CN104769433A - 诊断或监测肾功能或者诊断肾功能异常的方法 - Google Patents

诊断或监测肾功能或者诊断肾功能异常的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104769433A
CN104769433A CN201380051659.3A CN201380051659A CN104769433A CN 104769433 A CN104769433 A CN 104769433A CN 201380051659 A CN201380051659 A CN 201380051659A CN 104769433 A CN104769433 A CN 104769433A
Authority
CN
China
Prior art keywords
proenkephalin
amino acid
level
seq
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380051659.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104769433B (zh
Inventor
安德里亚斯·伯格曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Si Fuyingao Tektronix Ltd
Original Assignee
Si Fuyingao Tektronix Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Si Fuyingao Tektronix Ltd filed Critical Si Fuyingao Tektronix Ltd
Publication of CN104769433A publication Critical patent/CN104769433A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104769433B publication Critical patent/CN104769433B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/665—Assays involving proteins derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • G01N2333/70—Enkephalins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)

Abstract

用于(a)诊断或监测对象的肾功能、或者(b)诊断对象的肾功能异常、或者(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险、或者(d)预测或监测治疗或干预的成功的方法，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，所述方法包括：·测定获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PENK)或其具有至少5个氨基酸的片段的水平；以及(a)将所述脑啡肽原或其片段的水平与对象的肾功能相关联，或者(b)将所述脑啡肽原或其片段的水平与肾功能异常相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或者将所述脑啡肽原或其片段的水平与所述患病对象的不良事件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风险增加，或者(d)将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象的治疗干预的成功相关联，其中低于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。

Description

诊断或监测肾功能或者诊断肾功能异常的方法
本发明的主题为方法，其被用于(a)诊断或监测对象的肾功能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测治疗或干预的成功，所述方法包括：
·测定获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PEN)或其具有至少5个氨基酸的片段的水平；以及
(a)将所述脑啡肽原或其片段的水平与对象的肾功能相关联，或
(b)将所述脑啡肽原或其片段的水平与肾功能异常相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或
(c)将所述脑啡肽原或其片段的水平与所述患病对象中的不良事件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风险增加，或
(d)将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象的治疗或干预的成功相关联，其中低于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。
Met-脑啡肽为来源于脑啡肽前体(前脑啡肽原)的具有5个氨基酸的肽，也称为“阿片生长因子”(OGF)，其与脑啡肽原片段一起释放。成熟肽结合不同的阿片受体(Koneru et al,2009)。已发现脑啡肽(OGF)具有多种生理功能。在CNS中，其下调P物质相关的疼痛信号，作为细胞因子起作用(Plotnikoff et al,1997)。脑啡肽原相关的肽展现抗菌作用(Goumon et al,1998)。脑啡肽原和脑啡肽展现抗肿瘤作用，并用作促细胞凋亡剂(Tavishet al,2007,Donahue et al,2011,Zagon et al,2009)。据报道，肾功能异常中脑啡肽升高(Smith et al,1985,Zoccali et al.,1987,Smith et al,1981)。脑啡肽产生为较大的脑啡肽原，并通过蛋白水解转化为成熟五肽。在成熟过程中，生成了多种脑啡肽原片段，其与脑啡肽一起释放(Ernst et al.,2006)。
本发明的主题为脑啡肽原(PENK)或其片段作为肾功能和肾功能异常的标志物的用途，以及其在健康和患病对象中的临床应用。本发明的主题为用于诊断或监测对象的肾功能或者诊断对象的肾功能异常或预测患病对象的死亡或不良事件的风险的方法。
本发明的主题还为提供PENK或其片段对诊断患病对象的肾功能、肾功能异常的预后和诊断力以及预后价值。
令人吃惊地，显示出PENK或片段为用于肾、其功能、功能异常、死亡或不良事件的风险以及预后和监测治疗或干预的成功的有力和高度显著的生物标记。
本发明的主题为方法，其被用于(a)诊断或监测对象的肾功能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测治疗或干预的成功，所述方法包括：
·测定获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PENK)或其具有至少5个氨基酸长的片段的水平；以及
(a)将所述脑啡肽原或其片段的水平与对象的肾功能相关联，或
(b)将所述脑啡肽原或其片段的水平与肾功能异常相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或
(c)将所述脑啡肽原或其片段的水平与所述患病对象中的不良事件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风险增加，或
(d)将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象治疗或干预的成功相关联，其中小于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。
根据本发明，在一个具体的实施方案中，所述脑啡肽原或其片段不为leu-脑啡肽，且不为met-脑啡肽。在另一具体的实施方案中，所述脑啡肽原片段为MR-脑啡肽原(MRPENK)或其具有至少5个氨基酸的片段。
换句话说：本发明的主题为方法，其被用于：(a)诊断或监测对象的肾功能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测治疗或干预的成功，所述方法包括：
·通过使用与获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PENK)的氨基酸序列中的区域结合的至少一种结合剂来测定免疫反应性分析物的水平；以及
(a)将所述免疫反应性分析物的水平与对象的肾功能相关联，或
(b)将所述免疫反应性分析物的水平与肾功能异常相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或
(c)将所述免疫反应性分析物的水平与所述患病对象中的不良事件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风险增加，或
(d)将所述免疫反应性分析物的水平与患病对象治疗或干预的成功相关联，其中小于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。
根据本发明，在具体的实施方案中，所述免疫反应性分析物不为leu-脑啡肽，并且不为met-脑啡肽。在另一具体的实施方案中，所述免疫反应性分析物为MR-脑啡肽原(MR ENK)或其具有至少5个氨基酸的片段。
这意味着在将与体液中的脑啡肽原(PENK)的氨基酸序列中的区域结合的结合剂用于本发明的方法的情况下，则术语“测定获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PENK)或其具有至少5个氨基酸的片段的水平”等价于“通过使用与获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PENK)的氨基酸序列中的区域结合的至少一种结合剂测定免疫反应性分析物的水平”。在具体的实施方案中，在本发明的方法中使用了与体液中的脑啡肽原(PENK)的氨基酸序列中的区域结合的结合剂。在具体的实施方案中，用于本发明的方法的所述结合剂不结合体液中的leu-脑啡肽或met-脑啡肽的氨基酸序列中的区域。在本发明的另一具体的实施方案中，所述至少一种结合剂结合MR-脑啡肽原(MRPENK)或其具有至少5个氨基酸的片段。
如本文所使用，术语“对象”是指活的人或非人的生物。优选地，在本文中，所述对象为人对象。如果在其他地方没有叙述，对象可为健康的或患病的。在本发明的一个实施方案中，所述对象未患中风。在另一实施方案中，所述对象不为急性中风患者。
术语“升高的水平”是指大于某个阈值水平的水平。术语“升高的”水平可指大于被当做参照水平的值的水平。
预测或监测治疗或干预的成功可为，例如使用脑啡肽原(PENK)或其具有至少5个氨基酸的片段的测量，来预测或监测肾脏替代疗法的成功。
预测或监测治疗或干预的成功可为，例如使用脑啡肽原(PENK)或其具有至少5个氨基酸的片段的测量，利用已接受肾脏替代疗法的患者中的透明质酸来预测或监测治疗的成功。
预测或监测治疗或干预的成功可为，例如使用PENK或其具有至少5个氨基酸的片段的测量，预测或监测肾脏替代疗法和/或药物干预之前和之后肾功能受损患者的肾功能恢复。
体液可选自包含以下的组：血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(csf)和唾液。
脑啡肽原或其片段的测定显示对象的肾功能。增加的脑啡肽原或其片段的浓度指示降低的肾功能。在随访测量中，脑啡肽原或其片段的相对改变与对象肾功能的改善(降低的脑啡肽原或其片段)和恶化(增加的脑啡肽原或其片段)相关。
脑啡肽原或其片段可用于诊断肾功能异常，其中升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象中的肾功能异常。在随访测试中，脑啡肽原或其片段的相对改变与对象肾功能异常的改善(降低的脑啡肽原或其片段)和恶化(增加的脑啡肽原或其片段)相关。
脑啡肽原或其片段比用于肾功能/功能异常诊断和随访的其他标记(NGAL、血液肌酸酐、肌酐清除率、胱抑素C、尿素)更优异。优异性是指更高的特异性、更高的灵敏度和与临床终点的更好的相关性。
将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象的不良事件或死亡风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测死亡或不良事件的风险增加。同样在该方面，脑啡肽原或其片段优于上述临床标记。
根据本发明的风险与如RIFLE标准(Venkatamaran and Kellum,2006)所定义的风险相关。
病人可患有选自下述的疾病：对炎症的免疫反应引起的慢性肾衰竭、由减少的血流引起的急性肾衰竭(其可与由创伤引起的极低血压一起发生)、创伤患者、手术、中风、急性和慢性肾衰竭、SIRS患者、败血症、败血性休克、中风、急性心肌梗死和心肌梗死后、急性和慢性心力衰竭、局部和系统性细菌和病毒感染、自身免疫性疾病、烧伤患者、癌症、肝病、肺病、接受肾毒素如环孢霉素、抗生素(包括氨基糖苷类和抗癌药物如顺铂)的患者。
支持或替代肾功能的治疗或干预可包括各种肾替代疗法的方法，包括但不限于：血液透析、腹膜透析、血液滤过和肾移植。
不良事件可选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化(根据RIFLE标准，Venkatamaran andKellum,2006)。
在本发明的一个实施方案中，应理解，术语脑啡肽原的片段也包含Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽。
根据本发明的主题为方法，其中通过使用与脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段结合的结合剂、至少一种结合剂，测定了脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平。在本发明的一个实施方案中，所述结合剂选自包含以下的组：与脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig支架。在具体的实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的组的序列的区域结合。在具体的实施方案中，所述结合剂不结合脑啡肽——[Met]脑啡肽SEQ ID No:3和[Leu]脑啡肽SEQ ID No:4。在具体的实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.1、2、5、6、7、8、9和10的组的序列的区域结合。在另一具体的实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.2、5、6和10的组的序列的区域结合。在另一非常具体的实施方案中，所述结合剂与脑啡肽原119-159、中间区脑啡肽原-片段、MRPENK结合。
脑啡肽原具有以下序列：
SEQ ID NO.1(脑啡肽原(1-243)
ECSQDCATCSYRLVRPAD1NFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLAKRYGGFMKRYGGFMKKMDELYPMEPEEEANGSEILAKRYGGFMKKDAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVSKRYGGFMRGLKRSPQLEDEAKELQKRYGGFMRRVGRPEWWMDYQKRYGGFLKRFAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGF MRF
体液中可测定的脑啡肽原的片段，例如可为选自如下片段：
SEQ ID NO.2(合成脑啡肽，脑啡肽原1-73)
ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLA
SEQ ID NO.3(Met-脑啡肽)
YGGFM
SEQ ID NO.4(Leu-脑啡肽)
YGGFL
SEQ ID NO.5(脑啡肽原90-109)
MDELYPMEPEEEANGSEILA
SEQ ID NO 6：(脑啡肽原119-159，中间区脑啡肽原-片段，MPENK)
DAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVS
SEQ ID NO.7(Met-脑啡肽-Arg-Gly-Leu)
YGGFMRGL
SEQ ID NO.8(脑啡肽原172-183)
SPQLEDEAKELQ
SEQ ID NO.9(脑啡肽原193-203)
VGRPEWWMDYQ
SEQ ID NO.10(脑啡肽原213-234)
FAEALPSDEEGESYSKEVPEME
SEQ ID NO.11(脑啡肽原213-241)
FAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGF M
SEQ ID NO.12(Met-脑啡肽-Arg-Phe)
YGGFMRF
测定包含Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽的脑啡肽原或其片段的水平，可指测定对包含Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽的脑啡肽原或其片段的免疫反应性。用于基于结合区来测定包含Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽的脑啡肽原或其片段的结合剂，可结合多于一种上述分子。这对本领域技术人员来说是清楚的。
因此，根据本发明，通过使用与任何上述肽和肽片段(即，序列1-12中任一个所示的脑啡肽原(PENK)和片段)的氨基酸序列中的区域结合的至少一种结合剂，测定了获自所述对象的体液中的免疫反应性分析物的水平；并与临床相关的特定实施方案相关联。
在根据本发明的方法的更具体的实施方案中，测定了MRPENK(SEQID NO.6:脑啡肽原119-159,中间区脑啡肽原-片段,MRPENK)的水平。在更具体的实施方案中，通过使用与MR-PENK结合的至少一种结合剂，测定了免疫反应性分析物的水平，并将其与根据本发明的上述实施方案和临床相关的特定实施方案相关联，例如
·将所述免疫反应性分析物的水平与对象的肾功能相关联，或
(b)将所述免疫反应性分析物的水平与肾功能异常相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或
(c)将所述免疫反应性分析物的水平与所述患病对象中的不良事件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风险增加，或
(d)将所述免疫反应性分析物的水平与患病对象治疗或干预的成功相关联，其中小于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。
可选地，可通过其他分析方法如质谱测定上述分析物中的任一种的水平。
因此，本发明的主题为方法，其被用于(a)诊断或监测对象的肾功能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测治疗或干预的成功，所述方法包括
·通过使用与获自所述对象的体液中的选自包含SEQ ID No.1-12所示的肽和片段的组的肽氨基酸序列中的区域结合的至少一种结合剂，测定免疫反应性分析物的水平；以及
(a)将所述脑啡肽原或其片段的水平与对象的肾功能相关联，或
(b)将所述脑啡肽原或其片段的水平与肾功能异常相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或
(c)将所述脑啡肽原或其片段的水皮与所述患病对象中的不良事件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风险增加，或
(d)将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象治疗或干预的成功相关联，其中小于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。
在具体的实施方案中，通过使用与选自包含脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的组的肽氨基酸序列中的区域结合的至少一种结合剂，测定了免疫反应性分析物的水平。在具体的实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的组的序列的区域结合。在具体的实施方案中，所述结合剂不结合脑啡肽——[Met]脑啡肽SEQ ID No:3和[Leu]脑啡肽SEQ ID No:4。在具体的实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.1、2、5、6、7、8、9和10的组的序列的区域结合。在另一具体的实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.2、5、6和10的组的序列的区域结合。在另一非常具体的实施方案中，所述结合剂与脑啡肽原119-159、中间区脑啡肽原-片段、MRPENK结合。上述结合剂与所述获自所述对象的体液中的肽结合。
在本发明的一个实施方案中，所述结合剂选自包含以下的组：与脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig-支架。
在更具体的实施方案中，通过使用与获自所述对象的体液中的脑啡肽原119-159、中间区脑啡肽原-片段、MRPEN(SEQ ID No.6)的氨基酸序列中的区域结合的至少一种结合剂，测定了免疫反应性分析物的水平。
在具体的实施方案中，通过使用与脑啡肽原或其片段结合的抗体或抗体片段的免疫分析，测量了脑啡肽原或其片段的水平。可用于测定脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平的免疫分析，可包括实施例1中所示的步骤。所有阈值和值都必须理解为与根据实施例1所使用的测试和校准相关。本领域技术人员可了解阈值的绝对值可能受到所用校准影响。这意味着应当在本文(实施例1)中所用校准的上下文中理解本文给出的所有值和阈值。
根据本发明，针对脑啡肽原的诊断性结合剂选自：抗体如IgG(一种典型的全长免疫球蛋白)，或至少包含重链和/或轻链的F-可变域的抗体片段如化学偶联的抗体(结合抗原的片段)，包括但不限于Fab-片段，包括具有表位标签如Fab-V5Sx2的Fab小抗体、单链Fab抗体、单价Fab抗体；与CH3结构域二聚化的二价Fab(小抗体)；二价Fab或多价Fab，例如在异源结构域的帮助下通过多聚化形成的，例如通过dHLX结构域的二聚化形成的如Fab-dHLX-FSx2；F(ab')2-片段、scFv-片段、多聚化的多价或/和多特异性scFv-片段、二价和/或双特异性双体、(双特异性T细胞连接物)、三功能抗体、多价抗体，例如来自不同于G的类型；单结构域抗体如来源于骆驼或鱼免疫球蛋白的纳米抗体。
在具体的实施方案中，通过利用与脑啡肽原或其片段结合的、选自包含在下文有更详细描述的适配子、非Ig支架的组的结合剂的分析来测量脑啡肽原或其片段的水平。
可用于测定脑啡肽原或其片段水平的结合剂展现的对脑啡肽原的亲和常数为至少107M-1，优选108M-1，优选的亲和常数大于109M-1，最优选大于1010M-1。本领域技术人员了解，可考虑通过施用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和力，并且这一措施不会导致本发明超范围。可使用Biacore法测定结合亲和力，所述方法在例如Biaffin,assel,Germany(http://www.biaffin.com/de/)处被提供为服务分析。
人脑啡肽原对照样品购自ICI-Diagnostics,Berlin,Germanyhttp://www.ici-diagnostics.com/。还可通过合成(对于我们的实验，我们使用了合成的MRPENK,SEQ ID NO.6)或重组的脑啡肽原或其片段来校准该分析。
除了抗体，其他生物聚合物支架是本领域熟知的用于复合靶标分子的物质，并且已被用于生成高靶标特异性的生物聚合物。实例为适配子、Spiegelmer、抗运载蛋白(anticalin)和芋螺毒素。非Ig支架可为蛋白支架，并且可用作抗体模拟物，因为它们能够结合配体或抗原。非Ig支架可选自包含以下的组：基于四连接素的非Ig支架(例如，描述于US2010/0028995中的)、纤连蛋白支架(例如，描述于EP 1266 025中的；基于脂运载蛋白的支架(例如，描述于WO 2011/154420中的)；泛素支架(例如，描述于WO 2011/073214中的)、转运支架(例如，描述于US2004/0023334中的)、蛋白A支架(例如，描述于EP 2231860中的)、基于锚蛋白重复的支架(例如，描述于WO 2010/060748中的)、微量蛋白，优选形成胱氨酸结的微量蛋白)支架(例如，描述于EP 2314308中的)、基于Fyn SH3结构域的支架(例如，描述于WO 2011/023685中的)、基于EGFR-A-结构域的支架(例如，描述于WO 2005/040229中的)和基于Kunitz结构域的支架(例如，描述于EP 194 867中的)。
用于诊断肾病/肾功能异常或测定死亡或不良事件的风险的阈值可为正常范围上限(99百分位数,80pmol MRPENK/L,更优选100pmol/L，更优选120pmol/L)。75-130pmol MRPENK/L的阈值范围是可用的。
在一个具体的实施方案中，通过免疫分析来测量脑啡肽原的水平，并且所述结合剂为与脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段结合的抗体或抗体片段。
在一个具体的实施方案中，所述分析使用了包含与脑啡肽原区中的两个不同区域即氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)结合的两种结合剂，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，所述分析的分析灵敏度能够定量健康对象的脑啡肽原或脑啡肽原片段，并且<15pmol/L，优选<10pmol/L，并且更优选L<6pmol/L。
本发明的主题为在下述方法中将与获自所述对象的体液中的选自包含SEQ ID No.1-12所示的肽和片段的组的肽氨基酸序列中的区域结合的至少一种结合剂应用于：(a)诊断或监测对象的肾功能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测治疗或干预的成功。在本发明的一个实施方案中，所述结合剂选自包含以下的组：与脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig支架。在具体的实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的组的序列的区域结合。在具体的实施方案中，所述结合剂不结合脑啡肽——[Met]脑啡肽SEQ ID No:3和[Leu]脑啡肽SEQ ID No:4。在具体的实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.1、2、5、6、7、8、9和10的组的序列的区域结合。在另一具体的实施方案中，所述至少一种结合剂与具有选自包含SEQ ID No.2、5、6和10的组的序列的区域结合。在另一非常具体的实施方案中，所述结合剂与脑啡肽原119-159、中间区脑啡肽原-片段、MRPENK结合。
在更具体的实施方案中，至少一种结合剂与获自所述对象的体液中的脑啡肽原119-159、中间区脑啡肽原-片段、MRPEN(SEQ ID No.6)的氨基酸序列中的区域结合，更具体地，与氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)和/或氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)结合，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
因此，根据本方法，测定了获自所述对象的体液中的上述结合剂的免疫反应的水平。免疫反应性的水平是指通过结合剂与这类分析物的结合反应来定量、半定量或定性测定的分析物的浓度，其中优选地，所述结合剂具有的结合所述分析物的亲和常数为至少108M-1，并且所述结合剂可为抗体或抗体片段或非IgG支架，并且结合反应为免疫分析。
本发明方法使用PENK及其片段，特别是MRPENK，其在下述用途中远优于现有技术中使用的方法和生物标记：(a)诊断或监测对象的肾功能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测治疗或干预的成功。首先，作为用于上述应用的生物标记的所有PENK及其片段是炎症非依赖性标记。这是重要的特征，因为大多数已知的肾生物标记如NGAL和KIM是炎症依赖性的，意味着如果对象具有炎症，例如在败血症中，NGAL或KIM的升高可能是由于炎症或由于肾功能/功能异常。因此，不可进行差别诊断，至少通过使用独立于研究的特定患者群体的简单的阈值(意指一个(1)阈值)不行。对于NGAL和KIM，根据所述对象的炎症状态，每名患者具有针对肾功能/功能异常的“单个的”阈值，这使得这些肾标记难以在临床上应用于一些疾病，并且不能应用于其他疾病。与之相反，独立于对象的炎症状态的单个阈值可根据本方法用于所有对象。这使得本方法适于临床途径，这与上述标记相反。
与NGAL和KIM相反(它们反映了肾损伤和炎症)，在本发明的方法中作为生物标记的PENK及其片段，特别是MRPENK，反映了“真实的”肾功能。
因此，本发明的主题为方法，其被用于：(a)诊断或监测对象的肾功能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测具有上述步骤和特征的治疗或干预的成功，其中使用了炎症状态非依赖性阈值。
上述方法以及PENK及片段在用于如下方法中用作生物标记的另一优势在于PENK及片段作为生物标记为肾功能、肾功能异常、不良事件的风险、治疗或干预的成功的非常早期的生物标记：所述方法用于：(a)诊断或监测对象的肾功能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测治疗或干预的成功。非常早期意味着例如，比肌酸酐早、比NGAL早。
PENK相比肌酸酐的优势的一个明显指征来源于，承认他们的7天死亡率当天在危重患者中测定的各自浓度的相关性分析：存活者的PENK浓度明显不同于未存活者，然而对于肌酐清除率来说却并非如此。此类患者群体的死亡主要起因于肾功能丧失。因此，相比与肌酐清除率的相关性，PENK与死亡的相关性更显著和更强，这支持了PENK作为肾功能异常标记相比肌酐清除率的优势。
本发明的主题还为方法，其被用于(a)诊断或监测对象的肾功能，或(b)诊断对象的肾功能异常，或(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，或(d)预测或监测支持或替代肾功能的治疗或干预的成功，所述治疗或干预包括肾替代疗法的各种方法，包括但不限于根据任何前述实施方案的血液透析、腹膜透析、血液滤过和肾移植，其中单独使用或结合其他可用于诊断的实验或临床参数使用了获自所述对象的体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平，所述方法可选自如下的替代性选择：
·与获自所述对象的体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平的中值比较，所述对象位于“健康的”或“表面上健康的”对象群体的预定样品的整体中，
·与获自所述对象的体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平的分位数比较，所述样品位于“健康的”或“表面上健康的”对象群体的预定样品的整体中，
·基于Cox比例风险分析或通过使用风险指数计算如NR1(净重新分类指数)或IDI(整合鉴别指数)进行计算。
可确定所述其他至少一个临床参数，其选自包含以下的组：年龄、NGAL、胱抑素C、肌酐清除率、肌酸酐、尿素和Apache评分。
在本发明的一个实施方案中，为了监测所述对象的功能或功能异常或风险，或为了监测肾和/或疾病治疗的过程，所述方法进行了多于一次。在一个具体的实施方案中，为了评估所述对象对采取的预防性和/或治疗性措施的反应而进行所述监测。
在本发明的一个实施方案中，使用了所述方法以将所述对象分级为风险组。
本发明的主题还为用于测定样品中的脑啡肽原和脑啡肽原片段的分析，其包含与脑啡肽原区中的两个不同区域即氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID NO.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)结合的两种结合剂，其中所述区域中的每个包含至少4或5个氨基酸。
在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，所述分析的分析灵敏度能够定量健康对象的脑啡肽原或脑啡肽原片段，并且<15pmol/，优选<10pmol/L，并且更优选L<6pmol/L。
在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，所述结合剂展现的与脑啡肽原的结合亲和力为至少107M-1，优选108M-1，优选亲和常数小于109M-1，最优选小于1010M-1。本领域技术人员了解，可考虑通过施用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和力，并且这一措施不会导致本发明超范围，可按如上所述测定结合亲和力。
在本发明的一个实施方案中，其可为所谓的POC-检测(现场护理，point-of-care)，即允许在少于1小时内在患者附近实施测试而不需要全自动测试系统的测试技术。该技术的一个实例为免疫层析测试技术。
在本发明的一个实施方案中，这样的分析为三明治型免疫分析，其使用任何类型的检测技术，包括但不限于：酶标记、化学发光标记、电化学发光标记，优选全自动的分析。在本发明的一个实施方案中，这样的分析为酶标记的三明治型分析。自动化或全自动化分析的实例包括可用于下述体系中一种的分析：RocheAbbottSiemensBrahmsBiomerieuxAlere
多种免疫分析是已知的，并且可用于本发明的分析和方法，这些包括：放射免疫分析(“RIA”)、均质酶放大免疫分析(“EMIT”)、酶联免疫吸附分析(“ELISA”)、脱辅酶再活化免疫分析(“ARIS”)、量尺免疫分析和免疫-色谱分析。
在本发明的一个实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种被标记以被检测。
优选的分析方法包括各种形式的免疫分析，如放射免疫分析(RIA)、化学发光和荧光免疫分析、酶联免疫分析(ELISA)、基于Luminex的珠子分析、蛋白微阵列分析和快速测试形式如免疫层析试纸条测试。
在优选的实施方案中，所述标记选自包含以下的组：化学发光标记、酶标记、荧光标记、放射碘标记。
所述分析可为同源或异源的分析、竞争性的和非竞争性的分析。在一个实施方案中，分析为三明治型分析形式，其为非竞争性的免疫分析，其中待检测和/或定量的分子与第一抗体和第二抗体结合。第一抗体可与固相如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或试纸条(strip)结合，并且第二抗体为例如以染料、放射性同位素或者反应性或催化反应性部分标记的抗体。然后通过合适的方法测量与分析物结合的标记抗体的量。与“三明治型分析”相关的一般组成和程序已确定并且为技术人员所知(23)。
在另一实施方案中，所述分析包括两种捕获分子，优选均为在液体反应混合物中作为分散体存在的抗体，其中第一标记组分与第一捕获分子连接，其中所述第一标记组分为基于荧光或化学冷光淬灭或放大的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二标记组分与第二捕获分子连接，使得在两种捕获分子与所述分析物结合后，产生能够检测在包含样品的溶液中形成的三明治复合物的可测量的信号。
在另一实施方案中，所述标记系统包含与荧光染料或化学发光染料特别是花青类型染料结合的稀土穴状化合物或稀土螯合物。
在本发明的上下文中，基于荧光的分析包括使用染料，例如其可选自包含以下的组：FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、IRD-700/800、花青染料如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、占吨(Xanthen)、6-羧基-2’4’7’4,7-六氯代荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、5-羧基若丹明-6G(R6G5)、6-羧基若丹明-6G(RG6)、若丹明、若丹明绿、若丹明红、若丹明110、BODIPY染料如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素如伞形酮、苯甲亚胺如Hoechst33258；菲啶如德克萨斯红、亚基马黄(Yakima Yellow)、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶染料、咔唑染料、吩恶嗪染料、紫菜碱染料、聚甲炔染料等。
在本发明的上下文中，基于化学发光的分析包括基于(24)中描述的化学发光物质的物理原理使用染料。优选的化学发光染料为吖啶酯。
如本文所提及，“分析”或“诊断分析”可为诊断领域中应用的任何类型。这样的分析可基于待检测的分析物与具有某种亲和力的一种或多种捕获探针的结合。考虑到捕获分子与靶标分子或目的分子之间的相互作用，亲和常数优选大于108M-1。
在本发明的上下文中，“结合剂分子”为可用于结合来自样品的靶标分子或目的分子即分析物(即，在本发明的上下文中，PENK及其片段)的分子。因此，结合剂分子必须在空间上和表面特征如表面电荷、疏水性、亲水性、有无Lewis供体和/或受体形式上充分成形，以特异性结合所述靶标分子或目的分子。因此，所述结合可，例如通过离子、范德瓦尔斯、π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用，或者捕获分子与靶标分子或目的分子之间的两种或更多种上述相互作用的组合来介导。在本发明的上下文中，结合剂分子可，例如选自包含以下的组：核酸分子、糖类分子、PNA分子、蛋白、抗体、肽或糖蛋白。优选地，所述结合剂分子为抗体，包括其与靶标或目的分子具有足够亲和力的片段，并且包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体的化学和/或生物改良的衍生物，或来源于其变体链的至少12个氨基酸长度的片段。
化学发光标记可为吖啶酯标记、类固醇标记，包括异鲁米诺标记等。
酶标记可为乳酸盐脱氢酶(LDH)、肌磷酸酶(CPK)、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、酸性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。
在本发明的一个实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种与作为磁性粒子和聚苯乙烯表面的固相结合。
在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，该分析为三明治型分析，优选为全自动的分析。其可为ELISA全自动的或手动的。其可为所谓的POC检测(现场护理)。自动或全自动分析的实例包括可用于下述体系中一种的分析：RocheAbbottSiemensBrahmsBiomerieuxAlere测试形式的实例在上文有提供。
在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种被标记以被检测。标记的实例在上文有提供。
在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种与固相结合。固相的实例在上文有提供。
在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，所述标记选自包含以下的组：化学发光标记、酶标记、荧光标记、放射碘标记。本发明的其他主题为包含根据本发明的分析的试剂盒，其中所述分析的组分可包含在一个或多个容器中。
在一个实施方案中，本发明的主题为用于实施根据本发明的方法的现场护理装置(point-of-care device)，其中所述现场护理装置包含针对氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)或氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)的至少一种抗体或抗体片段，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的主题为用于实施根据本发明的方法的现场护理装置，其中所述现场护理装置包含针对氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)的至少两种抗体或抗体片段，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的主题为实施根据本发明的方法的试剂盒，其中所述现场护理装置包含针对氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ IDNo.13)或氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)的至少一种抗体或抗体片段，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的主题为用于实施根据本发明的方法的试剂盒，其中所述现场护理装置包含针对氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)的至少两种抗体或抗体片段，其中每个所述区域包含至少4或5个氨基酸。
实施例
实施例1
抗体的开发
肽
合成了肽(JPT Technologies,Berlin,Germany)。
用于免疫的肽/缀合物：
合成了用于免疫的、具有另外的用于连接所述肽与牛血清白蛋白(BSA)的N-端半胱氨酸残基的肽(JPT Technologies,Berlin,Germany)。通过使用硫代-SMCC(Perbio-science,Bonn,Germany)将所述肽与BSA共价连接。根据Perbio手册实施连接方案。
表1：
用于免疫的肽 脑啡肽原序列
(C)DAEEDD 119-125
(C)EEDDSLANSSDLLK 121-134
(C)LKELLETG 133-140
(C)TGDNRERSHHQDGSDNE 139-155
(C)SDNEEEVS 152-159
根据下述方法产生了抗体：
在第0天和14天以100μg肽-BSA缀合物(在100μl完全弗氏佐剂中乳化)免疫BALB/c小鼠，并在第21和28天以50μg(在100μl不完全弗氏佐剂中)免疫。在进行融合实验前3天，动物接受了溶解于100μl盐水中的50μg缀合物，给出为一次腹膜内和一次静脉内注射。
37℃下将来自免疫的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞与1ml 50％聚乙二醇融合30s。洗涤后，将细胞接种在96-孔细胞培养平板中。通过在HAT培养基[RPMI 1640培养基，补充有20％胎牛血清和HAT-补充物]中培养来挑选杂合子克隆。2周后，将HAT培养基替换为HT培养基，传代3代，然后回复至正常细胞培养基。
在融合后3周，首先筛选细胞培养上清液的抗原特异性IgG抗体。将阳性测试微量培养物转移至24-孔板用于繁殖。再次测试后，使用有限稀释技术来克隆和再克隆所挑选的培养物，并测定了同种型。
(Lane,R.D.“A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique forincreasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas”,J.Immunol.Meth.81:223-228；(1985),Ziegler,B.et al.“Glutamatedecarboxylase(GAD)is not detectable on the surface of rat islet cellsexamined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediatedcytotoxicity of monoclonal GAD antibodies”,Horm.Metab.Res.28:11-15,(1996))。
单克隆抗体制备
通过标准抗体制备方法(Marx et al.,Monoclonal Antibody Production(1997),ATLA 25,121)制备抗体，并通过蛋白A-色谱法纯化。基于SDS凝胶电泳分析的抗体纯度>95％。
抗体的标记和包被。
根据以下方案用吖啶酯标记所有抗体：
标记的化合物(示踪物)：j2100μg(100μl)抗体(1mg/ml,于PBS中,pH7.4)与10μl吖啶NHS-酯(1mg/ml,于乙腈中,InVent GmbH,Germany)(EP0353971)混合，并在室温下孵育20min。在Bio-Sil SEC 400-5(Bio-RadLaboratories,Inc.,USA)上通过凝胶过滤HPLC来纯化标记的抗体。将纯化的标记抗体稀释在(300mmol/l磷酸钾、100mmol/l NaCl、10mmol/lNa-EDTA、5g/l牛血清白蛋白，pH 7.0)中。终浓度为每200μl约800.000相对光单位(RLU)的标记的化合物(约20ng标记的抗体)。
通过使用AutoLumat LB 953(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)来测量吖啶酯化学发光。
固相抗体(包被的抗体)：
固相：用抗体(1.5μg抗体/0.3ml 100mmol/l NaCl,50mmol/l Tris/HCl,pH 7.8)包被聚苯乙烯管(Greiner Bio-One International AG,Austria)(18h，室温)。在用5％牛血清白蛋白封闭后，用PBS,pH 7.4洗涤管子，并真空干燥。
抗体特异性
表2：
用于免疫的肽 前脑啡肽原序列 抗体名称
(C)DAEEDD 119-125 NT-MRPENK
(C)EEDDSLANSSDLLK 121-134 NM-MRPENK
(C)LKELLETG 133-140 MR-MRPENK
(C)TGDNRERSHHQDGSDNE 139-155 MC-MRPENK
(C)SDNEEEVS 152-159 CT-MRPENK
按如下所述测定抗体交叉反应：
将于300μl PBS,pH 7,4中的1μg肽移取至聚苯乙烯管中，并在室温下孵育1h。孵育后，使用于PBS,pH 7,4中的5％BSA将管子洗涤5次(每次1ml)。添加每种标记的抗体(300μl于PBS中,pH 7.4,800.000RLU/300μl)，并在室温下孵育2h。在洗涤5次(每次1ml的洗涤溶液(20mmol/l PBS,pH 7.4,0.1％Triton X 100)后，使用AutoLumat LB 953定量剩余的冷光(标记的抗体)。将MRPENK-肽用作参照物质(100％)。
不同抗体的交叉反应性列出在表3中。
表3：
所有抗体均结合MRPENK肽，这与用于免疫的肽相当。除了NT-MRPENK-抗体(与EEDDSLANSSDLLK的10％的交叉反应)外，没有抗体显示与不用于单个抗体免疫的MR-PENK片段的交叉反应。
脑啡肽原免疫分析：
将50μl的样品(或校准物)吸入至包被的管中，在添加标记的抗体(200μl)后，将管子在18-25℃下孵育2h。通过用洗涤溶液(20mmol/l PBS,pH7.4,0.1％Triton X-100)洗涤5次(每次1ml)来去除未结合的示踪物。通过使用Luminumeter 953和固定浓度的1000pmol/l的MRPENK测量与管子结合的标记的抗体。不同抗体组合的信号(RLU,1000pmol MRPENK/l)与噪声(RLU，无MRPENK)比给出在表4中。所有抗体均能够与任何其他抗体产生三明治复合物。令人吃惊地，通过将MR-MRPENK和CT-MRPENK抗体组合产生了最强的信噪比(最佳灵敏度)。随后，我们使用该抗体组合进行MRPENK-免疫分析，用于进一步研究。将MR-MRPENK抗体用作管子包被抗体，并将CT-MRPENK抗体用作标记的抗体。
表4：
校准：
使用稀释于20mM K2PO4、6mM EDTA、0.5％BSA、50μΜ氨肽酶抑制剂、100μΜ亮抑酶肽,pH 8.0中的合成的MRPENK的溶液来校准所述分析。脑啡肽原对照血浆购自ICI-diagnostics,Berlin,Germany。
图1显示了典型的脑啡肽原剂量/信号曲线。
分析灵敏度为20次测定0-校准物(未添加MRPENK)+2SD)5.5pmol/L。
肌酐清除率
使用MDRD公式(参见Levey et al,2009)测定肌酐清除率。
实施例2：
健康对象的PENK
使用MRPENK分析测量了健康对象(n＝4211,平均年龄为56岁)。均值为44.7pmol MRPENK/L，最小值为9pmol/L，并且第99百分位数为80pmol/L。由于分析灵敏度为5.5pmol/L，使用所描述的MRPENK分析，可检测100％的所有健康对象(参见图2)。
脑啡肽原与具有正常肾功能的健康对象中的肌酐清除率相关。
令人吃惊地，脑啡肽原与健康对象中的肌酐清除率成负相关(r＝-0.33,p<0.0001)，参见图3。男性比女性中的相关系数略高(r＝-0.34相对-0.29,均为p<0.0001)。这些数据指示了PENK与肾功能之间的强相关性。
图3：健康对象中肌酐清除率相对于PENK的相关性。Y轴：肌酐清除率的四分位数，x轴：PENK的四分位数。
实施例3：
慢性和急性疾病患者中的PENK与肾功能(肌酐清除率)的相关性。
表5：
在急性疾病中PENK总是与肌酐清除率显著相关，该相关性比慢性疾病或健康对象中的强。
实施例4：重症患者中的PENK
为了研究急性临床环境中PENK对诊断肾衰竭的诊断性能，我们进行了以下临床研究：
临床研究
随后将符合败血症定义(Crit Care Med.2008Jan；36(1):296-327)的101名ED患者安排住院(平均住院5天)，并接受标准的5天护理治疗。从第1天(ED表现)起产生EDTA-血浆，并在住院期间每天取样一次。用于后面的分析物测量的样品的冷冻时间少于4h。
患者特征概述在表6中：
表6：
所有患者中的26.7％在住院期间死亡，并被视为治疗未响应者，所有患者中的73.3％从败血症存活，并被视为治疗响应者。
患败血症的所有患者中的53％具有异常的PENK值>80pmol/L(99百分位数)，表明PENK不是感染的标记物。
临床研究的结果：
PENK与肌酐清除率高度相关(r＝-0.74,p<0.0001,图4)。
PENK诊断肾功能异常：
基于RIFLE标准(Venkatamaran and Kellum,2007)定义肾功能异常。如果符合任何RIFLE分类因子，则患者被视为肾功能异常。在研究群体中，我们在第1天(ED表现)测定了90名对象的RIFLE，39名患者符合RIFLE分类(具有肾病、肾损伤、肾衰竭、肾功能丧失或终末期肾病的风险)，并且51名患者无肾功能异常。增加的PENK与肾功能异常显著相关(p＝<0.0001)(AUC:0.868)(图5和6)。
为了比较肾功能异常的诊断价值，我们使用NGAL作为参照标记(Soni et al,2010)。使用商购ELISA(NGAL Elisa试剂盒,Bioporto,Gentofte,Denmark)测量了NGAL。
如同PENK，肾功能异常患者中NGAL显著增加(p<0.0001)，诊断肾功能异常的AUC为0.809(图7和8)。
比较PENK和NGAL显示出，PENK相对于NGAL对诊断肾功能异常的较强优势：相对于NGAL的32.21，PENK的Chi2值为45.32，显示PENK诊断品质的40％改善(特异性和灵敏度)(表7)。
表7：
初始PENK具有高度预测性。
我们将初始PENK值与院内死亡率相关联，并比较PENK与APACHE2败血症评分(参见Knaus et al,1985,2001)和肌酐清除率。PENK对败血症结果具有高度预后性(参见图9)，且与APACHE 2评分相当(AUC/C指数0.744(PENK)和0.783(Apache)。如果组合PENK和APACHE 2，则将具有显著增加的信息(组合的AUC:0.794图10)。相比肌酐清除率，PENK预后要强得多(AUC 0.638)。令人吃惊地，PENK的预后价值在第一天的ICU治疗后更强(AUC 0.79)。
在1天的ICU治疗后使用基线样品和1个样品院内死亡预后的阈值分析。
由于PENK的预后能力在开始ICU治疗后一天得到进一步改善，我们分析了在ICU治疗前当天和开始ICU治疗后1天的系列测量的PENK。为了说明临床性能，我们使用了100pmol/L阈值的简单阈值分析。
如果患者在住院时小于阈值且在开始ICU治疗后保持小于该阈值，则死亡率为11％(住院之前和期间得到良好治疗)。如果PENK在两个时间点大于该阈值，则死亡率为约5倍高(52.5％)(不响应治疗)，并且如果患者出现的PENK值大于100pmol/l且在ICU治疗期间其PENK水平降至小于100pmol/l，则死亡率为0(治疗响应者)。这些数据显示PENK与治疗成功的强相关性，支持其可用于持续治疗(系列测试)。
表8：
图11a-d:患者持续测量的实例。
a)初始PENK<100pmol/L且在住院期间保持<100pmol/L的患者(存活者)。
b)初始PENK>100pmol/L且未降至值<100pmol/L的患者(住院期间死亡)。
c)初始PENK>100pmol/L且未降至值<100pmol/L的患者(住院期间死亡)。
d)初始PENK>100pmol/L、在一天的ICU治疗内PENK值降至值<100pmol/L的患者(存活者)。
实施例5:使用PENK的系列测量
在实施例4中描述的患者(患败血症、重症败血症或败血性休克的患者)群体中，在确认当天和随后一天(第1天)测量了血浆PENK。使用100pmol/L的简单阈值(其接近正常范围的第99百分位数)，将群体分成两组(大于和小于100pmol/L)，并且相应的7天存活率如Kaplan-Meier图(图16a和b))所示。在确认当天具有小于100pmol/L的PENK浓度的患者，其PENK浓度在第1天保持小于100pmol/L，其具有87％的高存活率，然而，当其PENK浓度在第1天增加超过100pmol/L时，存活率降至67％。相反，PENK浓度在确认当天大于100pmol/L的患者，其PENK浓度在第1天保持大于100pmol/L，其具有仅50％的较差存活率，然而，当其PENK浓度在第1天下降为小于100pmol/L时，存活率为100％。
实施例6：
使用在确认当天测定的实施例4中描述的患者群体(患败血症、重症败血症或败血性休克的患者)的血浆PENK浓度，通过多元线性回归分析对其进行分析，所述参数/变量确定PENK浓度的程度。在图17中示出了偏R2。该分析表明肾功能的测量(在显示肌酐清除率的情况下)为PENK浓度的最强决定因素。
表9：
表9:在确认7天死亡率当天测定的实施例4中所述的患者群体的变量组合。
男性中的PENK
使用PENK作为预后标记，在男性群体的医院内死亡预后中，在第一天(ED表现)的PENK甚至要更强(AUC 0.849,图12)，相对于仅Apache的0.837，PENK与Apache的组合产生0.89的AUC(图13)。相对于仅肌酐清除率的0.721，PENK与肌酐清除率的组合产生更优的AUC 0.91的预后值(图14)。对于整个患者群体，在第一天的ICU治疗后，PENK的预后值更强(第2天,AUC 0.872)。
附图说明
图1:显示了典型的脑啡肽原剂量/信号曲线。标准曲线脑啡肽原
图2:健康群体中脑啡肽原的频率分布(n＝4211)
PENK的均值为44.7pmol/L，标准偏差＝1.27,该99百分位数(正常范围上限)为80pmol PENK/L。图2显示了PENK的LN值。
图3:健康对象中肌酐清除率相对于PENK的相关性。Y轴:肌酐清除率的四分位数,x轴:PENK的四分位数。
图4:PENK与肌酐清除率高度相关(r＝-0.74,p<0.0001)。
图5:增加的PENK与肾功能异常显著相关。
图6:脑啡肽原的受试者/操作者曲线(ROC)，以及根据RIFLE标准(参见上文)诊断肾功能异常。曲线下的面积(AUC)为0.868，显示了脑啡肽原对肾功能异常的强诊断能力。
图7:增加的NGAL在具有肾功能异常的患者显著增加。NGAL的正常范围(范围0.037-0.106μg/mL；http://www.bioporto.com/products/bioporto_diagnostics/ngal_elisa_kits/ngal_rapid_elisa_kit_ce_ivd)如图中的阴影区域所示。
图8:NGAL的受试者/操作者曲线(ROC)，以及根据RIFLE标准(参见上文)诊断肾功能异常。我们使用NGAL作为肾功能异常的参照标记。AUC为0.809，显著小于脑啡肽原的值(AUC 0.868,图6)，指示了脑啡肽原的增值。
图9:PENK高度预后败血症结果。
图10:如果PENK与APACHE 2组合，将存在明显增加的信息。
图11a):患者(存活者)初始PENK<100pmol/L，且在住院期间保持<100pmol/L。
图11b):患者(在住院期间死亡)初始PENK>100pmol/L，且未降至值<100pmol/L。
图11c):患者(在住院期间死亡)初始PENK>100pmol/L，且未降至值<100pmol/L。
图11d):患者(存活者)初始PENK>100pmol/L，PENK值在一天的ICU治疗内降至值<100pmol/L。
图12:在男性群体的医院内死亡预后中，在第1天(ED表现)的PENK甚至要更强。
图13:相对于仅Apache的0.837，PENK和Apache的组合产生了0.89的AUC。
图14:相对于仅肌酐清除率的0.721，PENK和肌酐清除率的组合产生了AUC 0.91的更优的预后值。
图15:图15A/B:分别为通过急性肾功能异常等级分类的败血症患者中的血浆PENK(A)和NGAL(B)的浓度。0＝无肾功能异常；R＝风险；I＝损伤；F＝衰竭；L＝丧失。分类定义如下：(http://en.wikipedia.org/wiki/Acute_kidney_injury):风险:6小时的GFR下降>25％,血清肌酸酐增加1.5倍或尿素产生<0.5ml/kg/hr；损伤:12小时的GFR下降>50％,肌酸酐翻倍或尿素产生<0.5ml/kg/hr；衰竭:24小时的GFR下降>75％,肌酸酐为3倍或肌酸>355μmol/l(增加>44)(>4mg/dl)或者尿素输出小于0.3ml/kg/hr；丧失:多于4周的持续性AKI或肾功能完全丧失。PENK(参见图2)和NGAL的正常范围(范围0.037-0.106μg/mL；http://www.bioporto.com/products/bioporto_diagnostics/ngal_elisa_kits/ngal_rapid_elisa_kits_ce_ivd)浓度如图中的阴影区域所示。该图说明甚至在他们无肾功能异常时，败血症患者中的NGAL浓度仍大幅上升，而对于PENK来说却并非如此。
图16:基于确认当天和接下来一天(第1天)其血浆PENK浓度的危重患者的存活率。图A:在左侧，示出了分别在确认时具有大于和小于100pmol/L的PENK浓度的那些患者亚群的Kaplan-Meier图。在右侧，示出了在第1天分别具有大于和小于100pmol/L的PENK浓度的那些患者亚群的Kaplan-Meier图，所述患者在确认当天具有小于100pmol/L的PENK浓度。图B:在左侧，示出了分别在确认时具有大于和小于100pmol/L的PENK浓度的那些患者亚群的Kaplan-Meier图。在右侧，示出了在第1天分别具有大于和小于100pmol/L的PENK浓度的那些患者亚群的Kaplan-Meier图，所述患者在确认当天具有大于100pmol/L的PENK浓度。
图17:预测PENK的多元线性回归。注意：由于与MAP或肌酐清除率的高相关性而剔除了BP、肌酸酐和尿素。使用如下列出的变量计算线性回归：Log(PENK)＝a*肌酸酐清除+b*心血管+c*MAP+等。偏R2给出了每个变量贡献至PENK所达到的程度，即肌酸酐清除率最强，并具有稍大于0.15的偏R2，即肌酸酐清除率占PENK中观察到的变异性的约15％。重要的是，年龄、性别等对PENK浓度无显著影响。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.用于(a)诊断或监测对象的肾功能、或者(b)诊断对象的肾功能异常、或者(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险、或者(d)预测或监测治疗或干预的成功的方法，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，所述方法包括：
·测定获自所述对象的体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平；和
(a)将所述脑啡肽原或其片段的水平与对象的肾功能相关联，或者
(b)将所述脑啡肽原或其片段的水平与肾功能异常相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或者
(c)将所述脑啡肽原或其片段的水平与所述患病对象中的不良事件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风险增加，或者
(d)将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象的治疗或干预的成功相关联，其中小于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功,
其中所述脑啡肽原或片段选自包含以下的组：SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11。
2.如权利要求1所述的方法，其中通过使用脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的结合剂来测定脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述结合剂选自包含以下的组：与脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig支架。
4.用于(a)诊断或监测对象的肾功能、或者(b)诊断对象的肾功能异常、或者(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险、或者(d)预测或监测权利要求1-3中任一项所述的治疗或干预的成功的方法，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，所述方法包括：
·通过使用与获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PENK)或其片段的氨基酸序列中的区域结合的至少一种结合剂，测定免疫反应性分析物的水平；以及
(a)将所述免疫反应性分析物的水平与对象的肾功能相关联，或者
(b)将所述免疫反应性分析物的水平与肾功能异常相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或者
(c)将所述免疫反应性分析物的水平与所述患病对象中的不良事件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风险增加，或者
(d)将所述免疫反应性分析物的水平与患病对象的治疗或干预的成功相关联，其中低于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功，
其中所述脑啡肽原或片段选自包含以下的组：SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述至少一种结合剂与选自包含SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的组的氨基酸序列中的区域结合，优选不与脑啡肽—[Met]脑啡肽SEQ IDNo:3和[Leu]脑啡肽SEQ ID No:4结合，优选与选自包含SEQ ID No.1、2、5、6、7、8、9和10的组的序列中的区域结合，优选与选自包含SEQ ID No.2、5、6和10的组的序列中的区域结合，优选与SEQ ID No.6结合。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阈值为80pmol/L。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中利用免疫分析测量了脑啡肽原的水平，并且所述结合剂为与脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段结合的抗体或抗体片段。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中使用了分析，其包含与脑啡肽原区中的两个不同区域即氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID NO.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID No.14)结合的两种结合剂，其中所述区域中的每个包含至少4或5个氨基酸。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中使用了用于测定脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平的分析，并且其中所述测定的测定灵敏度能够定量健康对象的脑啡肽原或脑啡肽原片段，并且<15pmol/L。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述体液可选自包含以下的组：血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(csf)和唾液。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中另外测定了选自包含以下的组的至少一项临床参数：年龄、BUN、NGAL、肌酐清除率、肌酸酐和Apache评分。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在一名患者中实施脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的所述测定多于一次。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中为了评估所述对象对采用的预防性和/或治疗性措施的反应而进行所述监测。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其用于将所述对象分级为风险组。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象的死亡或不良事件的风险相关，其中升高的大于某个阈值的水平预测死亡或不良事件的风险增加，并且其中所述患病对象为男性。
16.用于进行权利要求1-15中任一项所述的方法的现场护理装置，其中所述现场护理装置包含至少两种针对氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ IDNO.14)的抗体或抗体片段。
17.用于进行权利要求1-15中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述现场护理装置包含至少两种针对氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)或氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)的抗体或抗体片段。

Claims (19)

1.用于(a)诊断或监测对象的肾功能、或者(b)诊断对象的肾功能异常、或者(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险、或者(d)预测或监测治疗或干预的成功的方法，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，所述方法包括：
·测定获自所述对象的体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平；和
(a)将所述脑啡肽原或其片段的水平与对象的肾功能相关联，或者
(b)将所述脑啡肽原或其片段的水平与肾功能异常相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或者
(c)将所述脑啡肽原或其片段的水平与所述患病对象中的不良事件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风险增加，或者
(d)将所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象的治疗或干预的成功相关联，其中小于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。
2.如权利要求1所述的方法，其中通过使用脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的结合剂来测定脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述结合剂选自包含以下的组：与脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段结合的抗体、抗体片段或非Ig支架。
4.用于(a)诊断或监测对象的肾功能、或者(b)诊断对象的肾功能异常、或者(c)预测或监测患病对象中的不良事件的风险、或者(d)预测或监测权利要求1-3中任一项所述的治疗或干预的成功的方法，其中所述不良事件选自包含以下的组：包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常的恶化，或由包括肾衰竭、肾功能丧失和终末期肾病在内的肾功能异常导致的死亡，所述方法包括：
·通过使用与获自所述对象的体液中的脑啡肽原(PENK)或其片段的氨基酸序列中的区域结合的至少一种结合剂，测定免疫反应性分析物的水平；以及
(a)将所述免疫反应性分析物的水平与对象的肾功能相关联，或者
(b)将所述免疫反应性分析物的水平与肾功能异常相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测或诊断所述对象的肾功能异常，或者
(c)将所述免疫反应性分析物的水平与所述患病对象中的不良事件的风险相关联，其中升高的大于某个阈值的水平预测所述不良事件的风险增加，或者
(d)将所述免疫反应性分析物的水平与患病对象的治疗或干预的成功相关联，其中低于某个阈值的水平预测治疗或干预的成功。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述至少一种结合剂与选自包含SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的组的氨基酸序列中的区域结合，优选不与脑啡肽—[Met]脑啡肽SEQ IDNo:3和[Leu]脑啡肽SEQ ID No:4结合，优选与选自包含SEQ ID No.1、2、5、6、7、8、9和10的组的序列中的区域结合，优选与选自包含SEQ ID No.2、5、6和10的组的序列中的区域结合，优选与SEQ ID No.6结合。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阈值为80pmol/L。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中利用免疫分析测量了脑啡肽原的水平，并且所述结合剂为与脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段结合的抗体或抗体片段。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中使用了分析，其包含与脑啡肽原区中的两个不同区域即氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID NO.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID No.14)结合的两种结合剂，其中所述区域中的每个包含至少4或5个氨基酸。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中使用了用于测定脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平的分析，并且其中所述分析的分析灵敏度能够定量健康对象的脑啡肽原或脑啡肽原片段，并且<15pmol/L。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述体液可选自包含以下的组：血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(csf)和唾液。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中另外测定了选自包含以下的组的至少一项临床参数：年龄、BUN、NGAL、肌酐清除率、肌酸酐和Apache评分。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在一名患者中实施脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的所述测定多于一次。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中为了评估所述对象对采用的预防性和/或治疗性措施的反应而进行所述监测。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其用于将所述对象分级为风险组。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述脑啡肽原或其片段的水平与患病对象的死亡或不良事件的风险相关，其中升高的大于某个阈值的水平预测死亡或不良事件的风险增加，并且其中所述患病对象为男性。
16.用于进行权利要求1-15中任一项所述的方法的现场护理装置，其中所述现场护理装置包含至少一种针对氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)和/或氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQID NO.14)的抗体或抗体片段，其中所述区域中的每一个包含至少4或5个氨基酸。
17.用于进行权利要求1-15中任一项所述的方法的现场护理装置，其中所述现场护理装置包含至少两种针对氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ IDNO.14)的抗体或抗体片段，其中所述区域中的每一个包含至少4或5个氨基酸。
18.用于进行权利要求1-15中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述现场护理装置包含至少一种针对氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)或氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)的抗体或抗体片段，其中所述区域中的每一个包含至少4或5个氨基酸。
19.用于进行权利要求1-15中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述现场护理装置包含至少两种针对氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID No.13)或氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.14)的抗体或抗体片段，其中所述区域中的每一个包含至少4或5个氨基酸。
CN201380051659.3A 2012-10-02 2013-10-01 诊断或监测肾功能或者诊断肾功能异常的方法 Active CN104769433B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12187051.3 2012-10-02
EP12187051 2012-10-02
EP13170327.4 2013-06-03
EP13170327 2013-06-03
PCT/EP2013/070470 WO2014053501A1 (en) 2012-10-02 2013-10-01 A method for diagnosing or monitoring kidney function or diagnosing kidney dysfunction

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104769433A true CN104769433A (zh) 2015-07-08
CN104769433B CN104769433B (zh) 2018-07-27

Family

ID=49356398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380051659.3A Active CN104769433B (zh) 2012-10-02 2013-10-01 诊断或监测肾功能或者诊断肾功能异常的方法

Country Status (12)

Country Link
US (4) US9664695B2 (zh)
EP (2) EP3361260B1 (zh)
JP (2) JP6307509B2 (zh)
CN (1) CN104769433B (zh)
CA (1) CA2886779C (zh)
DK (2) DK2904403T3 (zh)
ES (2) ES2810001T3 (zh)
HK (1) HK1212436A1 (zh)
PL (2) PL3361260T3 (zh)
RU (2) RU2679913C2 (zh)
TR (1) TR201809001T4 (zh)
WO (1) WO2014053501A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3286570A1 (en) * 2015-04-24 2018-02-28 SphingoTec GmbH A method for predicting the risk of incidence of chronic kidney disease
JP7123329B2 (ja) * 2016-05-17 2022-08-23 国立大学法人大阪大学 腎臓病の予後予測方法及びシステム
RU2653817C1 (ru) * 2016-11-23 2018-05-14 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ульяновский государственный университет" Способ прогнозирования острого повреждения почек у больных с инсультом
CN110678757B (zh) 2017-05-30 2024-04-05 斯弗因高泰克有限公司 诊断或监测肾功能或诊断肾功能障碍的方法
CN114364984A (zh) * 2019-08-15 2022-04-15 思芬构技术有限公司 一种诊断或监测儿科患者的肾功能或诊断肾功能障碍的方法
RU2753588C1 (ru) * 2020-10-05 2021-08-18 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Оренбургский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ диагностики доклинической стадии вторичных нефропатий у детей
RU2767701C1 (ru) * 2020-12-16 2022-03-18 Надежда Владимировна Агранович Способ ранней диагностики эндотелиальной дисфункции почек у больных хронической обструктивной болезнью легких

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU634716B2 (en) 1988-08-01 1993-03-04 Ciba Corning Diagnostics Corp. Method for detection of an analyte using acridinium esters and liposomes
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
AU2002323501C1 (en) 2001-08-30 2010-04-29 Biorexis Technology, Inc Modified transferrin fusion proteins
US20040014143A1 (en) * 2002-05-29 2004-01-22 Haskins William E. Method and apparatus for detecting and monitoring peptides, and peptides identified therewith
DK1531791T3 (da) 2002-06-07 2010-11-01 Dyax Corp Forebyggelse og begrænsning af iskæmi
CA2543360A1 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Joost A. Kolkman Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers
US20100028995A1 (en) 2004-02-23 2010-02-04 Anaphore, Inc. Tetranectin Trimerizing Polypeptides
DE602005026931D1 (de) 2004-05-13 2011-04-28 Brahms Gmbh Verwendung von vorstufen von enkephalinen und/oder deren fragmenten in der medizinischen diagnostik
WO2006032436A2 (en) 2004-09-21 2006-03-30 Nascacell Technologies Ag. Use of microproteins as tryptase inhibitors
WO2008113363A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-25 Bioporto Diagnostics A/S Diagnostic test for renal injury
EP2231860B1 (en) 2007-12-19 2011-10-05 Affibody AB Polypeptide derived from protein a and able to bind pdgf
WO2010060748A1 (en) 2008-11-03 2010-06-03 Molecular Partners Ag Binding proteins inhibiting the vegf-a receptor interaction
WO2010058378A1 (en) * 2008-11-21 2010-05-27 Phadia Ab Methods, devices and kits for detecting or monitoring acute kidney injury
CA2772162C (en) 2009-08-27 2018-05-22 Covagen Ag Anti-il-17a fynomers and medical uses thereof
US20120301393A1 (en) 2009-12-14 2012-11-29 Scil Proteins Gmbh Modified ubiquitin proteins having a specific binding activity for the extradomain b of fibronectin
CN105949301B (zh) 2010-06-08 2020-03-27 皮里斯制药有限公司 结合IL-4受体α的泪脂质运载蛋白突变蛋白
EP2601532B1 (en) * 2010-08-06 2016-01-27 Mycartis N.V. Perlecan as a biomarker for renal dysfunction
CN102636652A (zh) * 2012-04-18 2012-08-15 苏州大学 尿液中可溶性Corin在慢性肾病诊断中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015535936A (ja) 2015-12-17
DK2904403T3 (en) 2018-07-16
JP6669794B2 (ja) 2020-03-18
PL2904403T3 (pl) 2018-08-31
EP3361260B1 (en) 2020-06-10
CA2886779C (en) 2022-11-01
RU2707303C1 (ru) 2019-11-26
ES2810001T3 (es) 2021-03-08
US20150260732A1 (en) 2015-09-17
US9664695B2 (en) 2017-05-30
HK1212436A1 (zh) 2016-06-10
DK3361260T3 (da) 2020-08-03
ES2674822T3 (es) 2018-07-04
JP6307509B2 (ja) 2018-04-04
RU2015116674A (ru) 2016-11-27
JP2018141788A (ja) 2018-09-13
US10114029B2 (en) 2018-10-30
RU2679913C2 (ru) 2019-02-14
WO2014053501A1 (en) 2014-04-10
US20170261522A1 (en) 2017-09-14
EP2904403B1 (en) 2018-03-28
US11016107B2 (en) 2021-05-25
CN104769433B (zh) 2018-07-27
EP3361260A1 (en) 2018-08-15
TR201809001T4 (tr) 2018-07-23
CA2886779A1 (en) 2014-04-10
US20210333292A1 (en) 2021-10-28
US20190049470A1 (en) 2019-02-14
EP2904403A1 (en) 2015-08-12
PL3361260T3 (pl) 2020-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104769433A (zh) 诊断或监测肾功能或者诊断肾功能异常的方法
JP6336911B2 (ja) アドレノメジュリンアッセイおよび成熟アドレノメジュリンの測定方法
CN108362885A (zh) 用于指导血压下降疗法的肾上腺髓质素
KR20190003959A (ko) Dpp3을 결정하는 방법 및 치료 방법
JP6812521B2 (ja) クロモグラニンａを検出するための免疫アッセイ法および抗体
CN104781672A (zh) 预测女性对象患癌症风险或诊断其癌症的方法
RU2701730C2 (ru) Способ прогнозирования риска развития рака или диагностирования рака у индивидуума
JP2016526684A (ja) アウグリン免疫学的検定
CN114364984A (zh) 一种诊断或监测儿科患者的肾功能或诊断肾功能障碍的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1212436

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant