CN104761524A - 一种化合物及其在制备抗寄生虫病药物中的应用 - Google Patents

一种化合物及其在制备抗寄生虫病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种化合物及其在制备抗寄生虫病药物中的应用。所述化合物的结构式如式Ⅰ或式Ⅱ所示。本发明提供的化合物，具有丰富的官能团多样性与可修饰性，产物相对易于分离纯化。本发明所提供的化合物对与恶性疟NDH蛋白的活性具有很好的抑制作用，这是一种新的抗疟疾的作用靶点与机制，因而这些化合物对于许多对传统药物已经产生抗性的疟原虫种株也具有很好的抑制作用，这就为当前日益严重的疟原虫耐药性方面提供了新的突破口。同时，疟原虫的NDH与人类的NADH氧化还原酶属于不同的种类，因此可以预期，这类化合物对人类能够产生较少的副作用。综上所述，本发明具有广阔的发展与应用前景。

Description

一种化合物及其在制备抗寄生虫病药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种化合物及其在制备抗寄生虫病药物中的应用。
背景技术
疟疾是一种由疟原虫（Plasmodium falciparum）造成的，通过疟蚊传播的全球急性传染性疾病，是对人类危害最大的寄生虫病。致病疟原虫主要有间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和恶性疟原虫，分别引起间日疟、三日疟、卵形疟和恶性疟，前三者又称为良性疟，恶性疟感染最广，症状较重，对人类身体健康危害最大。世界范围内，每年的疟疾患者有3亿之多，造成上百万人死亡。
现有的抗疟药中尚无一种药能够对疟原虫生活史的各个阶段都有杀灭作用，不同的抗疟药作用于不同的阶段。
恶性疟原虫II型还原辅酶醌还原氧化酶（PfNDH2）是一种抗疟靶点。PfNDH2为分子量为52kDa的酶，位于疟原虫的线粒体中，是电子传递链的重要电子供体。阻断PfNDH2可导致疟原虫线粒体功能紊乱，进而杀死疟原虫。该酶对其抑制剂产生耐受的概率极低而且在人体内尚未发现该酶的存在，这为避免或降低作用于该靶点的药物的副作用提供了有利条件，如此，PfNDH2的阻断剂有希望成为新的抗疟疾的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种化合物及其在制备抗寄生虫病药物中的应用。
本发明首先提供了一种式Ⅰ所示化合物，
式Ⅰ中，基团X为-O-、-NH-、-S-、-SO-、-SO2-、-CH2-、-CF2-、-CO-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2，当n=2时，基团R1可以相同或不同，基团R3可以相同或不同；
基团R1为-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-OR、-CF3、-COOR、-OCF3或-R，其中R为碳原子数为1～6的烷基；
基团R2为-H、-COOH、-COOR、-CONHNH2、-CONHOH、-CONH2、-CH2OH、-CF3或碳原子数为1～10的烷基；
基团R3为-F、-Cl、-R、-OR、-OH、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3、-COOH、-COOR、-CONH2、-CONHNH2、-CONHOH、-CONHOR，-NHOCR或-NHCOCF3；
基团R4和R5均为-H、碳原子数为1～5的烷基或碳原子数为1～5的烷氧基。
本发明进一步提供了式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）式1所示化合物与式2所示化合物经Suzuki反应、Ullmann偶联反应或芳香亲核取代反应得到式3所示酮化合物；
式中，基团R’2为-H、-COOR、-CF3或碳原子数为1～10的烷基，其中R为碳原子数为1-6的烷基；基团R’3为-F、-Cl、-R、-OR、-OAc、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3、COOR或-NHCOCF3；基团X’为-O-、-NH-、-S-、-CH2-、-CF2-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2，当n=2时，基团R’3可以相同或不同；
基团M为-CH2Br，-B（OH）2，-Br、-Cl、-OH、-SH或-NH2，基团M’为-Br、-Cl、-OH、-SH、-NH2、-CH2Br或-B（OH）2；
（2）经下述1）或2）或3）的步骤即得式Ⅰ所示化合物：
1）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式4所示化合物经缩合反应即得式Ⅰ所示化合物；
2）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式4所示化合物经缩合反应的产物再进行水解反应、氨解反应、肼解反应或羟胺解反应得到式Ⅰ所示化合物；
3）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式4所示化合物经缩合反应的产物再进行氧化反应得到式Ⅰ所示化合物；
式4中，基团R1为-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-OR、-CF3、-COOR、-OCF3或-R，其中R为碳原子数为1～6的烷基；基团R4和R5均为-H、碳原子数为1～5的烷基或碳原子数为1～5的烷氧基。
上述的制备方法中，步骤（1）中，所述Suzuki反应的催化剂可为醋酸钯，所述Suzuki反应的温度可为100～120℃，时间可为10～20小时；
所述Ullmann偶联反应的催化剂可为碘化亚铜，所述Ullmann偶联反应的温度可为110～130℃，时间可为10～20小时；
所述芳香亲核取代反应温度可为130℃，时间可为5小时；
式1所示化合物与式2所示化合物的摩尔比可为1：1～1.5；
步骤（2）中，所述缩合反应的温度可为130℃，时间可为16小时；
式3所示酮化合物与式4所示化合物的摩尔比可为1：1～2；
所述水解反应和所述羟胺解反应均可在20～25℃的条件下进行，时间可为5～20小时；
所述肼解和所述氨解反应均可70～90℃的条件下进行，时间可为5～20小时；
所述氧化反应可在20～25℃或85℃的条件下进行，时间可为1h～24h。
本发明还提供了一种式Ⅱ所示化合物，
式Ⅱ中，基团X为-O-、-NH-、-S-、-SO-、-SO2-、-CH2-、-CF2-、-CO-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；基团Z为-O-或-NH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2，当n=2时，基团R1可以相同或不同，基团R3可以相同或不同；
基团R1为-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-OR、-CF3、-COOR、-OCF3或-R，其中R为碳原子数为1～6的烷基；
基团R2为-H、-COOH、-COOR、-CONHNH2、-CONHOH、-CONH2、-CH2OH、-CF3或碳原子数为1～10的烷基；
基团R3为-F、-Cl、-R、-OR、-OH、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3、-COOH、-COOR、-CONH2、-CONHNH2、-CONHOH、-CONHOR，-NHOCR或-NHCOCF3。
本发明进一步提供了式Ⅱ所示化合物的制备方法，包括如下步骤，其中式Ⅱ中的基团Z为-O-：
（1）式1所示化合物与式2所示化合物经Suzuki反应、Ullmann偶联反应或芳香亲核取代反应得到式3所示酮化合物；
式中，基团R’2为-H、-COOR、-CF3或碳原子数为1～10的烷基，其中R为碳原子数为1-6的烷基；基团R’3为-F、-Cl、-R、-OR、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3COOR或-NHCOCF3；基团X’为-O-、-NH-、-S-、-CH2-、-CF2-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2，当n=2时，基团R’3可以相同或不同；
基团M为-CH2Br，-B（OH）2，-Br,-Cl,-OH,-SH,-NH2，基团M’为-Br、-Cl、-OH、-SH、-NH2、-CH2Br或-B（OH）2；
（2）在碱存在的条件下，式3所示酮化合物与式5所示酯化合物经加成消除反应得到式6所示二酮化合物；
式中，基团R’1为-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-COOR、-OR、-CF3或-R，其中R为碳原子数为1～6的烷基；基团R’2为-H、-COOR、-CF3或碳原子数为1～10的烷基,其中R为碳原子数为1-6的烷基；基团R’3为-F、-Cl、-R、-OR、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3、-COOR或-NHCOCF3；基团X’为-O-、-NH-、-S-、-CH2-、-CF2-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2，当n=2时，基团R’1可以相同或不同，基团R’3可以相同或不同；
（3）经下述1）或2）或3）的步骤即得式Ⅱ所示化合物：
1）式6所示二酮化合物经分子内芳香亲核取代反应即得基团Z为-O-时的式Ⅱ所示化合物；
2）式6所示二酮化合物经芳香亲核取代反应后的产物再经水解反应、氨解反应、肼解反应或羟胺解反应得到基团Z为-O-时的式Ⅱ所示化合物。
3）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式4所示化合物经缩合反应的产物再进行氧化反应得到基团Z为-O-时的式Ⅱ所示化合物。
上述的制备方法中，步骤（1）中，所述Suzuki反应的催化剂可为醋酸钯，所述Suzuki反应的温度可为100～120℃，时间可为10～20小时；
所述Ullmann偶联反应的催化剂可为碘化亚铜，所述Ullmann偶联反应的温度可为110～130℃，时间可为10～20小时；
所述芳香亲核取代反应温度可为130℃，时间可为5小时。
式1所示化合物与式2所示化合物的摩尔比可为1：1～1.5。
步骤（2）中，所述加成消除反应在氢化钠存在的条件下进行；所述加成消除反应的温度可为60～70℃，时间可为5～15小时；
式3所示酮化合物与式5所示酯化合物的摩尔比可为1：1～2。
步骤（3）中，所述分子内芳香亲核取代反应在碳酸钾存在的条件下进行；
所述分子内芳香亲核取代反应的温度可为110～130℃，时间可为2～10小时。
所述水解反应和所述羟胺解反应均可在20～25℃的条件下进行，时间可为5～20小时；
所述肼解和所述氨解反应均可在70～90℃的条件下进行，时间可为5～20小时；
所述氧化反应可在20～25℃或85℃的条件下进行，时间可为1h～24h。
本发明进一步提供了式Ⅱ所示化合物的制备方法，包括如下步骤，其中式Ⅱ中的基团Z为-NH-且R2为-H：
（1）式1’所示化合物与式2所示化合物经Suzuki反应、Ullmann偶联反应或芳香亲核取代反应得到式3’所示酮化合物；
式中，基团R’3为-F、-Cl、-R、-OR、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3、-COOR或-NHCOCF3；基团X’为-O-、-NH-、-S-、-CH2-、-CF2-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2，当n=2时，基团R’3可以相同或不同；
基团M为-CH2Br、-B（OH）2、-Br、-Cl、-OH、-SH或-NH2，基团M’为-Br、-Cl、-OH、-SH、-NH2、-CH2Br或-B（OH）2；
（2）在碱存在的条件下，式3’所示酮化合物与碳酸二甲酯经加成消除反应得到式7所示β-羟基酯类化合物；
式7中，基团R’3、X’和Y的定义同式3’；n表示取代基的个数，n为0、1或2；
（3）式7所示β-羟基酯类化合物与式8所示苯胺化合物经缩合反应得到式9所示烯胺化合物；
式中，基团R1为-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-OR、-CF3、-COOR、-OCF3或-R，其中R为碳原子数为1～6的烷基；基团R’3、X’和Y的定义同式3；n表示取代基的个数，n为0、1或2，当n=2时，基团R’3可以相同或不同；
（4）经下述1）或2）或3）的步骤即得式Ⅱ所示化合物：
1）式9所示烯胺化合物经环合反应即得基团Z为-NH-且R2为-H时的式Ⅱ所示化合物；
2）式9所示烯胺化合物经环合反应的产物再经水解反应、氨解反应、肼解反应或羟胺解反应得到基团Z为-NH-且R2为-H时的式Ⅱ所示化合物；
3）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式4所示化合物经缩合反应的产物再进行氧化反应得到式Ⅰ所示化合物。
上述的制备方法中，步骤（1）中，所述Suzuki反应的催化剂可为醋酸钯，所述Suzuki反应的温度可为100～120℃，时间可为10～20小时；
所述Ullmann偶联反应的催化剂可为碘化亚铜，所述Ullmann偶联反应的温度可为110～130℃，时间可为10～20小时；
所述芳香亲核取代反应温度可为130℃，时间为5小时。
式1所示化合物与式2所示化合物的摩尔比可为1：1～1.5。
上述的制备方法中，步骤（2）中，所述加成消除反应在氢化钠存在的条件下进行；所述加成消除反应的温度可为50～70℃，时间可为5～10小时；
式3’所示酮化合物与碳酸二甲酯的摩尔比可为1：2～3；
步骤（3）中，所述缩合反应的温度可为70～90℃，时间可为8～16小时；
式7所示β-羟基酯类化合物与式8所示苯胺化合物的摩尔比为1：1。
步骤（4）中，所述环合反应在Dowtherm A（CAS：8004-13-5）中进行；所述环合反应的温度可为240℃，时间可为0.5小时。
所述水解反应和所述羟胺解反应均可在20～25℃的条件下进行，时间可为5～20小时；
所述肼解和所述氨解反应均可在70～90℃的条件下进行，时间可为5～20小时；
所述氧化反应可在20～25℃或85℃的条件下进行，时间可为1h～24h。
本发明还提供了式Ⅱ所示化合物的制备方法，包括如下步骤，式Ⅱ中基团Z为-NH-且R2不为-H：
（1）式1所示化合物与式2所示化合物经Suzuki反应、Ullmann偶联反应或芳香亲核取代得到式3所示酮化合物；
式中，基团R’2为-H、-COOR、-CF3或碳原子数为1～10的烷基，其中R为碳原子数为1-6的烷基；基团R’3为-F、-Cl、-R、-OR、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3,COOR或-NHCOCF3；基团X’为-O-、-NH-、-S-、-CH2-、-CF2-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2，当n=2时，基团R’3可以相同或不同；
基团M为-CH2Br、-B（OH）2、-Br、-Cl、-OH、-SH或-NH2，基团M’为-Br、-Cl、-OH、-SH、-NH2、-CH2Br或-B（OH）2；
（2）经下述1）或2）或3）的步骤即得式Ⅱ所示化合物：
1）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式10所示靛红酸酐衍生物经缩合反应即得基团Z为-NH-且R2不为-H时的式Ⅱ所示化合物；
2）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式10所示靛红酸酐衍生物经缩合反应的产物再经水解反应、氨解反应、肼解反应或羟胺解反应得到基团Z为-NH-且R2不为-H时的式Ⅱ所示化合物；
3）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式4所示化合物经缩合反应的产物再进行氧化反应得到式Ⅰ所示化合物；
式10中，基团R’1为-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-OR、-CF3或-R，其中R为碳原子数为1～6的烷基。
上述的制备方法中，步骤（1）中，所述Suzuki反应的催化剂可为醋酸钯，所述Suzuki反应的温度可为100～120℃，时间可为10～20小时；
所述Ullmann偶联反应的催化剂可为碘化亚铜，所述Ullmann偶联反应的温度可为110～130℃，时间可为10～20小时；
所述芳香亲核取代反应温度可为130℃，时间可为5小时。
式1所示化合物与式2所示化合物的摩尔比可为1：1～1.5。
上述的制备方法中，步骤（2）中，所述缩合反应的温度可为70～100℃，时间可为2～10小时；
式3所示酮化合物与式10所示靛红酸酐衍生物的摩尔比可为1：1～2。
所述水解反应和所述羟胺解反应均可在20～25℃的条件下进行，时间可为5～20小时；
所述肼解和所述氨解反应均可在70～90℃的条件下进行，时间可为5～20小时；
所述氧化反应可在20～25℃或85℃的条件下进行，时间可为1h～24h。
本发明提供的式Ⅰ所示化合物或式Ⅱ所示化合物可用于制备预防和/或治疗疟疾的产品。
本发明提供的式Ⅰ所示化合物或式Ⅱ所示化合物可用于制备抑制NDH-2蛋白活性的产品中，所述NDH-2蛋白具体可如序列表的序列1所示；
所述产品具体表现为促进NDH-2蛋白的活性降低。
本发明提供的式Ⅰ所示化合物或式Ⅱ所示化合物可用于制备抑制恶性疟原虫菌株生长的产品，所述恶性疟原虫菌株具体为恶性疟原虫3D7菌株。
本发明还提供了一种预防和/或治疗疟疾的药物，其活性成分为式Ⅰ所示化合物或式Ⅱ所示化合物。
本发明还提供了一种恶性疟原虫菌株生长抑制剂，其活性成分为式Ⅰ所示化合物或式Ⅱ所示化合物。
本发明提供的化合物，具有丰富的官能团多样性与可修饰性，产物相对易于分离纯化。本发明所提供的化合物对与恶性疟NDH蛋白的活性具有很好的抑制作用，这是一种新的抗疟疾的作用靶点与机制，因而这些化合物对于许多对传统药物已经产生抗性的疟原虫种株也具有很好的抑制作用，这就为当前日益严重的疟原虫耐药性方面提供了新的突破口。同时，疟原虫的NDH与人类的NADH氧化还原酶属于不同的种类，因此可以预期，这类化合物对人类能够产生较少的副作用。综上所述，本发明具有广阔的发展与应用前景。
附图说明
图1为测定coenzyme Q1的Km和Kcat值时的结果。
图2为测NADH的Km和Kcat值时的结果。
图3为不同化合物对NDH-2蛋白活性的抑制作用。
图4为实施例47中化合物1的拟合曲线(Ki值为76nM)。
图5为实施例47中化合物2的拟合曲线(Ki值为101.7nM)。
图6为实施例47中化合物3的拟合曲线(Ki值为112nM)。
图7为实施例47中化合物4的拟合曲线(Ki值为871nM)。
图8为实施例47中化合物5的拟合曲线(Ki值为2.86μM)。
图9为实施例47中化合物6的拟合曲线(Ki值为6.34μM)。
图10为实施例47中化合物7的拟合曲线(Ki值为4.06μM)。
图11为实施例47中化合物8的拟合曲线(Ki值为80nM)。
图12为实施例47中化合物9的拟合曲线(Ki值为3.69μM)。
图13为实施例47中化合物10的拟合曲线(Ki值为283.1nM)。
图14为实施例47中化合物11的拟合曲线(Ki值为690.6nM)。
图15为实施例47中化合物12的拟合曲线(Ki值为1.43μM)。
图16为实施例47中化合物13的拟合曲线(Ki值为3.60μM)。
图17为实施例47中化合物14的拟合曲线(Ki值为901.8nM)。
图18为实施例47中化合物15的拟合曲线(Ki值为2.82μM)。
图19为实施例47中化合物16的拟合曲线(Ki值为2.09μM)。
图20为实施例47中化合物17的拟合曲线（Ki值为341.5nM）。
图21为实施例47中化合物36的拟合曲线（Ki值为3.4nM）。
图22为实施例47中化合物44的拟合曲线（Ki值为57.5nM）。
图23为实施例47中化合物48的拟合曲线（Ki值为741.2nM）。
上述附图中，纵坐标Activity[um/s]表示NDH-2蛋白的活性，横坐标inhibitor[um]表示化合物的浓度。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、化合物1的制备
反应方程式如下：
在氩气保护下，称取1.5g对溴甲基苯乙酮、2g对三氟甲氧基苯硼酸、32mg醋酸钯、74mg三苯基膦和3g磷酸钾于100ml圆底烧瓶中，加入20ml甲苯并在氩气保护下，80℃反应8小时，减压旋干溶剂，剩余物用20ml二氯甲烷溶解，用水洗涤两次后用无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=30:1（体积比）过硅胶柱，得到1.7g中间体A1（中间体A1为浅黄色液体），产率为81%。
取1g邻氯苯甲酸乙酯于100ml圆底烧瓶中，加入20ml干燥的四氢呋喃溶解；称取200mg氢化钠加入到上述溶液中，在50℃条件下搅拌。取1g中间体A1溶解到5ml干燥的四氢呋喃溶液中，并将中间体A1的四氢呋喃溶液慢慢滴加得到上述50℃条件下搅拌的溶液中；然后将温度升高得到80℃，回流约10h至反应结束。减压旋干溶剂，剩余物用二氯甲烷溶解，用水洗涤两次之后用无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=20:1（体积比）过硅胶柱，得到635mg中间体A2(中间体A2为浅黄色液体)，产率为49%。
取600mg中间体A2于25ml圆底烧瓶中，加入250mg碳酸钾和5mlDMF作为溶剂，100℃下搅拌4h后冷却至室温并加入50ml水终止反应，用15ml二氯甲烷萃取3次后，合并有机相并用饱和氯化钠洗涤一次。加压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=10:1（体积比）过硅胶柱，得到380mg化合物1（化合物1为白色固体），产率为64%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):4.07(s,2H),6.80(s,1H),7.16(d,J=8.36Hz,2H),7.22(d,J=8.48Hz,2H),7.34(d,J=8.04Hz,2H),7.42(t,J=7.48Hz,1H),7.55(d,J=8.36Hz,1H),7.70(t,J=7.48Hz,1H),7.87(d,J=8.08Hz,2H),8.23(d,J=7.92Hz,1H)LC-MS:calcd for C23H16F3O3[M+H]+:397.09,found397.13。
实施例2、化合物2的制备
反应方程式如下：
取1.2g2,4-二氯苯甲酸甲酯于100ml圆底烧瓶中，加入20ml干燥的四氢呋喃溶解；称取200mg氢化钠加入到上述溶液中，在50℃条件下搅拌。取1g中间体A1溶解到5ml干燥的四氢呋喃溶液中，并将中间体A1的四氢呋喃溶液慢慢滴加得到上述50℃条件下搅拌的溶液中；然后将温度升高得到80℃，回流约10h至反应结束。减压旋干溶剂，剩余物用二氯甲烷溶解，用水洗涤两次之后用无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=20:1（体积比）过硅胶柱，得到842mg中间体A3(中间体A3为浅黄色液体)，产率为52%。
取600mg中间体A3于25ml圆底烧瓶中，加入250mg碳酸钾和5mlDMF作为溶剂，100℃下搅拌4h后冷却至室温并加入50ml水终止反应，用15ml二氯甲烷萃取3次后，合并有机相并用饱和氯化钠洗涤一次。加压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=10:1（体积比）过硅胶柱，得到382mg化合物2（化合物2为白色固体），产率为71%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):4.04(s,2H),6.74(s,1H),7.15(d,J=8.32Hz,2H),7.21(d,J=8.52Hz,2H),7.30-7.35(m,3H),7.54(s,1H),7.80(d,J=8.12Hz,2H),8.12(d,J=8.48Hz,1H)。
LC-MS:calcd for C23H15ClF3O3[M+H]+:431.06,found431.08。
实施例3、化合物3的制备
反应方程式如下：
取1.3g2,6-二氯苯甲酰氯于100ml圆底烧瓶中，加入20ml干燥的四氢呋喃溶解；称取200mg氢化钠加入到上述溶液中，在50℃条件下搅拌。取1g中间体A1溶解到5ml干燥的四氢呋喃溶液中，并将中间体A1的四氢呋喃溶液慢慢滴加得到上述50℃条件下搅拌的溶液中；然后将温度升高得到80℃，回流约10h至反应结束。减压旋干溶剂，剩余物用二氯甲烷溶解，用水洗涤两次之后用无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=20:1（体积比）过硅胶柱，得到541mg中间体A4(中间体A4为浅黄色液体)，产率为34%。
取500mg中间体A4于25ml圆底烧瓶中，加入250mg碳酸钾和5mlDMF作为溶剂，100℃下搅拌4h后冷却至室温并加入50ml水终止反应，用15ml二氯甲烷萃取3次后，合并有机相并用饱和氯化钠洗涤一次。加压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=10:1（体积比）过硅胶柱，得到332mg化合物3（化合物3为白色固体），产率为72%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):4.06(s,2H),6.74(s,1H),7.15(d,J=8.28Hz,2H),7.21(d,J=8.44Hz,2H),7.32(d,J=8.00Hz,2H),7.38(d,J=7.60Hz,1H),7.46(d,J=8.24Hz,1H),7.53(t,J=8.08Hz,1H),7.83(d,J=8.00Hz,2H)；
LC-MS:calcd for C23H15ClF3O3[M+H]+:431.06,found431.08。
实施例4、化合物4的制备
反应方程式如下：
称取3.2g靛红酸酐于100ml圆底烧瓶中，加入3ml2-氨基异丁醇和280mg氯化锌，然后加入25ml氯苯作为溶剂，140℃回流反应18小时，冷却至室温，减压旋干氯苯，所得剩余物用二氯甲烷溶解，水洗两次得到有机相，减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=20:1（体积比）过硅胶柱，得到1.5g中间体A5（中间体A5为白色固体），产率为52%。
在氩气保护下，称取2g2-溴-5-乙酰基吡啶、1.5ml对三氟甲氧基苯酚、380mg碘化亚铜、492mg2-吡啶羧酸以及4.3g磷酸三钾于100ml圆底烧瓶中，加入20ml DMSO作为溶剂110℃反应约10小时，冷却至室温，加入100ml水，然后用20ml二氯甲烷萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=10:1（体积比）过硅胶柱，得到2.2g中间体A6（中间体A6为白色固体），产率为77%。
称取1.5g中间体A5和1.4g中间体A6于50ml圆底烧瓶中，加入300mg对甲苯磺酸（PTSA）和15ml正丁醇作为溶剂，130℃回流24小时，冷却至室温，减压旋干溶剂。剩余物用乙酸乙酯溶解，水洗2次，减压旋干得到的有机相，剩余物先用石油醚：乙酸乙酯=1:1然后逐渐增加到100%乙酸乙酯过硅胶柱，得到652mg化合物4（化合物4为浅黄色固体），产率为29%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):1.46(s,6H),3.63(s,1H),3.70(s,2H)5.41(s,1H),6.87(s,1H),7.04(d,J=8.56Hz,1H),7.20(d,J=9.08Hz,2H),7.26(d,J=8.40Hz,2H),7.34(t,J=7.32Hz,1H),7.58-7.62(m,2H),8.00(d,J=8.28Hz,1H),8.43(dd,J=8.00Hz,J=2.40Hz,1H),8.61(d,J=2.12Hz,1H)。
LC-MS:calcd for C25H23F3N3O3[M+H]+:470.16,found470.05。
实施例5、化合物5的制备
反应方程式如下：
在氩气保护下，称取2g2-溴-5-乙酰基吡啶、1.8g对羟基苯甲酸甲酯、380mg碘化亚铜、492mg2-吡啶羧酸以及4.3g磷酸三钾于100ml圆底烧瓶中，加入20ml DMSO作为溶剂110℃反应约10小时，冷却至室温，加入100ml水，然后用20ml乙酸乙酯萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=5:1（体积比）过硅胶柱，得到1.7g中间体A7（中间体A7为白色固体），产率为63%。
称取3g中间体A5和1.3g中间体A7于50ml圆底烧瓶中，加入190mg对甲苯磺酸（PTSA）和15ml正丁醇作为溶剂，130℃回流24小时，冷却至室温，减压旋干溶剂。剩余物用乙酸乙酯溶解，水洗2次，减压旋干得到的有机相，剩余物先用石油醚：乙酸乙酯=1:1然后逐渐增加到100%乙酸乙酯过硅胶柱，得到487mg化合物5（化合物5为浅黄色固体），产率为22%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,MeOD,ppm):1.55(s,6H),3.73(s,2H),3.91(s,3H),7.10(s,1H),7.19(d,J=8.56Hz,1H),7.27(d,J=8.76Hz,2H),7.46(t,J=8.20Hz,1H),7.66(t,J=7.32Hz,1H),7.92(d,J=8.44Hz,1H),8.03(d,J=8.44Hz,1H),8.09(d,J=8.76Hz,1H),8.43(dd,J=8.52Hz,J=2.44Hz，1H)，8.74(d,J=2.32Hz,1H)。
LC-MS:calcd for C26H26N3O4[M+H]+:444.18,found444.21。
实施例6、化合物6的制备
反应方程式如下：
取200mg化合物5于25ml圆底烧瓶中，加入130mg氢氧化钾，以及10ml甲醇作为溶剂，室温反应约8小时，加水并滴加浓盐酸调节酸性至PH≈4，析出白色固体，抽滤分离得到白色固体，将所得白色固体于二氯甲烷中重结晶，得到181mg化合物6（化合物6为白色固体），产率为94%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,MeOD,ppm):1.59(s,6H),3.78(s,2H),7.23-7.30(m,4H),7.68(t,J=7.76Hz,1H),7.92(t,J=7.36Hz,1H),8.00-8.07(m,3H),8.40(d,J=8.28Hz,2H),8.69(s,1H)。
LC-MS:calcd for C26H26N3O4[M+H]+:444.18,found444.21。
实施例7、化合物7的制备
反应方程式如下：
在氩气保护下，称取2g2-溴-5-乙酰基吡啶、2.1g对三氟乙酰氨基酚、380mg碘化亚铜、492mg2-吡啶羧酸以及4.3g磷酸三钾于100ml圆底烧瓶中，加入20ml DMSO作为溶剂110℃反应约10小时，冷却至室温，加入100ml水，然后用20ml乙酸乙酯萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=5:1（体积比）过硅胶柱，得到2.1g中间体A8（中间体A8为白色固体），产率为65%。
称取2g中间体A5和1.5g中间体A8于50ml圆底烧瓶中，加入210mg对甲苯磺酸（PTSA）和15ml正丁醇作为溶剂，130℃回流24小时，冷却至室温，减压旋干溶剂。剩余物用乙酸乙酯溶解，水洗2次，减压旋干得到的有机相，剩余物先用石油醚：乙酸乙酯=1:1然后逐渐增加到100%乙酸乙酯过硅胶柱，得到360mg化合物7（化合物7为白色固体），产率为19%。与此同时还可以得到化合物8。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):1.47(s,6H),3.60(s,2H),5.27(s,1H)，6.19(s,1H)，7.17(m,2H),7.26(d,J=8.48Hz,2H),7.42(t,J=7.64Hz,1H),7.63(t,J=7.40Hz,1H),7.74(d,J=8.36Hz,2H),7.86(d,J=8.36Hz,1H),8.16(d,J=8.40Hz,1H),8.59(d,J=8.60Hz,1H)，8.88(s,1H)，11.33(b,1H)。
LC-MS:calcd for C26H24F3N4O3[M+H]+:497.17,found497.23。
实施例8、化合物8的制备
反应方程式如下：
化合物8的制备方法同化合物7，即利用该方法可以同时得到化合物7和化合物8，在后处理过程中略有不同。在减压旋干正丁醇之后，加入乙酸乙酯溶解剩余物，不溶的白色固体即为化合物8，过滤得到61mg化合物8，产率为3.8%。而滤液按照化合物7的制备方法可得到化合物7。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,MeOD,ppm):6.57(s,1H),7.18(d,J=8.68Hz,1H),7.23(d,J=8.88Hz,2H)，7.51(m,1H)，7.53(t,J=7.76Hz,1H),7.76(m，3H),8.26(m,2H),8.58(d,J=2.08Hz,1H)。
LC-MS:calcd for C22H15F3N3O3[M+H]+:426.10,found426.24。
实施例9、化合物9的制备
反应方程式如下：
取200mg化合物5于25ml圆底烧瓶中，加入50微升水合肼，以及10ml甲醇作为溶剂，80℃加热回流约10h，冷却至室温，减压旋干溶剂，剩余物过硅胶柱，洗脱剂极性从乙酸乙酯逐渐增大到乙酸乙酯：甲醇=100:3，得到110mg化合物9（化合物9为白色固体），产率为55%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):7.15(d,J=7.96Hz,2H),7.22(d,J=8.00Hz,2H),7.61(m,3H)，7.90(m,2H)，8.02(d,J=8.44Hz,2H),8.32(t,J=8.12Hz,1H),13.14(s,1H)。
LC-MS:calcd for C23H14NO6[M-H]-:400.09,found400.11。
实施例10、化合物10的制备
反应方程式如下：
在氩气保护下，称取3.7g对碘苯乙酮、2.5g对三氟乙酰氨基酚、571mg碘化亚铜、738mg2-吡啶羧酸以及6.4g磷酸三钾于100ml圆底烧瓶中，加入20ml DMSO作为溶剂110℃反应约10小时，冷却至室温，加入100ml水，然后用20ml乙酸乙酯萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=20:1（体积比）过硅胶柱，得到3.3g中间体A9（中间体A9为浅黄色液体），产率为83%。
称取1.3g中间体A9于50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水四氢呋喃和1.7ml碳酸二甲酯，然后加入600mg氢化钠，75℃回流约8小时后冷却至室温，减压旋干溶剂，剩余物用二氯甲烷溶解，水洗2次，饱和氯化铵溶液洗一次，减压旋干有机相，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=15:1过硅胶柱，得到1.2g中间体A10(中间体A10为浅黄色液体)，产率为74%。
称取1g中间体A10于50ml圆底烧瓶中，加入15ml无水N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，加入200mg氢化钠，然后慢慢加入500mg靛红酸酐，80℃搅拌8小时，冷却至室温，加入100ml水，并用盐酸调节PH至酸性，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，减压旋干，所得剩余物用乙酸乙酯：石油醚=1:1，并逐渐增大极性至乙酸乙酯：甲醇=100:5过硅胶柱，得到210mg中间体A11（中间体A11为白色固体），产率为21%。
称取200mg中间体A11，于25ml圆底烧瓶中。加入5ml甲醇和5ml水作为溶剂，加入104mg氢氧化钾，100℃回流10小时，冷却至室温，加入10ml水用乙酸乙酯洗涤水相，将得到的水相用浓盐酸调节至PH=2，析出白色固体，过滤并干燥得到99mg化合物10，产率为51%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):7.15(d,J=7.96Hz,2H),7.22(d,J=8.00Hz,2H),7.61(m,3H)，7.90(m,2H)，8.02(d,J=8.44Hz,2H),8.32(t,J=8.12Hz,1H),13.14(s,1H)。
LC-MS:calcd for C23H14NO6[M-H]-:400.09,found400.11。
实施例11、化合物11的制备
反应方程式如下：
在氩气保护下，称取2g对溴苯乙酮、1.9g对三氟甲氧基苯酚、380mg碘化亚铜、492mg2-吡啶羧酸以及4.3g磷酸三钾于100ml圆底烧瓶中，加入20ml DMSO作为溶剂110℃反应约10小时，冷却至室温，加入100ml水，然后用20ml乙酸乙酯萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=15:1（体积比）过硅胶柱，得到2.2g中间体A12（中间体A12为浅黄色液体），产率为73%。
称取3g中间体A12于50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水四氢呋喃和2.6ml碳酸二甲酯，然后加入720mg氢化钠，75℃回流约8小时后冷却至室温，减压旋干溶剂，剩余物用二氯甲烷溶解，水洗2次，饱和氯化铵溶液洗一次，减压旋干有机相，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=15:1过硅胶柱，得到2.4g中间体A13(中间体A13为浅黄色液体)，产率为69%。
称取1.6g中间体A13于50ml圆底烧瓶中，加入15ml无水N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，加入312mg氢化钠，然后慢慢加入1.1g靛红酸酐，80℃搅拌8小时，冷却至室温，加入100ml水，并用盐酸调节PH至酸性，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，减压旋干，所得剩余物用乙酸乙酯：石油醚=1:1，并逐渐增大极性至乙酸乙酯：甲醇=100:5过硅胶柱，得到660mg化合物11（化合物11为白色固体），产率为29%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):3.56(s,3H),7.19-7.22(m,4H),7.40(m,1H)，7.46(d,J=8.56Hz,2H)，7.62(d,J=8.60Hz,2H),7.72(m,2H),8.13(d,J=7.96Hz,1H)12.07(s,1H)。
LC-MS:calcd for C24H17F3NO5[M+H]+:456.10,found456.21。
实施例12、化合物12的制备
反应方程式如下：
在氩气保护下，称取2g对溴苯乙酮、1.8g间三氟甲基苯酚、380mg碘化亚铜、492mg2-吡啶羧酸以及4.3g磷酸三钾于100ml圆底烧瓶中，加入20ml DMSO作为溶剂110℃反应约10小时，冷却至室温，加入100ml水，然后用20ml乙酸乙酯萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=15:1（体积比）过硅胶柱，得到2.2g中间体A14（中间体A14为浅黄色液体），产率为76%。
称取2.8g中间体A14于50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水四氢呋喃和2.6ml碳酸二甲酯，然后加入720mg氢化钠，75℃回流约8小时后冷却至室温，减压旋干溶剂，剩余物用二氯甲烷溶解，水洗2次，饱和氯化铵溶液洗一次，减压旋干有机相，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=15:1过硅胶柱，得到2.2g中间体A15(中间体A15为浅黄色液体)，产率为65%。
称取2.2g中间体A15于50ml圆底烧瓶中，加入15ml无水N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，加入312mg氢化钠，然后慢慢加入1.1g靛红酸酐，80℃搅拌8小时，冷却至室温，加入100ml水，并用盐酸调节PH至酸性，用15ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，减压旋干，所得剩余物用乙酸乙酯：石油醚=1:1，并逐渐增大极性至乙酸乙酯：甲醇=100:5过硅胶柱，得到657mg化合物12（化合物12为白色固体），产率为23%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):3.56(s,3H),7.26(d,J=8.48Hz,2H),7.38(m,3H)，7.55(d,J=7.68Hz,1H)，7.64-7.74(m,5H),8.14(d,J=8.04Hz,1H),12.10(s,1H)。LC-MS:calcd for C24H17F3NO4[M+H]+:440.10,found440.18。
实施例13、化合物13的制备
反应方程式如下：
称取200mg化合物11，于25ml圆底烧瓶中。加入5ml甲醇和5ml水作为溶剂，加入104mg氢氧化钾，100℃回流10小时，冷却至室温，加入10ml水用乙酸乙酯洗涤水相，将得到的水相用浓盐酸调节至PH=2，析出白色固体，过滤并干燥得到159mg化合物13，产率为82%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):7.15-7.22(m,4H),7.47(d,J=8.60Hz,2H),7.57-7.61(m,3H)，7.85-7.88(m,2H)，8.30(d,J=8.00Hz,1H),13.04(s,1H)。LC-MS:calcd for C23H15F3NO5[M+H]+:442.08,found442.18。
实施例14、化合物14的制备
反应方程式如下：
称取200mg化合物12，于25ml圆底烧瓶中。加入5ml甲醇和5ml水作为溶剂，加入104mg氢氧化钾，100℃回流10小时，冷却至室温，加入10ml水用乙酸乙酯洗涤水相，将得到的水相用浓盐酸调节至PH=2，析出白色固体，过滤并干燥得到118mg化合物14，产率为61%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):7.20(d,J=8.56Hz,2H),7.39(d,J=8.72Hz,2H),7.55-7.62(m,4H)，7.70(t,J=7.84Hz,1H)，7.88(m,2H),8.30(d,J=7.96Hz,1H),13.10(s,1H)。
LC-MS:calcd for C23H15F3NO4[M+H]+:426.09,found426.18。
实施例15、化合物15的制备
反应方程式如下：
称取200mg化合物12，于25ml圆底烧瓶中。加入10ml一水合肼，115℃回流4小时，冷却至室温，加入20ml水，并用10ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相以及附着于有机相的固体，减压旋干溶剂，剩余物在二氯甲烷中重结晶到66mg化合物15，产率为15%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):4.26（b,2H）,7.19(d,J=8.44Hz,2H),7.37-7.41(m,3H),7.56(d,J=7.68Hz,1H)，7.61(d,J=8.48Hz,2H)，7.67-7.73(m,3H),8.16(d,J=8.16Hz,1H),9.74(s,1H),13.10(s,1H)。
LC-MS:calcd for C23H17F3N3O3[M+H]+:440.11,found440.22。
实施例16、化合物16的制备
反应方程式如下：
称取200mg化合物11，于25ml圆底烧瓶中。加入10ml一水合肼，115℃回流4小时，冷却至室温，加入20ml水，并用10ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相以及附着于有机相的固体，减压旋干溶剂，剩余物在二氯甲烷中重结晶到104mg化合物15，产率为23%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):4.32（b，2H）,7.14(d,J=8.48Hz,2H),7.20(d,J=8.92Hz,2H),7.38(t,J=7.64Hz,1H)，7.46(d,J=8.68Hz,2H)，7.61(d,J=8.48Hz,2H),7.67-7.73(m,2H),8.17（d,J=8.08Hz,1H），9.80(s,1H),12.01(s,1H)。
LC-MS:calcd for C23H17F3N3O3[M+H]+:456.11,found456.22。
实施例17、化合物17的制备
反应方程式如下：
取140mg盐酸羟胺于10ml圆底烧瓶中，加入224mg氢氧化钾，等到产生氯化钾沉淀，过滤除去沉淀，称取444mg化合物5于滤液中，室温搅拌14h，加盐酸调pH至约为4，用15ml乙酸乙酯萃取三次，减压旋干溶剂，用乙酸乙酯：甲醇=10:1过硅胶柱，得到56mg化合物17（棕色固体），产率为13%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d4-MeOH,ppm):1.53(s，3H）,3.73(s,2H),7.06(s,1H),7.10(d,J=7.68Hz,1H)，7.19(d,J=8.04Hz,2H)，7.46(t,J=7.24Hz,1H),7.67(t,J=6.96Hz，1H),7.80（d,J=7.96Hz,2H），7.87（d,J=6.94Hz,1H），8.07(d,J=7.92Hz,1H),8.33(d,J=6.04Hz,1H),8.65(s,1H)。
LC-MS:calcd for C25H25N4O4[M+H]+:445.18,found445.29。
实施例18、化合物18的制备
反应方程式如下：
取500mg中间体A10和1ml苯胺于25ml圆底烧瓶中，加入1.2ml乙酸和5ml甲醇，回流12小时后冷却至室温，加入50ml水，用10ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用石油醚：乙酸乙酯=10:1过硅胶柱，得到320mg中间体A20(黄色液体)，产率为52%。
取320mg中间体A20于10ml密封管中，加入3ml Dowthernm A作为溶剂，240℃反应30min，冷却至室温，加入石油醚使析出固体。依次用石油醚、二氯甲烷、甲醇重结晶，最后得到200mg中间体A21（白色固体），产率为68%。
取60mg中间体A21于10ml圆底烧瓶中，加入112mg KOH和2ml甲醇，室温搅拌10h，加盐酸调节pH约3，析出白色固体，滤去上清得到28mg化合物18，产率为49%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):6.55(s，1H）,7.13(d,J=8.12Hz,2H)，7.27(d,J=8.04Hz,2H)，7.42(t,J=7.28Hz,1H),7.74(t,J=7.12Hz，1H),7.85（d,J=8.20Hz,1H），7.91（d,J=8.08Hz,2H），7.99(d,J=8.08Hz,2H),8.13(d,J=7.96Hz,1H)。
LC-MS:calcd for C22H16NO4[M+H]+:358.10,found358.19。
实施例19、化合物19的制备
反应方程式如下：
取100mg中间体A21于10ml圆底烧瓶中，加入2ml DMSO作为溶剂，加入200uL水合肼，80℃反应16h，加盐酸调节pH至约3，析出固体，过滤得到64mg化合物19（灰白色固体），产率为64%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):6.38(s，1H）,7.13(d,J=8.00Hz,2H)，7.23(d,J=7.32Hz,2H)，7.35(t,J=7.24Hz,1H),7.68(t,J=7.12Hz，1H),7.76（d,J=8.20Hz,1H），7.88（m,4H），8.10(d,J=7.92Hz,2H),9.79(s，1H),11.85(b，1H)。
LC-MS:calcd for C22H18N3O3[M+H]+:372.13,found372.18。
实施例20、化合物20的制备
反应方程式如下：
称取4g2-溴-5-乙酰基吡啶和760mg一水合对甲苯磺酸于50ml圆底烧瓶中，加入7ml原甲酸三甲酯和20ml乙二醇，在氩气保护下，60℃搅拌20h。反应结束，将反应液倾入100ml饱和碳酸氢钠溶液中，用20ml二氯甲烷萃取三次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得到中间体A22，直接用于下一步。
称取6g对甲基苯甲酸甲酯和8g NBS，加入20ml无水乙腈作溶剂，加入500mgAIBN,90℃回流8h，冷却至室温，旋干溶剂，加入100ml二氯甲烷，用水、饱和食盐水洗，旋干有机相，用石油醚：乙酸乙酯=50:1，过硅胶柱得到7.8g中间体A23（无色液体），产率为85%。
取2g锌粉于100ml圆底烧瓶中，无水无氧条件下加入20ml无水THF，加入一滴三甲基氯硅烷。另取7g中间体A23用无水THF溶解慢慢滴加到上述溶液中，直至变为澄清溶液，悬浊液消失，得到有机锌试剂溶液。另取一个100ml圆底烧瓶，加入350mgPd（PPh3）4和之前得到的中间体A22，加入10ml无水THF,边搅拌边向里面加入有机锌溶液，室温反应12h后，旋干溶剂，加入100ml饱和氯化铵溶液，用20ml DCM萃取三次，合并有机相，旋干，得到的剩余物加入30ml丙酮和20ml10%盐酸，50℃反应20h后，加氢氧化钾调pH至约10，20ml DCM萃取两次，得到有机相用石油醚：乙酸乙酯=4:1过硅胶柱，得到3.4g中间体A24(白色固体)，产率为34%。
取2.2ml碳酸二甲酯与50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水THF和624mg NaH。取3.4g中间体A24，加无水THF溶解，将得到的A24溶液慢慢加入到NaH的THF悬浊液中，回流12h。旋干溶剂，加入100ml饱和氯化铵溶液，用20ml DCM萃取2次，得到有机相，用石油醚：乙酸乙酯=3:1过硅胶柱得到2.5g中间体A25（黄色液体），产率为61%。
取1.5g中间体A25、1.3ml苯胺和2.6ml乙酸于50ml圆底烧瓶中，加入20ml甲醇作为溶剂，回流12h，加50ml水，用20ml DCM萃取2次，得到有机相用石油醚：乙酸乙酯=4:1过硅胶柱，得到613mg中间体A26（黄色液体），产率为31%。
取613mg中间体A26于10ml密封管中，加入3ml Dowtherm A作为溶剂，240℃反应30min，冷却至室温，加入石油醚使析出固体。依次用石油醚、二氯甲烷、甲醇重结晶，最后得到222mg化合物20（白色固体），产率为35%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):3.83(s，3H),4.28(s，2H),6.38(s，1H),7.34(t,J=7.00Hz,1H)，7.47(d,J=8.04Hz,2H)，7.55(d,J=8.08Hz,1H),7.67-7.72(m,2H),7.91（d,J=8.08Hz,2H），8.09（d,J=7.96Hz,1H），8.17(d,J=7.64Hz,1H),8.93(s，1H),11.80(s，1H)。
LC-MS:calcd for C22H19N2O3[M+H]+:370.13,found371.26。
实施例21、化合物21的制备
反应方程式如下：
取74mg化合物20于10ml圆底烧瓶中，加入112mg氢氧化钾和2ml甲醇，室温反应24h后，加盐酸调节pH至约4，析出固体，滤去上清得到45mg化合物21（白色固体），产率为58%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):4.27(s，2H),6.44(s，1H),7.36-7.45(m,3H)，7.55(d,J=6.88Hz,1H),7.69-7.73(m,2H),7.89（d,J=6.52Hz,2H），8.11（d,J=6.60Hz,1H），8.19(d,J=6.20Hz,1H),9.00(s，1H)。
LC-MS:calcd for C22H17N2O3[M+H]+:356.12,found357.29。
实施例22、化合物22的制备
反应方程式如下：
取74mg化合物20于10ml圆底烧瓶中，加入0.5ml一水合肼和2ml DMSO，80℃反应24h后，加盐酸调节pH至约4，析出固体，滤去上清得到21mg化合物22（棕色固体），产率为28%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):4.24(s，2H),4.55(b，2H),6.38(s，1H),7.35-7.40(m,3H)，7.54(d,J=7.28Hz,1H),7.70-7.78(m,4H),8.10（d,J=7.96Hz,1H），8.17（s,1H），8.94(s,1H),9.71(s，1H),11.79(s，1H)。
LC-MS:calcd for C22H19N4O2[M+H]+:371.14,found371.24。
实施例23、实施例24：化合物23和化合物24的制备
反应方程式如下：
称取5g中间体A1于100ml圆底烧瓶中,加入500mg FeCl3.6H2O,和10ml吡啶，再加入12ml70%过氧化叔丁醇水溶液，85℃反应24h，反应结束后加100ml2N盐酸，用20ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用二氯甲烷：石油醚=1:1，过硅胶柱得到2.6g中间体A26（白色固体），产率为55%。
称取2.6g中间体A26于50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水四氢呋喃和2.2ml碳酸二甲酯，然后加入608mg氢化钠，75℃回流约8小时后冷却至室温，减压旋干溶剂，剩余物用二氯甲烷溶解，水洗2次，饱和氯化铵溶液洗一次，减压旋干有机相，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=10:1过硅胶柱，得到1.6g中间体A27(中间体A27为浅黄色液体)，产率为52%。
取1.6g中间体A27和1ml间氯苯胺于25ml圆底烧瓶中，加入1.5ml乙酸和5ml甲醇，回流12小时后冷却至室温，加入50ml水，用10ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用石油醚：乙酸乙酯=10:1过硅胶柱，得到555mg中间体A28(黄色液体)，产率为26%。
取555mg中间体A28于10ml密封管中，加入3ml Dowthernm A作为溶剂，240℃反应30min，冷却至室温，加入石油醚使析出固体。依次用石油醚、二氯甲烷、甲醇重结晶，最后得到222mg中间体A29和A30的混合物（白色固体，两者比例约为2:1），产率为43%。
取上述得到的A29和A30的混合物于10ml圆底烧瓶中，加入112mg叔丁醇钾和4ml无水THF,室温搅拌30min，然后加入92uL N,N-二甲基甲酰氯，继续反应2h，结束后，加入20ml饱和食盐水，用10ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用二氯甲烷：石油醚=2:1过硅胶柱，得到纯的化合物23和24混合物，然后用半制备HPLC将混合物分开，分别得到纯的152mg化合物23（白色固体）和68mg化合物24（白色固体），总产率为86%。
化合物23表征数据如下：
H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):3.13(s，3H),3.30(s，3H)，7.26(s，1H),7.34(d,J=8.20Hz,2H),7.51(d,J=8.84Hz,1H)，7.89–8.00(m,6H),8.20(s，1H),8.26（d,J=8.16Hz,2H）。LC-MS:calcd for C26H19ClF3N2O4[M+H]+:514.09,found515.25。
化合物24表征数据如下：
H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):3.11(s，3H),3.26(s，3H)，7.27(d,J=9.64Hz,2H),7.56–7.65(m,3H),7.71(s，1H)，7.90–7.94(m,3H),8.14(d,J=7.88Hz,2H),8.28（d,J=8.24Hz,2H）。
LC-MS:calcd for C26H19ClF3N2O4[M+H]+:514.09,found515.25。
实施例25、化合物25的制备
反应方程式如下：
取130mg化合物23于5ml圆底烧瓶中，加入0.5ml乙二硫醇，和180uL三氟化硼二乙酸络合物，室温反应10h，将反应液倾入饱和碳酸氢钠溶液，用20ml二氯甲烷萃取2次，得到的有机相用二氯甲烷：石油醚=2:1过硅胶柱得到132mg中间体A31(黄色液体),产率为89%。
取56mg NBS和1ml无水DCM于合适的塑料瓶中，加入0.2ml HF.pyridine，在-78℃氩气保护下，将74mg中间体A31溶于DCM加入到上述溶液，继续反应2h，结束后，将反应液倾入饱和碳酸钠溶液中，用10ml二氯甲烷萃取2次，所得有机相用二氯甲烷：石油醚=2:1过硅胶柱，得到52mg化合物25（黄色液体），产率为77%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):3.10(s，3H),3.26(s，3H)，7.26(d,J=8.40Hz,2H),7.47(d,J=8.84Hz,1H),7.57(d,J=9.00Hz,2H)，7.62(d,J=8.12Hz,2H),7.86(s，1H),7.92（d,J=8.88Hz,1H）,8.15-8.19(m,3H)。
LC-MS:calcd for C26H19ClF5N2O3[M+H]+:536.09,found537.22。
实施例26、化合物26的制备
反应方程式如下：
取26mg化合物25于10ml圆底烧瓶中,加入20ul一水合肼和2ml甲醇，室温反应12h，浓缩使析出固体，得到18mg化合物26（白色固体），产率为82%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):6.40(s,1H),7.36(d,J=7.52Hz,1H),7.52(d,J=7.24Hz,2H),7.73–7.76(m,5H)，7.95(d,J=5.76Hz,2H),8.09(d,J=8.00Hz,1H),11.82（s,1H）。
LC-MS:calcd for C23H14ClF5NO2[M+H]+:466.06,found466.16。
实施例27、化合物27的制备
反应方程式如下：
取52mg化合物24于5ml圆底烧瓶中，加入0.5ml乙二硫醇，和100uL三氟化硼二乙酸络合物，室温反应10h，将反应液倾入饱和碳酸氢钠溶液，用20ml二氯甲烷萃取2次，得到的有机相用二氯甲烷：石油醚=2:1过硅胶柱得到48mg中间体A32(黄色液体),产率为82%。
取25mg NBS和1ml无水DCM于合适的塑料瓶中，加入0.2ml HF.pyridine，在-78℃氩气保护下，将34mg中间体A32溶于DCM加入到上述溶液，继续反应2h，结束后，将反应液倾入饱和碳酸钠溶液中，用10ml二氯甲烷萃取2次，所得有机相用二氯甲烷：石油醚=2:1过硅胶柱，得到21mg化合物27（黄色液体），产率为39%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):3.10(s，3H),3.25(s，3H)，7.27(d,J=9.08Hz,2H),7.56–7.65(m,7H),8.10(d,J=7.89Hz,2H)，8.17–8.21(m,2H)。
LC-MS:calcd for C26H19ClF5N2O3[M+H]+:536.09,found537.22。
实施例28、化合物28的制备
反应方程式如下：
在100ml圆底烧瓶中加入3.6g L-酪氨酸和20ml甲醇，慢慢滴加2.18ml二氯亚砜，室温搅拌2h后将温度升到90℃回流半小时后，停止反应，旋干溶剂，得到固体，用乙醚重结晶得到中间体A33的盐酸盐4.33g，产率为94%。
在100ml圆底烧瓶中加入3.3g中间体A33，4.2ml三乙胺和30ml DCM，慢慢滴加3ml三氟乙酸酐，室温反应5h，加2N盐酸100ml，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得到3.3g中间体A34（白色固体），产率为72%。
称取1.2g2-溴-4-丙酰基吡啶和1.92g中间体A34与25ml圆底烧瓶中，加入500mg碳酸钾和10ml无水DMF，氩气保护下，130℃反应5h，冷却至室温后，加入100ml水，用20ml二氯甲烷萃取三次，合并有机相，依次用水、饱和食盐水洗，减压旋干有机相，用石油醚：乙酸乙酯=3:1过硅胶柱，得到650mg中间体A35(白色固体),产率为26%。
称取4.7g2-氨基-6-氟苯甲酸于100ml圆底烧瓶中，加入5g碳酸钾和40ml乙酸乙酯，加入9g三光气，室温反应24h，慢慢加入100ml饱和碳酸氢钠溶液，超滤得到4.9g中间体A36（棕色固体），产率为86%。
称取上面得到的中间体A36于100ml圆底烧瓶中，加入6ml2-氨基异丁醇和820mg氯化锌，然后加入25ml氯苯作为溶剂，140℃回流反应18小时，冷却至室温，减压旋干氯苯，所得剩余物用二氯甲烷溶解，水洗两次得到有机相，减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=10:1（体积比）过硅胶柱，得到3.8g中间体A37（中间体A37为黄色固体），产率为70%。
称取600mg中间体A37和650mg中间体A35于25ml圆底烧瓶中，加入116mg一水合对甲苯磺酸，以及10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=2:1过硅胶柱得到230mg化合物26（白色固体），产率为28%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):2.83(s，3H),3.09–3.25(m，2H)，3.72(s，3H),4.81(m,1H),6.70(d,J=8.36Hz,1H)，6.78(dd,J=10.00Hz,J=8.481Hz1H),6.95(d,J=8.00Hz,2H),7.09(d,J=8.04Hz,2H),7.44(m,1H),7.64(m,1H),7.72(m,2H),8.18(s,1H),12.16(s,1H)。
LC-MS:calcd for C27H22F4N3O5[M+H]+:544.14,found544.35。
实施例29、化合物29的制备
反应方程式如下：
取130mg化合物28于10ml圆底烧瓶中，加入70mg KOH和2ml甲醇，室温反应12h，用2N盐酸调节pH至约4，用10ml乙酸乙酯萃取3次，得到有机相，用乙酸乙酯：甲醇：乙酸=9:1:0.5逐渐增大到乙酸乙酯：甲醇：乙酸=30:70:2过硅胶柱依次得到32mg化合物29（白色固体）,产率为26%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,MeOD,ppm):2.00(s，3H),3.04(m，1H)，3.31(m，1H),4.58(m,1H),6.98(dd,J=8.00Hz,J=12.001Hz1H),7.05–7.11(m,3H),7.31–7.37(m,3H),7.57(m,1H),7.98(dd,J=1.76Hz,J=8.521Hz,1H),8.29(d,J=1.201Hz,1H),7.72(m,2H),8.18(s,1H),12.16(s,1H)。
LC-MS:calcd for C26H20F4N3O5[M+H]+:530.13,found530.32。
实施例30、化合物30的制备
称取89mg化合物5于10目录圆底烧瓶中，加入90mg叔丁醇钾和60uL碘甲烷，加入2ml DMF在60℃反应5h后，加入50ml食盐水，用10ml乙酸乙酯萃取3次，有机相用乙酸乙酯：石油醚=2:1，过硅胶柱，得到90mg化合物30（无色液体），产率为98%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):1.53(s,6H),3.47(s,2H),3.48(s,2H),3.91(s,1H),5.71(s,1H),7.07(s,1H),7.11(d,J=8.52Hz,1H),7.23–7.26(m,2H),7.42(t,J=7.84Hz,1H)，7.73(t,J=7.84Hz,1H),7.71(d,J=8.36Hz,1H),8.02(d,J=8.36Hz,1H),8.10（d,J=8.48Hz,2H）,8.56(dd,J=8.48Hz,J=1.40Hz,1H),8.82(d,J=1.16Hz,1H)。
LC-MS:calcd for C27H28N3O4[M+H]+:458.20,found458.36。
实施例31、化合物31的制备
反应方程式如下：
取39mg化合物30于10ml圆底烧瓶中，加入25uL一水合肼和2ml甲醇，80℃回流12h，旋干溶剂，剩余物用二氯甲烷：甲醇=10:1过硅胶柱得到25mg化合物31（棕色固体），产率为65%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):1.52(s,6H),3.47(s,2H),3.48(s,2H),4.08(b,2H),5.74(s,1H),7.05(s,1H),7.09(d,J=8.52Hz,1H),7.21–7.26(m,2H),7.42(t,J=7.68Hz,1H)，7.63(t,J=7.52Hz,1H),7.71(d,J=8.32Hz,1H),7.82(d,J=8.40Hz,2H),8.04（d,J=8.32Hz,1H）,8.54(d,J=8.48Hz,1H),8.79(s,1H)。
LC-MS:calcd for C26H28N5O3[M+H]+:458.21,found458.32。
实施例32、化合物32和33的制备
称取6.7g氯化铝于100ml圆底烧瓶中，加入20ml甲苯，在冰浴条件下慢慢滴加丁酰氯5.2ml,然后在室温条件下反应12h，旋干溶剂，加入100ml2N盐酸，用30ml二氯甲烷萃取2次，用石油醚：乙酸乙酯=30:1过硅胶柱得到7.4g中间体A38（无色液体）。
称取2.43g中间体A38、3g NBS于100ml圆底烧瓶，加入20ml无水乙腈，加入246mg AIBN，90℃反应7h，减压旋干溶剂，加40ml二氯甲烷，水洗、饱和食盐水洗，用石油醚：乙酸乙酯=30:1过硅胶柱得到3.5g中间体A39（无色液体），产率为87%。
取上面得到的中间体A39于100ml圆底烧瓶中，加入63mg醋酸钯、147mg三苯基膦、6g磷酸钾和3.2g对三氟甲氧基苯硼酸，加入30ml甲苯，氩气保护下，80℃反应12h，旋干溶剂，加入100ml水，用20ml二氯甲烷萃取两次，用石油醚：乙酸乙酯=30:1过硅胶柱，得到2.8g中间体A40(无色液体)，产率为64%。
称取1.7g2-氨基-4-氯苯甲酸于50ml圆底烧瓶中，加入1.4g碳酸钾和20ml乙酸乙酯，加入1.5g三光气，室温反应24h，慢慢加入100ml饱和碳酸氢钠溶液，超滤得到1.7g中间体A41（白色固体），产率为87%。
称取上面得到的中间体A41于50ml圆底烧瓶中，加入3ml2-氨基异丁醇和300mg氯化锌，然后加入10ml氯苯作为溶剂，140℃回流反应18小时，冷却至室温，减压旋干氯苯，所得剩余物用二氯甲烷溶解，水洗两次得到有机相，减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=10:1（体积比）过硅胶柱，得到560mg中间体A42（中间体A42为黄色固体），产率为28%。
称取322mg中间体A40和224mg中间体A42于25ml圆底烧瓶中，加入114mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱分别得到76mg化合物32（白色固体）和43mg化合物33（白色固体），总产率为26%。
化合物32的表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):0.94(t,J=7.24Hz,3H),2.30(q,J=7.28Hz,2H),4.08(s,2H),7.29–7.32(m,3H),7.42–7.45(m,4H),7.57(d,J=1.76Hz,1H)，8.10(d,J=8.68Hz,1H),11.57(s,1H)。
LC-MS:calcd for C25H20ClF3NO2[M+H]+:458.11,found458.28。
化合物33的表征数据如下：
H-NMR(400MHz,MeOD,ppm):1.06(t,J=7.40Hz,3H),2.58(q,J=7.48Hz,2H),4.09(s,2H),7.19(d,J=8.12Hz,2H),7.33–7.40(m,7H),7.76(d,J=2.04Hz,1H)，8.12(d,J=9.00Hz,1H)。
LC-MS:calcd for C25H21ClF3N2O[M+H]+:457.12,found457.27。
实施例33、化合物34和35的制备
取644mg中间体A40和416mg中间体A37于25ml圆底烧瓶中，加入228mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱分别得到145mg化合物34（白色固体）和56mg化合物35（白色固体），总产率为28%。
化合物34的表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):0.93(t,J=7.20Hz,3H),2.27(q,J=7.28Hz,2H),4.07(s,2H),6.91(dd,J=8.08Hz,J=11.84Hz,1H),7.30(d,J=8.08Hz,1H),7.36(d,J=8.20Hz,1H)，7.37(m,6H),7.50(m,1H),11.54(s,1H)。
LC-MS:calcd for C25H20F4NO2[M+H]+:442.14,found442.19。
化合物35的表征数据如下：
H-NMR(400MHz,MeOD,ppm):1.05(t,J=7.40Hz,3H),2.54(q,J=7.40Hz,2H),4.05(s,2H),7.03(dd,J=7.68Hz,J=14.08Hz,1H),7.17(d,J=8.12Hz,1H),7.28–7.32(m,6H)，7.46(m,1H),7.57(d,J=8.44Hz,1H)。
LC-MS:calcd for C25H21F4N2O[M+H]+:441.15,found441.25。
实施例34、化合物36和37的制备
称取6.7g氯化铝于100ml圆底烧瓶中，加入20ml甲苯，在冰浴条件下慢慢滴加丙酰氯4.4ml,然后在室温条件下反应12h，旋干溶剂，加入100ml2N盐酸，用30ml二氯甲烷萃取2次，用石油醚：乙酸乙酯=30:1过硅胶柱得到6.9g中间体A43（无色液体）。
称取2.22g中间体A43、3g NBS于100ml圆底烧瓶，加入20ml无水乙腈，加入246mg AIBN，90℃反应7h，减压旋干溶剂，加40ml二氯甲烷，水洗、饱和食盐水洗，用石油醚：乙酸乙酯=30:1过硅胶柱得到3.2g中间体A44（无色液体），产率为87%。
取上面得到的中间体A44于100ml圆底烧瓶中，加入63mg醋酸钯、147mg三苯基膦、6g磷酸钾和3.2g对三氟甲氧基苯硼酸，加入30ml甲苯，氩气保护下，80℃反应12h，旋干溶剂，加入100ml水，用20ml二氯甲烷萃取两次，用石油醚：乙酸乙酯=30:1过硅胶柱，得到3g中间体A45（无色液体)，产率为69%。
取554mg中间体A45和370mg中间体A37于25ml圆底烧瓶中，加入120mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱分别得到200mg化合物36（白色固体）和24mg化合物37（白色固体），总产率为30%。
化合物36的表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):1.82(s,3H),4.07(s,2H),6.92(dd,J=8.00Hz,J=11.84Hz,1H),7.30(d,J=8.12Hz,1H),7.36–7.55(m,8H),11.55(s,1H)。
LC-MS:calcd for C24H18F4NO2[M+H]+:428.12,found428.28。
化合物37的表征数据如下：
H-NMR(400MHz,MeOD,ppm):2.08(s,3H),4.06(s,2H),7.05(dd,J=7.68Hz,J=14.12Hz,1H),7.17(d,J=8.24Hz,1H),7.30–7.32(m,4H)，7.46(m,1H),7.37(d,J=8.00Hz,2H),7.46(m,1H),7.59(d,J=8.54Hz,1H)。
LC-MS:calcd for C24H20F4N2O[M+H]+:427.14,found427.27。
实施例35、化合物38和39的制备
取644mg中间体A40和380mg中间体A5于25ml圆底烧瓶中，加入120mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱分别得到100mg化合物38（白色固体）和36mg化合物39（白色固体），总产率为16%。
化合物38的表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):0.95(t,J=7.04Hz,3H),2.33(q,J=7.84Hz,2H),4.07(s,2H),7.26–7.44(m,9H),7.57(d,J=5.40Hz,2H),8.13(d,J=7.72Hz,1H),11.50(s,1H)。
LC-MS:calcd for C25H21F3NO2[M+H]+:424.14,found424.27。
化合物39的表征数据如下：
H-NMR(400MHz,MeOD,ppm):1.06(t,J=7.44Hz,3H),2.58(q,J=7.44Hz,2H),4.04(s,2H),7.17(d,J=8.28Hz,1H),7.27–7.35(m,6H),7.40(t,J=7.40Hz,1H)，7.56(t,J=7.40Hz,1H),7.78(d,J=8.28Hz,1H),8.07(d,J=8.44Hz,1H)。
LC-MS:calcd for C25H22F3N2O[M+H]+:423.16,found423.29。
实施例36、化合物40的制备
取618mg中间体A45和380mg中间体A5于25ml圆底烧瓶中，加入190mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱得到51mg化合物40（白色固体），产率为7%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,MeOD,ppm):2.13(s.3H),4.07(s,2H),7.18(d,J=8.16Hz,2H),7.31–7.34(m,4H),7.42–7.44(m,3H)，7.59(t,J=7.56Hz,1H),7.80(d,J=8.40Hz,1H),8.10(d,J=8.44Hz,1H)。
LC-MS:calcd for C24H20F3N2O[M+H]+:409.14,found409.31。
实施例37、化合物41的制备
称取1.7g2-氨基-6-氯苯甲酸于50ml圆底烧瓶中，加入2g碳酸钾和20ml乙酸乙酯，加入2.8g三光气，室温反应24h，慢慢加入100ml饱和碳酸氢钠溶液，超滤得到2g中间体A46（白色固体），产率为100%。
称取上面得到的中间体A46于50ml圆底烧瓶中，加入2ml2-氨基异丁醇和260mg氯化锌，然后加入10ml氯苯作为溶剂，140℃回流反应18小时，冷却至室温，减压旋干氯苯，所得剩余物用二氯甲烷溶解，水洗两次得到有机相，减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=10:1（体积比）过硅胶柱，得到268mg中间体A47（中间体A47为白色固体），产率为13%。
取370mg中间体A45和268mg中间体A47于25ml圆底烧瓶中，加入120mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱得到158mg化合物41（白色固体），产率为35%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):1.83(s,3H),4.07(s,2H),7.22(d,J=7.36Hz,1H),7.30(d,J=8.08Hz,2H)7.41–7.49(m,7H),7.53(d,J=8.24Hz,1H),11.53(s,1H)。
LC-MS:calcd for C24H18ClF3NO2[M+H]+:444.09,found444.28。
实施例38、化合物42的制备
在氩气保护下，称取2.1g对溴苯丙酮、2.3g对三氟甲硫基苯酚、380mg碘化亚铜、492mg2-吡啶羧酸以及4.3g磷酸三钾于100ml圆底烧瓶中，加入20ml DMSO作为溶剂110℃反应约10小时，冷却至室温，加入100ml水，然后用20ml乙酸乙酯萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=15:1（体积比）过硅胶柱，得到1.8g中间体A48（中间体A48为浅黄色液体），产率为56%
取600mg中间体A48和380mg中间体A5于25ml圆底烧瓶中，加入228mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱得到201mg化合物42（白色固体），产率为24%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):1.93(s,3H),7.19(d,J=8.52Hz,1H),7.29–7.31(m,3H),7.62–7.65(m,4H),7.78(d,J=8.52Hz,2H),8.13(d,J=8.04Hz,1H),11.62(s,1H)。
LC-MS:calcd for C23H16F3NO2S[M+H]+:428.09,found428.17。
实施例39、化合物43的制备
在氩气保护下，称取1g对溴苯乙酮、1.2g对三氟甲硫基苯酚、200mg碘化亚铜、246mg2-吡啶羧酸以及2.2g磷酸三钾于50ml圆底烧瓶中，加入20ml DMSO作为溶剂110℃反应约10小时，冷却至室温，加入100ml水，然后用20ml乙酸乙酯萃取3次，所得有机相减压旋干溶剂，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=15:1（体积比）过硅胶柱，得到1g中间体A49（中间体A49为浅黄色液体），产率为65%
称取288mg氢化钠于50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水四氢呋喃和1ml碳酸二甲酯，然后加入1g中间体A49，75℃回流约8小时后冷却至室温，减压旋干溶剂，剩余物用二氯甲烷溶解，水洗2次，饱和氯化铵溶液洗一次，减压旋干有机相，剩余物用石油醚：乙酸乙酯=10:1过硅胶柱，得到900mg中间体A50(中间体A50为浅黄色液体)，产率为78%。
取900mg中间体A50和433uL苯胺于25ml圆底烧瓶中，加入667uL乙酸和5ml甲醇，回流12小时后冷却至室温，加入50ml水，用10ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用石油醚：乙酸乙酯=10:1过硅胶柱，得到362mg中间体A51(黄色液体)，产率为36%。
取362mg中间体A51于10ml密封管中，加入3ml Dowthernm A作为溶剂，240℃反应30min，冷却至室温，加入石油醚使析出固体。依次用石油醚、二氯甲烷、甲醇重结晶，最后得到184mg化合物43（白色固体），产率为54%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):6.35(s,3H),7.20(d,J=8.36Hz,2H),7.30–7.36(m,3H),7.67(t,J=7.20Hz,1H),7.76–7.78(m,3H),7.92(d,J=7.80Hz,2H),8.10(d,J=7.92Hz,1H),11.74(s,1H)。
LC-MS:calcd for C23H15F3NO2S[M+H]+:414.07,found414.18。
实施例40、化合物44的制备
称取400mg2-溴-4-丙酰基吡啶和427mg对三氟甲硫苯酚于25ml圆底烧瓶中，加入276mg碳酸钾和10ml无水DMF，氩气保护下，130℃反应5h，冷却至室温后，加入100ml水，用20ml二氯甲烷萃取三次，合并有机相，依次用水、饱和食盐水洗，减压旋干有机相，用石油醚：乙酸乙酯=8:1过硅胶柱，得到600mg中间体A52(白色固体),产率为92%。
取600mg中间体A52和380mg中间体A5于25ml圆底烧瓶中，加入228mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱得到200mg化合物44（白色固体），产率为24%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):1.92(s,3H),7.29–7.38(m,4H),7.57-7.62(m,2H),7.80(d,J=8.20Hz,2H),8.13(d,J=8.00Hz,2H),8.40(s,1H),11.70(s,1H)。
LC-MS:calcd for C22H16F3N2O2S[M+H]+:429.09,found429.18。
实施例41、化合物45的制备
称取400mg2-溴-4-丙酰基吡啶和451mg对三氟乙酰基苯酚于25ml圆底烧瓶中，加入276mg碳酸钾和10ml无水DMF，氩气保护下，130℃反应5h，冷却至室温后，加入100ml水，用20ml二氯甲烷萃取三次，合并有机相，依次用水、饱和食盐水洗，减压旋干有机相，用石油醚：乙酸乙酯=6:1过硅胶柱，得到228mg中间体A53(白色固体),产率为34%。
取228mg中间体A53和200mg中间体A5于25ml圆底烧瓶中，加入95mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱得到87mg化合物45（白色固体），产率为30%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):1.93(s,3H),7.22–7.30(m,4H),7.60(m,2H),7.77(d,J=8.72Hz,2H),8.08(dd,J=1.68Hz,J=8.44Hz,1H),8.13(d,J=8.08Hz,1H),8.37(s,1H),11.37(b,1H),11.71(s,1H)。
LC-MS:calcd for C23H17F3N3O3[M+H]+:440.11,found440.21。
实施例42、化合物46的制备
取1.2g中间体A48和832mg中间体A37于25ml圆底烧瓶中，加入380mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱得到350mg化合物45（白色固体），产率为20%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):1.88(s,3H),6.86(dd,J=7.84Hz,J=11.88Hz,1H),7.17(d,J=8.32Hz,2H),7.24(d,J=8.24Hz,2H),7.39(d,J=8.32Hz,2H),7.46(m,1H),7.59(d,J=8.20Hz,2H),7,77(d,J=8.28Hz,2H)。
LC-MS:calcd for C23H16F4NO2S[M+H]+:446.08,found446.21。
实施例43、化合物47的制备
取660mg中间体A52和416mg中间体A37于25ml圆底烧瓶中，加入200mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱得到135mg化合物46（白色固体），产率为15%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):1.88(s,3H),6.88(dd,J=8.08Hz,J=12.00Hz,1H),7.23(d,J=8.44Hz,1H),7.32–7.47(m,4H),7.78(d,J=8.32Hz,2H),8.06(d,J=8.40Hz,1H),8.33(s,1H)。
LC-MS:calcd for C22H15F4N2O2S[M+H]+:447.07,found447.18。
实施例44、化合物48的制备
称取2.8g2-溴-4-醛基吡啶和2.5g尼泊金甲酯与50ml圆底烧瓶中，加入2.3g碳酸钾和15ml无水DMF，氩气保护下，130℃反应5h，冷却至室温后，加入100ml水，用20ml二氯甲烷萃取三次，合并有机相，依次用水、饱和食盐水洗，减压旋干有机相，用石油醚：乙酸乙酯=7:3过硅胶柱，得到3g中间体A16(白色固体),产率为78%
在氩气保护下，称取1g锌粉与于50ml圆底烧瓶中，加入10ml无水THF,加入一滴三甲基氯硅烷，慢慢滴加1.4ml溴代乙酸甲酯，直到变为澄清黄色溶液。将3g中间体A16溶于无水THF，在氩气保护下慢慢加入上述溶液中，60℃反应10h，减压旋干溶剂，加入100ml饱和氯化铵溶液，用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，减压旋干，用石油醚：乙酸乙酯=2:1过硅胶柱，得到1.4g中间体A17(淡黄色液体)，产率为37%。
取1.4g中间体A17于50ml圆底烧瓶中，加入20ml二氯甲烷作为溶剂，在搅拌、室温条件下，分批加入2.2g戴斯马丁氧化剂（DMP），继续反应2h，将反应液倾倒入含有3g亚硫酸钠和3g碳酸氢钠的水溶液，加入30ml二氯甲烷，充分搅拌后，用分液漏斗分离出有机相，减压旋干溶剂，用石油醚：乙酸乙酯=5:1过硅胶柱，得到1.2g中间体A18(黄色液体)，产率为86%。
取500mg中间体A18和1ml苯胺于25ml圆底烧瓶中，加入1.2ml乙酸和5ml甲醇，回流12小时后冷却至室温，加入50ml水，用10ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用石油醚：乙酸乙酯=10:1过硅胶柱，得到252mg中间体A19(黄色液体)，产率为41%。
取252mg中间体A19于10ml密封管中，加入3ml Dowthernm A作为溶剂，240℃反应30min，冷却至室温，加入石油醚使析出固体。依次用石油醚、二氯甲烷、甲醇重结晶，最后得到86mg化合物16（白色固体），产率为38%。
表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):3.82（s，3H）,6.47(s,1H),7.15-7.20(m,2H),7.25(d,J=8.52Hz,2H)，7.49(t,J=7.04Hz,1H)，7.67(d,J=8.32Hz,1H),7.98(d,J=8.56Hz，2H),8.00（d,J=8.00Hz,1H），8.40（dd,J=8.52Hz,J=2.24Hz，1H），8.67(d,J=1.92Hz,1H)。
LC-MS:calcd for C22H17N2O3[M+H]+:373.11,found373.19。
实施例45、化合物49的制备
取中间体A44于100ml圆底烧瓶中，加入198mg Pd(dppf)2.DCM、2g磷酸钾和1.2g对三氟甲硫基基苯硼酸频哪醇酯，加入10ml甲苯，氩气保护下，100℃反应12h，旋干溶剂，加入100ml水，用20ml二氯甲烷萃取两次，用石油醚：乙酸乙酯=30:1过硅胶柱，得到1g中间体A54（无色液体)，产率为64%。
取1g中间体A54和650mg中间体A37于25ml圆底烧瓶中，加入240mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱得到320mg化合物49（白色固体），总产率为24%。
化合物49的表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):1.82(s,3H),4.11(s,2H),6.93(m，1H),7.37–7.46(m,8H),7.65–7.67(m,2H),11.55(s,1H)。
LC-MS:calcd for C24H18F4NOS[M+H]+:444.10,found444.18。
实施例46、化合物50的制备
取中间体A39于100ml圆底烧瓶中，加入170mg Pd(dppf)2.DCM、1.8g磷酸钾和1.5g对三氟甲硫基基苯硼酸频哪醇酯，加入10ml甲苯，氩气保护下，100℃反应12h，旋干溶剂，加入100ml水，用20ml二氯甲烷萃取两次，用石油醚：乙酸乙酯=30:1过硅胶柱，得到560mg中间体A55（无色液体)，产率为40%。
取560mg中间体A55和345mg中间体A37于25ml圆底烧瓶中，加入132mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚=1:1过硅胶柱得到200mg化合物50（白色固体），总产率为24%。
化合物50的表征数据如下：
H-NMR(400MHz,d6-DMSO,ppm):0.93(t,J=6.96Hz,3H),2.26(q,J=7.12Hz,2H),4.14(s，1H),6.91(dd,J=8.12Hz,J=11.28Hz,1H),7.34(d,J=8.32Hz,1H),7.45–7.54(m,7H),7.67(d,J=7.68Hz,2H),11.52(s,1H)。
LC-MS:calcd for C25H20F4NOS[M+H]+:458.11,found458.21。
实施例47、化合物的对NDH-2蛋白活性的抑制作用
一、实验原理
NDH-2（二型NADH脱氢酶）催化的化学反应为：NADH+UQ→NAD++UQH2；其中NADH在340nm有光吸收，因此可以通过340nm处光吸收值的减少评价NADH的减少速率。
二、实验材料的制备
（一）NDH-2蛋白的制备
在大肠杆菌中表达恶性疟原虫3D7株的NDH-2蛋白（NDH-2蛋白由533个氨基酸残基组成，如序列表的序列1所示，自N末端第1至24位氨基酸残基为信号肽，用于将蛋白定位到疟原虫线粒体内膜上；NDH-2基因由1602个核苷酸组成，如序列表的序列2所示），具体步骤如下：
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤1的双链DNA分子为模板，用NDH-2上游引物和NDH-2下游引物组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
NDH-2上游引物：5’-ACCGAGGATCCAATGTAGCAAAAAATAATTTA-3’，
NDH-2下游引物：5’-cgtagctcgagTCATTTGATGAAAGGACGCCCATA-3’。
3、用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切PQE80L载体（购自QIAGEN公司），回收载体骨架（约4700bp）。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在PQE80L载体的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2第73至1602位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒中，外源插入序列与载体骨架上的His标签编码序列融合，表达融合蛋白。
6、将步骤5得到的重组菌转化大肠杆菌BL21菌株（购自New England Biolabs，商品目录号为C2530H），得到重组菌。
7、挑取步骤6得到的重组菌并接种至50ml LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养7-8小时，然后取10mL菌液接种至1L LB液体培养基，37℃培养至OD600nm=1.0，向培养体系中加入IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，一种诱导剂，使其在培养体系中的初始浓度为0.5mM），23℃、80rpm振荡培养12小时，离心收集菌体。
8、将步骤7收集的菌体在含1mM EDTA的50mM Tris缓冲液（pH8.0）中超声破碎（功率500W，频率20-25KHz，超声3秒停9秒，共60个循环），11000rpm离心15min，收集上清液。
9、将步骤8得到的上清液35000rpm离心1小时，收集沉淀。
10、将步骤9收集的沉淀重悬于缓冲液A（含有200mM NaCl、0.1mM EDTA和体积百分含量为10%甘油的pH7.6、50mM Tris缓冲液）并匀浆破碎1分钟，功率20W，频率20kHz，然后加入Triton X-100使其浓度为0.3g/100ml，4℃孵育2小时，然后35000rpm离心1小时，收集上清液。
11、将步骤10得到的上清液上样于镍金属螯合树脂(Ni-NTA，Qiagen)，用15ml含0.1g/100ml Triton X-100和8mM组氨酸的缓冲液A清洗柱子以去除杂蛋白，然后用12ml含0.02g/100ml TritonX-100和200mM组氨酸的缓冲液A清洗柱子并收集过柱后洗脱液。
12、将步骤11收集的过柱后洗脱液上样于分子筛(Superdex-20010/30,GEHealthcare)，用缓冲液B（含300mM NaCl、5mM DTT、0.1mM EDTA和0.02g/100mlTriton X-100的pH7.5、25mM Tris-HCl缓冲液）进行洗脱，流速为0.5ml/分钟，收集保留体积为12-15毫升之间的过柱后洗脱液（峰值位于13.5毫升处），即为目的蛋白溶液（又称NDH-2蛋白液）。
（二）其它实验材料
NADH（水溶）：购自Sigma，产品目录号为N8129。
coenzyme Q1（DMSO溶）：购自Sigma，产品目录号为C7956。
三、化合物对NDH-2蛋白活性的抑制作用
1、coenzyme Q1和NADH的Km和Kcat值
反应体系（1.6ml）：溶剂为50mM MOPS-NaOH缓冲液（pH6.5），溶质及其浓度为：150mM NaCl、1mM EDTA、0.01g/100ml Triton X-100、1nM NDH-2蛋白（以NDH-2蛋白液的形式加入）、NADH和coenzyme Q1。
反应温度为25℃。反应体系制备过程中，最后加入NDH-2蛋白液，从加入NDH-2蛋白液开始计反应时间，共记录1分钟。采用Lambda45分光光度计(PerkinElmer LifeSciences；内含磁力搅拌器)检测340nm处的光吸收值。NADH在340nm的吸光系数为6220cm-1M-1。
测定coenzyme Q1的Km和Kcat值时，NADH在反应体系中的浓度为200μM，coenzyme Q1采用不同浓度。结果见图1，纵坐标代表的是平均每秒多少μM的NADH被降解掉（因为NADH在340nM的消光系数为6220cm-1M-1，因此由吸光值到μMNADH/s的换算方法为：将吸光值乘以1000并除以6.22）。Km(UQ1)=21.8uM，Kcat(UQ1)=418s-1。
测NADH的Km和Kcat值时，coenzyme Q1在反应体系中的浓度为100μM，NADH采用不同浓度。结果见图2，纵坐标代表的是平均每秒多少μM的NADH被降解掉。Km（NADH）=47uM，Kcat（NADH）=482s-1。
2、检测不同化合物对NDH-2蛋白活性的抑制作用
反应体系（1.6ml）：溶剂为50mM MOPS-NaOH缓冲液（pH6.5），溶质及其浓度为：150mM NaCl、1mM EDTA、0.01g/100ml Triton X-100、1nM NDH-2蛋白、50μMNADH、30μM coenzyme Q1和1μM待测化合物。待测化合物为实施例1-实施例46制备的化合物；设置不加入待测化合物的对照处理。
反应温度为25℃。反应体系制备过程中，最后加入NDH-2蛋白液，从加入NDH-2蛋白液开始计反应时间，共记录2分钟。采用Lambda45分光光度计(PerkinElmer LifeSciences；内含磁力搅拌器)检测340nm处的光吸收值。NADH在340nm的吸光系数为6220cm-1M-1。
结果见图3（计算从反应起始至反应结束的时间阶段，平均每秒催化多少μM的NADH被降解掉，即为蛋白活性；将对照处理的蛋白活性作为1.0，其它处理与对照处理的蛋白活性比值即为其相对活性）。化合物1、化合物3、化合物8、化合物14、化合物18、化合物19、化合物20、化合物22、化合物23、化合物28、化合物29、化合物31、化合物32、化合物36、化合物37、化合物38、化合物39、化合物40、化合物41、化合物42、化合物43、化合物44、化合物46、化合物47、化合物48和化合物49对NDH-2蛋白活性的抑制作用较强。
3、不同化合物对NDH-2蛋白活性的抑制作用的动力学分析
反应体系（1.6ml）：溶剂为50mM MOPS-NaOH缓冲液（pH6.5），溶质及其浓度为：150mM NaCl、1mM EDTA、0.01g/100ml Triton X-100、1nM NDH-2蛋白、50μMNADH、30μM coenzyme Q1和待测化合物。待测化合物的浓度可变。待测化合物为化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物15、化合物16、化合物17、化合物36、化合物44和化合物48；设置不加入待测化合物的对照处理。
反应温度为25℃。反应体系制备过程中，最后加入NDH-2蛋白液，从加入NDH-2蛋白液开始计反应时间，采用Lambda45分光光度计(PerkinElmer Life Sciences；内含磁力搅拌器)检测340nm处的光吸收值。NADH在340nm的吸光系数为6220cm-1M-1。
用非竞争性抑制模型：v=v0*(Ki+a*I)/(Ki+I)来进行拟合。其中V和V0分别为加入待测化合物的体系中的反应速度（反应速度V是指在20秒内的反应初速度）和对照处理体系中的反应速度（同样指在20秒内的反应初速度）。Ki为抑制常数，a为参数，I为抑制剂浓度。拟合结果如下：
化合物1的拟合曲线(Ki值为76nM)见图4；化合物2的拟合曲线(Ki值为101.7nM)见图5；化合物3的拟合曲线(Ki值为112nM)见图6；化合物4的拟合曲线(Ki值为871nM)见图7；化合物5的拟合曲线（Ki值为2.86μM）见图8；化合物6的拟合曲线（Ki值为6.34μM）见图9；化合物7的拟合曲线（Ki值为4.06μM）见图10；化合物8的拟合曲线（Ki值为80nM）见图11；化合物9的拟合曲线（Ki值为3.69μM）见图12；化合物10的拟合曲线（Ki值为283.1nM）见图13；化合物11的拟合曲线（Ki值为690.6nM）见图14；化合物12的拟合曲线（Ki值为1.43μM）见图15；化合物13的拟合曲线（Ki值为3.60μM）见图16；化合物14的拟合曲线（Ki值为901.8nM）见图17；化合物15的拟合曲线（Ki值为2.82μM）见图18；化合物16的拟合曲线（Ki值为2.09μM）见图19；化合物17的拟合曲线（Ki值为341.5nM）见图20；化合物36的拟合曲线（Ki值为3.4nM）见图21；化合物44的拟合曲线（Ki值为57.5nM）见图22；化合物48的拟合曲线（Ki值为741.2nM）见图23。
4、不同化合物处理的恶性疟原虫3D7菌株的代谢物分析
P.falciparum3D7菌株（Jinxia Ma et al PLoS One,2013Sep25;8(9)）以1%的感染率与小分子一起加入培养基中培养。培养体系：100uL，用标准的96孔细胞培养板。培养基成分：标准的RPIMI1640(Invitrogen)培养基中加入Albumax II(Invitrogen),25mMHepes(pH7.4),glutamine,NaHCO3,40UM次黄嘌呤和20μM硫酸庆大霉素.首先培养基与人类红细胞的悬浮液维持在2.5%的血压积，加160μL于96孔板的第一排，然后将稀释好的待测化合物（1:200）吸40μL于第一排变成2%的血压积，然后将第二排到第八排加入100μL2%血压积的虫血培养基悬浊液，然后从第一排吸100μL加入第二排进行混匀，再从中吸100μL到第三排以此类推进行小分子浓度稀释，未加感染疟原虫的红细胞作为阴性对照，DMSO作为阳性对照。培养环境：在5%O2、5%CO2和90%N2的培养箱，温度是37℃。加入化合物的初始浓度是1μM，待测化合物为化合物1-化合物50。培养三天后进行离心，吸走上清，加入100μL的红细胞裂解液（含5×SyBr Green I）反应30min，将其转入一个新的96孔黑板中，用BioTek酶标仪进行荧光检测。激发波长480nm，发射波长528nm。
将加入化合物与DMSO的疟原虫读数分别减去每一排的未加入疟原虫的物红细胞的读数，即为每孔疟原虫的数量，以每一排中加入DMSO的疟原虫的数目作为阳性对照即为正常生长的虫子数量，用每一排中加入化合物后虫子数目除以总数目即为加入化合物后虫子生长的相对比例，用1减去这个数值即为每一浓度的化合物对虫子生长抑制的相对比例。根据每个浓度对应的抑制比例，用SPSS软件可以计算化合物对恶性疟原虫3D7菌株的半数致死量，即IC50，每一种化合物对应的IC50统计于表格1和表2中。
表1化合物1-24的对恶性疟原虫3D7菌株的IC50
表2化合物25-50的对恶性疟原虫3D7菌株的IC50
由表1和表2中的数据可以看出，化合物11、化合物20、化合物32、化合物33、化合物34、化合物35、化合物36、化合物37、化合物38、化合物40、化合物41、化合物42、化合物43、化合物44、化合物46、化合物47、化合物49和化合物50对P.falciparum3D7菌株的抑制作用较强。

Claims (10)

1.式Ⅰ所示化合物，
式Ⅰ中，基团X为-O-、-NH-、-S-、-SO-、-SO2-、-CH2-、-CF2-、-CO-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2；
基团R1为-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-OR、-CF3、-COOR、-OCF3或-R，其中R为碳原子数为1～6的烷基；
基团R2为-H、-COOH、-COOR、-CONHNH2、-CONHOH、-CONH2、-CH2OH、-CF3或碳原子数为1～10的烷基；
基团R3为-F、-Cl、-R、-OR、-OH、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3、-COOH、-COOR、-CONH2、-CONHNH2、-CONHOH、-CONHOR，-NHOCR或-NHCOCF3；
基团R4和R5均为-H、碳原子数为1～5的烷基或碳原子数为1～5的烷氧基。
2.式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）式1所示化合物与式2所示化合物经Suzuki反应、Ullmann偶联反应或芳香亲核取代反应得到式3所示酮化合物；
式中，基团R’2为-H、-COOR、-CF3或碳原子数为1～10的烷基，其中R为碳原子数为1-6的烷基；基团R’3为-F、-Cl、-R、-OR、-OAc、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3、COOR或-NHCOCF3；基团X’为-O-、-NH-、-S-、-CH2-、-CF2-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2；
基团M为-CH2Br，-B（OH）2，-Br、-Cl、-OH、-SH或-NH2，基团M’为-Br、-Cl、-OH、-SH、-NH2、-CH2Br或-B（OH）2；
（2）经下述1）或2）或3）的步骤即得式Ⅰ所示化合物：
1）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式4所示化合物经缩合反应即得式Ⅰ所示化合物；
2）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式4所示化合物经缩合反应的产物再进行水解反应、氨解反应、肼解反应或羟胺解反应得到式Ⅰ所示化合物；
3）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式4所示化合物经缩合反应的产物再进行氧化反应得到式Ⅰ所示化合物；
式4中，基团R1为-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-OR、-CF3、-COOR、-OCF3或-R，其中R为碳原子数为1～6的烷基；基团R4和R5均为-H、碳原子数为1～5的烷基或碳原子数为1～5的烷氧基。
3.式Ⅱ所示化合物，
式Ⅱ中，基团X为-O-、-NH-、-S-、-SO-、-SO2-、-CH2-、-CF2-、-CO-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；基团Z为-O-或-NH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2；
基团R1为-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-OR、-CF3、-COOR、-OCF3或-R，其中R为碳原子数为1～6的烷基；
基团R2为-H、-COOH、-COOR、-CONHNH2、-CONHOH、-CONH2、-CH2OH、-CF3或碳原子数为1～10的烷基；
基团R3为-F、-Cl、-R、-OR、-OH、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3、-COOH、-COOR、-CONH2、-CONHNH2、-CONHOH、-CONHOR，-NHOCR或-NHCOCF3。
4.基团Z为-O-时，式Ⅱ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）式1所示化合物与式2所示化合物经Suzuki反应/Ullmann偶联反应或芳香亲核取代反应得到式3所示酮化合物；
式中，基团R’2为-H、-COOR、-CF3或碳原子数为1～10的烷基，其中R为碳原子数为1-6的烷基；基团R’3为-F、-Cl、-R、-OR、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3COOR或-NHCOCF3；基团X’为-O-、-NH-、-S-、-CH2-、-CF2-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2；
基团M为-CH2Br，-B（OH）2，-Br,-Cl,-OH,-SH,-NH2，基团M’为-Br、-Cl、-OH、-SH、-NH2、-CH2Br或-B（OH）2；
（2）在碱存在的条件下，式3所示酮化合物与式5所示酯化合物经加成消除反应得到式6所示二酮化合物；
式中，基团R’1为-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-COOR、-OR、-CF3或-R，其中R为碳原子数为1～6的烷基；基团R’2为-H、-COOR、-CF3或碳原子数为1～10的烷基,其中R为碳原子数为1-6的烷基；基团R’3为-F、-Cl、-R、-OR、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3、-COOR或-NHCOCF3；基团X’为-O-、-NH-、-S-、-CH2-、-CF2-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2；
（3）经下述1）或2）或3）的步骤即得式Ⅱ所示化合物：
1）式6所示二酮化合物经分子内芳香亲核取代反应即得基团Z为-O-时的式Ⅱ所示化合物；
2）式6所示二酮化合物经芳香亲核取代反应后的产物再经水解反应、氨解反应、肼解反应或羟胺解反应得到基团Z为-O-时的式Ⅱ所示化合物。
3）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式4所示化合物经缩合反应的产物再进行氧化反应得到基团Z为-O-时的式Ⅱ所示化合物。
5.基团Z为-NH-且R2为-H时，式Ⅱ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）式1’所示化合物与式2所示化合物经Suzuki反应、Ullmann偶联反应或芳香亲核取代反应得到式3’所示酮化合物；
式中，基团R’3为-F、-Cl、-R、-OR、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3、-COOR或-NHCOCF3；基团X’为-O-、-NH-、-S-、-CH2-、-CF2-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2；
基团M为-CH2Br、-B（OH）2、-Br、-Cl、-OH、-SH或-NH2，基团M’为-Br、-Cl、-OH、-SH、-NH2、-CH2Br或-B（OH）2；
（2）在碱存在的条件下，式3’所示酮化合物与碳酸二甲酯经加成消除反应得到式7所示β-羟基酯类化合物；
式7中，基团R’3、X’和Y的定义同式3’；n表示取代基的个数，n为0、1或2；
（3）式7所示β-羟基酯类化合物与式8所示苯胺化合物经缩合反应得到式9所示烯胺化合物；
式中，基团R1为-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-OR、-CF3、-COOR、-OCF3或-R，其中R为碳原子数为1～6的烷基；基团R’3、X’和Y的定义同式3；n表示取代基的个数，n为0、1或2；
（4）经下述1）或2）或3）的步骤即得式Ⅱ所示化合物：
1）式9所示烯胺化合物经环合反应即得基团Z为-NH-且R2为-H时的式Ⅱ所示化合物；
2）式9所示烯胺化合物经环合反应的产物再经水解反应、氨解反应、肼解反应或羟胺解反应得到基团Z为-NH-且R2为-H时的式Ⅱ所示化合物；
3）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式4所示化合物经缩合反应的产物再进行氧化反应得到基团Z为-NH-且R2为-H时的式Ⅱ所示化合物。
6.基团Z为-NH-且R2不为-H时，式Ⅱ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）式1所示化合物与式2所示化合物经Suzuki反应或Ullmann偶联反应或芳香亲核取代反应得到式3所示酮化合物；
式中，基团R’2为-H、-COOR、-CF3或碳原子数为1～10的烷基，其中R为碳原子数为1-6的烷基；基团R’3为-F、-Cl、-R、-OR、-CF3、-OCF3、-SCF3、-SOCF3、-SO2CF3,COOR或-NHCOCF3；基团X’为-O-、-NH-、-S-、-CH2-、-CF2-或-CHF-；基团Y为=N-或=CH-；n表示取代基的个数，n为0、1或2；
基团M为-CH2Br、-B（OH）2、-Br、-Cl、-OH、-SH或-NH2，基团M’为-Br、-Cl、-OH、-SH、-NH2、-CH2Br或-B（OH）2；
（2）经下述1）或2）或3）的步骤即得式Ⅱ所示化合物：
1）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式10所示靛红酸酐衍生物经缩合反应即得；
2）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式10所示靛红酸酐衍生物经缩合反应的产物再经水解反应、氨解反应、肼解反应或羟胺解反应得到基团Z为-NH-且R2不为-H时的式Ⅱ所示化合物；
3）在碱性或酸性条件下，式3所示酮化合物与式4所示化合物经缩合反应的产物再进行氧化反应得到基团Z为-NH-且R2不为-H时的式Ⅱ所示化合物；
式10中，基团R’1为-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-OR、-CF3或-R，其中R为碳原子数为1～6的烷基。
7.式Ⅰ所示化合物或式Ⅱ所示化合物在下述任一种中的应用：
1）制备预防和/或治疗疟疾的产品的；
2）制备抑制NDH-2蛋白活性的产品；
3）制备抑制恶性疟原虫菌株生长的产品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述3）的应用中，所述产品表现为促进NDH-2蛋白的降解。
9.一种预防和/或治疗疟疾的药物，其活性成分为式Ⅰ所示化合物或式Ⅱ所示化合物。
10.一种恶性疟原虫菌株生长抑制剂，其活性成分为式Ⅰ所示化合物或式Ⅱ所示化合物。
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