CN104762251A - 填充床细胞培养装置的大量细胞收获方法 - Google Patents

填充床细胞培养装置的大量细胞收获方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104762251A
CN104762251A CN201410164574.2A CN201410164574A CN104762251A CN 104762251 A CN104762251 A CN 104762251A CN 201410164574 A CN201410164574 A CN 201410164574A CN 104762251 A CN104762251 A CN 104762251A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
growth
base material
large amount
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410164574.2A
Other languages
English (en)
Inventor
李崇仁
陈宏飞
陈永琇
刘骏逸
傅正男
王昱麒
陈俊谷
张景明
何玉书
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CESCO Bioengineering Co Ltd
Original Assignee
CESCO Bioengineering Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CESCO Bioengineering Co Ltd filed Critical CESCO Bioengineering Co Ltd
Publication of CN104762251A publication Critical patent/CN104762251A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
    • C12M25/18—Fixed or packed bed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

一种填充床细胞培养装置的大量细胞收获方法，其藉由提供以多个多孔基材及/或基材乘载装置宽松填充的细胞生长空间，当执行至少包含摇动或旋转培养槽的细胞分离步骤时，空隙体积足够大使得基材乘载装置彼此碰撞或是撞向培养槽以产生动量从而使得细胞从多孔基材分离以收获细胞。本发明的填充床细胞培养装置的大量收获细胞方法可轻易地达成任何实务生产量级。

Description

填充床细胞培养装置的大量细胞收获方法
技术领域
本发明是有关于一种大量细胞收获方法，特别是关于一种用于填充床细胞培养装置的大量细胞收获方法。
本发明请求于2014年1月6日提交的美国专利14/148,631，名称为“PACKED-BED CELL CULTURE AND HARVEST DEVICE”的优先权，并将其及此处所引用文件，或引用文件所引用文件以参考文件方式纳入。
背景技术
培养细菌、酵母菌及霉菌的大规模细胞培养制程已经广泛发展且行之有年，而上述物种因为都具有强韧的细胞壁及/或细胞外基质，因此具有较佳的环境适应力。这些微生物结构所产生的环境适应能力正是这些微生物可快速进行高效细胞培养制程的重要因素。举例而言，细菌细胞可生长于利用激烈搅拌、培养翻动及打气技术的超大容积培养液中，以在生长期间能达到良好的通气效果同时可维持培养细胞的生命力。相反地，由于真核细胞、动物细胞、哺乳类动物细胞及/或组织相较于微生物细胞更加地细致及脆弱，因此培养这些细胞所需的技术往往更加困难。在一般生物反应器中微生物培养所需的激烈曝气及搅拌所造成的巨大剪力(shear force)很容易让这些细胞受损。
请参照图1，其为一示意图显示公知技术的填充床(Packed-bed)培养装置。填充床生物反应器1.1包含可提供细胞生长及保护细胞避免剪力的多孔性基材1.3(porous matrix)。由于多孔性基材具有大量的表面积，因此相较于其它系统可达到较高的细胞密度。通常每一毫升的基材可轻易地达到5～10×107的细胞密度。然而，由于填充床作为一个深度过滤器，并且在液体进入填充床后无法混合，因此接种物被沿着过填充床的流动路径所困住，并在填充床内产生非均相及具有梯度的细胞分布1.4。
在培养过程之中，营养和氧气也会沿着填充床流道消耗并耗尽，使得氧气和营养在流道的开始时十分丰富但在流道的末端变得过低或是耗尽。上述所有原因造成细胞于填充床生物反应器内无法均质生长，并妨碍传统填充床生物反应器的放大能力。
收获细胞是在填充床生物反应器的另一个重要问题。细胞通常难以从填充床生物反应器的多孔基材分离，因为非常难以对基材床内进行搅拌，而上述步骤对于胰蛋白酶处理后使细胞从基材分离细胞是必不可少的。因此，细胞的来源，例如填充床细胞培养系统所需的细胞接种物通常必须由其它细胞培养装置所提供，例如组织培养瓶，滚瓶，细胞工厂(Cell Factory,Nalgene NuncInternational)，微载体搅拌罐系统等。由于需要同时从多个细胞培养装置收集细胞以用于收集足够在填充床生物反应器内播种的细胞接种物，如此使得细胞收获程序过于冗长并产生容易被污染的风险。
为了使填充床系统的放大变得更加有效率，一个可以直接从一个填充床系统收获细胞并将它们传送到另一个更大规模的填充床系统的细胞收获系统，可以使填充床系统成为一个“容器到容器”的封闭传输系统。那么就能够降低准备接种物的风险和劳动成本。因此，填充床生物反应器的放大就可以不再依赖于其它细胞培养装置。
另一个问题是当细胞是在不同培养系统以不同培养原则培养时可能引起细胞特性的变化。一个使用相似的培养原则装置的放大程序可以减轻对细胞行为改变的质疑，而细胞行为改变可能会影响细胞培养程序的产出结果。
因此，发展可由填充床细胞培养装置进行细胞收获的装置和方法是当前重要的发展目标。
发明内容
本发明的目标为提供一种自填充床细胞培养装置大量收获细胞的方法，藉以轻易地达成任何实务的生产量级。
在本发明一实施例中，一种大量细胞收获方法，包含：提供填充床细胞培养装置，其具有培养槽，培养槽具有于培养槽内所界定的细胞生长空间，其中细胞生长空间系以多个多孔基材宽松填充，多个细胞生长于多孔基材上，以及一个空隙体积为细胞生长空间中未被多孔基材占据的空间；执行细胞分离步骤，其至少包含摇动或旋转培养槽，其中空隙体积足够大使得多孔基材彼此碰撞或是撞向培养槽以产生动量从而使得细胞从多孔基材分离；以及收获细胞。
在本发明的另一实施例，一种大量细胞收获方法，包含：提供填充床细胞培养装置，其具有培养槽，培养槽具有于培养槽内所界定的细胞生长空间，其中细胞生长空间系以多个基材乘载装置宽松填充，其中基材乘载装置具有多孔并且包含多孔基材于其中，多个细胞生长于多孔基材上，以及一个空隙体积为细胞生长空间中未被多孔基材占据的空间；执行细胞分离步骤，其至少包含摇动或旋转培养槽，其中空隙体积足够大使得基材乘载装置彼此碰撞或是撞向培养槽以产生动量从而使得细胞从多孔基材分离；以及收获细胞。
以下藉由具体实施例配合附图详加说明，使本发明的目的、技术内容、特点及其所达成的功效更容易被了解。
附图说明
图1为示意图显示一个现有技术的填充床培养装置。
图2a和2b为示意图显示本发明一较佳实施例的填充床培养槽，其中图2b是图2a的放大视图。
图2c为示意图显示固定床细胞培养装置，其显示本发明的分配梯度剖面。
图3为示意图显示本发明的固定床细胞培养装置，其中培养槽以多个球状的基材乘载装置宽松填充。
图4为示意图显示本发明的固定床细胞培养装置，其中培养槽以多个圆柱状的基材乘载装置宽松填充。
图5为示意图显示本发明的固定床细胞培养装置，其中培养槽以多个长柱状的基材乘载装置宽松填充。
图6为示意图显示本发明的细胞收获装置。
图7为示意图显示依据本发明一较佳实施例的细胞培养装置，其具有内部再循环。
图8为示意图显示依据本发明一较佳实施例的细胞培养装置，其具有外部再循环。
图9为示意图显示本发明一较佳实施例的细胞培养装置，其采用间歇淹没和露出的方式。
图10为示意图显示根据本发明一较佳实施例的细胞回收率。
具体实施方式
本发明的实施例可用以从大规模填充床细胞培养装置收获细胞。本发明是有关培养细胞例如真核细胞，动物细胞，哺乳动物细胞及/或组织等较困难和复杂的生物科学技术，因为这些细胞较微生物细胞更加的细致和脆弱。
大多数填充床细胞培养装置是无法进行细胞收获，因为基材床是固定的，并抑制在一定的空间内，而容器的材质是玻璃或金属，如不锈钢，因此无法进行细胞收获。一些市售的填充床细胞培养装置能够执行细胞回收，如CESCOBioengineering Co.,Ltd.所售的BelloCell(www.cescobio.com.tw)，其中容器是由具弹性的塑料制成。其容器内装有100ml基材。经过胰蛋白酶处理，并通过拍击塑料，塑料容器的弹力所产生的动能可以被转移到基材本身，并迫使细胞被弹出基材造成移位以进行细胞收获。然而，当相同的构造被放大到1升以上时，回收率会大幅度下降，因为大部分拍击器壁所产生的动能无法穿透并转移到载体床内深层的基材上。
为了解决这个问题，将基材松散填充而使容器内产生更多的空隙体积，并藉由在带液体或不带液体的情况下摇动基材本身或是在带液体的情况下旋转容器，可以将力量传输到每个基材本身，而不是透过拍击容器的器壁转移。
另一个问题是，当基材床不断放大，基材本身形成类似过滤器的功能并再次捕获细胞，因此必须要增加清洗步骤以收获大部分的细胞。然而，如果收获时的时间太长，那么细胞会倾向于重新附着于基材。通过内部封装有基材的基材乘载装置，可以将基材分配到不同的组别之中，使得细胞有空间可流出而降低被重新捕获的机会。这将使得细胞收获效率增加。因此，本发明旨在解决或改善从基材体积为500毫升至高达100升的细胞回收效率，也就是在5×109细胞到2×1012细胞之间。当基材体积小于5L以下，仅增加基材床中的空隙体积即可提高细胞回收率。当基材体积大于5L，通过采用基材乘载装置可以更有效率地增强细胞回收率并避免细胞被基材本身重新捕获。
参照图2a和2b为示意图显示根据本发明一较佳实施例的填充床培养槽，其中图2b是图2a的放大视图。填充床培养槽有开口2.6作为空气入口和出口，槽顶开口2.7用以引入细胞，培养液和缓冲溶液。作为空气入口和出口的开口2.6包含一空气过滤器。多孔基材2.3/多孔基材乘载装置2.2被设置于填充床培养槽2.1的内部。
比较图1和图2c，相较于传统的填充床系统，本发明的分配梯度剖面2.5可以大为改善，而传统的填充床系统中较大的填充床造成沿着液体的流动方向的严重梯度下降，从而限制了放大能力。
基材乘载装置2.2采用韧性材料，并具有孔洞使得营养和细胞可以渗透并进行交换。基材乘载装置2.2可以以不同的几何和形状设置。较佳者为，基材乘载装置为球状、圆柱状、棒状或椭圆形。更具体地，基材乘载装置2.2是采用韧性材料，例如聚丙烯、聚乙烯、聚乙烯对苯二甲酸酯(polyethylenetetraphalate,PET)，或其它生物性相容材料。基材乘载装置可以是多孔基材本身，或是封装多孔基材的多孔韧韧性胶囊或卡匣。基材乘载装置2.2的大小可为0.5厘米直径至10厘米直径。较佳者为，基材乘载装置2.2的直径大小可以是从0.5厘米到5厘米。
在一实施例中，基材乘载装置2.2由两部分组成，并可组装形成基材乘载装置2.2。可以组装之前，将多孔基材2.3封入到基材乘载装置，使得基材乘载装置2.2装设有多孔基材2.3。
基材乘载装置2.2内部有包含有多孔基材2.3。多孔基材2.2较佳者为不织布纤维基材，并经表面处理使其具有亲水性。更具体地，多孔基材是大孔材质，其孔径为50微米至200微米，并且孔率大于70％。更具体地，多孔基材具有大量表面积用以截留细胞、粘附、生长及透氧。
细胞生长空间是以多孔基材2.3/基材乘载装置2.2宽松填充，使得多孔基材2.3/基材乘载装置2.2彼此碰撞或碰撞到培养槽或以液体冲洗以产生动量从而使得细胞从多孔基材2.3及/或基材乘载装置2.2分离。
此处所提到的“宽松填充”被定义为在细胞生长空间中具有较高比率的空隙体积2.8(如图2a所示)。特定而言，在细胞生长空间以多孔基材填充的情况下，空隙体积2.8为细胞生长空间的25％v/v以上，较佳者为33％v/v以上。特定而言，在细胞生长空间以基材乘载装置填充的情况下，空隙体积2.8为细胞生长空间的10％v/v以上，较佳者为33％v/v以上。
图3为示意图显示本发明的固定床细胞培养装置，其中培养槽以多个基材乘载装置宽松填充，基材乘载装置内部埋设多孔基材。基材乘载装置为球状，以韧性材料制成，并设置了孔洞以使营养和细胞自由渗透和交换。
图4为示意图显示本发明的固定床细胞培养装置，其中培养槽以多个基材乘载装置宽松填充，基材乘载装置内部埋设多孔基材。基材乘载装置为圆柱状，以韧性材料制成，并设置了孔洞以使营养和细胞自由渗透和交换。
图5为示意图显示本发明的固定床细胞培养装置，其中培养槽以多个基材乘载装置宽松填充，基材乘载装置内部埋设多孔基材。基材乘载装置为长柱状，以韧性材料制成，并设置了孔洞以使营养和细胞自由渗透和交换。
参照图7，其为示意图显示依据本发明一较佳实施例的细胞培养装置。填充床系统可以是一个内循环细胞培养系统，其中培养槽7.1包含一通风口7.2。基材乘载装置7.3填充于篮子7.4内部，藉由限制基材乘载装置7.3的移动。培养槽7.1底部设有一螺旋桨7.5，用于液体再循环。培养液7.6淹没整个填充床并于培养槽7.1内再循环，如箭头所示。
参照图8，图8为示意图显示依据本发明一较佳实施例的细胞培养装置，其具有外部再循环，其中培养槽8.1包含基材乘载装置8.4。混合容器8.2具有通风口8.3和以作为入口和出口的通口8.7。培养液8.5通过蠕动泵8.8或其它方式在培养槽8.1和混合容器8.2之间被重新循环。混合容器8.2具有螺旋桨8.6以均质化培养期间的培养液8.5。培养液8.5重新循环于培养槽8.1和混合容器8.2之间，如箭头所示。
参照图9，其为示意图显本发明一较佳实施例的细胞培养装置。填充床系统可以是一个双向并且间歇淹没及露出细胞培养系统，其中培养槽9.1包含通风口9.3，并以基材乘载装置9.4填充。混合容器9.2有通风口9.3及连接培养槽9.1和混合容器9.2之间的开口9.7。培养液9.5通过压力和真空或其它装置在培养槽9.1与混合容器9.2之间转移。当培养液9.5从混合容器9.2流到培养槽9.1时，培养液9.5可能淹没基材乘载装置9.4，或者当培养液9.5从培养槽9.1流向混合容器9.2时，基材乘载装置9.4可能会露出。混合容器9.2具有螺旋桨9.6，用以均质化培养期间的培养液9.5。培养液9.5的流动路径，如箭头所示，是通过培养槽9.1和混合容器9.2之间。
参照图6，其为示意图显示本发明的细胞收获装置。培养槽6.1设置有宽松填充内部的基材乘载装置6.3和选择性的通风口6.2。在细胞培养完成后，培养槽6.1连接到试剂套组，其包含进行整个细胞消化(cell digestion)和收集程序的必要试剂和容器。试剂套组可含但不限于磷酸缓冲生理盐水(phosphate buffersaline)6.6，胰蛋白酶/EDTA6.7，胰蛋白酶抑制剂6.8，培养液6.9，废液容器6.5，及细胞收获容器6.10。每个容器都有一个入口/出口6.12和选择性的通风口6.2。每个容器放置在秤或天平或其它手段来测量和控制重量。液体流动可由蠕动泵或其它驱动工具6.4来控制。
本技术领域人员可以理解细胞收获，例如在带液体摇动与或带液体旋转的程序。带液体旋转的方式可为间歇地顺时针和逆时针旋转，旋转速度从10rpm至500rpm。较佳旋转速度范围为100rpm到300rpm。
在一实施例中，细胞收获程序可以下列方式执行：
步骤1、在细胞培养结束之后，连接试剂套组之前，藉由打入收获罐将培养槽6.1内的培养液丢弃。
步骤2、通过管6.12连接培养槽6.1与试剂套组。
步骤3、从容器6.6通过蠕动泵6.4或其它方式引进磷酸缓冲生理盐水6.6进入培养槽6.1。缓冲液的传输量可以由天平6.11或其它方式控制。然后可旋转培养槽6.1或轻摇以通过一些手段来冲洗基材乘载装置内的基材6.3。然后从培养槽6.1通过蠕动泵或其它驱动工具6.4转移磷酸缓冲生理盐水6.6到废液容器6.5。这个步骤可重复两次或三次。
步骤4、接着由蠕动泵或其它驱动工具6.4从容器6.7转移胰蛋白酶/EDTA6.7溶液到培养槽6.1。移转试剂量是由天平6.11或其它方式所控制。然后可旋转或轻摇培养槽6.1以通过一些手段来冲洗基材乘载装置内的基材6.3。可实施5至20分钟孵育(incubation)以使胰蛋白酶有效的消化细胞。然后可以从培养槽6.1通过蠕动泵或其它驱动工具6.4转移胰蛋白酶溶液6.7到废液容器6.5。可在从培养槽6.1移除胰蛋白酶溶液6.7之后，进一步进行孵育。
步骤5、选择性地从容器6.8通过蠕动泵或其它驱动工具6.4引入胰蛋白酶抑制剂6.8到培养槽6.1。试剂的转移量可以通过例如天平6.11或其它方式进行控制。然后可旋转或轻摇培养槽6.1以通过一些手段来冲洗基材乘载装置6.3。然后可以从培养槽6.1通过蠕动泵或其它驱动工具6.4转移胰蛋白酶抑制剂6.8溶液到废液容器6.5。
步骤6、可在消化之后施加剧烈摇动及/或带或不带液体地旋转，以迫使基材乘载装置6.3彼此碰撞或被混合的液体冲洗。这样可以帮助细胞到从多孔基材移位。
步骤7、如果是未带液体摇动的情形，容器6.9中的培养液6.9可接着从容器6.9通过蠕动泵或其它驱动工具6.4被引入到培养槽6.1。移转培养液的量可以通过天平6.11或其它手段来控制。接着可剧烈摇动培养槽6.1以通过一些手段来冲洗基材乘载装置6.1使得细胞从多孔基材洗掉。含有细胞的培养液6.9接着可以从培养槽6.1经由蠕动泵或其它驱动工具6.4转移到细胞收获容器6.10。
重复步骤6和步骤7，以收集从基材乘载装置6.3的大部分细胞。
本发明进一步通过下面的工作实施例说明，其不应被解释为进一步限制了。
例1
提供2L具有多孔基材的填充床培养槽，亦即200克BioNOC II载体(CESCO Bioengineering Co.,Ltd.)并且空隙空间小于10％。细胞收获程序是由抽入磷酸缓冲生理盐水(PBS)并冲洗3分钟，之后将的PBS抽出到废液容器而完成。重复步骤三次，随后抽入0.25％胰蛋白酶/EDTA以淹没载体达10分钟。将胰蛋白酶/EDTA溶液抽出到废液容器以丢弃，和接着再孵育细胞10分钟。进行160rpm1分钟的上下摇动，以便从多孔基材撞出细胞。抽入1.5升培养液，并顺时针和逆时针方向间歇以100rpm的速度旋转培养槽以冲洗并洗出细胞。然后抽出培养液并收集于收获容器。重复进行5次的摇动，旋转和收取培养液步骤。对收获的细胞进行计数，并与初始细胞密度进行比较，其中初始细胞密度是是由10个载体的平均细胞数进行估算。
表1.具有多孔基材且空隙空间小于10％的培养槽的实验结果
全部细胞数 存活率 回收细胞数 回收率 累积回收率
初始细胞数 1.91×1010 - - - -
第一次PBS清洗后 - - - - -
第二次PBS清洗后 - - - - -
第三次PBS清洗后 - - - - -
胰蛋白酶/EDTA处理 - 99.00％ 1.68×107 0.09％ 0.09％
第一次细胞回收 - 98.53％ 6.10×108 3.19％ 3.28％
第二次细胞回收 - 100.00％ 3.88×108 2.03％ 5.31％
第三次细胞回收 - 95.34％ 1.54×108 0.81％ 6.12％
第四次细胞回收 - 98.85％ 2.77×108 1.45％ 7.57％
第五次细胞回收 - 99.10％ 1.31×108 0.69％ 8.26％
回收结束 1.73×1010 - - - -
第一个例子的全部细胞收获率仅为8.26％。大多数细胞仍在多孔基材中，因为摇动和旋转时较少空间可用以产生足够的动力来推动细胞移出多孔基材。
例2
提供2L具有多孔基材的填充床培养槽，亦即200克BioNOCII载体并且载体所占的空间为67％，而空隙空间约为33％。细胞收获程序是由抽入磷酸缓冲生理盐水(PBS)并冲洗3分钟，之后将的PBS抽出到废液容器而完成。重复步骤三次，随后抽入0.25％胰蛋白酶/EDTA以淹没载体达10分钟。将胰蛋白酶/EDTA溶液抽出到废液容器以丢弃，和接着再孵育细胞10分钟。进行160rpm、1分钟的上下摇动，以便从多孔基材撞出细胞。抽入1.5升培养液，并顺时针和逆时针方向间歇以100rpm的速度旋转培养槽以冲洗并洗出细胞。然后抽出培养液并收集于收获容器。重复进行5次的摇动，旋转和收取培养液步骤。对收获的细胞进行计数，并与初始细胞密度进行比较，其中初始细胞密度由10个载体的平均细胞数进行估算。
表2.具有多孔基材且空隙空间大约为33％的培养槽的实验结果
全部细胞数 存活率 回收细胞数 回收率 累积回收率
初始细胞数 1.26E+10 - - - -
第一次PBS清洗后 - - 0 - -
第二次PBS清洗后 - - 0 - -
第三次PBS清洗后 - - 0 - -
胰蛋白酶/EDTA处理 - - 0.00E+00 0.00％ 0.0％
第一次细胞回收 - 98％ 6.92E+09 54.92％ 54.92％
第二次细胞回收 - 92％ 2.85E+09 22.62％ 77.54％
第三次细胞回收 - 85％ 1.05E+09 8.33％ 85.87％
第四次细胞回收 - 50％ 3.76E+07 0.30 86.17％
第五次细胞回收 83％ 6.05E+07 0.48％ 86.65％
回收结束 1.09E+10
请参照图10，藉由增加空隙空间使得基材与基材之间、基材与培养材以及基材与液体之间的相对作动可以大幅增加。本例的细胞回收率可增加至86.65％，而例1只有8.26％的回收率。
例3
提供2L填充床培养槽其具有多孔圆柱基材乘载装置，其所占的培养槽空间比例约为50％，100克BioNOCII载体平均填充于多孔圆柱基材乘载装置之内。细胞收获程序是由抽入磷酸缓冲生理盐水(PBS)并冲洗3分钟，之后将的PBS抽出到废液容器而完成。重复步骤三次，随后抽入0.25％胰蛋白酶/EDTA以淹没载体达10分钟。将胰蛋白酶/EDTA溶液抽出到废液容器以丢弃，和接着再孵育细胞10分钟。进行160rpm、1分钟的上下摇动，以便从多孔基材撞出细胞。抽入1.5升培养液，并顺时针和逆时针方向间歇以100rpm的速度旋转培养槽以冲洗并洗出细胞。然后抽出培养液并收集于收获容器。重复进行5次的摇动，旋转和收取培养液步骤。对收获的细胞进行计数，并与初始细胞密度进行比较，其中初始细胞密度由10个载体的平均细胞数进行估算。
表3.具有多孔基材且空隙空间大约为50％的培养槽的实验结果
全部细胞数 存活率 回收细胞数 回收率 累积回收率
初始细胞数 1.60E+10
第一次PBS清洗后
第二次PBS清洗后
第三次PBS清洗后
胰蛋白酶/EDTA处理
第一次细胞回收 6.53E+9 40.83％ 40.83％
第二次细胞回收 3.65E+9 22.82％ 63.65％
第三次细胞回收 1.72E+9 10.78％ 74.43％
第四次细胞回收 1.17E+9 7.34％ 81.77％
第五次细胞回收 8.43E+8 5.27％ 87.04％
回收结束 1.39E+10
在具有多孔基材且空隙体积约为50％的例子中，全部回收率可达到87.04％。
以上所述的实施例仅为说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，不能以之限定本发明的专利范围，即大凡依本发明所揭示的精神所作的均等变化或修饰，仍应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (13)

1.一种自填充床细胞培养装置大量收获细胞的方法，包含：
提供填充床细胞培养装置，其具有培养槽，培养槽具有于培养槽内所界定的细胞生长空间，其中
细胞生长空间以多个多孔基材宽松填充，
多个细胞生长于多孔基材上，以及
一个空隙体积,该空隙体积为细胞生长空间中未被多孔基材占据的空间；
执行细胞分离步骤，其至少包含摇动或旋转培养槽，其中空隙体积足够大使得多孔基材彼此碰撞或是撞向培养槽以产生动量从而使得细胞从多孔基材分离；以及
收获细胞。
2.如权利要求1所述的大量细胞收获方法，其特征在于，空隙体积大于细胞生长空间的25％v/v。
3.如权利要求1所述的大量细胞收获方法，其特征在于，空隙体积大于细胞生长空间的33％v/v。
4.如权利要求1所述的大量细胞收获方法，其特征在于，细胞为动物细胞。
5.如权利要求1所述的大量细胞收获方法，其特征在于，细胞分离步骤更包含带液体摇动或带液体旋转。
6.如权利要求1所述的大量细胞收获方法，其特征在于，细胞生长空间大于500ml。
7.一种自填充床细胞培养装置大量收获细胞的方法，包含：
提供填充床细胞培养装置，其具有培养槽，培养槽具有于培养槽内所界定的细胞生长空间，其中
细胞生长空间以多个基材乘载装置宽松填充，其中基材乘载装置具有多孔并且包含多孔基材于其中，
多个细胞生长于多孔基材上，以及
空隙体积为细胞生长空间中未被基材乘载装置占据的空间；
执行细胞分离步骤，其至少包含摇动或旋转培养槽，其中空隙体积足够大使得基材乘载装置彼此碰撞或是撞向培养槽以产生动量从而使得细胞从多孔基材分离；以及
收获细胞。
8.如权利要求7所述的大量细胞收获方法，其特征在于，空隙体积大于细胞生长空间的10％v/v。
9.如权利要求7所述的大量细胞收获方法，其特征在于，空隙体积大于细胞生长空间的33％v/v。
10.如权利要求7所述的大量细胞收获方法，其特征在于，细胞为动物细胞。
11.如权利要求7所述的大量细胞收获方法，其特征在于，细胞分离步骤更包含带液体摇动或带液体旋转。
12.如权利要求7所述的大量细胞收获方法，其特征在于，基材乘载装置的形状为球状、圆柱状、棒状或椭圆球状。
13.如权利要求7所述的大量细胞收获方法，其特征在于，细胞生长空间大于500ml。
CN201410164574.2A 2013-01-07 2014-04-21 填充床细胞培养装置的大量细胞收获方法 Pending CN104762251A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361749736P 2013-01-07 2013-01-07
US14/148,631 US9273278B2 (en) 2013-01-07 2014-01-06 Large scale cell harvesting method for pack-bed culture device
US14/148,631 2014-01-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104762251A true CN104762251A (zh) 2015-07-08

Family

ID=51061244

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410164574.2A Pending CN104762251A (zh) 2013-01-07 2014-04-21 填充床细胞培养装置的大量细胞收获方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US9273278B2 (zh)
JP (1) JP5939650B2 (zh)
CN (1) CN104762251A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017028713A1 (zh) * 2015-08-18 2017-02-23 重庆润泽医药有限公司 一种用于悬浮组织细胞的培养装置
CN109628287A (zh) * 2018-12-28 2019-04-16 科兴（大连）疫苗技术有限公司 细胞收集摇床以及细胞收集方法
US10494421B2 (en) 2014-02-10 2019-12-03 Univercells Nv System, apparatus and method for biomolecules production
CN112424332A (zh) * 2018-03-16 2021-02-26 尤尼沃尔塞尔斯技术股份公司 固定床取样器及相关方法
CN114901796A (zh) * 2019-11-05 2022-08-12 康宁股份有限公司 固定床生物反应器及其使用方法

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6351113B2 (ja) * 2015-01-29 2018-07-04 藤森工業株式会社 振とう型培養装置及びこれを用いた培養方法
WO2017101096A1 (zh) * 2015-12-18 2017-06-22 江阴瑞康健生物医学科技有限公司 一种适用于灌流式培养的组合式生物反应器仓
US10326032B2 (en) 2016-05-10 2019-06-18 Baker Hughes, A Ge Company, Llc Graphene tunneling photodetectors for high-temperature downhole use
BE1024733B1 (fr) 2016-11-09 2018-06-14 Univercells Sa Matrice de croissance cellulaire
EP3492578B1 (en) * 2016-12-27 2021-05-12 Fullstem Co., Ltd. Method for harvesting cultured cells from three-dimensional porous scaffold
US10578220B2 (en) 2017-02-27 2020-03-03 Bimba Manufacturing Company Proportionally controlled pinch valves, systems and methods
RU2020123777A (ru) 2017-12-20 2022-01-21 Юниверселлс Текнолоджиз С.А. Биореактор и связанные способы
WO2019175442A1 (en) * 2018-03-16 2019-09-19 Univercells S.A. Fixed bed sampler and related methods
JP6628448B2 (ja) * 2018-05-29 2020-01-08 藤森工業株式会社 振とう型培養装置及びこれを用いた培養方法
US20200248124A1 (en) 2019-02-05 2020-08-06 Corning Incorporated Methods of culturing cells on woven cell culture substrates and bioreactors using the same
US20230348834A1 (en) 2019-11-25 2023-11-02 Corning Incorporated Fixed bed bioreactor vessel and methods of using the same
EP4065685A1 (en) 2019-11-27 2022-10-05 Corning Incorporated Stacked fixed bed bioreactor and methods of using the same
CN114761534A (zh) 2019-11-27 2022-07-15 康宁股份有限公司 固定床细胞培养和收获系统及其使用方法
JP2023503649A (ja) 2019-11-27 2023-01-31 コーニング インコーポレイテッド ラジアルフロー型固定床バイオリアクター及びその使用方法
US20230242854A1 (en) 2020-06-30 2023-08-03 Corning Incorporated Tubular packed-bed cell culture vessels, systems, and related methods
WO2022076639A2 (en) 2020-10-09 2022-04-14 Corning Incorporated Surface-modified cell culture substrates and methods of modifying cell culture substrates
EP4251725A1 (en) * 2020-11-25 2023-10-04 Corning Incorporated Modular fixed-bed bioreactor systems and methods of using the same
JP2024501108A (ja) 2020-11-30 2024-01-11 コーニング インコーポレイテッド 区域気孔率が制御された充填床バイオリアクタ
EP4320217A1 (en) 2021-04-06 2024-02-14 Corning Incorporated Cell culture sampling substrate for fixed bed reactor
EP4334427A1 (en) 2021-05-03 2024-03-13 Corning Incorporated Fixed bed bioreactor for cell culture and harvesting and related methods
CN117616110A (zh) 2021-06-30 2024-02-27 康宁股份有限公司 用于监测填充床细胞培养的系统和方法
US20240344008A1 (en) 2021-07-30 2024-10-17 Corning Incorporated Uniform cell culture substrate for fixed bed bioreactor
EP4377437A1 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Corning Incorporated Uniform cell culture substrate for fixed bed bioreactor
WO2023101848A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Corning Incorporated Cell culture sampling from fixed bed bioreactor methods and apparatus
WO2023101821A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Corning Incorporated Hybrid fixed bed cell culture substrate and bioreactor
WO2023170523A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 Stemmedical A/S Closed system bioreactor for cell culturing
WO2023249816A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Corning Incorporated Fixed bed cell culture reactor vessel for substrate alignment and sampling
WO2024030477A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Corning Incorporated Rolled adherent cell culture substrates for uniform flow in fixed bed reactors
WO2024102296A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Corning Incorporated Adherent cell culture systems with removable witness substrates for cell sampling
WO2024118423A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Corning Incorporated Systems and methods for organizing cell substrates in bioreactors
WO2024145139A2 (en) 2022-12-30 2024-07-04 Corning Incorporated Systems and methods of biomass monitoring for cell culture bioreactors
EP4424811A1 (en) 2023-02-28 2024-09-04 Corning Incorporated Rolled cell culture substrates for fixed bed bioreactors with controlled perfusion zones
IL303555B2 (en) * 2023-06-08 2024-07-01 Pluri Biotech Ltd A system for growing plant cells in three dimensions and methods of use

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101864361A (zh) * 2009-04-16 2010-10-20 赛宇细胞科技股份有限公司 可放大的细胞培养装置
CN102021115A (zh) * 2009-09-21 2011-04-20 惠识瑶 无搅拌装置的填充床式细胞生物反应器及培养动物细胞方法
CN102947438A (zh) * 2010-05-11 2013-02-27 阿特利斯公司 用于细胞培养的装置和方法
CN103476924A (zh) * 2011-04-15 2013-12-25 普拉里斯坦有限公司 收获细胞的方法和系统

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008109674A2 (en) * 2007-03-05 2008-09-12 Caridianbct, Inc. Cell expansion system and methods of use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101864361A (zh) * 2009-04-16 2010-10-20 赛宇细胞科技股份有限公司 可放大的细胞培养装置
CN102021115A (zh) * 2009-09-21 2011-04-20 惠识瑶 无搅拌装置的填充床式细胞生物反应器及培养动物细胞方法
CN102947438A (zh) * 2010-05-11 2013-02-27 阿特利斯公司 用于细胞培养的装置和方法
CN103476924A (zh) * 2011-04-15 2013-12-25 普拉里斯坦有限公司 收获细胞的方法和系统

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10494421B2 (en) 2014-02-10 2019-12-03 Univercells Nv System, apparatus and method for biomolecules production
WO2017028713A1 (zh) * 2015-08-18 2017-02-23 重庆润泽医药有限公司 一种用于悬浮组织细胞的培养装置
CN106635795A (zh) * 2015-08-18 2017-05-10 重庆润泽医药有限公司 一种用于悬浮组织细胞的培养装置
CN112424332A (zh) * 2018-03-16 2021-02-26 尤尼沃尔塞尔斯技术股份公司 固定床取样器及相关方法
CN109628287A (zh) * 2018-12-28 2019-04-16 科兴（大连）疫苗技术有限公司 细胞收集摇床以及细胞收集方法
CN114901796A (zh) * 2019-11-05 2022-08-12 康宁股份有限公司 固定床生物反应器及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2014158461A (ja) 2014-09-04
US20140193901A1 (en) 2014-07-10
US9273278B2 (en) 2016-03-01
JP5939650B2 (ja) 2016-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104762251A (zh) 填充床细胞培养装置的大量细胞收获方法
CN101875917A (zh) 生物反应器微载体培养动物细胞生产猪瘟疫苗的方法
CN103409321A (zh) 基于悬浮型载体的微藻悬浮—附着混合培养与分离收获方法
CN104087536B (zh) 一种生活污泥减量复合微生物制剂及其制备与应用方法
CN107083337A (zh) 一种食用菌原生质体的制备方法以及原生质体
CN104541975A (zh) 一种真姬菇液体菌种的快速制备方法及使用方法
CN106754546A (zh) 一株溶解甲藻的盐单胞菌菌株及含有其的固定化菌剂
CN101984827B (zh) 助植物生长菌剂及其制备方法
CN103255123B (zh) 菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法
CN103497914B (zh) 枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产γ-PGA的方法
CN1238495C (zh) 动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法及其培养基
CN102391973A (zh) 一种耐重金属的植物内生细菌及其应用
CN103520715B (zh) 利用wave波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法
CN109251880A (zh) 一种蜡样芽胞杆菌及其在改善水体磷污染中的应用
CN105087395A (zh) 一种利用磁力搅拌培养蛹虫草液体菌种的方法
CN203373351U (zh) 一种程序化控制的驯化筛选培养设备
CN103289931B (zh) 一种花域芽孢杆菌菌株sj及其在制备烟草抗病毒制剂和促生剂中的应用
CN105359831A (zh) 一种金针菇固体转液体的接种方法
CN103308360B (zh) 粘稠性临床检验标本的降粘设备及降粘方法
CN106699416A (zh) 一种多元液态复合微生物肥料及其制备方法
CN102719385B (zh) 细胞培养装置Opticell的新用途
CN107603870B (zh) 一种用于微载体细胞培养的消化过滤装置
CN102268375B (zh) 单胞藻培养的藻液连续收集方法和系统
CN111411048A (zh) 一种玫红巨孢囊霉菌根真菌单孢扩繁方法
CN204097479U (zh) 一种用于提高微生物培养过程中溶氧水平的震荡器具

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150708