CN104782270A - 一种青钱柳育种发芽方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青钱柳育种发芽方法，属于树木繁殖领域，其特征在于包括以下步骤：（1）碱化浸种处理；（2）振荡减压富氮处理；（3）催芽处理。与现有技术相比较，本发明的方法能促进青钱柳种子的萌发，获得较高的发芽率，且在相对低温环境下，能够获得较高的幼苗存活率。

Description

一种青钱柳育种发芽方法

技术领域

本发明为发明申请《一种提高青钱柳种子发芽率的方法》（申请号：2013104704786）的分案申请，涉及一种种子促萌发方法，特别是一种适用于山东地区种植培育的青钱柳种子促萌发方法。

背景技术

青钱柳（Cyclocarya paliurus Iljin.）是我国独有的单种属乔木植物，是国家重点保护的濒危植物之一，属三类保护植物。青钱柳树种用途广泛，是一种很有发展和开发利用前景的珍贵树种。研究发现青钱柳叶中不仅含有人体所必须的钾、钙、镁、磷等常量元素，而且还含有对人体保健有重要作用的微量元素如锰、铁、铜、锌、硒、铬、矾、锗等；从青钱柳叶片中提取的青钱柳甙I (cyclocarioside I )是目前世界上发现的40种具有甜味的天然化合物之一，具有很重要的研究应用价值；青钱柳嫩叶可代茶，叶中含有多糖类化合物、黄酮类化合物、齐墩果酸、乳香、萜类化合物，此外还含有机酸，生物碱，以及甾醇很多对人体有利的无机物质和有机物质，具有多种药用和保健功能。

青钱柳具有极高的保护和开发应用价值。但是，现有的青钱柳资源主要是天然林，不仅数量少，而且多零星分布于深山老林和一些自然保护区中。青钱柳种子具有深休眠习性，自然更生率低，人工扦插、栽培青钱柳成活率也不高，严重影响了青钱柳的开发利用与产业化进程。目前，国内外尚无大量人工繁殖和栽培青钱柳的成功经验，因此研究青钱柳的人工繁殖技术成为开发利用青钱柳的当务之急。

目前对青钱柳繁殖技术研究的探索主要包括有性繁殖和无性繁殖，但国内外对青钱柳的组织培养研究仍处于探索阶段，相关的研究仅获得了愈伤组织但未能诱导芽的形成，故而生产上一般仍用种子自然繁殖。

青钱柳果实为坚果，通称种子，呈扁球形，形如铜钱。青钱柳种子的种壳坚硬，一般播种后需1~3年萌发，自然发芽率低，仅为 0.1～0.2%。研究表明青钱柳种子具有深休眠特性。既往研究表明青钱柳种子休眠的因素多样化，属于综合性深休眠类型：坚硬外壳是导致其强迫休眠的主要原因，它既束缚了种胚，又影响了透气性，但仍具有透水性，其次，种子还存在着生理休眠，种皮在一定程度上阻碍了胚与外界的水气交换；同时，种皮内积累了大量的抑制物质，使幼胚进入深度休眠状态。因此，在有性繁殖方面，种子发芽技术一直是研究的重点和难点。近几年来众多学者对其进行了研究，人们除了对种子进行湿沙埋藏与温水浸泡等催芽外，还对种子采用低温层积、酸蚀和赤霉素处理，以提高种子的发芽率，缩短育苗周期。如采用外源赤霉素处理种子，不仅能提高种子出苗率，还能有效缩短育苗周期。但上述方案仍然存在以下缺陷：①GA₃（赤霉素）是我国目前农、林、园艺上应用最广泛的一种植物生长调节剂，主要用于促进作物的生长发育，提早成熟，提高产量和打破种子、块茎、鳞茎等器官的休眠，但是赤霉素的主要作用是促进细胞伸长，从而引起茎杆伸长和植株增高，在使用GA₃后若出现干旱等不利气候条件，由于GA₃带来的过速生长，则会加重幼苗的伤害，造成幼苗死亡，以上原因限制了在青钱柳种子的应用，仅仅限制于实验室研究领域；②依旧存在种子萌发时间不统一、种子发芽率难以有效大幅度提高等问题，限制了青钱柳遗传育种和生产应用；③青钱柳主要分布在安徽、江苏、浙江、江西、福建等地，在山东未见有生长，其原因也多在于萌发期和幼苗期，种子萌发和幼苗生长早期是对逆境的敏感时期，抗性较低。自然条件下，青钱柳萌发环境要求比较高，耐寒能力一般，喜温暖湿润气候。现有技术中：萌发为2～3月中旬，温度为14.0~20.0℃，继之在5月下旬至6月初，幼苗10～20cm高时定苗。但是同期山东地区的温度则为5~14℃，远远低于长江流域。但如果要是迁就萌发育苗温度，延后至4月中旬温度适宜时播种，则幼苗苗高还未达到10cm时，此时已进入夏季，高温炎热，且伴有伏旱，空气湿度较低，同时地下水位高，土壤排水性能较差，容易导致幼苗无法过夏导致死亡，即使采用蓬荫处理，苗木安然度过，但生长缓慢，甚至停滞。

因此，解除青钱柳种子休眠促进其萌发对青钱柳种质资源保藏与利用、青钱柳产业发展具有一定意义。

发明内容

本发明的技术任务是针对青钱柳种子深休眠、发芽慢、出苗率低的特性，提供一种青钱柳种子促萌发方法，能促进青钱柳种子的萌发，获得较高的发芽率。

本发明解决其技术问题的技术方案是：一种青钱柳育种发芽方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）碱化浸种处理：1000ml的清水中滴加浓度为1N的NaOH溶液将该溶液的pH值调整为8.2~8.6，应用该碱液浸泡预处理种子9h；

（2）振荡减压富氮处理：将步骤（1）得到的青钱柳种子放入密封的恒温清水水浴培养振荡器中，抽出部分空气，加入氮气，降低气压，达到气压为0.06~0.07MPa，氮气含量为85%~90%时，开始振荡处理，振荡处理温度30~40℃，振荡转速15~20r/min，时间0.5h，打开气阀充分换气，直至振荡器内气体为常压空气，保持震荡12h；

（3）催芽处理：将步骤（2）得到的青钱柳种子用15℃清水清洗、自然干燥，稻草盖好保温催芽，温度保持在20℃，湿度保持在60%，保存8天。

休眠是生活周期中的一个重要阶段，对植物具有重要的生态学意义，种子在有利生境中“正确”的时间萌发不仅有利于幼苗存活，而且可以使一个物种能够成功定居并且长期保持其种群。发明人研究发现，青钱柳种子休眠期长，发芽不整齐的原因在于其部分种子在适宜条件下仍保持休眠状态，也即同批次种子无论在什么条件下都不会一次完全萌发，该种推迟萌发现象通过时间上的扩散来降低种子萌发及幼苗建成过程中的死亡风险，保持种族延续，这是一种自然进化中出现的可避免种群灭绝的、谨慎的萌发对策。现有技术的研究主要集中在种皮透气性差和存在发芽抑制物质两个方向上：青钱柳种皮结构致密，透气性、透水性均差；发芽抑制物质在种胚内，随时间推移而逐渐通过种皮外渗消散；种皮在延迟萌发上起的作用，一方面是通过限制氧气的穿透而抑制了种子的萌发，另一方面阻碍发芽抑制物质的外渗消散。

而发明人的研究发现这种因素依据的物质基础是种皮物理结构的差异性，显微镜下青钱柳种子种皮切片显示，种皮内存在多条孔道，部分孔道内有团块样填充物。组织切片统计，同批次种子同时间点的团块样填充物反应点数量差异较大（P<0.05），同批次种子随时间点的推移团块样填充物反应点数量逐渐减少（P<0.05），单体种皮水浸泡前与断面蜡封水浸泡1小时后、断面蜡封草木灰溶液浸渍1小时后比较，组织切片统计显示填充物反应点数量差异无统计学意义（P>0.05）。可以据该基础实验研究结果推论出：该种孔道内团块样填充物是影响发芽抑制物质通过种皮外渗的因素，且同批次种子内团块样填充物含量的不同是造成发芽不整齐的原因。

目前的通用方法是：播种期在2～3月中旬，播种前浸种2d，再用稻草盖好保温催芽，温度保持在20-30℃。定时翻动拌匀，加淋40℃左右的热水，4-5d种子露白，宜选露白种子在2月中旬播种。也有报道，通过酸蚀方法催芽的种子发芽可提早15d左右，但是最高发芽率仍然不足60%，保存1年以内的种子发芽率不到50%。其原因在于，浸泡不能改变内团块样填充物含量，仅能对于原本团块样填充物含量已经下降的种子通过浸泡，加快种皮原渗出的发芽抑制物质消除，依旧存在种子萌发时间不统一、种子发芽率难以有效大幅度提高等问题，限制了青钱柳遗传育种和生产应用。

与现有技术相比较，本发明方法先对种实进行碱化浸种，继之振荡减压富氮催芽的处理方案，通过碱化破坏之前已经由种胚内通过种皮内无开放的团块样填充物填充的孔道外渗出的发芽抑制物质，之后通过减压富氮用以破坏团块样填充物物理化学结构，加速发芽抑制物质的外排，后恢复常压和空气供应，使种子得到良好的氧交换，并通过持续振荡使发芽抑制物质脱离种皮；经过上述处理的种子有效脱离了休眠抑制，在适宜的温度与光照下进行萌发。

与现有技术相比较，本发明处理时间短，可有效地诱发青钱柳种果的大量萌发，显著提高种子发芽率，提高出苗率，并具有培育时间短、发芽率高、成活率高等特点。且该种处理方案用于新种子（储存期一年以内的种子）同时有效，对于缩短青钱柳种苗种子繁育的生产周期具有实际意义。

以上有益效果均为实验所证实，实验方法及结果见具体实施方式。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进一步说明。

一、实验一：对于储存期在1年~2年的青钱柳种子。

（一）材料与方法。

1、采种：为2011年自南京采集成熟的青钱柳种子。

采集处理过程采用以下传统方式：果实采回后，立即冷水浸渍，搓去果皮，用水冲净，再将种子表面油脂用草木灰溶液浸渍，清水洗净阴干，然后在通风阴凉的室内沙藏。

2、育种萌发：2012年3月14日，在临沂莒南地区开始研究，温度16℃日/3℃夜。将种子随机分为5组：酸蚀对照组、碱液处理组、优化处理组、单纯浸种液组、优化处理+浸种液组，每组100粒。

2.1酸蚀对照组采用文献报道方法：

（1）浸种处理：应用浓硫酸浸泡种子9h；

（2）催芽处理：将步骤（1）得到的青钱柳种子用15℃清水清洗、自然干燥，稻草盖好保温催芽，温度保持在20℃，湿度保持在60%，保存10天。

2.2碱液处理组即为实施例1方案：

（1）浸种处理：1000ml的清水中滴加浓度为1N的NaOH溶液将该溶液的pH值调整为8.6，温度为30℃，应用该碱液浸泡预处理种子9h；

（2）催芽处理：将步骤（1）得到的青钱柳种子用15℃清水清洗、自然干燥，稻草盖好保温催芽，温度保持在20℃，湿度保持在60%，保存8天。

2.3优化处理组即为实施例2方案：

（1）碱化浸种处理：1000ml的清水中滴加浓度为1N的NaOH溶液将该溶液的pH值调整为8.6，应用该碱液浸泡预处理种子9h；

（2）振荡减压富氮处理：将步骤（1）得到的青钱柳种子放入密封的恒温清水水浴培养振荡器中，抽出部分空气，加入氮气，降低气压，达到气压为0.07MPa，氮气含量为85%时，开始振荡处理，振荡处理温度30℃，振荡转速20r/min，时间0.5h，打开气阀充分换气，直至振荡器内气体为常压空气，保持震荡12h；

（3）催芽处理：将步骤（2）得到的青钱柳种子用15℃清水清洗、自然干燥，稻草盖好保温催芽，温度保持在20℃，湿度保持在60%，保存8天。

2.4单纯浸种液组即为实施例3方案：

（1）浸种处理：应用温度为30℃的浸种液，进行浸种9h；

（2）催芽处理：将步骤（1）得到的青钱柳种子稻草盖好保温催芽，温度保持在20℃，湿度保持在60%，保存8天。

所述的浸种液的组成和制备方法为：将NaCl 0.6g、KCl 0.98g、CaCl₂·2H₂O 0.17g、MgCl₂·6H₂O 0.11g、甲基丙烯酸烷基醇聚氧乙烯酯 30mg、γ-氨基丁酸 40mg、虾黄质 0.2g加入到1000ml蒸馏水中制成混悬液

2.5优化处理+浸种液组即为实施例4方案：

（1）浸种处理：1000ml的清水中加入浸种液，应用该浸种液浸泡预处理种子9h；

（2）振荡减压处理：将步骤（1）得到的青钱柳种子放入密封的恒温清水水浴培养振荡器中，抽出部分空气，加入氮气，降低气压，达到气压为0.07MPa，氮气含量为85%时，开始振荡处理，振荡处理温度30℃，振荡转速20r/min，时间0.5h，打开气阀充分换气，保持震荡12h；

（3）催芽处理：将步骤（2）得到的青钱柳种子用15℃清水清洗、自然干燥，稻草盖好保温催芽，温度保持在20℃，湿度保持在60%，保存8天。

所述的浸种液的组成和制备方法为：将NaCl 0.6g、KCl 0.98g、CaCl₂·2H₂O 0.17g、MgCl₂·6H₂O 0.11g、甲基丙烯酸烷基醇聚氧乙烯酯 30mg、γ-氨基丁酸 40mg、虾黄质 0.2g加入到1000ml蒸馏水制成混悬液。

3、条播发芽：将上述各组处理后所得种子进行条播，播种沟宽4cm，深3cm，行距株距均为25cm，覆土厚度2cm，每天淋水保持床面含水量35％~40%。

15天过后测定各组发芽率，3个月后测定苗高大于10cm的株数。

（二）结果。

1、发芽率：由表1可以看出，5种不同处理方法对青钱柳当年种子发芽率的影响有很大差异。

1.1组间比较显示：碱液对照组发芽率高于酸蚀对照组，差异有统计学意义（P=0.047，卡方=3.934），表明采用碱性溶液处理破坏青钱柳种子种皮结构，可以促进其对水分吸收，但发芽率明显高于酸蚀对照组，表明其作用并不仅仅限于碱性破坏物理结构，并可能与其分解发芽抑制物质有关。

1.2组间比较显示：优化处理组（实施例2）发芽率高于碱液处理组，差异有统计学意义（P=0.015，卡方=5.882），表明采用碱化振荡减压富氮优化处理方法优于单纯碱化方案。其作用环节可能在于：通过碱化破坏之前已经由种胚内通过种皮内无开放的团块样填充物填充的孔道外渗出的发芽抑制物质，之后通过减压富氮用以破坏团块样填充物物理化学结构，加速发芽抑制物质的外排，后恢复常压和空气供应，使种子得到良好的氧交换，并通过持续振荡使发芽抑制物质脱离种皮；经过上述处理的种子有效脱离了休眠抑制，在适宜的温度与光照下进行萌发。

1.3组间比较显示：单纯浸种液组（实施例3）发芽率高于碱液处理组，差异有统计学意义（P=0.035，卡方=4.432），表明该种浸种液有助于促进种子萌发。其途径可能在于通过内外离子浓度渗透压的作用加速外渗；基础实验表明单体种皮甲基丙烯酸烷基醇聚氧乙烯酯溶液浸泡前与断面蜡封甲基丙烯酸烷基醇聚氧乙烯酯溶液浸泡1小时后比较，组织切片统计显示填充物反应点数量减少23.47%；虾黄质有助于增加该种化学刺激下种皮下组织的稳固性，而γ-氨基丁酸的作用也在于增加种皮对环境的适应性。

1.4组间比较显示：优化处理组（实施例2）发芽率高于单纯浸种液组（实施例3），差异无统计学意义（P=0.743，卡方=0.107），表明采用碱化振荡减压富氮优化处理方法与该种浸种液促萌发效果相当。

1.5组间比较显示：优化处理+浸种液组（实施例4）发芽率高于优化处理组（实施例2），差异有统计学意义（P=0.027，卡方=4.878）。

1.6组间比较显示：优化处理+浸种液组（实施例4）发芽率高于单纯浸种液组（实施例3），差异有统计学意义（P=0.012，卡方=6.368）。本方案为最佳优化方案，说明青钱柳种子应用所述的浸种液配合振荡减压双重优化处理，能够更快的打破休眠抑制，促进萌发，具有培育时间短、发芽率高、成活率高的特点。

2、条播3个月后苗高大于10cm株数百分率比较：由表1可以看出，碱液处理组（实施例1）青钱柳当年种子均明显高于酸蚀对照组（P<0.05），而优化处理组（实施例2）、单纯浸种液组（实施例3）、优化处理+浸种液组（实施例4）与酸蚀对照组比较，则差异极明显（P<0.01）。

表1 各处理方法对于青钱柳新种子的萌发影响

组号	处理	发芽率（%）	苗高>10cm比率（%）
				1	酸蚀对照组	46	41
2	碱液处理组	60	53
				3	优化处理组	76	73
4	单纯浸种液组	74	72
				5	优化处理+浸种液组	88	85

二、实验二：对于储存期在1年~2年的青钱柳种子。

（一）材料与方法

1、采种：为2011年自南京采集成熟的青钱柳种子。

采集处理过程采用以下传统方式：果实采回后，立即冷水浸渍，搓去果皮，用水冲净，再将种子表面油脂，用草木灰溶液浸渍，清水洗净阴干，然后在通风阴凉的室内沙藏。

2、育种萌发：2013年3月15日，在临沂莒南地区开始研究，温度14℃日/4℃夜。将种子随机分为5组：酸蚀对照组、碱液处理组、优化处理组、单纯浸种液组、优化处理+浸种液组，每组100粒。

2.1酸蚀对照组采用文献报道方法：

（1）浸种处理：应用浓硫酸浸泡种子9h；

（2）催芽处理：将步骤（1）得到的青钱柳种子用15℃清水清洗、自然干燥，稻草盖好保温催芽，温度保持在20℃，湿度保持在60%，保存10天。

2.2碱液处理组即为实施例5方案：

（1）浸种处理：1000ml的清水中滴加浓度为1N的NaOH溶液将该溶液的pH值调整为8.2，温度为30℃，应用该碱液浸泡预处理种子9h；

（2）催芽处理：将步骤（1）得到的青钱柳种子用15℃清水清洗、自然干燥，稻草盖好保温催芽，温度保持在20℃，湿度保持在60%，保存8天。

2.3优化处理组即为实施例6方案：

（1）碱化浸种处理：1000ml的清水中滴加浓度为1N的NaOH溶液将该溶液的pH值调整为8.2，应用该碱液浸泡预处理种子9h；

（2）振荡减压富氮处理：将步骤（1）得到的青钱柳种子放入密封的恒温清水水浴培养振荡器中，抽出部分空气，加入氮气，降低气压，达到气压为0.06MPa，氮气含量为90%时，开始振荡处理，振荡处理温度40℃，振荡转速15r/min，时间0.5h，打开气阀充分换气，直至振荡器内气体为常压空气，保持震荡12h；

（3）催芽处理：将步骤（2）得到的青钱柳种子用15℃清水清洗、自然干燥，稻草盖好保温催芽，温度保持在20℃，湿度保持在60%，保存8天。

2.4单纯浸种液组即为实施例7方案：

（1）浸种处理：应用温度为30℃的浸种液，进行浸种9h；

（2）催芽处理：将步骤（1）得到的青钱柳种子稻草盖好保温催芽，温度保持在20℃，湿度保持在60%，保存8天。

所述的浸种液的组成和制备方法为：将NaCl 0.6g、KCl 0.98g、CaCl₂·2H₂O 0.17g、MgCl₂·6H₂O 0.11g、甲基丙烯酸烷基醇聚氧乙烯酯 30mg、γ-氨基丁酸 40mg、虾黄质 0.2g加入到1000ml蒸馏水中制成混悬液。

2.5优化处理+浸种液组即为实施例8方案：

（1）浸种处理：1000ml的清水中加入浸种液，应用该浸种液浸泡预处理种子9h；

（2）振荡减压处理：将步骤（1）得到的青钱柳种子放入密封的恒温清水水浴培养振荡器中，抽出部分空气，达到气压为0.06MPa，开始振荡处理，振荡处理温度40℃，振荡转速10r/min，时间0.5h，打开气阀充分换气，保持震荡12h；

（3）催芽处理：将步骤（2）得到的青钱柳种子用15℃清水清洗、自然干燥，稻草盖好保温催芽，温度保持在20℃，湿度保持在60%，保存8天。

所述的浸种液的组成和制备方法为：将NaCl 0.6g、KCl 0.98g、CaCl₂·2H₂O 0.17g、MgCl₂·6H₂O 0.11g、甲基丙烯酸烷基醇聚氧乙烯酯 30mg、γ-氨基丁酸 40mg、虾黄质 0.2g加入到1000ml蒸馏水制成混悬液。

3、条播发芽：将上述各组处理后所得种子进行条播，播种沟宽4cm，深3cm，行距株距均为25cm，覆土厚度2cm，每天淋水保持床面含水量35％~40%。

15天过后测定各组发芽率，3个月后测定苗高大于10cm的株数。

（二）结果。

1、发芽率：由表2可以看出，5种不同处理方法对青钱柳种子发芽率的影响有很大差异。

1.1组间比较显示：碱液对照组（实施例5）发芽率高于酸蚀对照组，差异有统计学意义（P=0.036，卡方=4.367）。

1.2组间比较显示：优化处理组（实施例6）发芽率明显高于酸蚀对照组，差异有明显统计学意义（P<0.001，卡方=12.718）。

1.3组间比较显示：单纯浸种液组（实施例7）发芽率明显高于酸蚀对照组，差异有明显统计学意义（P<0.001，卡方=13.987）。

1.4组间比较显示：优化处理组（实施例6）、单纯浸种液组（实施例7）发芽率高于碱液对照组（实施例5），但是该差别无统计学意义（P>0.05）；优化处理组（实施例6）与单纯浸种液组（实施例7）之间比较，差别不明显（P>0.05）；

1.5组间比较显示：优化处理+浸种液组（实施例8）发芽率明显高于碱液对照组（实施例5），差异有统计学意义（P=0.004，卡方=8.317），但与优化处理组（实施例6）、单纯浸种液组（实施例7）之间差别不明显（P>0.05）。

3、条播3个月后苗高大于10cm株数百分率比较：由表2可以看出，碱液对照组（实施例5）青钱柳种子比率均明显高于酸蚀对照组（P<0.05），而优化处理组（实施例6）、单纯浸种液组（实施例7）、优化处理+浸种液组（实施例8）与酸蚀对照组比较，则差异极明显（P<0.01）。

表2 各处理方法对于青钱柳旧种子的萌发影响

组号	处理	发芽率（%）	苗高>10cm比率（%）
				6	酸蚀对照组	59	54
7	碱液处理组	73	68
				8	优化处理组	82	78
9	单纯浸种液组	83	79
				10	优化处理+浸种液组	89	88

（三）结论。

本发明中所涉及的一种青钱柳种子促萌发方法，能促进青钱柳种子的萌发，获得较高的发芽率，且在相对低温环境下，能够获得较高的幼苗存活率。

本发明操作简单、标准统一、易于掌握、经济适用，既适用于科学研究中的小量青钱柳种子样品实验，也适用于生产过程中大量青钱柳种子处理。

需要说明的是，本发明的特定实施方案已经对本发明进行了详细描述，对于本领域的技术人员来说，在不背离本发明的精神和范围的情况下对它进行的各种显而易见的改变都在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种青钱柳育种发芽方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）碱化浸种处理：1000ml的清水中滴加浓度为1N的NaOH溶液将该溶液的pH值调整为8.2~8.6，应用该碱液浸泡预处理种子9h；

（2）振荡减压富氮处理：将步骤（1）得到的青钱柳种子放入密封的恒温清水水浴培养振荡器中，抽出部分空气，加入氮气，降低气压，达到气压为0.06~0.07MPa，氮气含量为85%~90%时，开始振荡处理，振荡处理温度30~40℃，振荡转速15~20r/min，时间0.5h，打开气阀充分换气，直至振荡器内气体为常压空气，保持震荡12h；

（3）催芽处理：将步骤（2）得到的青钱柳种子用15℃清水清洗、自然干燥，稻草盖好保温催芽，温度保持在20℃，湿度保持在60%，保存8天。