CN104764845B - 一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法 - Google Patents
一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，利用高效液相色谱方法从饲料鱼粉中快速分离肌胃糜烂素,并进行精确定量分析的方法；本发明能从鱼粉中的组胺、组氨酸等干扰物中有效分离肌胃糜烂素,并且通过待测样品与标准样品峰面积比进行定量分析；在鱼粉加工厂及饲料厂及鸡鸭鱼养殖场在控制肌胃糜烂素方面得到广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法。
背景技术
肌胃糜烂素是鱼粉在直火加热制作过程中,可能是由于组胺或者是组氨酸与赖氨酸在高温下的反应产物。配合鱼粉饲料中的肌胃糜烂素是导致鸡、鸭、鱼等养殖动物发生肌胃糜烂、食欲不振、产卵率下降、吐黑、死亡等现象的主要原因，而且肌胃糜烂素造成鸡鸭等动物发病率和死亡率均偏高。肌胃糜烂素引起小鸡发病现象在国内也有相应报道，2000年4月，宁波市某鸡场喂食了含有肌胃糜烂素的鱼粉配合饲料，引起小鸡大量死亡的现象。2005年,有两个中型肉鸡养殖场同时爆发肉鸡肌胃糜烂病症。2008～2009年期间，在辽宁，山东，河南，江苏，安徽等地的鸡养殖场，给小鸡喂食鱼粉配合饲料后，小鸡发生严重的肌胃层糜烂、吐黑等鸡病理现象。虽然经治疗未造成小鸡大量死亡，但是治疗使用的药剂会给食用此类禽肉的人们带来健康的隐患。所以开发肌胃糜烂素的检测技术是当务之急。
作为监测鱼粉肌胃糜烂素的方法也相继被开发。日本东京大学教授伊藤教授开发了肌胃糜烂素的OPA诱导后的荧光检测技术,此方法需要复杂的诱导化的前处理过程,而且需要三步色谱纯化过程。Hsu利用免疫化学方法检测肌胃糜烂素, 但是需要特殊的抗体。Marcla开发了放射标记的放射性标记的免疫测定法,但是这些方法都需要特殊的抗体，抗体制作起来比较困难,而且标记实验过程需要特殊的设施来进行实验操作。Manosalva开发了应用单克隆抗体ELISA检测鱼粉中的肌胃糜烂素的方法,但是这方法也需要特殊抗体。
到目前为止,国内外没发现有鱼粉中肌胃糜烂素的高效简单检测方法的相关报道。本发明涉及的鱼粉中的肌胃糜烂素的方法,是通过高效液相色谱方法,能有效的达到肌胃糜烂素与干扰物的分离,并能通过待测样品与标准样品峰面积比进行定量分析,检测浓度最低限值达到1ppm。
发明内容
本发明目的是提供一种鱼粉加工中产生的有害物质肌胃糜烂素的检测方法。
本发明提供的一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法具有以下步骤：
（1）在鱼粉中加入5倍重量的0.1 mol/L HCl，混合搅拌10分钟；
（2）通过离心分离，得到含有肌胃糜烂素的上清液；
（3）将上清液通过0.2 um的有机过滤膜过滤，取40 ul滤液于样品管中加入20 ul发色液A和60 ul发色液B进行重氮化衍生、发色、干燥； 所述发色液A是20 mmol/L二甲基对苯二胺和200 mmol/L亚硝酸钠的混合溶液，其体积比是1:1；所述发色液B是10 wt%无水碳酸钠溶解到5 wt%乙醇溶液的混合溶液；
（4） 处理后的样品进样到色谱柱，以1ml/min的流速通过流动相A和流动相B分离肌胃糜烂素与其它干扰物；所述流动相A是150mmol/L 醋酸钠溶解到5 wt%的乙醇混合液，所述流动相B是60 wt%乙腈溶液。
上述步骤（2）中经过12000rpm的离心机离心分离15～20分钟。
上述步骤（3）中干燥是在恒温干燥箱100℃干燥5分钟。
上述步骤（3）中通过重氮化和发色后的肌胃糜烂素样品能在420nm波长下有较强的吸收光。
上述步骤（4）中分离后的样品在420nm波长下检出其吸收光谱峰，高效液相色谱的检出波长为420 nm, 样品检出时间为30～35min，样品检出精度为1ppm。
上述步骤（4）经色谱分离后的所测样品的峰面积与标准样品的峰面积比进行定量分析。
本发明的有益效果：
本发明通过高效液相层析方法在30～35分钟达到肌胃糜烂素与干扰物的分离，只需要简单的衍生化预处理，并且检量限值能达到1ppm，简单迅速的测定技术能应用在鱼粉加工厂，饲料加工厂，鸡鸭养殖场等。本方法能从鱼粉中的组胺,组氨酸等干扰物中有效快速分离肌胃糜烂素,并且通过待测样品与标准样品峰面积比进行定量分析。
附图说明
图1是本发明肌胃糜烂素的分离示意图。
具体实施方式
实施例1：
材料：青鱼（产地：中国湛江）
1、青鱼粉碎后在25℃放置24h，然后121℃蒸煮15分钟，130℃干燥3h，粉碎。
2、肌胃糜烂素的提取
称取200mg鱼粉，加入5倍重量0.1mol/L HCl，混合搅拌10分钟。
3、离心分离
在12000rpm离心15min，取上清液。
4、预处理
将上清液通过0.2 um的有机过滤膜过滤, 取40 ul滤液于样品管中加入20 ul发色液A (发色液A是20 m mol二甲基对苯二胺和200 m mol亚硝酸钠混合溶液，其体积比是1:1)和60 ul发色液B （发色液B是10 wt%无水碳酸钠溶解到5 wt%乙醇溶液的混合溶液）进行重氮化衍生和发色，干燥；
5、上样分离
流速为以1ml/min，处理后的样品10ul上样到色谱柱，通过流动相A（150m mol 醋酸钠溶解到5 wt%的乙醇混合液）和流动相B（60 wt%乙腈溶液）分离肌胃糜烂素与其它干扰物；
6、检出
分离后的样品在420nm波长下检出其吸收光谱峰。
7、画像处理定量分析
通过待测样品与标准样品的峰面积比进行定量分析。
Claims (4)
1.一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，其特征在于具有以下步骤：
（1）在鱼粉中加入5倍重量的0.1 mol/L HCl，混合搅拌10分钟；
（2）通过12000rpm的离心机离心分离15～20分钟，得到含有肌胃糜烂素的上清液；
（3）将上清液通过0.2μm的有机过滤膜过滤，取40μL滤液于样品管中加入20μL发色液A和60μL发色液B进行重氮化衍生、发色及干燥； 所述发色液A是20 mmol/L二甲基对苯二胺和200 mmol/L亚硝酸钠的混合溶液，其体积比是1:1；所述发色液B是10 wt%无水碳酸钠溶解到5 wt%乙醇溶液的混合溶液；所述干燥是在恒温干燥箱100℃干燥5分钟；
（4）处理后的样品进样到色谱柱，以1ml/min的流速通过流动相A和流动相B分离肌胃糜烂素与其它干扰物；所述流动相A是150mmol/L 醋酸钠溶解到5 wt%的乙醇混合液，所述流动相B是60 wt%乙腈溶液。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：上述步骤（3）中通过重氮化和发色后的肌胃糜烂素样品能在420nm波长下有较强的吸收光。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：上述步骤（4）中分离后的样品在420nm波长下检出其吸收光谱峰，高效液相色谱的检出波长为420 nm, 样品检出时间为30～35min，样品检出精度为1ppm。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：上述步骤（4）经色谱分离后的所测样品的峰面积与标准样品的峰面积比进行定量分析。
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