形成和内膜增生的功能。NPY通过诱导毛细血管新生促进滋养血管渗入植入血管支架材料，从而为血管支架提供营养，促进植入血管存活并逐渐被宿主血管替代。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的内容作进一步说明：本发明所用材料和试剂均为市购产品，所用方法无特殊说明均为本领域常用方法。

1、血管支架材料制备：①在无菌条件下，取同种或异种个体的颈总动脉，用生理盐水将血液冲洗干净。在37℃，用胰酶脱细胞后用PBS清洗10次。再用RNA酶，DNA酶、脂肪酶去除核酸和脂肪，得到去除细胞和细胞外基质而保留血管胶原纤维和弹力纤维的血管基质材料。②用胶原辅助丝素以及聚乳酸，用电纺丝技术模拟血管三层结构可以编织达7层结构的任意管径血管管腔。

2、血管支架材料的修饰：对光交联材料进行再磺酸化和硫酸酯化成可降解的能控制药物释放及抗凝的材料。用70%-90%d的N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯、肝素等孵育血管支架材料。进一步获得切除具有抗原性尾肽的血管胶原与弹性纤维及抗凝材料复合，运用快速成型技术制备成具有良好力学特性、适于原位血管再生的可控降解材料体系。其缝合强度大于0.5N，拉伸应力大于7.5N，扯断伸长率大于20%，用生理盐水为介质，在相当于130 mmHg的压力下维持15秒，无渗漏现象。

3、功能分子修饰的生物人工血管制备：① 纳米控释材料的制备：主要是通过一种能控制药物释放的PLGA/壳聚糖的纳米颗粒来实现的，具体方法是利用水和油两相性的特点，将PLGA加入到含有5%-20%矿物油的水溶液中，之后搅拌18-24小时，高速离心分离出PLGA微球，冷冻干燥；将40-100mg的壳聚糖和10-30mg的神经因子溶于1-3%的冰醋酸溶液，搅拌均匀后， 缓慢的加入PLGA溶液，TPP等离子或者化学交流的方法制备包括有神经因子的PLGA/壳聚糖纳米颗粒。扫描电镜检测纳米缓释颗粒的形态，红外波谱扫描检测其包裹情况。②层层组装的方式构建生物人工血管：根据1制备的血管支架材料，孵育胶原18-48个小时，加入PLGA/壳聚糖的纳米颗粒，EDC交联24-48小时；之后100-300ng/ml浓度加入NGF、100-300ng/ml BDNF或100-300ng/ml NPY于4 mg/ml的胶原溶液中，孵育已经制备好的血管基质材料24-48小时，之后用5-10 mM EDC对孵育了胶原的血管基质材料进行交联，时间为24-48小时，然后用PBS清洗3-5次；交联了胶原的血管基质材料再放入2-8mg/ml agent N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP)溶液中作用2-4小时，用PBS洗涤3遍。③之后在10-30 mg/ml DTT溶液中作用30-50分钟。用PBS洗涤3遍。④再配制2-4% (v/v) 2-4 mg/ml SPDP 连接100-300ng/ml NGF、100-300ng/ml BDNF或100-300ng/ml NPY溶液，将血管基质材料放入其中作用24-48小时。用PBS洗涤3遍。

4、小口径生物人工血管体内构建：①将构建好的功能分子修饰的组织工程血管和对照组通过端端吻合移植到同种或异种的颈总动脉，用外科缝合线在显微镜下行端端吻合术，每组10例。②手术后，用多普勒血流仪测量移植组织工程血管的颈总动脉以及对侧健康颈总动脉的血流量。NGF修饰的小口径生物人工血管在体内主动捕获循环中的内皮祖细胞，并诱导内皮化，从而抗血栓形成和内膜增生。

实施例1.一种抗血栓形成和内膜增生的生物人工血管体内构建，按上述步骤1方法制备血管基质材料，步骤2修饰血管基质材料，按步骤3进行功能分子NGF偶联，按步骤4进行生物人工血管体内构建。

生物人工血管移植到大鼠颈动脉，1月后通过本发明制备的NGF修饰的生物人工血管保持通畅，平均血流量6.5ml/min，显著高于对照组。冰冻切片HE染色可见血管无血栓形成和内膜增生，对照组血栓形成并堵塞。免疫荧光染色显示内皮细胞连续。激光共聚焦显微镜下观察发现NGF修饰的生物人工血管内膜面内皮细胞形态正常，分布广泛。扫描电镜进一步显示血管已经实现了良好的内皮化。NGF修饰的小口径生物人工血管（内径=1mm)通过有效捕获内皮祖细胞，诱导植入血管更快更好的内皮化，从而保证了血管抗血栓形成和内膜增生，保持良好的通畅率。

实施例 2.一种高通畅的小口径生物人工血管体内构建，按上述步骤1方法制备血管基质材料，步骤2修饰血管基质材料，按步骤3进行功能分子脑源性神经营养因子BDNF偶联，按步骤4进行生物人工血管体内构建。

生物人工血管移植到大鼠颈动脉，2月后通过本发明制备的BDNF修饰的生物人工血管保持通畅，通畅率90%，对照组仅为10%。冰冻切片HE染色可见血管无血栓形成和内膜增生，对照组血栓形成并堵塞。免疫荧光染色显示内皮细胞连续，平滑肌细胞正常重建。激光共聚焦显微镜下观察发现BDNF修饰的生物人工血管内膜面内皮细胞形态正常，分布广泛，顺血流方向排列。扫描电镜进一步显示血管内皮化完整。

实施例3. 一种可被宿主替代并能长期通畅的小口径生物人工血管体内构建，按上述步骤1方法制备血管基质材料，步骤2修饰血管基质材料，按步骤3进行功能分子神经肽Y(NPY)偶联，按步骤4进行生物人工血管体内构建。

生物人工血管移植到大鼠颈动脉，6月后通过本发明制备的NPY修饰的生物人工血管保持通畅，对照组堵塞。冰冻切片HE染色可见血管无血栓形成和内膜增生，外膜中膜出现毛细血管。免疫荧光染色显示内皮细胞连续，平滑肌细胞正常重建，细胞外基质致密完整。Masson染色显示植入血管与正常血管相似。

实施例4. 一种可用于临床的小口径生物人工血管大动物体内构建，按上述步骤1方法制备血管基质材料，步骤2修饰血管基质材料，按步骤3进行功能分子神经生长因子NGF偶联，按步骤4进行生物人工血管体内构建。

生物人工血管移植到比格犬股动静脉之间作为股动静脉造瘘通路。5个月后生物人工血管仍然通畅，经CTA检测，血管造影完整，管腔光滑，无血栓无狭窄。扫描电镜显示血管内皮化良好，细胞形态正常，顺血流方向排列，细胞足生出，细胞间形成连结。冰冻切片HE染色进一步显示植入血管细胞化良好，平滑肌细胞长入，在体完成了体内构建。

实施例5. 一种可用于临床血液透析的小口径生物人工血管，按上述步骤1方法制备血管基质材料，步骤2修饰血管基质材料，按步骤3进行功能分子神经生长因子NGF偶联，按步骤4进行生物人工血管体内构建。

 生物人工血管用于血液透析病人上肢前臂动静脉造瘘，能够长时间保持通畅，并且耐受穿刺透析。穿刺后无渗血，植入血管迅速再生修复。

Claims (4)

1.一种抗血栓形成和内膜增生的小口径生物人工血管，其特征在于，由以下方法制备：

（1）制备血管基质材料：①以天然脱细胞血管基质材料作为支架材料，利用该支架材料采用传统制备生物人工血管支架的方法制备生物人工血管支架；或②采用胶原蛋白、蚕丝丝素或聚乳酸构成单组分的静电纺丝，或利用胶原蛋白/蚕丝丝素、蚕丝丝素/聚乳酸或胶原蛋白/聚乳酸构成双组分的静电纺丝，采用电纺丝技术制备生物人工血管支架；或③采用3D打印技术打印出生物人工血管支架；

（2）修饰血管基质材料：用70%-90%的N—磺酸—光交联—壳聚糖硫酸酯、0.5%-5%d弹性蛋白、10%-20%d胶原、0.05%-0.1%d肝素及0.005%-0.05%d RGD肽孵育所述生物人工血管支架；

（3）偶联神经营养因子：通过3-(2-吡啶二硫代)丙酸 N-琥珀酰亚胺酯或壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物或环糊精，与神经营养因子偶联经步骤（2）处理的生物人工血管支架，从而得到生物人工血管。

2.根据权利要求1所述一种抗血栓形成和内膜增生的小口径生物人工血管，其特征在于：所述天然脱细胞血管基质材料为将同种或异种个体的颈总动脉用胰酶脱细胞后，再用RNA酶、DNA酶和脂肪酶去除核酸和脂肪，从而得到保留血管胶原纤维和弹力纤维的天然脱细胞血管基质材料。

3.根据权利要求1所述一种抗血栓形成和内膜增生的小口径生物人工血管，其特征在于：所述神经营养因子为神经生长因子或脑源性神经生长因子或神经肽Y。

4.根据权利要求1所述一种抗血栓形成和内膜增生的小口径生物人工血管，其特征在于：所述步骤（2）处理后的生物人工血管支架，其缝合强度大于0.5N，拉伸应力大于7.5N，扯断伸长率大于20%，用生理盐水为介质，在相当于130 mmHg的压力下维持15秒，无渗漏现象。