CN104774917B - 一种甜瓜低化瓜率种质的筛选方法及其所用pcr引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甜瓜低化瓜率种质的筛选方法，是采用检测甜瓜CmEFs基因的PCR引物对，对甜瓜CmEFs的RNA水平进行检测，提取甜瓜幼嫩叶片组织的RNA，并反转录为cDNA作为检测样品，运用实时荧光PCR方法进行检测，得出CmEFs的表达水平，作为判断甜瓜低化瓜率的判断依据。本发明的有益效果为：采用上述引物对甜瓜CmEFs的RNA水平进行检测，提取甜瓜幼嫩叶片组织的RNA，并反转录为cDNA作为检测样品，运用实时荧光PCR方法进行检测，得出CmEFs的表达水平，作为判断甜瓜低化瓜率的判断依据，统计学数据表明，本方法具有良好的特异性和实用性，可有效提高甜瓜种质选择的效率。
Description
技术领域
本发明涉及农作物基因工程领域，具体涉及一种甜瓜低化瓜率种质的筛选方法及其所用PCR引物。
背景技术
细胞延伸因子家族是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。主要存在于植物细胞的各种成体与及大多数培养细胞中，对不同种类细胞具有一定的专一性。通常培养细胞的生长需要多种生长因子顺序的协调作用，细胞延伸因子亦参与细胞与细胞外基质间重要的信号传导。生长因子类物质自然存在于体内,是内源性的,为生植物生长、发育所必需,对植物的生长、发育具有广泛调节作用。
目前已经在拟南芥、水稻、小麦、玉米等多种作物中发现了细胞延伸因子，大多数研究结果认为，延伸因子是一种组织特异性表达蛋白,分析表明在植物幼嫩发育组织中活性较高。也有报道认为光照可显著提升大豆叶片中的EF1A的mRNA水平，影响小麦苗eEF1A的稳定性。创伤、低氧可能诱导马铃薯块茎延伸因子基因的转录，2，4－D处理后可提高转基因烟草中eEF1A－GUS嵌合基因的mRNA水平。通过ommp(omnia mea mecumporto)mRNA降解系统，研究4℃低温和水杨酸钠处理后，小麦、大麦eEF1AmRNA的稳定性，结果表明，品种抗霜冻能力越强，eEF1A mRNA愈稳定。也有研究指出，在植物受到真菌感染后，组织坏死阶段的eEF1A表达水平下降。此外,还与细胞增殖和衰老有关。总之,当植物受到外界环境压力或者植物发育的内在信号时,会作出迅速反应,即通过改变eEF1A的表达(影响转录水平或mRNA稳定性)调控蛋白质的合成，以适应各种环境条件和植物各个生长发育阶段的需要。EF的相对稳定性可作为一种新颖的分子、遗传和生理标记。
虽然在众多植物中已经发现大量细胞延伸因子EF基因的存在，但目前在甜瓜中EF被发现鉴定的数量较少，有关与甜瓜化瓜有关的基因EF的研究尚未见报道。在实际生产当中，甜瓜坐果率是甜瓜非常重要的一个目标性状，坐果率的高低直接决定了甜瓜产量的高低。一般而言，化瓜率高的品种产量较低。反之，低化瓜率的品种坐果能力较强。因此对育种者而言，在种质筛选过程中，选择低化瓜率的品种就显得尤为重要，这也是品种具有高产稳产性状的生物学基础。
目前生产上主要是通过田间调查的方法，将所有种质资源播种，在开花坐果期统计化瓜率，工作量大，费工费时，这种统计学方法也受低温、水肥等环境的干扰，影响育种效率。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种甜瓜低化瓜率种质的筛选方法及其所用PCR引物。
前期研究表明，甜瓜苗期延伸因子的表达量和甜瓜化瓜率具有很高的相关性，因此利用甜瓜内源延伸因子的基因表达量，通过反转录，检测甜瓜延伸因子转录量的高低，来判定甜瓜化瓜率的高低，可以大大提高甜瓜种质选择的效率，对于提升甜瓜育种效率和生产发展都具有十分重要的意义。因此甜瓜延伸因子基因对于瓜类作物改良具有非常重要的理论和实践意义。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：检测甜瓜CmEFs基因的PCR引物对，是由序列表中序列1和序列2组成的引物对。
正向引物(SEQ ID NO：1)：5-GGTTATGCTCCAGTCCTTGATT－3；
反向引物(SEQ ID NO：2)：5-CTGTTGGGTCCTTCTTCTCC－3。
本发明的第二个目的是提供了一种甜瓜低化瓜率种质的筛选方法，是采用上述的引物对，对甜瓜CmEFs的RNA水平进行检测，提取甜瓜幼嫩叶片组织的RNA，并反转录为cDNA作为检测样品，运用实时荧光PCR方法进行检测，得出CmEFs的表达水平，作为判断甜瓜低化瓜率的判断依据，表达量高的材料即为低化瓜率种质。
本发明的有益效果为：采用上述引物正对甜瓜CmEFs的RNA水平进行检测，提取甜瓜幼嫩叶片组织的RNA，并反转录为cDNA作为检测样品，运用实时荧光PCR方法进行检测，得出CmEFs的表达水平，作为判断甜瓜低化瓜率的判断依据，表达量高的材料即为低化瓜率种质，统计学数据表明，本方法具有良好的特异性和实用性，可有效提高甜瓜种质选择的效率。
附图说明
图1为CmEFs基因表达量、田间实际化瓜率和坐果率统计数据图。
具体实施方式
实施例1：
根据甜瓜CmEFs基因的cDNA进行设计PCR检测引物,引物序列如下：
正向引物(SEQ ID NO:1):5-GGTTATGCTCCAGTCCTTGATT-3；
反向引物(SEQ ID NO:2):5-CTGTTGGGTCCTTCTTCTCC-3。
检测步骤:
1)提取RNA：
将12份实验甜瓜种子置于28摄氏度条件下催芽2天，播种于育苗盘中，15天左右长至两片真叶时，摘取叶片组织，在液氮中速冻，提取RNA(多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，天根公司)。
2)反转录：
利用反转录试剂盒进行反转录(QuantScript RT Kit，天根公司)。获取甜瓜cDNA。按1μg的量计算需加入的模板量进行逆转录。取出RNA模板置于冰上解冻，引物、10×RTMix、dNTP、Rnase-Free ddH2O与室温解冻，使用前混匀。
总RNA：2-10μl；
Oligo(dT)1810mM：1μl；
5×RT Reaction MIX：4μl；
TUREscript H-Rtase：0.8μl；
Rnase free H2O至20μl。
按照下列体系将逆转录体系配制混合液，彻底混匀后分装置于冰上，按照各个样品的浓度添加模板，离心后放于42℃孵育50min,后再65℃加热15min失活TUREscript H-Rtase。反应结束后再加入80ulRnase-Free ddH2O，使终体积为100μl。
3)Q-PCR(采用东洋纺QPS-201T)：
PCR体系：20μl；
2×QPCR Mix：10μl；
Forword primer(10μM)：0.5μl；
Reverse primer(10μM)：0.5μl；
Template：1μl；
ddH2O补至20μl。
PCR程序：95℃5min；95℃10s、、60℃30s×40；95℃15s 60℃60s 95℃15s(每上升0.5℃收集一次信号)从冰箱取出2×QPCR Mix放于超净工作台里面的冰盒中使其自然解冻。解冻后上下颠倒混匀Mix，根据实验安排取出八连管放于PCR管盒中，根据实验管数计算所需要加入的Mix、引物、水的量，取一只200μl PCR管，将上述试剂按计算的量加入PCR管中，混匀后分装于八连管中，盖上盖子后离心。将八连管放入PCR仪中，设定程序，进行Q-PCR实验。
4)数据分析：
根据三组实验结果数据，利用-△△Ct法计算CmEFs基因在不同样本中的相对表达量。如表1和表2所示。表1为目标基因相对于内参基因△Ct；表2为目标基因表达量的方差分析。图1显示为CmEFs基因表达量、田间实际化瓜率和坐果率统计数据。
表1
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值 | 标准差 | |
| 1 | 1.52 | 1.79 | 2.10 | 1.80 | 0.24 |
| 2 | 2.04 | 1.40 | 1.84 | 1.76 | 0.27 |
| 3 | 2.27 | 1.64 | 1.53 | 1.81 | 0.33 |
| 4 | 0.53 | 0.97 | 0.91 | 0.80 | 0.20 |
| 5 | 1.27 | 2.85 | 1.95 | 2.02 | 0.65 |
| 6 | 2.89 | 2.73 | 3.18 | 2.93 | 0.19 |
| 7 | 2.62 | 2.33 | 3.23 | 2.73 | 0.37 |
| 8 | 3.05 | 3.12 | 3.07 | 3.08 | 0.03 |
| 9 | 1.78 | 2.04 | 2.17 | 2.00 | 0.16 |
| 10 | 1.99 | 1.93 | 2.06 | 1.99 | 0.05 |
| 11 | 2.14 | 1.77 | 2.58 | 2.16 | 0.33 |
| 12 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
表2
| 处理 | 平均 | 5％显著水平 | 1％极显著水平 |
| 8 | 3.080 | a | A |
| 6 | 2.933 | a | AB |
| 7 | 2.727 | ab | ABC |
| 11 | 2.163 | bc | BCD |
| 5 | 2.023 | c | CD |
| 9 | 1.997 | c | CD |
| 10 | 1.993 | c | CD |
| 3 | 1.813 | c | DE |
| 1 | 1.803 | c | DE |
| 2 | 1.760 | c | DE |
| 12 | 1 | d | EF |
| 4 | 0.803 | d | F |
5)结论：
12号材料为对照材料，通过比较表达量，材料排名顺序为：8＞6＞7＞11＞5＞9＞10＞3＞1＞2＞12＞4，显然8号材料表达量最高，4号材料表达量最低。结合田间实际调查，以上顺序和田间统计的化瓜率基本吻合。因此本方法提供的引物可以用来对甜瓜的种质资源进行化瓜率的筛选。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 甘肃省农业科学院蔬菜研究所
<120> 一种甜瓜低化瓜率种质的筛选方法及其所用PCR引物
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 甜瓜CmEFs基因PCR检测引物（正向）
<400> 1
ggttatgctc cagtccttga tt 22
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 甜瓜CmEFs基因PCR检测引物（反向）
<400> 2
ctgttgggtc cttcttctcc 20
Claims (2)
1.检测甜瓜CmEFs基因的PCR引物对，其特征在于，是由序列表中序列1和序列2组成的引物对。
2.一种甜瓜低化瓜率种质的筛选方法，其特征在于，是采用权利要求1所述的引物对，对甜瓜CmEFs的RNA水平进行检测，提取甜瓜幼嫩叶片组织的RNA，并反转录为cDNA作为检测样品，运用实时荧光PCR方法进行检测，得出CmEFs的表达水平，作为判断甜瓜低化瓜率的判断依据，表达量高的材料即为低化瓜率种质。
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Non-Patent Citations (2)
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| 植物延伸因子eEFI A研究进展;覃迎姿等;《广西农业科》;20091231;第40卷(第5期);第472-477页 * |
| 香蕉延长因子1A(MaEF1A)基因的分离及特征分析;刘菊华 等;《果树学报》;20111231;第28卷(第5期);第825-830页 * |
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