CN104777161B - 一种固定化微胶囊检测阵列及其加工方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种便携、易操作、防污染的固定化微胶囊检测阵列及其制作方法和应用。所述阵列的原料包括衬底、检测试剂溶液、光敏聚合胶以及限制液体胶的挡板。其由以下方法制作：检测试剂溶液以液体形式由移液器滴加于放置在提供零下低温(<0℃)的衬底上，并迅速冻成冰，待稳定的冰完全形成后，用挡板限制冰形成的区域，将液态的光敏聚合胶倾倒于冰上，使用相对应波长的光源进行照射，使液态胶聚合完成封装过程。采用移液器将检测试剂输滴加于衬底上的特定区域，无需引入微泵、微阀等流动系统，有效地降低了加工成本，并且具有操作简单、通量高、效率高等优势。

Description

一种固定化微胶囊检测阵列及其加工方法和应用

技术领域

本发明涉及一类基于冰打印技术的新型固定化微胶囊检测阵列的加工方法及其在目标物的可视化检测方面的应用。

背景技术

目前已经发展的检测阵列芯片，检测过程中试剂长时间暴露于光照条件或空气中，带来一些弊端，如在光照条件下试剂可能显色或吸收空气中的氮氧化合物而使得试剂空白值增高；一些毒性较大的试剂对操作人员的健康和安全造成威胁；无法有效地隔绝外界的污染物。同时，一般的阵列检测仪器如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄像机价格较为昂贵、体积庞大，不利于检测方法的推广与普及，提高了检测的成本。

因此，发展安全性高、防污染、检测过程简便、成本低的检测阵列是高通量的生化分析检测领域急需要解决的问题。

微胶囊化技术通过成膜物质将分散的固体、液体或气体包裹起来，形成囊内空间与囊外空间隔离开的微小粒子微胶囊，包在微胶囊内部的物质称为“囊心”。囊心种类多样，如药物、染料、纳米微粒和活细胞等都可作为囊心被包埋。微胶囊依靠囊壁的屏蔽作用可以有效地保护囊心物质免受环境因素(如光、热、温度、压力、氧等)的不利影响而变质，减少了囊心物质向环境的扩散和蒸发，因而提高了囊心的稳定性，延长了贮存期，并且改变物态利于携带与运输。微胶囊的这些优点为解决检测阵列芯片的弊端提供了有力的支持。

但由于常规的微胶囊化方法侧重于提高微胶囊的分散性，分散的微胶囊很难进行固定化，无法制备结构较稳定的微胶囊阵列，极大地限制了微胶囊化技术在加工检测阵列芯片方面的应用。

因此，发展固定化微胶囊阵列检测技术对于改善检测阵列芯片的安全系和稳定性非常必要。

发明内容

本发明基于现有检测阵列芯片的缺点，提供一种安全性高、防污染、低成本的新型固定化微胶囊检测阵列的制作方法以及该方法在目标物的可视化检测方面的应用。

本发明利用软刻的加工思想将液态的聚合物的前体倾倒于成冰的检测溶液之上，然后进行光聚合形成位置确定的微胶囊，达到预封装试剂的目的，同时实现了微胶囊的固定化，从而可以制备一种新型的高通量、多目标、低成本的固定化微胶囊检测阵列，以满足现场、即时、便携的目标检测需求。

为了实现本发明目的，本发明的一种固定化微胶囊检测阵列，包括衬底、检测试剂溶液、光敏聚合胶以及限制液体胶的挡板。

所述检测阵列由以下方法制作：检测试剂溶液以液体形式由移液器滴加于放置在提供零下低温(<0℃)的衬底上，并迅速冻成冰，待稳定的冰完全形成后，用挡板限制冰形成的区域，将液态的光敏聚合胶倾倒于冰上，使用相对应波长的光源进行照射，使液态胶聚合完成封装过程。

上述检测阵列中：

所述衬底为疏水性好、可以达到溶液冰点以下，并且导热性良好的材料，优选为封口膜或高分子材料等或导热性良好的其他材料；所述衬底优选为聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酸酯；

进一步优选地，衬底的厚度为1-100微米，以保证衬底的强度足够大可以有效地保护微胶囊中的溶液。

更进一步优选为表面疏水性较好(即接触角大于90°)的厚度为30-50微米的聚苯乙烯膜，由于聚苯乙烯材料同时也被应用于生化分析容器中，可以确保微胶囊阵列在生化分析方面具有良好的兼容性。

所述检测试剂溶液为水溶液，检测的底物主要为致癌物、葡萄糖、神经递质、乳酸、尿酸、蛋白质或DNA等溶于水的目标物；

检测试剂溶液优选为亚硝酸盐、葡萄糖、乳酸、尿酸、黄曲霉毒素、多巴胺、肾上腺素。

每个胶囊的检测试剂溶液的体积大小为1-100微升，滴加于疏水性衬底形成半球形的液滴，液滴之间的间距为100-1000微米。

所述光敏聚合胶为毒性较小的、主要由液态的丙烯酸酯单体与丙烯酰胺组成的胶黏剂，及在光敏剂的存在下可以经光催化聚合而固化。

光敏胶在避光条件下可长期保存，在紫外光及可见光(波长为200-800纳米)的照射下可迅速固化。在UV光照射过程中，检测液以冰的形式存在，可以保证光敏胶在聚合过程中不会与检测溶液中的物质发生化学反应。优选的光敏胶为商品化3311^TM光固化粘合剂，其照射光的波长为405纳米。

优选地，所述检测阵列由以下方法制作：

1)检测试剂溶液以液体形式由移液器滴加于放置在提供零下低温(<0℃)的衬底上，并迅速冻成冰，所述衬底的厚度为20-50微米，冰与冰之间的间距为100-400微米，冰的体积为5-20微升；

2)待稳定的冰完全形成后，用挡板限制冰形成的区域，将液态的光敏聚合胶倾倒于冰上，厚度为1-5毫米，使用相对应波长的光源进行照射，使液态胶聚合完成封装过程。

所述的挡板主要由玻璃或有机玻璃等材料经过机械加工而制得，可以重复使用。

所述的冷却器主要为帕尔贴热电半导体制冷器件，可将温度降至-30℃以下，也可以为制冷效果良好的其他类型制冷器。实际操作中，帕尔贴制冷器的温度根据所选衬底的厚度和导热性而设定。

本发明还提供了上述检测阵列在用于可视化检测方面的应用，所述可视化检测为初级诊断测试、环境检测或食品安全能等方面的检测。

与现有技术相比，本发明提出的固定化微胶囊检测阵列的优点在于：

1、采用疏水性好、可以达到溶液冰点以下，并且导热性良好的材料作为衬底，可以保证水溶液在疏水性衬底上的液滴形状为半球形，并且在较短的时间内完全凝结成冰，利于水溶液的规则成形，以获得形状均一的微胶囊。

同时，分离的检测溶液成冰之后，利用光敏聚合胶可将冰球预封装，固化后的聚合物可以保护检测试剂免受外界灰尘、病菌的污染。胶囊之间的物理隔离可以有效地避免交叉污染，同时确定了微胶囊的位置，便于制备多目标的微胶囊检测阵列。

2、采用移液器将检测试剂输滴加于衬底上的特定区域，无需引入微泵、微阀等流动系统，有效地降低了加工成本，并且具有操作简单、通量高、效率高等优势。

3、微胶囊阵列体积小，并且尺寸和形状设计灵活，便于携带，样品消耗量少，节约了检测的成本，利于在欠发达地区推广，在初级诊断测试、环境检测、食品安全能领域有潜在的应用价值。

本发明的一种基于冰打印概念的便携、易操作、防污染的固定化微胶囊检测阵列的制作方法，综合了软刻蚀、牺牲层技术以及微阵列合成方法的优势，既具有软刻蚀方法加工技术简单、成本低、易推广等优点，又具有微阵列合成方法高通量、合成效率高、无交叉污染等优点，可进一步采用固定化微胶囊阵列的加工方法，将目标物的检测试剂预封装于微胶囊中，利用目标物与检测试剂之间发生的显色反应，可以实现对目标物的快速、简便的可视化检测。

附图说明

图1为本发明中固定化微胶囊检测阵列的制备流程示意图，其中：1为冷却器，2为衬底，3为检测液溶液的液滴，4为移液器，5为挡板，6为光敏胶，UV light为紫外光。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明：

本发明用到的装置为常规装置，而实施例中用到的装置，是为了使得本发明的固定化微胶囊检测阵列制备更佳，不应该作为必须使用的工具。

实施例1：一种用于亚硝酸盐检测的固定化微胶囊阵列的制备

以导热性良好的疏水的聚苯乙烯高分子膜为衬底采用冰打印的技术制作亚硝酸盐检测的固定化微胶囊阵列，具体为：

1、亚硝酸盐检测液(含有以下成分)：柠檬酸(60毫克/毫升)，磺胺(5毫克/毫升)，N-(1-萘基)-乙二胺(1毫克/毫升)；

2、以厚度为50微米的聚苯乙烯膜为衬底(见附图1的标记2，简写为2，下同)，将衬底2置于帕尔贴冷却器1上，调整冷却器温度，使其低于-20℃，待聚苯乙烯膜的温度完全冷却后，采用移液器4以200微米为间距滴加亚硝酸盐检测液溶液3于衬底表面，每个液滴的体积为10微升，液滴迅速冷冻后，形成小冰珠，见图1A；

3、采用挡板5将阵列区域围住，加入液体状态的3311^TM光固化粘合剂光敏胶6，厚度控制在3±0.5毫米，如图1B。然后用紫外光(由照射光波长为405纳米的发光二极管提供)照射液体胶5-10分钟，保证光聚合反应发生完全，冰珠被光聚合胶封闭良好，如图1C。将衬底2与冷却器1分离，即得亚硝酸盐的微胶囊检测阵列，如图1D。使用前避光保存。

测亚硝酸盐时，在常温下，用微量进样针刺破较薄的聚苯乙烯膜注射待检测的亚硝酸盐溶液。反应1分钟，观察溶液的颜色深浅，与标准的亚硝酸盐浓度梯度对比，完成实际样品的检测。

该方法操作简便，时间短，检测只需1分钟，检测迅速，检出限低至0.1毫摩尔/升；稳定性好，20天内信号基本保持不变。

实施例2：一种用于葡萄糖检测的固定化微胶囊阵列的制备

以导热性良好的疏水的聚对苯二甲酸乙二醇酯高分子膜为衬底采用冰打印的技术制作葡萄糖的固定化微胶囊阵列，具体为：

1、葡萄糖检测液(含有以下成分)：葡萄糖氧化酶(2毫克/毫升)，过氧化物酶(200微克/毫升)，4-氨基安替比林(2.5毫摩尔/升)，苯酚(5毫摩尔/升)；

2、以厚度为30微米的聚对苯二甲酸乙二醇酯高分子膜为衬底2，将衬底2置于帕尔贴冷却器1上，调整冷却器温度，使其低于-20℃，待聚对苯二甲酸乙二醇酯高分子膜的温度完全冷却后，采用移液器4以100微米为间距滴加葡萄糖检测液溶液3于衬底表面，每个液滴的体积为5微升，液滴迅速冷冻后，形成小冰珠，见图1A；

3、采用挡板5将阵列区域围住，加入液体状态的GBN-501光学光敏胶6，厚度控制在2±0.1毫米，如图1B。然后用紫外光(由照射光波长为365纳米的高压汞灯提供)照射液体胶5-10分钟，保证光聚合反应发生完全，冰珠被光聚合胶封闭良好，如图1C。将衬底2与冷却器1分离，即得葡萄糖的微胶囊检测阵列，如图1D。

测葡萄糖时，在常温下，用微量进样针刺破较薄的聚对苯二甲酸乙二醇酯高分子膜注射待检测的葡萄糖溶液。反应5分钟，观察溶液的颜色深浅，与标准的葡萄糖浓度梯度对比，完成实际样品的检测。该方法操作简便，时间短，检测迅速，检出限低至0.5毫摩尔/升；稳定性好，20天内信号基本保持不变。

实施例3：一种用于乳酸检测的固定化微胶囊阵列的制备

以导热性良好的疏水的封口膜Parafilm^TM为衬底采用冰打印的技术制作检测乳酸的固定化微胶囊阵列，具体为：

1、乳酸检测液(含有以下成分)：乳酸氧化酶(5毫克/毫升),过氧化物酶(200微克/毫升)，4-氨基安替比林(2.5毫摩尔/升)，苯酚(5毫摩尔/升)；

2、以厚度为20微米的封口膜Parafilm^TM为衬底2，将衬底2置于帕尔贴冷却器1上，调整冷却器温度，使其低于-30℃，待封口膜Parafilm^TM的温度完全冷却后，采用移液器4以300微米为间距滴加乳酸检测液溶液3于衬底表面，每个液滴的体积为15微升，液滴迅速冷冻后，形成小冰珠，见图1A；

3、采用挡板5将阵列区域围住，加入液体状态的3311^TM光固化粘合剂光敏胶6，厚度为1毫米，如图1B。然后用紫外光(由照射光波长为405纳米的发光二极管提供)照射液体胶5-10分钟，保证光聚合反应发生完全，冰珠被光聚合胶封闭良好，如图1C。将衬底2与冷却器1分离，即得乳酸的微胶囊检测阵列，如图1D。使用前避光保存。

测乳酸时，在常温下，用微量进样针刺破较薄的封口膜Parafilm^TM注射待检测的乳酸溶液。反应1分钟，观察溶液的颜色深浅，与标准的乳酸浓度梯度对比，完成实际样品的检测。

该方法操作简便，时间短，检测只需5分钟，检测迅速，检出限低至1毫摩尔/升；稳定性好，12天内信号基本保持不变。

实施例4：一种用于尿酸检测的固定化微胶囊阵列的制备

以导热性良好的疏水的封口膜Parafilm^TM为衬底采用冰打印的技术制作检测尿酸的固定化微胶囊阵列，具体为：

1、尿酸检测液(含有以下成分)：尿酸酶(4毫克/毫升),过氧化物酶(200微克/毫升)，4-氨基安替比林(2.5毫摩尔/升)，苯酚(5毫摩尔/升)；

2、以厚度为20微米的封口膜Parafilm^TM为衬底2，将衬底2置于帕尔贴冷却器1上，调整冷却器温度，使其低于-30℃，待封口膜Parafilm^TM的温度完全冷却后，采用移液器4以400微米为间距滴尿酸检测液溶液3于衬底表面，每个液滴的体积为20微升，液滴迅速冷冻后，形成小冰珠，见图1A；

3、采用挡板5将阵列区域围住，加入液体状态的3311^TM光固化粘合剂光敏胶6，厚度为4±0.3毫米，如图1B。然后用紫外光(由照射光波长为405纳米的发光二极管提供)照射液体胶5-10分钟，保证光聚合反应发生完全，冰珠被光聚合胶封闭良好，如图1C。将衬底2与冷却器1分离，即得尿酸的微胶囊检测阵列，如图1D。使用前避光保存。

测尿酸时，在常温下，用微量进样针刺破较薄的封口膜Parafilm^TM注射待检测的乳酸溶液。反应1分钟，观察溶液的颜色深浅，与标准的乳酸浓度梯度对比，完成实际样品的检测。

该方法操作简便，时间短，检测只需5分钟，检测迅速，检出限低至0.1毫摩尔/升；稳定性好，12天内信号基本保持不变。

以上4个实施例验证了我们提出的新型固定化微胶囊检测阵列在生化分析领域的可行性。该微胶囊检测阵列使用简便，检测时间短，并且安全性好，具有优良的检测性能。与常规的检测阵列相比，该微胶囊检测阵列有效地将检测溶液与外界空气隔绝，避免了检测液吸收空气中的物质造成的信号背景升高问题。由于微胶囊阵列有多个分离开来互不干扰的检测区域，因此可以完成多个样品的同时检测，检测效率大大提高。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种固定化微胶囊检测阵列，其原料包括衬底、检测试剂溶液、光敏聚合胶以及限制液体胶的挡板；

由以下方法制作：检测试剂溶液以液体形式由移液器滴加于放置在提供零下低温的衬底上，并迅速冻成冰，待稳定的冰完全形成后，用挡板限制冰形成的区域，将液态的光敏聚合胶倾倒于冰上，使用相对应波长的光源进行照射，使液态胶聚合完成封装过程；

每个检测试剂溶液的体积大小为1-100微升，滴加于疏水性衬底形成半球形的液滴，液滴之间的间距为100-1000微米；所述衬底为聚苯乙烯或聚对苯二甲酸乙二酸酯。

2.根据权利要求1所述的检测阵列，其特征在于，所述衬底的厚度为1-100微米。

3.根据权利要求1所述的检测阵列，其特征在于，所述检测试剂溶液为水溶液，检测的底物主要为致癌物、葡萄糖、神经递质、乳酸、尿酸、蛋白质或DNA溶于水的目标物。

4.根据权利要求3所述的检测阵列，其特征在于，所述检测试剂溶液为亚硝酸盐、葡萄糖、乳酸、尿酸、黄曲霉毒素、多巴胺、肾上腺素。

5.根据权利要求1所述的检测阵列，其特征在于，所述光敏聚合胶为毒性较小的、主要由液态的丙烯酸酯单体与丙烯酰胺组成的胶黏剂，及在光敏剂的存在下可以经光催化聚合而固化。

6.根据权利要求1-5任一项所述的检测阵列，其特征在于，所述检测阵列由以下方法制作：

1)检测试剂溶液以液体形式由移液器滴加于放置在提供零下低温的衬底上，并迅速冻成冰，所述衬底的厚度为20-50微米，冰与冰之间的间距为100-400微米，冰的体积为5-20微升；

2)待稳定的冰完全形成后，用挡板限制冰形成的区域，将液态的光敏聚合胶倾倒于冰上，光敏胶的厚度为1-5毫米，使用相对应波长的光源进行照射，使液态胶聚合完成封装过程。

7.权利要求1-6任一项所述的检测阵列在用于可视化检测方面的应用。