CN104758279A - 逆转紫杉醇耐药性的化合物组合物的制备方法与药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于制药技术领域。本发明公开了紫杉醇、冬凌草甲素和冬凌草乙素在制备抗肿瘤药物中的应用和制备方法。紫杉醇是从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)中分离得到。冬凌草甲素和冬凌草乙素是从香茶菜属植物冬凌草(碎米桠Rabdosia rubescens[Hems1.]Hara.)干燥地上部分中分离得到。冬凌草甲素／紫杉醇组合物和冬凌草乙素／紫杉醇组合物具有显著抑制耐紫杉醇肺癌细胞的增殖作用，促进耐紫杉醇肺癌细胞的凋亡，可作为紫杉醇类药物的耐药逆转剂和化疗增敏剂。

Description

逆转紫杉醇耐药性的化合物组合物的制备方法与药物用途

一、技术领域

本发明属于制药技术领域，涉及二萜类化合物紫杉醇、冬凌草甲素和冬凌草乙素的制备方法，并涉及冬凌草甲素／紫杉醇组合物(冬凌草甲素组合物)以及冬凌草乙素／紫杉醇组合物(冬凌草乙素组合物)具有逆转紫杉醇耐药性和增加紫杉醇化疗敏感性的作用，可用于紫杉醇耐药的肺癌等癌症的治疗。

二、背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类生命及生活质量，其发病率呈逐年上升的趋势。肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，己成为目前人类因肿瘤死亡的主要原因，随着环境污染的日益严重，其发病率在相当长的时间内将呈显著的上升趋势。我国是肺癌的高发国家，在致人死亡的恶性肿瘤中，肺癌位居首位。

化疗在肿瘤的治疗中发挥着重要作用。紫杉醇(Taxol)是Wani等于1971年从美国西部短叶红豆杉中分离提取出来的一种天然抗肿瘤药物，其主要通过与肿瘤细胞内微管蛋白结合，破坏细胞有丝分裂期微管的正常功能，诱导细胞阻滞于G₂／M期，从而杀伤肿瘤细胞。紫杉醇疗效确切，抗瘤谱广，目前己成为临床上治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、前列腺癌和胃癌的一线用药。然而，耐药问题的出现是临床治疗失败的主要原因，成为制约紫杉醇发展的一大瓶颈。

紫杉醇耐药现象的产生机制为：P-gp过度表达或功能亢进；促调亡因子基因及蛋白表达减低，或抗凋亡因子基因及蛋白表达升高，使肿瘤多药耐药细胞抵抗和逃逸抗肿瘤药物诱导的凋亡；微管蛋白亚型表达的改变或其与药物结合位点的基因突变，导致微管聚合临界浓度的提高或微管与药物结合受阻；细胞周期改变及肿瘤微环境改变等等。所以，利用体外耐药细胞系，寻找具有逆转肿瘤多药耐药作用的化合物，显得尤其重要。中医药作为肿瘤综合治疗的重要组成部分，以其安全、有效、副作用小等特点在预防和阻断肿瘤的发生发展中，有重要的疗效和独特的优势。

冬凌草(碎米桠Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara.)是一种唇形科香茶菜属植物，产于我国湖北、四川、贵州、广西、陕西、甘肃、山西、河南、河北、浙江、安徽等地。冬凌草抗肿瘤作用良好，毒性不明显，被誉为“紫杉醇第二”，并被《中华人民共和国药典》1977年版收载。冬凌草甲素(Oridonin，ORI)和冬凌草乙素(Ponicidin，PON)是冬凌草中贝壳杉烯类的二萜成分，是冬凌草中最重要的抗癌成分。己有文献报道，ORI和PON可显著抑制多种肿瘤细胞生长，如抑制前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、白血病细胞、多形性恶性胶质瘤细胞的增殖。冬凌草甲素体外抗肿瘤的机制与阻遏细胞周期、下调端粒酶活性、诱导肿瘤细胞凋亡等有关。

细胞凋亡是由基因控制的、高度有序的细胞主动死亡过程，对维持机体内环境的稳定和生长发育有着极其重要的作用。研究证明，肿瘤的发生与细胞凋亡机制的紊乱密切相关，如果受损细胞的凋亡机制不能正常启动，机体内细胞增殖与凋亡的平衡将被破坏，导致细胞过度增殖，就有可能引起肿瘤的产生。

由于冬凌草甲素和冬凌草乙素具有显著的抗肿瘤作用，而紫杉醇在临床使用中具有耐药现象。为此，探讨冬凌草甲素组合物(紫杉醇：冬凌草甲素=2∶1)和冬凌草乙素组合物(紫杉醇∶冬凌草乙素=2∶1)对肺癌细胞紫杉醇耐药性的拮抗作用，这目前尚未见报道。

三、发明内容

本发明包括了两部分内容，第一部分：紫杉醇、冬凌草甲素和冬凌草乙素的制备方法；第二部分：冬凌草甲素组合物以及冬凌草乙素组合物具有逆转紫杉醇耐药性和增加紫杉醇化疗敏感性的作用，可用于紫杉醇耐药的肺癌等癌症的治疗。

1、紫杉醇的制备方法

将新鲜的南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei，人工栽培，三至五年生)粉碎成粗粉，用80％乙醇提取3次，合并提取液，过滤后减压回收乙醇后，所得浸膏用氯仿萃取3次，合并萃取液，减压回收有机溶剂，及减压干燥得浸膏。上述浸膏用石油醚进行固液萃取，余下的固形物溶适量氯仿中，经氧化铝柱层析去杂后，再用C_-18硅胶柱层析，用乙腈／水溶剂系统进行梯度洗脱，含紫杉醇的洗脱液经减压浓缩至干得紫杉醇粗品；再分别用适量甲醇／水混合溶剂进行两次重结晶，经真空干燥得紫杉醇。

其结构如下图所示：

2、冬凌草甲素和乙素的制备方法

将香茶菜属植物冬凌草(碎米桠Rabdosia Rubescens(Hemsl.)Hara)干燥地上部分，用80％乙醇回流提取3次，减压浓缩提取液至含醇量约60％，静置过夜，过滤。滤液减压浓缩至无醇，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液。乙酸乙酯萃取液经减压浓缩为浸膏。该浸膏通过多次硅胶柱层析(氯仿-丙酮、氯仿-甲醇梯度洗脱)和重结晶，得到冬凌草乙素和冬凌草甲素。

其结构如下图所示：

本发明所述冬凌草甲素组合物和冬凌草乙素组合物可与常规辅助剂制备成冻干纳米乳注射剂、脂质体等多种剂型，具有逆转紫杉醇耐药性和增加紫杉醇化疗敏感性的作用，可用于紫杉醇耐药的肺癌等癌症的治疗。

4、冬凌草甲素组合物和冬凌草乙素组合物逆转紫杉醇耐药性的研究

4.1凌草甲素组合物和冬凌草乙素组合物对耐紫杉醇的人肺腺癌A549细胞(A549／T)增殖的抑制作用(MTT法)

取对数生长期A549／T细胞消化成单细胞悬液接种于96孔细胞培养板(4×10³cell／孔)内，37℃、5％CO₂，用10％胎牛血清的1640培养基预培养24h后，更换培养液，分为23组。模型对照组为A549／T细胞的自然培养，药物组为A549／T细胞与紫杉醇(4、6、8、10、12、24μmol／L)或冬凌草甲素(4、6、8、12μmol／L)或冬凌草乙素(4、6、8、12μmol／L)或冬凌草甲素组合物(紫杉醇∶冬凌草甲素=2∶1)(2.25、4.5、9、18μmol／L)或冬凌草乙素组合物(紫杉醇∶冬凌草乙素=2∶1)(2.25、4.5、9、18μmol／L)共培养。孵育48h后，加入含0.5％MTT的培养基20μL，再培养4h后，弃培养液，加入150μLDMSO，振荡10min，待结晶完全溶解后，用酶联免疫仪于490nm波长处测定吸光值(OD₄₉₀值)，并计算紫杉醇、冬凌草甲素、冬凌草乙素抑制A549／T生长的IC₅₀。实验重复3次，每次3个复孔。每个联用组可求得2个IC₅₀值，一个是紫杉醇的，另一个是冬凌草甲素或冬凌草乙素的，抑制浓度的分数之和即联用指数(combination index，CI)值。按以下公式计算：CI=C_a，x／ICx，a+C_b，x／ICx，b，其中Ca，x和C_b，x是指a、b两种药物联用达到x％有效时的药物浓度，ICx，a和ICx，_b是指单用一种药物达到x％有效时的药物浓度。如果CI<1，说明两药联用具有协同效应；CI>1，说明具有拮抗效应；CI=1，则认为是相加效应。

结果如表1所示：紫杉醇、冬凌草甲素、冬凌草乙素、抑制A549／T生长的IC₅₀分别为10.2、6.5、5.1μmol／L。冬凌草甲素组合物(紫杉醇：冬凌草甲素=2∶1)抑制A549／T生长的IC₅₀为7.71μmol／L(紫杉醇5.14μmol／L+冬凌草甲素2.57μmol／L)，其联用指数为0.90，故紫杉醇与冬凌草甲素化合物的合用为协同效应。冬凌草乙素组合物(紫杉醇∶冬凌草乙素=2∶1)抑制A549／T生长的IC₅₀为5.5μmol／L(紫杉醇3.67μmol／L+C1.83μmol／L)，其联用指数为0.72，故紫杉醇与冬凌草乙素的合用为协同效应。

表1冬凌草甲素组合物和冬凌草乙素组合物对A549／T细胞生长的抑制作用

4.2冬凌草甲素组合物和冬凌草乙素组合物对A549／T细胞凋亡的影响

取对数生长期A549／T细胞消化成单细胞悬液接种于6孔细胞培养板(1×10⁵cell／孔)内，37℃、5％CO₂，用10％FBS-1640培养基预培养24h后，更换培养液，分为6组。模型对照组为A549／T细胞的自然培养，药物组为A549／T细胞与紫杉醇12μmol／L、冬凌草甲素6μrnol／L、冬凌草乙素6μmol／L、紫杉醇+冬凌草甲素(6+3)μmol／L、紫杉醇+冬凌草乙素(6+3)μmol／L共培养。培养48h后，弃去培养上清，每组细胞按Annexin V-FITC／PI染色试剂盒说明书进行染色处理，最后通过流式细胞仪(型号：BD FACS Calibur)检测各组细胞凋亡率。实验重复3次。

结果如图1所示，与模型组对照组(Contro1)相比，紫杉醇(Taxol)12μmol／L、冬凌草甲素(ORI)6μmol／L、冬凌草乙素(PON)6μmol／L、冬凌草甲素组合物(Taxol6μmol／L+ORI3μmol／L)、冬凌草乙素组合物(Taxol6μmol／L+PON3μmol／L)组的细胞凋亡率均极显著升高(P<0.01)；冬凌草甲素组合物(Taxol6μmol／L+ORI3μmol／L)组与紫杉醇12μmol／L组相比，其细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)；冬凌草甲素组合物(Taxol6μmol／L+ORI3μmol／L)组与冬凌草甲素3μmol／L组相比，其细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)；冬凌草乙素组合物(Taxol6μmol／L+PON3μmol／L)组与紫杉醇12μmol／L组相比，其细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)；冬凌草乙素组合物(Taxol6μmol／L+PON3μmol／L)组与冬凌草乙素3μmol／L组相比，其细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)。可见，紫杉醇与冬凌草甲素合用或紫杉醇与冬凌草乙素合用均可以逆转紫杉醇的肺腺癌细胞耐药性，紫杉醇与冬凌草甲素合用具有协、同效应，紫杉醇与冬凌草乙素合用具有协同效应。

本发明所述，冬凌草甲素组合物和冬凌草乙素组合物具有显著抑制耐紫杉醇肺癌细胞的增殖作用，促进耐紫杉醇肺癌细胞的凋亡，可作为紫杉类药物的耐药逆转剂和化疗增敏剂。

四、附图说明

图1凌草甲素组合物和冬凌草乙素组合物对A549／T细胞凋亡的影响

取对数生长期A549／T细胞消化成单细胞悬液接种于6孔细胞培养板(1×10⁵cell／孔)内，37℃、5％CO₂，用10％FBS-1640培养基预培养24h后，更换培养液，分为6组。模型对照组为A549／T细胞的自然培养，药物组为A549／T细胞与紫杉醇12μmol／L、ORI6μmol／L、PON6μmol／L、冬凌草甲素组合物(Taxol6μmol／L+ORI3μmol／L)、冬凌草乙素组合物(Taxol6μmol／L+PON3μmol／L)共培养。培养48h后，弃去培养上清，每组细胞按Annexin V-FITC／PI染色试剂盒说明书进行染色处理，最后通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果以表示。^**P<0.01vsControl；^##P<0.01vs冬凌草甲素组合物(Taxol6μmol／L+ORI3μmol／L)组；^§§P<0.01vs冬凌草乙素组合物(Taxol6imol／L+PON3μmol／L)组(Student's-t test).

五、具体实施方式

下面结合实例对本发明进行详细描述。但是，本发明不局限于所给出的这些实例。

实施例1：紫杉醇的制备

将新鲜的人工栽培南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei，三至五年生)粉碎成粗粉，用80％乙醇提取3次，合并提取液，过滤后减压回收乙醇(回收的乙醇供套用)后，所得浸膏用氯仿萃取3次，合并萃取液，减压回收有机溶剂，及减压干燥得浸膏。

上述浸膏用6倍量石油醚进行固液萃取三次，余下的固形物溶适量氯仿中，上氧化铝层析柱，用氯仿洗脱去杂，再用氯仿／甲醇溶剂系统进行梯度洗脱，收集(96∶4)洗脱液，减压浓缩至干得浸膏；将该浸膏溶于适量乙腈／水(4∶6)中，上C_-18硅胶柱，用乙腈／水溶剂系统进行梯度洗脱，收集乙腈／水(1∶1)洗脱液，减压浓缩至干得紫杉醇粗品。紫杉醇粗品用适量甲醇／水(3∶1)重结晶，减压抽滤得紫杉醇结晶；该结晶再用适量甲醇／水(4∶1)重结晶，减压抽滤得结晶，经真空干燥至干，得紫杉醇(含量99.0％)。

紫杉醇的理化、波谱数据

无色粉状晶体(甲醇／水)，mp213～216℃，易溶于二氯甲烷、氯仿、甲醇等，喷香草醛-浓硫酸显色为蓝色，继续加热后变为灰棕色。

ESI-MS m／z：854.1[M+H]⁺，888.4[M+C1]^-，分子量为853。¹HNMR(500MHz，CDCl₃)，δ：5.67(1H，d，J=7.1Hz，H-2)，3.80(1H，d，J=6.9Hz，H-3)，2.38(3H，s，4-OAc)，4.94(1H，dd，J=2.0Hz，J=9.4Hz，H-5)，2.54(1H，ddd，J=6.7，9.7，14.8Hz，H-6_a)，1.88(1H，ddd，J=2.3，11.0，14.7Hz，H-6_b)，4.40(1H，dd，J=6.8Hz，J=10.9Hz，H-7)，6.27(1H，s，H-10)，2.23(3H，s，10-OAc)，6.23(1H，qt，J=1.5Hz，J=9.0Hz，H-13)，2.35(1H，dd，J=9.0Hz，J=15.4Hz，H-14_a)2.28(1H，dd，J=9.0Hz，J=15.4Hz，H-14_b)，1.14(3H，s，H-16)，1.24(3H，s，H-17)，1.79(3H，d，J=1.5Hz，H-18)，1.68(3H，s，H-19)，4.30(1H，dd，J=1.1，8.4Hz，H-20_a)，4.19(1H，dd，J=1.0Hz，J=8.5Hz，H-20_b)，4.78(1H，d，J=2.6Hz，H-2’)，5.78(1H，dd，J=2.8Hz，J=8.9Hz，H-3’)，6.94(1H，d，J=8.8Hz，3’-NH)，8.13(2H，dd，J=1.3Hz，J=8.5Hz，2-OBz／o-ph)，7.51(2H，cm，2-OBz／m-ph)，7.61(1H，tt，J=1.4Hz，J=7.4Hz，2-OBz／p-ph)，7.48(2H，cm，13side chain／o-phl)，7.42(2H，cm，13side chain／m-phl)，7.35(1H，tt，J=1.6Hz，J=7.3Hz，13side chain／p-phl)，7.74(1H，dd，J=1.2Hz，J=8.3Hz，13side chain／o-ph2)，7.40(2H，cm，13side chain／m-ph2)，7.49(1H，overlap，13side chain／p-ph2)。

实施例2：冬凌草甲素和冬凌草乙素的制备

提取分离

冬凌草(香茶菜属植物碎米桠Rabdosia Rubescens(Hemsl.)Hara)的干燥地上部分，用80％乙醇回流提取2次，减压浓缩提取液至含醇量约60％，静置过夜，过滤。滤液减压浓缩至无醇，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液。石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分别浓缩为浸膏。

乙酸乙酯萃取液浸膏通过多次硅胶柱层析(氯仿-丙酮、氯仿-甲醇梯度洗脱)和重结晶，得到冬凌草乙素(含量99.1％)和冬凌草甲素(含量99.2％)。

理化、波谱数据

冬凌草乙素：白色针晶，m.p.241～244℃(甲醇)，溶于氯仿、甲醇，50％浓硫酸喷洒后烘烤显棕黄色，显色后于365nm下可观察到黄色荧光，分子式C₂₀H₂₆O₆。IR(KBr)_υcm^-1：3376(羟基)，2957，2947，2923，2907，2863，1731(羰基)，1639(烯键)，1078，1061，954，943。EI-MS(m／z，％)：362[M]⁺(2)，344[M-H₂O]⁺(13)，298(32)，280(25)，270(37)，269(35)。¹HNMR(300MHz，Pyridine-d₆，δ)和¹³CNMR(75MHz，Pyridine-d₆，δ)数据见Tab.1和Tab.2。

冬凌草甲素：无色棱柱状结晶，m.p.248～251℃(甲醇)，溶于甲醇，50％浓硫酸喷洒后烘烤显棕黄色，显色后于365nm下可观察到黄色荧光，分子式C₂₀H₂₈O₆。IR(KBr)_υcm^-1：3381(羟基)，3314，2941，1711(羰基)，1645(双键)，1460，1434，1169，1095，1079，1067。EI-MS(m／z，％)：364[M]⁺(35)，346[M-H₂O]⁺(10)，328[M-2×H₂O](7)，318(8)，204(7)，183(14)，177(10)，159(13)。¹HNMR(300MHz，Pyridine-d₆，δ)和¹³CNMR(75MHz，Pyridine-d₆，δ)数据见Tab.1和Tab.2。

Tab.1化合物冬凌草乙素和冬凌草甲素的¹H信号归属(in Pyridine-d₆)

Tab.2冬凌草乙素和冬凌草甲素的¹³C信号归属(in Pyridine-d₆)

实施例3：冬凌草乙素／紫杉醇组合物脂质体的制备：

精密称取冬凌草乙素2.1mg、紫杉醇10.0mg、注射用大豆磷脂300mg、胆固醇8mg、α-生育酚18mg，完全溶于无水乙醇中，加入葡聚糖Sephadex G-50粉末2g(使用前过孔径为150μm筛，且放入烘箱中至恒重)，搅拌、超声，使混合均匀后倒入250mL圆底烧瓶中。25r·min-1、50℃恒温水浴减压蒸去无水乙醇，直至在圆底烧瓶内壁形成白色的干燥粉末。将10mL的磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.4)倒入梨形瓶中，旋转待薄膜水化至完全，冰浴条件下超声5min(功率300W)即得。

Claims (6)

1.冬凌草甲素／紫杉醇组合物和冬凌草乙素／紫杉醇组合物在制备紫杉醇类药物的耐药逆转剂和化疗增敏剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用中冬凌草甲素／紫杉醇组合物和冬凌草乙素／紫杉醇组合物通过显著抑制耐紫杉醇肺癌细胞的增殖，促进耐紫杉醇肺癌细胞的凋亡来发挥作用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于其中的冬凌草甲素和冬凌草乙素的制备方法是：(1)将香茶菜属植物冬凌草(碎米桠Rabdosia Rubescens(Hemsl.)Hara)干燥地上部分，用80％乙醇回流提取3次，减压浓缩提取液至含醇量约60％，静置过夜，过滤；

(2)滤液减压浓缩至无醇，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩为浸膏；

(3)将步骤(2)中的浸膏通过多次硅胶柱层析(氯仿-丙酮、氯仿-甲醇梯度洗脱)和重结晶，得到冬凌草乙素和冬凌草甲素。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于其中的紫杉醇的制备方法是：

(1)将新鲜的南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei，人工栽培，三至五年生)粉碎成粗粉，用80％乙醇提取3次，合并提取液，过滤后减压回收乙醇后，所得浸膏用氯仿萃取3次，合并萃取液，减压回收有机溶剂，及减压干燥得浸膏。

(2)上述浸膏用石油醚进行固液萃取，余下的固形物溶适量氯仿中，经氧化铝柱层析去杂质后，再用C_-18硅胶柱层析，用乙腈／水溶剂系统进行梯度洗脱，含紫杉醇的洗脱液经减压浓缩至干得紫杉醇粗品；

(3)上述紫杉醇粗品分别用适量甲醇／水混合溶剂进行两次重结晶，经真空干燥得紫杉醇。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述冬凌草甲素／紫杉醇组合物和冬凌草乙素／紫杉醇组合物与常规辅助剂混合制成药学上可以接受的剂型。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于剂型为冻干纳米乳注射剂、脂质体等。