CN104777316B - 一种基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法 - Google Patents

一种基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于材料科学与工程和微流控芯片技术领域，具体来说是一种基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法。首先对纸芯片基底表面进行氨基改性，并使表面带有羧基的CdTe量子点，而后将量子点接枝到纸芯片表面，再采用溶胶凝胶法与表面印迹技术在纸芯片的表面合成蛋白质印迹层，洗脱掉模板分子并将芯片固定在具有喷蜡微流通道的纸上，即得到蛋白质印迹纸芯片。本发明兼具快速、便携、经济、高灵敏等优势，提供了一种藻蓝蛋白检测新策略，丰富了纸芯片相关研究。

Description

一种基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法
技术领域
本发明属于材料科学与工程和微流控芯片技术领域，具体来说是一种基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法。
背景技术
微流控芯片技术是把化学、生物、医学分析等过程中的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析过程。微流控纸芯片作为微流控芯片的一个重要分支，目前被广泛应用到许多领域；纸作为分析的基底材料有成本低廉、生物相容性好、可降解、化学性能良好等优点。通过在纸芯片上构建微流通道，试样可以在设计的通道内通过毛细作用力流动，不需要借助外部动力，可自动驱动待测样品。在现场检测和经济欠发达地区，纸芯片有着很好的应用前景。关于纸芯片的检测手段主要有比色法、电化学法、化学发光和荧光等。目前以比色和电化学法研究比较多。这是因为在传统的化学反应中，关于比色和电化学法的研究体系比较多。借助成型的检测手段，纸芯片可以应用到不同的领域。作为新型的纳米荧光材料，量子点因具有荧光特性和量子效应激起了广大研究人员的兴趣。目前，将量子点用于高选择性、高特异性标记细胞和生物分子的技术上，对非特异性背景进行弱化等，取得了巨大的进步。将其作为具有良好荧光效果的信号材料，与纸芯片作为微管路系统相结合形成荧光型微流控纸芯片，用于快速识别和测定蛋白质有着巨大的应用潜力。
在蛋白质分析技术中，蛋白质芯片是一种高通量、微型化和自动化的新型分析手段。目前蛋白质芯片主要分两种:一种是微流控电泳芯片，通过在玻璃片或硅片上设置各种微泵、微阀、微电泳以及微流路，可将生化实验室的分析功能浓缩固化在蛋白质芯片上，然后在电场作用下，样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来，经喷雾直接进入质谱仪中进行检测，以确定样品中蛋白质的分子量及种类；另一种就是通过在固相支持物表面高密度排列的探针蛋白点阵，特异地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。通过纸芯片将蛋白质富集在待测区，蛋白质通过共振能量转移、表面吸附、电荷转移等方式可以实现对量子点荧光的猝灭，同时通过结合分子印迹技术对其进行选择性识别，因此可以通过荧光的变化实现对蛋白质的选择性识别和定量检测。因此，具有良好荧光效果的量子点和具有优异选择性的印迹材料相结合，在纳米技术、生物医疗技术和环境监测等领域都有着强大的生命力和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法，首先对纸芯片基底表面进行氨基改性，并使表面带有羧基的CdTe量子点，而后将量子点接枝到纸芯片表面，再采用溶胶凝胶法与表面印迹技术在纸芯片的表面合成蛋白质印迹层，洗脱掉模板分子并将芯片固定在具有喷蜡微流通道的纸上，即得到蛋白质印迹纸芯片。
进一步是，将纸芯片基底纸加入至乙醇水溶液中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷充分振荡反应，使基底纸表面带有氨基；而后将改性的基底纸加入经盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化的量子点溶液，室温避光搅拌反应，使得量子点接枝到纸芯片的表面；再以溶胶凝胶法在经过量子点改性的纸芯片表面进行印迹，以藻蓝蛋白为模板分子在纸芯片的表面合成蛋白质印迹层，洗脱掉模板分子藻蓝蛋白并将芯片固定在具有喷蜡微流通道的纸上，即得到蛋白质印迹纸芯片。
更进一步的说是：
a.纸芯片基底纸的改性：将纸芯片分散在乙醇和水的混合溶液中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，使其充分振荡反应，使得纸表面带有氨基，再用二次水进行清洗，待用；
b.CdTe量子点的合成：将碲粉和硼氢化钠混合，然后加入乙醇，再加入二次水，密闭加热恒温反应，待用；
将硝酸镉溶解在二次水中，并加入改性剂进行改性，而后用氢氧化钠溶液调节pH8-12，通氮除氧；而后加入将上述反应所得碲粉产物的上清液，氮气保护下回流，即得到黄绿色的CdTe量子点；
c.纸芯片表面接枝：将上述步骤a改性后纸芯片缓慢加入经盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化的量子点溶液，室温避光搅拌反应，使得量子点接枝到纸芯片的表面；
d.印迹壳层的制备：将步骤c表面上述接枝量子点的纸芯片浸泡至过量的磷酸盐缓冲溶液中，加入模板分子藻蓝蛋白和功能单体3-氨丙基三乙氧基硅烷，避光搅拌，使其充分结合，之后加入催化剂和交联剂，室温反应、洗涤，即形成印迹壳层；而后用曲拉通X-100溶液振荡洗脱，去除模板分子藻蓝蛋白，再用二次水漂洗；
e.固定芯片：将含有分子印迹改性功能的纸芯片修剪后固定在经喷蜡疏水处理含有流路通道的纸芯片中，含有流路通道的纸芯片可以进行试剂的引入和样品运输，最终得到基于量子点的印迹纸芯片。
所述步骤a.纸芯片基底纸的改性：取纸芯片基底纸分散在过量的乙醇和水的混合溶液中(乙醇和水按1:1，v/v)，然后加入乙醇和水混合溶液2-3倍的3-氨丙基三乙氧基硅烷，让其充分振荡反应1-2h，使得纸表面接有氨基，而后用过量二次水进行清洗3-8遍，将多余的3-氨丙基三乙氧基硅烷洗净。
所述步骤b.CdTe量子点的合成，可按照如下方式制备，也可按照文献中记载获得，
1)取碲粉和硼氢化钠加入到尖底黄盖瓶中，先加入乙醇，再加入二次水，迅速盖上盖子，使体系密闭，在盖子上插一根针头，在针头上用水进行液封隔氧，放在30-50℃恒温反应，反应3-5h，至黑色的碲粉完全消失，上清液为淡紫色为止；其中，碲粉和硼氢化钠按质量比为1:1-1.5混合，先加入适量的乙醇，再加入少量二次水；
2)把碲粉质量2-3倍的硝酸镉加入到的适量二次水中，然后再加入适量巯基乙酸，再用氢氧化钠溶液将pH调到9-11，用氮气吹10-30min除氧，待用；
3)将步骤1)反应获得碲粉产物的上清液加入到步骤2)获得含硝酸镉的溶液中，氮气保护下回流1-3小时，即可得到黄绿色的量子点；
所述步骤c.纸芯片表面接枝：上述合成的纸芯片2片，缓慢滴加量子点、盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温避光搅拌反应4-8小时，使得量子点接枝到纸芯片的表面，将反应产物分别用二次水、pH＝7.5的低浓度磷酸盐缓冲溶液漂洗3-5遍。
所述步骤d.印迹壳层的制备：取上述接枝量子点纸芯片，加入pH＝7.5的磷酸盐缓冲溶液，再加入的藻蓝蛋白和缓冲溶液1.5倍体积的的3-氨丙基三乙氧基硅烷，避光振荡25-35min，使其充分结合之后，分别加入磷酸盐缓冲溶液1.5倍体积的氨水和四乙氧基硅烷，反应10-14小时，用二次水清洗3-5遍，即形成印迹壳层。
所述步骤e.模板分子的洗脱：将上述所得印迹纸芯片用1％的曲拉通X-100溶液振荡清洗，将模板分子洗脱，然后用二次水离心漂洗、干燥。
本发明是对纸芯片基底表面进行氨基改性，并使表面带有羧基的CdTe量子点，而后将量子点接枝到纸芯片表面，以溶胶凝胶法在经过量子点改性的纸芯片表面进行印迹，以藻蓝蛋白为模板分子，将该含有分子印迹改性功能的纸芯片裁剪到合适大小，固定在经喷蜡疏水处理含有流路通道的纸芯片中，含有流路通道的纸芯片可以进行试剂的引入和样品运输，分子印迹作为选择识别单元和量子点作为信号单元，通过电子转移和表面吸附作用，当纸芯片上引入藻蓝蛋白之后，其被运输到经过量子点改性的纸芯片表面，量子点的荧光随蛋白的浓度增加而减弱，可以实现蛋白的定量检测。
本发明所具有的优点：
本发明将纸芯片技术、量子点和分子印迹技术相结合制备基于量子点的蛋白质印迹纸芯片，用于藻蓝蛋白的高效识别与高灵敏荧光检测。形成蛋白质印迹层后，由于电子转移和表面吸附作用，当加入藻蓝蛋白之后，量子点的荧光随蛋白的浓度增加而减弱，据此可实现对藻蓝蛋白的高效识别与高灵敏荧光检测。系统考察了该印迹芯片对藻蓝蛋白的分析性能，相比其它蛋白对藻蓝蛋白显示出很高的选择性吸附能力；相对于非印迹聚合物，对藻蓝蛋白有着更高的识别选择性和稳定性。本发明兼具快速、便携、经济、高灵敏等优势，提供了一种藻蓝蛋白检测新策略，丰富了纸芯片相关研究。
附图说明
图1为本发明实施例提供的蛋白质印迹纸芯片制备过程示意图，印迹纸芯片的实物图。
图2为本发明实施例提供的扫描电镜图:A：纤维素纸；B:接枝有量子点的纤维素纸；C、D蛋白质印迹纸芯片。
图3为本发明实施例提供的蛋白质印迹纸芯片同一批次6张纸的稳定性。
图4为本发明实施例提供的蛋白质印迹纸芯片同一张纸上20个点的稳定性。
图5为本发明实施例提供的蛋白质印迹纸芯片对藻蓝蛋白溶液的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
a.纤维素纸的改性：用刀裁剪长×宽为1.2cm×1cm的4片纤维素纸芯片，取纤维素纸分散在20mL乙醇和水的混合溶液中(1:1，v/v)，然后加入200μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，让其充分振荡反应1h，使得纤维纸表面接有氨基。用二次水进行清洗3遍，将多余的3-氨丙基三乙氧基硅烷洗净。
b.CdTe量子点的合成：称取38.3mg的碲粉和40mg的硼氢化钠加入到2mL的尖底黄盖瓶中，先加入1.5mL的乙醇，再加入0.5mL的去离子水，迅速盖上盖子，使体系密闭，在盖子上插一根针头，在针头上用去离子水进行液封隔氧。40℃恒温反应4h，至黑色的碲粉完全消失，上清液为淡紫色为止。同时把92.4mg的硝酸镉加入到75mL的去离子水中，然后加入63μL的巯基乙酸，再用1mol/L的氢氧化钠溶液将pH调到9.2，用氮气吹20min除氧，而后加入上述反应所得碲粉产物的淡紫色上清液1mL，并在氮气保护下回流2h，即可得到黄绿色的量子点。
c.纸芯片表面接枝：取上述所得合成的纸芯片2片，缓慢滴加10mL量子点、6mL的20mg/mL的盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、6mL的10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温避光搅拌反应6h，使得量子点接枝到纸芯片的表面，将反应产物分别用二次水、pH＝7.5的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液漂洗3-5遍，
d.印迹壳层的制备：取上述接枝量子点纸芯片，加入30mL的pH＝7.5的磷酸盐缓冲溶液，再加入5mg的藻蓝蛋白和40μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，避光振荡30min，使其充分结合之后，加入50μL的氨水和50μL的四乙氧基硅烷，反应12h，用二次水清洗3-5遍，即形成印迹壳层。
e.模板分子的洗脱：将上述所得印迹纸芯片用30mL的1％的曲拉通X-100溶液振荡清洗，将模板分子洗脱，然后用二次水离心漂洗、干燥。
f.固定芯片：将含有分子印迹改性功能的纸芯片裁剪到3×3mm合适大小，固定在经喷蜡疏水处理含有流路通道的纸芯片中，含有流路通道的纸芯片可以进行试剂的引入和样品运输，最终得到基于量子点的印迹纸芯片。为简便起见，记为MIP(参见图1)。
非印迹聚合物制备：按照上述操作规程，除了不加模板分子藻蓝蛋白之外，其他步骤同上，记为NIP。
MIP为含有藻蓝蛋白模板分子的印记材料，NIP为不含藻蓝蛋白模板分子的印记材料，也就是空白对照样品。
实施例2
分别将纤维素纸、接有量子点的纤维素纸、含有藻蓝蛋白的印迹纸芯片放在真空干燥箱中40℃干燥6h之后，进行喷金处理，将样品用扫描电镜进行观察(参见图2A-图2D)。如图2A所示，可以看到纤维素纸表面有明显的纤维素结构；图2B显示纤维素纸表面接有很多小点，颗粒比较均匀，说明CdTe量子点已经接枝在二氧化硅粒子上，并且CdTe量子点在纤维素纸载体上分布比较均匀。如图2C、D所示，通过溶胶凝胶法修饰之后，表面形成了一层明显的印迹层；并且，经过修饰之后，该印迹纸芯片仍具有良好的荧光性能，如图2D插图所示。
实施例3
取同一批次的6张的蛋白质印迹纸芯片，取50ul的磷酸盐缓冲溶液滴加到上样区，当溶液通过亲水通道到达待测区，使其平衡3min，然后用荧光仪测定每张纸芯片的荧光强度。如图3所示，纸芯片的荧光强度变化不大，相对标准偏差RSD小于13％，重现性比较好。然后测定同一张芯片上20个不同检测位点，得到其相应的荧光强度如图4所示。其信号值变化也相差不大，说明同一张纸上的接枝还是比较均匀，有着较好的重现性。
实施例4
取6张同一批次的蛋白质印迹纸芯片，配制浓度分别为为0、10、20、30、40、50mg/L的藻蓝蛋白溶液，取50μl的不同浓度的藻蓝蛋白溶液滴加到样品的待测区，当溶液通过亲水通道到达待测区，使其平衡3min，然后用荧光仪测定每张纸芯片的荧光强度。如图5所示，随着浓度的增大时，蛋白质印迹纸芯片的荧光强度逐渐下降，并有一定的线性关系，从而可以通过荧光强度的变化，实现藻蓝蛋白浓度的变化。

Claims (7)

1.一种基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法，其特征在于：首先对纸芯片基底纸表面进行氨基改性，而后将表面带有羧基的CdTe量子点接枝到纸芯片表面，再采用溶胶凝胶法与表面印迹技术在纸芯片的表面合成蛋白质印迹层，洗脱掉模板分子并将所得纸芯片固定在具有喷蜡微流通道的纸芯片中，即得到基于量子点的蛋白质印迹纸芯片；
具体为：将纸芯片基底纸加入至乙醇水溶液中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷充分振荡反应，使基底纸表面带有氨基；而后将改性的基底纸加入表面带有羧基的CdTe量子点溶液、盐酸1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温避光搅拌反应，使得CdTe量子点接枝到纸芯片的表面；再以溶胶凝胶法在经过CdTe量子点改性的纸芯片表面进行印迹，以藻蓝蛋白为模板分子在纸芯片的表面合成蛋白质印迹层，洗脱掉模板分子藻蓝蛋白并将所得纸芯片固定在具有喷蜡微流通道的纸芯片中，即得到基于量子点的蛋白质印迹纸芯片。
2.按权利要求1所述的基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法，其特征在于：
a. 纸芯片基底纸的改性：将纸芯片基底纸分散在乙醇和水的混合溶液中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，使其充分振荡反应，使得基底纸表面带有氨基，再用二次水进行清洗，待用；
b. CdTe量子点的合成：将碲粉和硼氢化钠混合，然后加入乙醇，再加入二次水，密闭加热恒温反应，待用；
将硝酸镉溶解在二次水中，并加入改性剂进行改性，而后用氢氧化钠溶液调节pH8-12，通氮除氧；而后加入将上述反应所得碲粉产物的上清液，氮气保护下回流，即得到黄绿色的CdTe量子点；
c. 纸芯片表面接枝：将上述步骤a改性后的纸芯片基底纸缓慢加入表面带有羧基的CdTe量子点溶液、盐酸1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温避光搅拌反应，使得CdTe量子点接枝到纸芯片的表面；
d. 印迹壳层的制备：将步骤c得到的上述表面接枝CdTe量子点的纸芯片浸泡至过量的磷酸盐缓冲溶液中，加入模板分子藻蓝蛋白和功能单体3-氨丙基三乙氧基硅烷，避光振荡，使其充分结合，之后加入催化剂和交联剂，室温反应、洗涤，即形成印迹壳层；
e．模板分子的洗脱：将步骤d所得纸芯片用曲拉通X-100溶液振荡洗脱，去除模板分子藻蓝蛋白，再用二次水漂洗，干燥；
f. 固定芯片：将所得的分子印迹改性的纸芯片修剪后固定在经喷蜡疏水处理含有流路通道的纸芯片中，含有流路通道的纸芯片可以进行试剂的引入和样品运输，最终得到基于量子点的蛋白质印迹纸芯片。
3. 按权利要求2所述的基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤a. 纸芯片基底纸的改性：取纸芯片基底纸分散在过量的乙醇和水的混合溶液中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，让其充分振荡反应1-2h，使得基底纸表面接有氨基，而后用过量二次水进行清洗3-8遍，将多余的3-氨丙基三乙氧基硅烷洗净，待用。
4. 按权利要求2所述的基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤b. CdTe量子点的合成：
1）取碲粉和硼氢化钠加入到尖底黄盖瓶中，先加入乙醇，再加入二次水，迅速盖上盖子，使体系密闭，在盖子上插一根针头，在针头上用水进行液封隔氧，放在30-50℃恒温反应，反应3-5h，至黑色的碲粉完全消失，上清液为淡紫色为止；其中，碲粉和硼氢化钠按质量比为1:1-1.5混合，先加入适量的乙醇，再加入少量二次水；
2）把碲粉质量2-3倍的硝酸镉加入到的二次水中，然后再加入巯基乙酸，再用氢氧化钠溶液将pH调到9-11，用氮气吹10-30min除氧，待用；
3）将步骤1）反应获得碲粉产物的上清液加入到步骤2）获得含硝酸镉的溶液中，氮气保护下回流1-3小时，即可得到黄绿色的CdTe量子点。
5. 按权利要求2所述的基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤c. 纸芯片表面接枝：步骤a改性的基底纸2片，缓慢滴加CdTe量子点溶液、盐酸1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温避光搅拌反应4-8小时，使得CdTe量子点接枝到纸芯片的表面，将反应产物分别用二次水、pH=7.5的低浓度磷酸盐缓冲溶液漂洗3-5遍。
6. 按权利要求2所述的基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤d. 印迹壳层的制备：取步骤c所得表面接枝CdTe量子点纸芯片，加入过量的pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液浸泡，再加入藻蓝蛋白和3-氨丙基三乙氧基硅烷，避光振荡25-35min，使其充分结合之后，分别加入氨水和四乙氧基硅烷，室温反应10-14小时，用二次水清洗3-5遍，即形成印迹壳层。
7. 按权利要求2所述的基于量子点的蛋白质印迹纸芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤e. 模板分子的洗脱：将上述所得纸芯片用1%的曲拉通X-100溶液振荡清洗，将模板分子洗脱，然后用二次水离心漂洗、干燥。
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