CN104774606A - 缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，将SQ和二胺类物质加入到无水二氯甲烷溶剂中，室温下搅拌，制备得到中间产物；将制备得到的中间产物和三乙胺加入到无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中混合，将溶有Biotin-NHS的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述混合液中，室温环境下搅拌过夜，得到近红外荧光探针；本发明的制备方法简单，易于合成，制备的近红外荧光探针，能够克服现有的荧光探针性能上的不足之处，能够准确、灵敏地检测缓冲水溶液中检测亲和素，具有选择性好、灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及小分子荧光探针技术领域，特别涉及缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法。
背景技术
亲和素作为一种生物蛋白质，在肿瘤/癌细胞中出现的机率比在正常细胞出现的机率要高很多，对亲和素的定性和定量检测相应地可作为肿瘤细胞诊断的重要依据之一。此外生物素与亲和素之间的这种强亲和专一性相互作用，广泛用于生物分析领域，如酶联免疫也就是ELISA法测定、生物分子识别、肿瘤细胞诊断等。因此，开发高灵敏和选择性地检测亲和素的探针成为研究的焦点。
近年来，荧光探针由于其具有选择性好、灵敏度高、响应时间快、可实现原位检测的优点，在生物分子检测方面得到很好的应用。但理想的亲和素荧光探针分子应该自身荧光很弱或最好不发荧光，只有当亲和素存在下才发光，产生显著的荧光增强，实现高灵敏性检测。
亲和素蛋白含有疏水性空腔，荧光探针如与亲和素通过疏水性相互作用，探针分子可从水溶液进入疏水性空腔。作用前后染料所处环境发生改变，诱导荧光产生[Zhuang,Y.；Chiang,P.；Wang,C.；TanK.Angew.Chem.Int.Ed.,2013,52,8124-8128.]。虽然可以选择环境敏感的荧光探针分子来调控其自身荧光，实现显著荧光增强，但是大多数染料不具有荧光环境敏感的特性。虽然大多数染料具有聚集诱导的荧光淬灭(ACQ)特性，可通过调控染料聚集降低探针分子的自身荧光，如罗丹明、荧光素与生物素相连得到的亲和素荧光探针，可实现显著荧光增强，但这些荧光探针需要引入合适的亲疏水基团来调控染料聚集，以期达到降低探针分子自身荧光的目的[(a)Mizusawa,K.；Ishida,Y.；Takaoka,Y.；Miyagawa,M.；Tsukiji,S.；Hamachi,I.J.Am.Chem.Soc.2010,132,7291-7293.(b)Mizusawa,K.；Takaoka,Y.；Hamachi,I.J.Am.Chem.Soc.2012,134,13386-13395.]。因此需要复杂的有机合成，此外引入的这些基团可能会影响探针与亲和素的特异性作用，最终影响检测结果。目前大部分亲和素荧光探针分子处于短波长区，激发时会对生物组织产生损伤，在该检测区域生物体自发荧光也对检测产生严重干扰，使其在实际应用中受到一定的限制。因此研究开发在缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针具有重要理论和实际应用价值。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，能够克服现有的荧光探针性能上的不足之处，且具有合成简单、检验灵敏准确的特点。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，将方酸菁染料(SQ)和二胺类物质加入到无水二氯甲烷溶剂中，室温下搅拌，制备得到中间产物SQ-n-NH2，其中，n为二胺类物质中C原子数量的一半；
将制备得到的中间产物SQ-n-NH2和三乙胺加入到无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中混合，制备得到混合液A，其中，SQ-n-NH2、三乙胺与无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂的摩尔比为1：0.19：166；将溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲 酰胺溶液逐滴加入到上述混合液A中，其中，溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶液与混合液A的摩尔比为1：160.8，室温环境下搅拌过夜，得到近红外荧光探针。
具体的，将方酸菁染料(SQ)和二胺类物质加入到无水二氯甲烷溶剂中，在氮气流保护下，室温环境中搅拌，然后蒸除无水二氯甲烷溶剂后得到中间产物SQ-n-NH2，所述中间产物SQ-n-NH2为粗品SQ-n-NH2，粗品SQ-n-NH2不经纯化直接用于下一步反应；
将制备得到的中间产物SQ-n-NH2和三乙胺加入到无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中混合，制备得到混合液A，其中，SQ-n-NH2、三乙胺与无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂的摩尔比为1：0.19：166；将溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂逐滴加入到上述混合液A中，其中，溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶液与混合液A的摩尔比为1：160.8，在氮气流保护下，室温环境中搅拌过夜，然后蒸除无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂后得到近红外荧光探针粗产品；经硅胶柱分离得到深蓝色固体，即得近红外荧光探针。
方酸菁染料(SQ)和二胺类物质的摩尔比为1:1.1。
二胺类物质主要包括：乙二胺、丁二胺和己二胺。
进一步的，所述中间产物SQ-n-NH2的分子式结构(机构式)为：
其中，n为二胺类物质中C原子数量的一半。
本发明的有益效果为：制备方法简单，易于合成。和现有技术相比，本发明制备的近红外荧光探针，能够克服现有的荧光探针性能上的不足之处，能够准确、灵敏地检测缓冲水溶液中的亲和素。制备的荧光探针分子在水相中与亲和素作用，荧光发射强度增强，具有选择性好、灵敏度高等优点。且荧光光谱的发射峰在近红外区。
附图说明
图1是本发明所述的近红外荧光探针缓冲水溶液中加入亲和素的吸收光谱图。
图2是本发明所述的近红外荧光探针缓冲水溶液中加入亲和素的荧光光谱图。图中从下到上每条曲线对应加入的亲和素浓度分别为：0,0.117,0.233,0.35,0.467,0.583,0.70,0.817,0.933,1.05,1.16,1.28,1.40,1.58,1.81,2.57,3.62,4.78,5.95,7.18,7.70微摩尔每升。
图3是本发明所述的近红外荧光探针缓冲水溶液中荧光强度对亲和素浓度变化的线性关系图。其中荧光强度(y)与亲和素浓度(x)满足一元线性方程：y＝0.38+4.41*x，相关系数r＝0.979。
图4是本发明所述的近红外荧光探针缓冲水溶液中不加、加入等浓度的不同蛋白或酶的选择性试验结果图。从左到右依次为：1：空白；2：胃蛋白酶；3：胰蛋白酶；4：核糖核酸酶A；5：凝血酶；6：溶菌酶；7：酪蛋白；8：肌红蛋白；9：伴刀豆球蛋白；10：牛血清蛋白；11：亲和素。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明为一种缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，包括：
将方酸菁染料(SQ)和二胺类物质加入到无水二氯甲烷溶剂中，室温下搅拌，制备得到中间产物SQ-n-NH2，其中，n为二胺类物质中C原子数量的一半；
将制备得到的中间产物SQ-n-NH2和三乙胺加入到无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中混合，制备得到混合液A，其中，SQ-n-NH2、三乙胺与无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂的摩尔比为1：0.19：166；将溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述混合液A中，其中，溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶液与混合液A的摩尔比为1：160.8，室温环境下搅拌过夜，得到近红外荧光探针。
具体的，将方酸菁染料(SQ)和二胺类物质加入到无水二氯甲烷溶剂中，在氮气流保护下，室温环境中搅拌，然后蒸除无水二氯甲烷溶剂后得到中间产物SQ-n-NH2，所述中间产物SQ-n-NH2为粗品SQ-n-NH2，粗品SQ-n-NH2不经纯化直接用于下一步反应；
将制备得到的中间产物SQ-n-NH2和三乙胺加入到无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中混合，制备得到混合液A，其中，SQ-n-NH2、三乙胺与无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂的摩尔比为1：0.19：166；将溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂逐滴加入到上述混合液A中，其中，溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶液与混合液A的摩尔比为1：160.8，在氮气流保护下，室温环境中搅拌过夜，然后蒸除无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂后得到近红外荧光探针粗产品；经硅胶柱分离得到深蓝色固体，即得近红外荧光探针。
二胺类物质包括：乙二胺、丁二胺和己二胺。
方酸菁染料和二胺类物质的摩尔比为1:1.1。
以乙二胺为例，将方酸菁染料(SQ)和乙二胺加入到无水二氯甲烷溶剂中，所述方酸菁染料(SQ)和乙二胺的摩尔比为1:1.1，在氮气流保护下，室温环境中搅拌，然后蒸除无水二氯甲烷溶剂后得到中间产物SQ-NH2(即SQ-n-NH2，n＝1)，所述中间产物SQ-NH2为粗品SQ-NH2，粗品SQ-NH2不经纯化直接用于下一步反应；其他化合物的合成与此相似。
将制备得到的中间产物SQ-NH2和三乙胺加入到无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中混合，制备得到混合液A；将溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂逐滴加入到上述混合液A中，所述SQ-NH2和N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的摩尔比可以为1:0.3，所述三乙胺、加入SQ-NH2和三乙胺的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂和加入N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺的体积比为0.03:15:5；在氮气流保护下，室温环境中搅拌过夜，然后蒸除无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂后得到近红外荧光探针粗产品；经硅胶柱分离得到深蓝色固体，即得近红外荧光探针。其他化合物的合成与此相似。
在以上缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法中，所述中间产物SQ-n-NH2的分子式结构(机构式)具体为：：
其中，n为二胺类物质中C原子数量的一半。
中间产物SQ-n-NH2的制备可详见公式1
所述中间产物SQ-NH2(即SQ-n-NH2，n＝1)的分子式结构(机构式)具体为：
中间产物SQ-NH2的制备可详见公式2
以下通过实施例对本发明提供的缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法进行详细的描述。
实施例：制备近红外荧光探针
将497mg方酸菁染料(SQ)和0.063毫升乙二胺加入到300毫升无水二氯甲烷溶剂中，在氮气流保护下，室温环境中搅拌40分钟，然后蒸除无水二氯甲烷溶剂后得到中间产物SQ-NH2；制备所得中间产物SQ-NH2为粗品SQ-NH2，粗品SQ-NH2不经纯化直接用于下一步反应；
将724mg制备得到的中间产物SQ-NH2和30微升三乙胺加入到15毫升的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中混合，将136mg N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)溶解在5毫升无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中得溶液，将该溶液逐滴加入到上述混合液中，在氮气流保护下，室温环境中搅拌过夜，然后蒸除无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂后得到近红外荧光探针粗产品；经硅胶柱分离得到深蓝色固体，即得近红外荧光探针。
该荧光探针的分子式如下：
近红外荧光探针(SQ-Biotin)的表征数据为：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)8.87(s,1H),8.17(s,1H),7.89(dd,J＝23.1,7.8Hz,2H),7.62(m,2H),7.53–7.40(m,2H),7.29(m,2H),6.31(d,J＝12.7Hz,2H),6.14(s,1H),6.00(s,1H),4.44(q,J＝6.1Hz,2H),4.26(q,J＝5.9Hz,2H),4.23–4.18(m,1H),4.05–3.97(m,1H),3.55(m,2H),3.27–3.21(m,2H),2.98–2.86(m,1H),2.72–2.65(dd,J＝12.5,5.0Hz,1H),2.57–2.49(d,J＝25.0Hz,1H),2.08–2.01(t,J＝7.0Hz,2H),1.63–1.31(m,6H),1.32–1.24(m,6H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ(ppm)174.13,173.65,163.97,163.18,161.12,160.31,157.52,156.28,140.77,140.73,128.39,128.22,125.40,125.06,123.43,123.14,122.45,119.89,117.33,113.61,113.46,87.16,86.34,61.51,59.69,55.86,43.27,42.09,41.63,35.61,28.72,28.58, 25.61,13.03,12.99.HRMS(ESI+)found 701.2406(M)+,calcd for C36H41N6O3S3,701.2396.
近红外荧光探针(SQ-Biotin)的性能实验
将合成的近红外荧光探针(SQ-Biotin)配成含有1％的DMSO(二甲基亚砜)的缓冲母液，然后用缓冲溶液稀释至相应的浓度，对其性能进行测试。
(1)近红外荧光探针缓冲水溶液中加入亲和素的吸收光谱变化分析；
参见图1，图1为本发明所述的近红外荧光探针缓冲水溶液中加入亲和素的吸收光谱图。图中，横轴为波长，单位为nm；纵轴为吸光度。
将亲和素加入到近红外荧光探针缓冲水溶液中，探针浓度为5微摩尔每升，由图1可以看出，随着亲和素的不断加入，600nm聚集体的吸收峰消失，645nm单体的吸收峰逐渐增强，实验结果表明近红外荧光探针与亲和素作用后，在水中的溶解度增大，染料由聚集向分散转变。
(2)近红外荧光探针缓冲水溶液中加入亲和素的荧光光谱变化分析；
参见图2，图2为本发明所述的近红外荧光探针缓冲水溶液中加入亲和素的荧光光谱图。图中，横轴为波长，单位为nm；纵轴为荧光强度。
将亲和素加入到近红外荧光探针缓冲水溶液中，探针浓度为5微摩尔每升，由图2可以看出，随着亲和素的不断加入，近红外荧光探针荧光强度逐渐增大。图中从下到上每条曲线对应加入的亲和素浓度分别为：0,0.117,0.233,0.35,0.467,0.583,0.70,0.817,0.933, 1.05,1.16,1.28,1.40,1.58,1.81,2.57,3.62,4.78,5.95,7.18,7.70微摩尔每升。
(3)近红外荧光探针缓冲水溶液中荧光强度对亲和素的灵敏性分析；
参见图3，图3为本发明所述的近红外荧光探针缓冲水溶液中荧光强度对亲和素浓度变化的线性关系图。图中，横轴为亲和素浓度，单位为μM；纵轴为荧光强度。其中荧光强度(y)与亲和素浓度(x)满足一元线性方程：y＝0.38+4.41*x，相关系数r＝0.979。
将亲和素加入到近红外荧光探针缓冲水溶液中，探针浓度为5微摩尔每升，由图3可以看出，荧光探针的荧光强度与亲和素浓度在0.76-1.46微摩尔每升范围内有较好的线性关系，从而使得定量检测亲和素成为可能，经分析计算，对亲和素的最低检测限为70纳摩尔每升。
(4)近红外荧光探针缓冲水溶液中选择性分析：
参见图4，图4为本发明所述的近红外荧光探针缓冲水溶液中荧光强度对亲和素浓度变化的线性关系图。图中，横轴为11种不同物质；纵轴为荧光强度。
将等浓度(6.07微摩尔每升)的不同蛋白或酶分别加入到近红外荧光探针缓冲水溶液中，探针浓度为5微摩尔每升，然后测定相应的荧光发射强度，得图4。由图4可以看出除亲和素外，其他蛋白或酶不能诱导近红外荧光探针明显的荧光增强，说明该近红外荧光探针对亲和素具有专一选择性，为选择性检测亲和素提供了可靠的条件。
综上所述，本发明的亲和素近红外荧光探针，具有较好的灵敏性和选择性，探针的合成和检测样品的前处理都比较简单，发射波长处在长波长区域，因此可有效避免蛋白等生物分子自发荧光干扰。
本发明提供了一种以方酸菁染料为母体，连接有生物素的可用于缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针。在缓冲水溶液中对亲和素具有很好的识别效果，溶液的荧光强度与亲和素的浓度在0.76-1.46微摩尔每升范围内有较好的线性关系；而且该近红外荧光探针的最大发射峰位于近红外区域。荧光探针几乎不产生背景干扰，而且在缓冲水溶液中，在其他蛋白/酶，如胃蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶，肌红蛋白，溶菌酶，牛血清蛋白，核糖核酸酶A，伴刀豆球蛋白，酪蛋白等存在下，该荧光探针荧光强度无明显变化。因此，上述近红外荧光探针可以用于亲和素蛋白高选择性、高灵敏性检测。
应当理解，所附权利要求概括了本发明的范围，在本发明构思的引导下，本领域的技术 人员应意识到，对本发明的各实施例方案所进行的一定的改变，都将被本发明的权利要求书的精神和范围所覆盖。
Claims (8)
1.缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：
将方酸菁染料(SQ)和二胺类物质加入到无水二氯甲烷溶剂中，室温下搅拌，制备得到中间产物SQ-n-NH2，其中，n为二胺类物质中C原子数量的一半；
将制备得到的中间产物SQ-n-NH2和三乙胺加入到无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中混合，制备得到混合液A，其中，SQ-n-NH2、三乙胺与无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂的摩尔比为1：0.19：166；将溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述混合液A中，其中，溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶液与混合液A的摩尔比为1：160.8，室温环境下搅拌过夜，得到近红外荧光探针。
2.根据权利要求1所述的缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：
将方酸菁染料(SQ)和二胺类物质加入到无水二氯甲烷溶剂中，在氮气流保护下，室温环境中搅拌，然后蒸除无水二氯甲烷溶剂后得到中间产物SQ-n-NH2，所述中间产物SQ-n-NH2为粗品SQ-n-NH2，粗品SQ-n-NH2不经纯化直接用于下一步反应；
将制备得到的中间产物SQ-n-NH2和三乙胺加入到无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中混合，制备得到混合液A，其中，SQ-n-NH2、三乙胺与无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂的摩尔比为1：0.19：166；将溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂逐滴加入到上述混合液A中，其中，溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶液与混合液A的摩尔比为1：160.8，在氮气流保护下，室温环境中搅拌过夜，然后蒸除无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂后得到近红外荧光探针粗产品；经硅胶柱分离得到深蓝色固体，即得近红外荧光探针。
3.根据权利要求2所述的缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：
将方酸菁染料(SQ)和乙二胺加入到无水二氯甲烷溶剂中，所述方酸菁染料(SQ)和乙二胺的摩尔比为1:1.1，在氮气流保护下，室温环境中搅拌，然后蒸除无水二氯甲烷溶剂后得到中间产物SQ-NH2(即SQ-n-NH2，n＝1)，所述中间产物SQ-NH2为粗品SQ-NH2，粗品SQ-NH2不经纯化直接用于下一步反应；
将制备得到的中间产物SQ-NH2和三乙胺加入到无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中混合，制备得到混合液A；将溶有N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂逐滴加入到上述混合液A中，所述SQ-NH2和N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的摩尔比可以为1:0.3，所述三乙胺、加入SQ-NH2和三乙胺的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂和加入N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(Biotin-NHS)的无水N,N'-二甲基甲酰胺的体积比为0.03:15:5；在氮气流保护下，室温环境中搅拌过夜，然后蒸除无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂后得到近红外荧光探针粗产品；经硅胶柱分离得到深蓝色固体，即得近红外荧光探针。
4.根据权利要求1或2中所述的缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述二胺类物质包括：乙二胺、丁二胺和己二胺。
5.根据权利要求1或2所述的缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述方酸菁染料(SQ)和二胺类物质的摩尔比为1:1.1。
6.根据权利要求3所述的缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：
将497mg方酸菁染料(SQ)和0.063毫升乙二胺加入到300毫升无水二氯甲烷溶剂中，在氮气流保护下，室温环境中搅拌40分钟，然后蒸除无水二氯甲烷溶剂后得到中间产物SQ-NH2；
将724mg制备得到的中间产物SQ-NH2和30微升三乙胺加入到15毫升的无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中混合，将136mg Biotin-NHS溶解在5毫升无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂中得溶液，将该溶液逐滴加入到上述混合液中，在氮气流保护下，室温环境中搅拌过夜，然后蒸除无水N,N'-二甲基甲酰胺溶剂后得到近红外荧光探针粗产品；经硅胶柱分离得到深蓝色固体，即得近红外荧光探针。
7.根据权利要求1或2中所述的缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述中间产物SQ-n-NH2的分子式结构为：
，其中，n为二胺类物质中C原子数量的一半。
8.根据权利要求3所述的缓冲水溶液中检测亲和素的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述中间产物SQ-NH2(即SQ-n-NH2，n＝1)的分子式结构为：
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