CN104755534B - 用于递送生物活性材料的低分子量支化聚胺 - Google Patents

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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

支化聚胺包含约8至约12个骨架叔胺基团，约18至约24个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团；其中(n'+q)为等于约8至约12的数，通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，L'为包含3至30个碳的二价连接基团，以及q/(n'+q)×100％等于约9％至约40％。

Description

用于递送生物活性材料的低分子量支化聚胺
联合研发协议的各方
本发明是在International Business Machines Corporation和the Agency ForScience，Technology and Research的联合研发协议下做出的。
背景
本发明涉及用于递送生物活性材料的低分子量支化聚胺，更具体地，涉及氨基甲酸酯官能化的低分子量支化聚乙烯亚胺，其包含用于基因递送的疏水氨基甲酸酯端基。
基于核酸的疗法在治疗人类疾病上大有前景。理论上，不仅错误和缺陷基因可以被功能基因修正和替换，而且多余的基因表达也可以通过使用RNA干预而被抑制到正常水平。通常，有两个主要类型的基因递送载体，即病毒载体和非病毒载体。尽管病毒载体具有优越的转导能力，但是病毒载体的致免疫和致癌的可能性限制了其临床应用。为了避免这个问题，已经报道了一些非病毒基因递送系统，其包括(1)核酸与包括脂类、聚合物和肽在内的多种阳离子分子的复合以及(2)核酸与诸如胆固醇和细胞穿透肽的天然配体的结合。非病毒基因递送载体正在受到更多的关注，这是由于其生物安全性、低生产成本、运输和储存方便、再生产性，以及用于靶向特定细胞类型的可调的官能性。
在各种类型的非病毒载体中，支化聚乙烯亚胺(重均分子量(Mw)为25kDa，数均分子量(Mn)为10kDa，在本文中称为bPEI-25)，其含有伯、仲和叔胺基团，提供了高的体外基因转染效率，并且视为工业标准。bPEI-25在生理pH下具有高阳离子电荷密度，其中bPEI-25中的约20％的胺基团(即伯胺)被质子化。这使得bPEI-25能够与带负电的核酸在宽泛的pH范围内静电相互作用并且使它们能够复合成纳米粒子。一旦bPEI-25/核酸纳米复合物被细胞吸收同化，那么仲胺和叔胺促进核酸从核内体通过“质子海绵效应”释放。对于脱氧核糖核酸(DNA)，所释放的核酸被摄入细胞核给予了高的基因转移效率。
尽管有着高的基因转染效率，bPEI-25的净正电荷具有涉及以下的主要缺点，即，涉及毒性、聚集以及bPEI-25/核酸复合物与细胞组分和非细胞组分(尤其在体内)的不期望的非特异性相互作用。副作用包括肝坏死、聚集的血小板的粘连以及更高剂量的全身注射之后的休克。
考虑到bPEI-25所面临的细胞毒性问题，低分子量支化聚乙烯亚胺(Mw为约2.0kDa，Mn为约1.8kDa，在本文中称为bPEI-2)也已获得关注，这是由于其有利的细胞毒性谱。当用于体内治疗目的时，低分子量使得bPEI-2可以从肾脏排泄。然而，bPEI-2的主要缺点是其低效的转染能力，使其不足以用作基因转染载体。
因此，对于开发更有效且细胞毒性更低的用于递送生物活性材料的聚乙烯亚胺衍生物，存在着持续的需求。
概述
因此，公开了支化聚胺，其包含：
约8至约12个骨架叔胺基团，约18至约24个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：
其中：
(n'+q)为等于约8至约12的数，
通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，
L'为包含3至30个碳的二价连接基团，以及
q/(n'+q)×100％等于约9％至约40％。
还公开了支化聚胺，其包含：
约8至约12个骨架叔胺基团，约18至约24个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(4)的骨架末端氨基甲酸酯基团：
其中
通式(4)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，
R1为氢、甲基或乙基，
R2为氢或包含1至27个碳的单价基团，
(n'+q)为等于约8至约12的数，以及
q/(n'+q)×100％等于约9％至约40％。
进一步公开了方法，其包括：
用环状碳酸酯单体处理包含约8至约12个伯胺基团、多个仲胺基团和多个叔胺基团的支化第一聚合物而不使所述环状碳酸酯单体聚合，从而形成包含以下的支化聚胺：i)约8至约12个骨架叔胺基团，ii)约18至约24个骨架仲胺基团，iii)大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及iv)大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：
其中：
(n'+q)为等于约8至约12的数，
通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，
L'为包含3至30个碳的二价连接基团，以及
q/(n'+q)×100％等于约9％至约40％。
还公开了复合物，其包含：
基因；以及
支化聚胺，其包含约8至约12个骨架叔胺基团，约18至约24个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：
其中：
(n'+q)为等于约8至约12的数，
通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，
L'为包含3至30个碳的二价连接基团，以及
q/(n'+q)×100％等于约9％至约40％。
还公开了处理细胞的方法，其包括使细胞与上述复合物接触。
进一步公开了具有通式(5)的结构的支化聚胺：
其中j、k、m、n'和q代表大于0的摩尔数，j具有约35至约47的值，k具有约8至约12的值，m具有约18至约24的值，(n'+q)具有约8至约12的值，以及q/(n'+q)×100％具有约9％至约40％的值，并且各个Z'为选自以下的独立的部分
及其组合。
从以下详述、附图以及所附的权利要求书，本领域技术人员会了解和理解本发明的上述及其它特征和优点。
附图简述
图1为示出用荧光素酶报告基因和多种修饰的bPEI-2聚合物制备的聚合物/DNA复合物的粒径的柱状图。未修饰的bPEI-2为数均分子量(Mn)＝1.8kDa且重均分子量(Mw)＝2000的支化聚乙烯亚胺。用于形成修饰的bPEI-2聚合物的环状碳酸酯单体在图例的括号中示出。以10至40的N/P比制备复合物。以40的N/P比制备未修饰的bPEI-2的荧光素酶报告基因复合物作为对照。
图2为示出用荧光素酶报告基因和多种修饰的bPEI-2聚合物制备的聚合物/DNA复合物的ζ电势的柱状图。用于形成修饰的bPEI-2聚合物的环状碳酸酯单体在括号中示出。以10至40的N/P比制备复合物。以40的N/P比制备未修饰的bPEI-2的DNA复合物作为对照。
图3为从由荧光素酶报告基因和未修饰的bPEI-2制备的对照聚合物/DNA复合物获得的DNA梯状电泳(DNA ladder)的照片。
图4为从由荧光素酶报告基因和未修饰的bPEI-25(数均分子量(Mn)＝10000kDa且重均分子量(Mw)＝25000)制备的对照聚合物/DNA复合物获得的DNA梯状电泳的照片。
图5-11为从由荧光素酶报告基因和多种修饰的bPEI-2聚合物制备的所选定的聚合物/DNA复合物获得的DNA梯状电泳的照片。
图12为比较用MTC-C2制备的几种修饰的bPEI-2聚合物的缓冲能力的图。缓冲能力随着MTC-C2含量的增加而降低。
图13为比较用MTC-C2制备的所选定的修饰的bPEI-2聚合物与荧光素酶报告基因结合能力的图。DNA结合能力随着MTC-C2含量的增加而降低。
图14是柱状图，其示出在SK-OV-3细胞中不同N/P比的由多种修饰的bPEI-2聚合物/DNA复合物介导的荧光素酶表达水平。用于形成修饰的bPEI-2聚合物的环状碳酸酯单体在括号中示出。对照包括N/P 40的未修饰的bPEI-2的DNA复合物、单独的DNA、以及没有DNA(在表中标记为“0”)。结果表示为三次重复实验的平均±标准偏差。随着MTC-C2修饰水平从未修饰的bPEI-2的伯胺基团的10％增加至40％，荧光素酶表达水平增加。用MTC-C2来100％修饰伯胺基团与未修饰的bPEI-2相比实现更低的表达水平。
图15为示出在HepG2细胞中不同N/P比的多种修饰的bPEI-2聚合物/DNA复合物介导的荧光素酶表达水平的柱状图。
图16为示出用以N/P 10至40制备的多种修饰的bPEI-2聚合物/荧光素酶复合物孵育之后SK-OV-3细胞的细胞活力的柱状图。
图17为示出用以N/P 10至40制备的多种修饰的bPEI-2聚合物/荧光素酶复合物孵育之后HepG2细胞的细胞活力的柱状图。
图18为比较了不同N/P比的修饰的bPEI-25聚合物P3、P6、P7和P9在SK-OV-3细胞中体外GFP基因转染效率的柱状图。
图19为比较了不同N/P比的三种修饰的bPEI-2聚合物P6、P7和P9在HepG2细胞中体外GFP基因转染效率的柱状图。
详述
所公开的是用于递送包括基因、蛋白质和/或药物在内的生物活性材料的低分子量支化聚胺。支化聚胺优选通过使一种或多种疏水环状碳酸酯化合物与包含约8至约12个伯胺基团、多个仲胺基团和多个叔胺基团的支化聚乙烯亚胺(bPEI)反应而制备。为了清楚起见，用于与环状碳酸酯单体进行的氨基甲酸酯形成反应的支化聚乙烯亚胺起始材料在以下描述中被称为未修饰的支化聚乙烯亚胺(“未修饰的bPEI”)。反应产物是被称作修饰的支化聚乙烯亚胺(“修饰的bPEI”)的氨基甲酸酯官能化的bPEI聚合物。未修饰的bPEI可以具有约1500至约2000的数均分子量(Mn)和约1800至约4000的重均分子量(Mw)。更具体的支化聚胺是通过用环状碳酸酯化合物处理bPEI-2(称为“未修饰的bPEI-2”)形成的。所获得的支化聚胺，其为氨基甲酸酯官能化的bPEI-2聚合物，被称作“修饰的bPEI-2”聚合物。应当理解除了支化聚乙烯亚胺之外的含支化胺的聚合物可以潜在地用于氨基甲酸酯形成反应(例如，包含约8至约12个伯胺基团、多个仲胺基团和多个叔胺基团的树枝状胺聚合物)。
在基因转染过程中，支化聚胺能够用作基因的载体。修饰的bPEI用作癌症基因治疗应用是有吸引力的，这是基于其低细胞毒性及其在不同癌细胞系中作为基因转染试剂的效能。示例性细胞系包括癌性人类肝脏细胞(例如HepG2)和癌性人类卵巢细胞(例如SK-OV-3细胞)。在一些实例中，从修饰的bPEI/基因复合物所获得的基因表达水平比从相应的未修饰的bPEI/基因复合物所观察到的基因表达水平高十倍。修饰的bPEI/基因复合物在N/P10至N/P50下还具有低的细胞毒性。
未修饰的bPEI包含多个二价亚乙基(*-CH2CH2-*)、多个骨架叔胺、多个骨架仲胺和多个骨架末端伯胺基团。更具体地，基于Mn的范围和分子量为43的平均氮丙啶亚单元，未修饰的bPEI具有约35至约47个亚乙基、约8至约12个骨架叔胺基团、约18至约24个骨架仲胺基团，以及约8至约12个骨架末端伯胺基团。未修饰的bPEI的骨架末端单元含有伯胺基团。
未修饰的bPEI具有基本由以下组成的结构：约8至约12个下述结构的伯氮丙啶重复单元
约18至约24个下述结构的仲氮丙啶重复单元
以及
约8至约12个下述结构的叔氮丙啶重复单元
不包括可能存在的上述重复单元的水合盐(hydrosalt)。在以上重复单元中各个星号键代表与未修饰的bPEI的另一重复单元的连接点。
未修饰的bPEI在本文中还表示为通式(1)：
其中j、k、m和n表示未修饰的bPEI结构的各独立官能团的摩尔数，j具有约35至约47的值，k具有约8至约12的值，m具有约18至约24的值，n具有约8至约20的值。基于通式(1)的标记应当理解，在方括号[]内开始并且在方括号外结束的每组圆括号()，包括了未修饰的bPEI的独立官能团，而不是聚合物链。下标k、m、n和j表示未修饰的bPEI结构的各独立官能团的每一种的摩尔数。星号键代表与括号相对侧的星号键的连接点。因此在方括号右侧的每一个氮都与在方括号左侧的亚乙基的碳结合。
作为一个实例，以上所述的可商购的支化聚乙烯亚胺bPEI-2具有2000的重均分子量(Mw)、约1800的数均分子量(Mn)，并且基于Mn和分子量为43的平均氮丙啶重复单元，平均包含10个骨架叔胺基团、20个骨架仲胺基团、10个骨架末端伯胺基团，以及35个亚乙基。在该实例中，j＝35，k＝10，m＝20以及n＝10。该材料在本文中还被称作“未修饰的bPEI-2”。
作为另一个实例，以上所述可商购的支化聚乙烯亚胺bPEI-2具有25000的重均分子量、约10000的数均分子量，并且基于Mn和分子量为43的平均氮丙啶重复单元，平均包含58个骨架叔胺基团、116个骨架仲胺基团、58个骨架末端伯胺基团，以及233个亚乙基。在该实例中，j＝233，k＝58，m＝116以及n＝58。该材料在本文中还被称作“未修饰的bPEI-25”。
未修饰的bPEI的骨架末端伯胺基团经历与环状碳酸酯化合物的氨基甲酸酯形成开环反应，从而形成支化聚胺。开环反应的发生优选伴随环着状碳酸酯化合物的最小聚合或无聚合。
支化聚胺包含约8至约12个骨架叔胺基团，约18至约24个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：
其中通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，q/(n'+q)×100％等于约9％至约40％，(n'+q)为等于约8至约12的数，以及L'为包含3至30个碳的二价连接基团。在一个实施方案中，L'为不带电的基团。在另一个实施方案中，修饰的bPEI不包括季胺基团。
更具体的支化聚胺具有包括以下的结构：
i)大于0的正数n'个下述结构的骨架末端伯氮丙啶重复单元：
ii)约18至约24个下述结构的骨架仲氮丙啶重复单元：
iii)约8至约12个下述结构的骨架叔氮丙啶重复单元：
以及
iv)大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯端基：
其中在以上结构中的各个星号键表示与支化聚胺的另一重复单元的连接点，q/(n'+q)×100％等于约9％至约40％，(n'+q)为等于约8至约12的数，以及L'为包含3至30个碳的二价连接基团。通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接。在一个实施方案中，支化聚胺基本由伯氮丙啶重复单元、仲氮丙啶重复单元、叔氮丙啶重复单元以及氨基甲酸酯端基组成。在另一个实施方案中，支化聚胺为氨基甲酸酯官能化的bPEI-2(即，修饰的bPEI-2聚合物)。在另一个实施方案中，L'为不带电的基团。在另一个实施方案中，支化聚胺不包括季胺基团。
支化聚胺在本文中可以表示为通式(3)：
其中j、k、m、n'和q表示在通式(3)的圆括号中包括的独立官能团的每一种的大于0的摩尔数，j具有约35至约47的值，k具有约8至约12的值，m具有约18至约24的值，(n'+q)具有约8至约12的值，以及表达式q/(n'+q)×100％具有约9％至约40％的值。使用括号和圆括号的标记具有与上文对通式(1)所述的相同意义。L'为包含3至30个碳的二价连接基团。
在制备支化聚胺的方法，反应混合物包含环状碳酸酯化合物和未修饰的bPEI，并且环状碳酸酯化合物的存在量为未修饰的bPEI的伯胺基团的总摩尔数的50mol％以下。因此，在该方法中，未修饰的bPEI的至少50％的伯胺基团在支化聚胺中保持未修饰。在实施方案中，通式(3)的(n'+q)/q×100％具有约9％至约25％的值。在甚至更具体的实施方案中，通式(3)的(n'+q)/q×100％具有约9％至约12％的值。在另一个实施方案中，q为1并且n'具有约7至约11的值。
支化聚胺的各个骨架叔胺基团、骨架仲胺基团和/或骨架末端伯胺基团可以以游离碱或水合盐的形式存在(例如，与诸如氢氧根离子、氯离子、乙酸根离子或磺酸根离子的带负电的抗衡离子缔合的带正电的质子化胺)。
另一个更具体的支化聚胺包含约8至约12个骨架叔胺基团，约18至约24个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(4)的骨架末端氨基甲酸酯基团：
通式(4)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，R1为氢、甲基或乙基，以及R2为氢或包含1至27个碳的基团，(n'+q)具有约8至约12的值，并且q/(n'+q)×100％具有约9％至约40％的值。在一个实施方案中，R2为酯*-C(＝O)OR3，其中R3包含1至26个碳。
另一个更具体的支化聚胺包含：
i)大于0的正数n'个下述结构的骨架末端伯氮丙啶重复单元：
ii)约18至约24个下述结构的骨架仲氮丙啶重复单元：
iii)约8至约12个下述结构的骨架叔氮丙啶重复单元：
以及
iv)大于0的正数q个通式(4)的骨架末端氨基甲酸酯端基：
其中，各星号键与支化聚胺的另一重复单元连接，R1为氢、甲基或乙基，以及R2为氢或包含1至27个碳的基团，(n'+q)具有约45至约70的值，并且q/(n'+q)×100％具有约9％至约40％的值。在实施方案中，支化聚胺基本由伯氮丙啶重复单元、仲氮丙啶重复单元、叔氮丙啶重复单元以及氨基甲酸酯端基组成。在另一个实施方案中，支化聚胺为氨基甲酸酯官能化的bPEI-2。
在实施方案中，通式4的R2为酯*-C(＝O)OR3，其中R3包含1至26个碳。
R3可以包含糖部分。包含糖部分的示例性R3基团包括甘露糖、半乳糖或葡萄糖的酯。
R3可以包含含有1至26个碳的单价烃基。示例性单价烃基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。单价烃基可以为支链或直链的。
其他R3基团包括苄酯和带有脲基的酯。
支化聚胺可以具有约1600至约5000的数均分子量(Mn)。修饰的bPEI可以具有约2100至约6000的重均分子量(Mw)。
氨基甲酸酯基团可以任选地包含一种或多种保护基。在这些实例中，形成支化聚胺的方法可以还包括选择性地去除一种或多种保护基。
示例性环状碳酸酯单体包括表1的化合物：
表1
环状碳酸酯单体的额外实例包括表2的化合物。
表2
环状碳酸酯单体可以单独使用或组合使用。
更具体的支化聚胺具有通式(5)的结构：
其中j、k、m、n'和q表示大于0的摩尔数，j为具有约为35至约47的值的数，k为具有约8至约12的值的数，m为具有约18至约24的值的数，(n'+q)具有约8至约12的值，以及表达式q/(n'+q)×100％具有约9％至约40％的值，并且各Z'为独立地选自以下的部分
及其组合。
还公开了包含基因和上述支化聚胺的复合物。进一步公开了处理细胞的方法，其包括使细胞与所述复合物接触。
以下实施例说明了使用环状碳酸酯将疏水氨基甲酸酯基团引入未修饰的bPEI-2的简易方法。环状碳酸酯可以是用或不用有机催化剂(1,8-二氮杂双环十一碳-7-烯，DBU)开环的环。不用DBU，可以形成具有伯醇的氨基甲酸酯。用DBU，当伯胺基团以高于环状碳酸酯的量存在时，也可以形成具有伯醇的氨基甲酸酯。然而，如果环状碳酸酯以高于伯胺基团的量存在，那么所得的支化聚胺很可能含有与伯胺位点连接的聚碳酸酯链。
描述了多种修饰的bPEI-2/基因复合物的DNA结合、粒径、ζ电势和基因表达性质。通过使用荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因，研究了在HepG2(人类肝癌细胞系)和SK-OV-3(人类卵巢癌细胞系)中修饰的bPEI-2复合物的基因转染效率和细胞毒性，并与未修饰的bPEI-2进行比较。
实施例
在以下实施例中使用的材料在表3中列出。
表3
在本文中，Mn为数均分子量，Mw为重均分子量，并且MW为一个分子的分子量。
将1,8-二氮杂双环[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)在CaH2中搅拌并且真空蒸馏，然后转移至手套箱中。具有25kDa(bPEI-25)和1.8kDa(bPEI-2)的重均分子量的支化聚乙烯亚胺、用于细胞毒性分析的1-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-3,5-二苯基甲(MTT)以及用于聚合物合成的其它试剂可从Aldrich购得，并且除非另有说明，不经过任何纯化而使用。荧光素酶底物和5×溶解缓冲液从Promega(Singapore)购得。GFP-报告基因(编码由巨细胞病毒启动子驱动的野生型GFP的红移变体)和荧光素酶-报告基因(编码由巨细胞病毒启动子驱动的6.4kb萤火虫荧光素酶基因)是分别从Clontech(U.S.A.)和Carl Wheeler，Vical(U.S.A.)获得的。BCA蛋白测定试剂盒来自Pierce。HepG2和SK-OV-3人类癌细胞系购自ATCC(U.S.A.)。
MTC-OH可以通过R.C.Pratt等人，Chemical Communications，2008，114-116中的方法制备。
MTC-C6H5(MW 326.2)的制备
向100mL圆底烧瓶填装随70mL四氢呋喃(THF)一起冲洗入的bis-MPA,(7),(5.00g，37mmol，MW 134.1)、双-(五氟苯基)碳酸酯(PFC，31.00g，78mmol，MW 394.1)和CsF(2.5g，16.4mmol)。反应最初为异相的，但是在一个小时之后形成澄清的均相溶液，使其搅拌20小时。在真空中去除溶剂并且将残留物再溶解在二氯甲烷中。使溶液静置约10分钟，在这段时间内五氟苯酚副产物沉淀并且可以定量回收。该五氟苯酚副产物在五氟苯酚19F NMR中显示出三个特征峰，并且在GCMS中显示出质量为184的单峰。将滤液用碳酸氢钠、水萃取并且用MgSO4干燥。将溶剂在真空中蒸发并且将产物重结晶(乙酸乙酯/己烷混合物)以得到白色结晶粉末形式的MTC-C6F5。GCMS具有质量为326g/mol的单峰。对C12H7F5O5计算得到的分子量与所指定的结构一致。1H-NMR(400MHz，在CDCl3中)：δ4.85(d，J＝10.8Hz，2H，CHaHb)，4.85(d，J＝10.8Hz，2H，CHaHb)，1.55(s，3H，CCH3).
I.单体的合成
实施例1.MTC-Cl(MW 178.6)的制备
将乙二酰氯(2.48mL，19.0mmol)在50mL干燥四氢呋喃(THF)中的溶液逐滴加入5-甲基-5-羧基-1,3-二氧基环己-2-酮(MTC-OH)(2.75g，17.2mmol，MW 160.1)在50mL干燥THF中的溶液中，随后在氮气氛下，历时30分钟，加入催化量(3滴)的无水二甲基甲酰胺(DMF)。伴随着N2全程鼓泡搅拌反应溶液1小时，从而去除挥发物。在反应之后，将溶剂在真空下蒸发，获得MTC-Cl，其未被进一步纯化。
实施例2.MTC-C2(MW 188.2)的制备
I)将bis-MPA(22.1g，0.165mol，MW 134.1)加入到具有Amberlyst-15(6.8g)的乙醇(150mL)中，并且回流过夜。随后将树脂过滤掉，并且将滤液蒸发。将二氯甲烷(200mL)加入所得的粘稠液体中以过滤未反应的溶剂和副产物。将溶液用MgSO4干燥并且蒸发之后，获得澄清无色液体形式的2,2-双(羟甲基)丙酸乙酯(MW 162.2)(24.3g，91％)。1H NMR(400MHz,CDCl3,22℃):δ4.67(d,2H,-CH2OCOO),4.25(q,2H,-OCH2CH3),4.19(d,2H,-CH2OCOO),1.30(s,3H,-CH3),1.27(t,3H,-OCH2CH3)。
II)历时30分钟、在使用干冰/丙酮的-75℃下、在氮气氛下，将三光气(11.7g，0.039mol)在二氯甲烷(150mL)中的溶液逐滴加入2,2-双(羟甲基)丙酸乙酯(12.6g，0.078mol，MW 162.2)和吡啶(39mL，0.47mol)的二氯甲烷溶液(150mL)中。将反应混合物在冷却的条件下持续再搅拌2小时，随后升温至室温。通过加入饱和NH4Cl水溶液(75mL)来淬灭反应，随后将有机层用1M的HCl水溶液(3×100mL)、饱和NaHCO3水溶液(1×100mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤和蒸发。将残留物用乙酸乙酯重结晶以得到白色晶体形式的MTC-C2(MW188)(8.0g，55％)。1H NMR(400MHz,CDCl3,22℃):δ4.67(d,2H,-CH2OCOO),4.25(q,2H,-OCH2CH3),4.19(d,2H,-CH2OCOO),1.30(s,3H,-CH3),1.27(t,3H,-OCH2CH3)。
实施例3.MTC-C8(MW 272.3)的制备
向烧瓶填装MTC-C6F5(5.5g，16.9mmol，MW 326.2)、辛醇(2.0g，15.4mmol)，PROTONSPONGE(3.29g，15.4mmol)以及THF(8mL)。将反应混合物搅拌12小时，并加入过量乙酸铵。将反应混合物再搅拌3小时，随后直接加到硅胶柱上。通过使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂的柱层析法来分离产物以得到油。MTC-C81H NMR(400MHz,CDCl3,22℃):δ4.71(d,2H,-CH2OCOO),4.23(d,2H,-CH2OCOO),4.22(t,2H,-OCH2CH2),1.68(t,2H,-OCH2CH2(CH2)5),1.36(s,3H,-CH3),1.31(t,10H,-CH2(CH2)5CH3),0.90(t,3H,-(CH2)5CH3)。
实施例4.使用实施例3的一般程序，用十二醇来代替乙醇，从而合成MTC-C12(MW328.4)。
MTC-C12 1H NMR(400MHz,CDCl3,22℃):δ4.69(d,2H,-CH2OCOO),4.23(d,2H,-CH2OCOO),4.21(t,2H,-OCH2CH2),1.68(t,2H,-OCH2CH2(CH2)5),1.35(s,3H,-CH3),1.28(t,10H,-CH2(CH2)5CH3),0.90(t,3H,-(CH2)5CH3)。
实施例5.MTC-Bn(MW 250.3)的合成
将2,2-双(羟甲基)丙酸(bis-MPA)(20g，149.1mmol，MW 134.1)和氢氧化钠(5.96g，149.1mmol)在100mL DMSO中合并，并且在80℃下搅拌过夜。逐滴加入苄基溴(30.6g，178.9mmol)。使溶液变清澈并且用NMR监测反应。一旦反应完成，将溶液冷却至室温并且加入500mL水。用乙醚萃取溶液几次并且将乙醚溶液浓缩至250mL。将溶液用水、碳酸氢钠和盐水溶液洗涤，干燥，并且浓缩成固体。将固体用THF/己烷重结晶以获得MPA-Bn(10.0g，30％)的白色晶体。随后将MPA-Bn(4.76g，21.2mmol，MW 224.3)和三乙胺(5.4g，53.1)溶解在干燥THF(210mL)中并且冷却至0℃。在氮气下，将氯甲酸乙酯(5.1g，46.7mmol)逐滴加入搅拌的溶液中。将溶液升温至室温并且反应18小时。随后将反应溶液浓缩成固体，并且将固体用乙醚重结晶两次以获得白色晶体形式的MTC-Bn(3.86g，72.6％)。1H NMR(400MHz,CDCl3,22℃):δ7.38(m,2H,C5H6),5.24(s,2H,-OCH2C5H6)4.72(d,2H,-CH2OCOO),4.21(d,2H,-CH2OCOO),4.21(t,2H,-OCH2C5H6),1.36(s,3H,-CH3)。
具有受保护的糖侧基的环状碳酸酯单体包括MTC-IPMAN、MTC-IPGAL和MTC-IPGLU。
实施例6.MTC-IPMAN(MW 402.3)的制备
MTC-IPMAN的制备具有代表性。MTC-Cl是如上那样制备的，并且将其溶解在50mL的干燥二氯甲烷(DCM)中。历时30分钟，在室温下将2,3:5,6-双-O-亚异丙基-D-呋喃甘露糖(IPMAN)(4.13g，15.8mmol，MW 260.3)和三乙胺(2.8mL，20.6mmol)在50mL的干燥二氯甲烷中的混合物逐滴加入溶液中。随后，将反应混合物加热至40℃，持续48小时。在将混合物冷却至室温后，将溶液浓缩，并将100mL THF加入以沉淀三乙胺盐。在过滤该盐并去除溶剂之后，使所得的粗产物经过使用乙酸乙酯和己烷(20/80至50/50)梯度洗脱的硅胶柱，以提供粘稠无色油形式的产物，其缓慢固化为白色固体(5.85g，85％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3,22℃):δ6.17(s,1H,H-a),5.79(dd,1H,H-b),4.83(m,1H,H-d),4.66(d,2H,H-c),4.41(m,1H,H-g),4.22(m,2H,H-c),4.03(m,2H,H-e+H-f),3.73(m,1H,H-e),1.33-1.50(m,15H,H-h+H-i)。
实施例7.MTC-IPGAL(MW 402.2)的制备
MTC-IPGAL是使用实施例6的程序和1,2:3,4-双-O-压异丙基-D-吡喃半乳糖(IPGAL，MW 260.3)制备的。产率81％。1H-NMR(400MHz,CDCl3,22℃):δ5.54(d,1H,H-a),4.70(m,2H,H-c),4.62(m,1H,H-b),4.41(m,1H,H-f),4.33(m,2H,H-d和H-e),4.26(m,3H,H-c和H-g),4.03(m,1H,H-g),1.32-1.49(5s,15H,H-h+H-i)。
实施例8.MTC-IPGLU(MW 402.2)的制备
MTC-IPGLU是使用实施例6中的程序和1,2:5,6-双-O-亚异丙基-D-呋喃葡萄糖(IPGLU，MW 260.3)制备的。产率75％。1H-NMR(400MHz,CDCl3,22℃):δ5.90(d,1H,H-a),5.39(d,1H,H-b),4.69(d,2H,H-c),4.46(d,1H,H-g),4.18(m,2H,H-c),4.06(m,2H,H-e和H-f),4.00(m,1H,H-e),1.30-1.52(5s,15H,H-h+H-i)。
具有苯基脲侧基的环状碳酸酯是根据方案1制备的。
方案1
实施例9.MTC-PUC2(MW 322.3)的合成
1)将乙醇胺(5.0g，48.5mmol，1eq)置于干燥的装有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中，并且加入干燥THF(30mL)。将所得的溶液通过冰浴冷却至0℃。将异氰酸苯酯(5.19g，4.74mL，43.6mmol，0.9当量)和30mL干燥THF通过滴液漏斗逐滴加入乙醇胺/THF混合物，历时30分钟。将所得的混合物放置以升温至环境温度，并使其在搅拌下放置额外的16小时。使用旋转蒸发来去除THF。将所得的粗产物用乙酸乙酯重结晶，然后剧烈搅拌额外的4小时。将重结晶的固体通过过滤来分离并且进一步用乙酸乙酯洗涤，并且干燥直到达到恒重，得到产率7.0g(～80％)的中间体苯基脲乙醇(方案1中n＝2)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,22℃):δ8.55(s,1H,-NHPh),7.36(d,2H,PhH),7.20(t,2H,PhH),6.88(t,1H,PhH),6.18(t,1H,-CH2NHCO-),4.76(t,1H,-OH),3.43(q,2H,-CH2OH),3.15(q,2H,-CH2NHCO-)。
2)如上述那样，通过使用乙二酰氯将MTC-OH(4.3g，26.8mmol)转化为MTC-Cl。将MTC-Cl溶解在50mL干燥二氯甲烷中，并且装入加料漏斗中。在干燥的装备有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中填装苯基脲乙醇(5.55g，25mmol)、吡啶(1.97g，2.02mL，25mmol)以及干燥二氯甲烷(150mL)。在氮气下连接加料漏斗并且用冰浴将烧杯冷却至0℃。在30分钟时段内逐滴加入MTC-Cl溶液，并将所得的溶液再搅拌30分钟。移去冰浴并且使溶液升温至环境温度，并且在搅拌下放置额外的16小时。将粗产物通过使用硅胶的柱层析法纯化。二氯甲烷初始用作洗脱剂，随后逐渐增加极性，结束时最终浓度为5vol％甲醇。收集产物级分并且将溶剂通过旋转蒸发来去除。将分离的产物在真空下干燥直至达到恒重，得到8.0g(约80％)的米色/黄色油，其在静置下结晶。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,22℃):δ8.59(s,1H,-NHPh),7.38(d,2H,PhH),7.21(t,2H,PhH),6.89(t,1H,PhH),6.26(t,1H,-CH2NHCO-),4.57(d,2H,-COOCH2CH2-),4.35(d,2H,-CH2OCOO-),4.16,(t,2H,-CH2OCOO-),3.35(q,2H,-CH2NHCO-),1.20(s,3H,-CH3)。
实施例10.使用实施例9的程序和8-氨基-1-辛醇来制备MTC-PUC8(MW 406.5)。产率，86％，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,22℃):δ8.37(s,1H,-NHPh),7.38(d,2H,PhH),7.21(t,2H,PhH),6.86(t,1H,PhH),6.10(t,1H,-CH2NHCO-),4.57(d,2H,-COOCH2CH2-),4.39(d,2H,-CH2OCOO-),4.17,(t,2H,-CH2OCOO-),3.06(q,2H,-CH2NHCO-),1.26-1.40(2s,15H,-(CH2)6-和-CH3)。
实施例11.使用实施例9的程序和12-氨基-1-十二醇来制备MTC-PUC12(MW462.6)。产率，65％，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,22℃):δ8.37(s,1H,-NHPh),7.34(d,2H,PhH),7.17(t,2H,PhH),6.83(t,1H,PhH),6.09(t,1H,-CH2NHCO-),4.51(d,2H,-COOCH2CH2-),4.33(d,2H,-CH2OCOO-),4.09,(t,2H,-CH2OCOO-),3.02(q,2H,-CH2NHCO-),1.28-1.56(m,23H,-(CH2)10-和-CH3)。
使用MTC-C8和MTC-C12的修饰
基于1摩尔＝1800(Mn)，bPEI-2每摩尔具有10伯胺基团、20个仲胺基团和10个叔胺基团。根据方案2使用带有不同链长的疏水酯基的环状碳酸酯单体修饰bPEI-2。
方案2
实施例12.使用MTC-C8形成P1的程序具有代表性。在手套箱中，将MTC-C8(0.0408g，0.15mmol，MW＝272g)加入bPEI-2(0.270g，0.15mmol，基于1摩尔＝1800g＝Mn)在2mL DCM中的溶液中。bPEI-2:MTC-C8的摩尔加料比为1:1，并且质量加料比为6.6:1。将反应溶液搅拌1小时。将聚合物在无水乙醚中沉淀并且通过旋转蒸发来干燥。对聚合物P1的NMR所得到的摩尔比为1:1。因此，对于方案2的聚合物P1，m＝20，q＝1，n'＝9，k＝10以及j＝43。
实施例13.用MTC-C12依照实施例12的一般程序来制备聚合物P2。bPEI-2:MTC-C12的摩尔加料比为1:1，并且质量加料比为5.5:1。对聚合物P2的NMR所得到的摩尔比为1:0.86。因此，对于方案2的聚合物P2，m＝20，q＝0.86，n'＝9.14，k＝10以及j＝43。
使用MTC-PUC2、MTC-PUC8和MTC-PUC12的修饰
根据方案3使用实施例12的一般程序，用带有不同链长的疏水的含脲的酯基的环状碳酸酯单体修饰bPEI-2，从而产生支化聚胺P3至P5。反应时间为1小时。将聚合物在无水乙醚中沉淀并且通过旋转蒸发来干燥。
方案3
实施例14.对于聚合物P3，bPEI-2:MTC-PUC12的摩尔加料比为1:1，并且质量加料比为5.6:1。对聚合物P3的NMR所得的摩尔比为1:0.9。因此，对于方案3的聚合物P3，m＝20，q＝0.9，n'＝9.1，k＝10以及j＝43。
实施例15.对于聚合物P4，bPEI-2:MTC-PUC8的摩尔加料比为1:1，并且质量加料比为4.4:1。对聚合物P4的NMR所得的摩尔比为1:0.9。因此，对于方案3的聚合物P4，m＝20，q＝0.9，n'＝9.1，k＝10以及j＝43。
实施例16.对于聚合物P5，bPEI-2:MTC-PUC12的摩尔加料比为1:1，并且质量加料比为3.9:1。对聚合物P5的NMR所得的摩尔比为1:1.1。因此，对于方案3的聚合物P5，m＝20，q＝1.1，n'＝8.9，k＝10以及j＝43。
使用MTC-Bn的修饰
根据方案4使用实施例12的一般程序，用MTC-Bn(MW250)修饰bPEI-2，从而产生支化聚胺P6和P13。反应时间为1小时。将聚合物在无水乙醚中沉淀并且通过旋转蒸发来干燥。
方案4
实施例17.对于P6的制备，bPEI-2:MTC-Bn的摩尔加料比为1:1，并且质量加料比为7.2:1。对P6的NMR所得的bPEI-2:MTC-Bn的摩尔比为1:1.1。因此，对于方案4的P6，m＝20，q＝1.1，n'＝8.9，k＝10以及j＝43。
实施例18.对于P13的制备，bPEI-2:MTC-Bn的摩尔加料比为1:4，并且质量加料比为1.8:1。对P13的NMR所得的bPEI-2:MTC-Bn的摩尔比为1:4.7。因此，对于方案4的P13，m＝20，q＝4.7，n'＝5.3，k＝10以及j＝43。
使用MTC-C2的修饰
根据方案5使用实施例12的一般程序，用MTC-C2修饰bPEI-2从而产生支化聚胺P7至P10。反应时间为1小时。将聚合物在无水乙醚中沉淀并且通过旋转蒸发来干燥。
方案5
实施例19.对于P7的制备，bPEI-2:MTC-C2的摩尔加料比为1:1，并且质量加料比为9.6:1。对P7的NMR所得的摩尔比为1:1。因此，对于方案5的P7，m＝20，q＝1，n'＝9，k＝10以及j＝43。
实施例20.对于P8的制备，bPEI-2:MTC-C2的摩尔加料比为1:2，并且质量加料比为4.8:1。对P8的NMR所得的摩尔比为1:1.8。因此，对于方案5的P8，m＝20，q＝1，n'＝8.2，k＝10以及j＝43。
实施例21.对于P9的制备，bPEI-2:MTC-C2的摩尔加料比为1:4，并且质量加料比为2.8:1。对P9的NMR所得的摩尔比为1:4.1。因此，对于方案5的P9，m＝20，q＝1，n'＝5.9，k＝10以及j＝43。
实施例22.对于P10的制备，bPEI-2:MTC-C2的摩尔加料比为1:10，并且质量加料比为0.96:1。对P10的NMR所得的摩尔比为1:9.9。因此，对于方案5的P10，m＝20，q＝1，n'＝0.1，k＝10以及j＝43。
使用TMC的修饰
根据方案6使用实施例12的一般程序，用TMC修饰bPEI-2，从而产生支化聚胺P11和P14。反应时间为1小时。将聚合物在无水乙醚中沉淀并且通过旋转蒸发来干燥。
方案6
实施例23.对于P11的制备，bPEI-2:TMC的摩尔加料比为1:1。对P11的NMR所得的摩尔比为1:1.2。因此，对于方案6的P11，m＝20，q＝1，n'＝8.8，k＝10以及j＝43。
实施例24.对于P14的制备，bPEI-2:TMC的摩尔加料比为1:4，并且质量加料比为4.4:1。对P14的NMR所得的摩尔比为1:4.1。因此，对于方案6的P14，m＝20，q＝4.1，n'＝5.9，k＝10以及j＝43。
使用BCF的修饰
根据方案7使用实施例12的一般程序，用TMC修饰bPEI-2，从而产生支化聚胺P12。反应时间为1小时。
方案7
实施例25(比较)对于P12的制备，bPEI-2:BCF的摩尔加料比为1:1。对P12的NMR所得的摩尔比为1:0.9。因此，对于方案7的P12，m＝20，q＝0.9，n'＝9.1，k＝10以及j＝43。
表4总结了聚合物的制备。
表4
表5总结了修饰的bPEI聚合物的NMR分析。
表5
a基于1摩尔bPEI-2＝1800g以及每摩尔10个伯胺基团。
b大于100％的值表示在所有活性伯胺位点反应，以及仲胺基团的反应和/或环状碳酸酯单体的开环聚合。
c在实施例31-37中大于10的数值表示在所有活性伯胺位点反应，以及仲胺基团反应和/或环状碳酸酯单体开环聚合。
III.与生物活性材料的复合
细胞培养
将HepG2和SK-OV-3细胞在伊格尔最低必需培养基(Minimum Essential MediumEagle，MEM，Invitrogen，新加坡，用于HepG2)以及RPMI 1640培养基(Invitrogen，新加坡，用于SK-OV-3)中培养。将两种培养基用10％胎牛血清(FBS，Invitrogen，新加坡)、100微克/mL链霉素、100U/mL青霉素、2mM L-谷氨酰胺以及1mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich，新加坡)补充。将MEM进一步用1mM非必需氨基酸(Sigma-Aldrich，新加坡)补充。将细胞在37℃于5％CO2和95％潮湿空气的气氛下培养。当达到90％融合时，将所有细胞系用胰蛋白酶/EDTA培养基分裂。
DNA复合物的形成
将修饰的bPEI-2聚合物分别溶于不含脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶的水和HPLC水中以制得聚合物水溶液。为了形成复合物，在温和地涡旋中，在10秒内，将DNA(GFP报告基因或荧光素酶报告基因)的等体积溶液滴入聚合物溶液中，以获得预期的N/P比(聚合物中的氮含量与核酸的磷含量的摩尔比)。在用于后续研究之前，将混合物在室温下平衡30分钟以允许完成聚合物与DNA分子之间的静电相互作用。相似地制备未修饰的bPEI-2和未修饰的bPEI-25的对照复合物。
DNA复合物的粒径和ζ电势分析
通过使用658nm的He-Ne激光束和90°散射角的动态光散射(BrookhavenInstrument Corp.，Holtsville，纽约，美国)以及Zetasizer(Malvern Instrument Ltd.，伍斯特郡，英国)分别测量平衡后的聚合物/DNA复合物的粒径和ζ电势。对每个样品重复3次粒径和ζ电势测量，并且将3组读数记作平均值±标准偏差。
表6列出不同N/P比的一些修饰的bPEI-2聚合物的动态半径。
表6
b大于100的百分数表示所有活性伯胺位点反应，以及仲胺基团反应和/或环状碳酸酯单体开环聚合。
尺寸通常为20nm至200nm的聚合纳米颗粒大到足以避免经由肾脏中肾小球过滤的过早排出，但是小到足以进入血管以及利用增强的渗透和滞留(EPR)效应而在目标肿瘤组织中被动累积。如从图1可以看出，修饰的bPEI-2聚合物的荧光素酶报告基因复合物具有约100nm的平均粒径，而以N/P 40制备的未修饰的bPEI-2的荧光素酶报告基因复合物具有约3000nm的粒径。
bPEI-2的疏水修饰与未修饰的bPEI-2对照复合物相比产生ζ电势的显著增加(图2)。不受理论限制，这可以有助于纳米颗粒与带负电的细胞膜的相互作用，由此增强内吞和转染。
凝胶阻滞试验
聚合物/荧光素酶报告基因复合物的多种制剂如上所述那样并以1比10或1比15的N/P比制备。平衡之后，将衍生自bPEI-2的复合物电穿孔在0.7％琼脂糖凝胶上，并且将与bPEI-25形成的复合物电穿孔在1％琼脂糖凝胶上。将琼脂糖凝胶用每50mL琼脂糖溶液5微升10mg/mL溴化乙锭染色。将凝胶在0.5×TBE缓冲液中在80V下运行50分钟，随后在UV照明器(Chemi Genius，Evolve，新加坡)下分析以揭示复合DNA与裸DNA质粒的相对位置。
聚合物P1至P7(分别为图5至11)能够在N/P3下与未修饰的bPEI-2(图3)和未修饰的bPEI-25(图4)一样有效地压缩DNA。
MTC-C2修饰的bPEI-2的缓冲能力
P7、P8、P9和P10代表bPEI-2的MTC-C2修饰水平系列(分别为10％、20％、40％和100％的伯胺基团修饰)。这些聚合物和未修饰的bPEI-2的缓冲能力在表7中示出。在2至11的pH范围内测定缓冲能力。首先将聚合物(0.1mmol氮原子)溶解在5mL的NaCl溶液(150mM)中。将15mL的0.01HCl加入以将pH降至2，随后使用自动滴定仪(Spectralab Instruments)用0.01M NaOH滴定。缓冲能力定义为在5.1至7.4的pH内质子化的胺基团的百分比，并且用以下等式计算：
缓冲能力(％)＝100×(ΔVNaOH×0.01M)/N mol
其中ΔVNaOH为将pH从5.1增至7.4所需的NaOH(0.01M)的体积，并且N mol为可质子化的胺基团的总摩尔数。
表7
聚合物 缓冲能力(％)
bPEI-2 21.9
P7 21.2
P8 22.4
P9 21.2
P10 20.3
图12为pH作为所加入的NaOH的函数的点图。数据表明MTC-C2取代量的增加导致缓冲能力降低。
图13为比较N/P 0至10的P7、P8、P9、P10以及未修饰的bPEI-2的荧光素酶报告基因结合能力的图，该结合能力测量为自由基因荧光的相对％。尤其在P10(其具有约100％的修饰的伯胺基团)中，MTC-C2取代度的增加产生了更弱的DNA结合效能。
荧光素酶基因表达
使用HepG2和SK-OV-3细胞系研究由修饰的bPEI-2聚合物和荧光素酶报告基因制备的复合物的体外转染效率。将HepG2细胞以8×104个细胞/500微升/孔的密度接种在24孔板上以用于荧光素酶基因递送。将SK-OV-3细胞以8×104个细胞/500微升/孔的密度接种在24孔板上以用于荧光素酶基因递送。24小时之后，将平板培养基用新鲜的生长培养基替换，随后逐滴加入50微升的多种N/P比的含2.5微克荧光素酶质粒DNA的复合物溶液。在4小时孵育之后，将游离复合物通过替换各孔中的培养基而去除。在另外68小时孵育之后，将在个孔中的细胞培养基去除，并且将细胞用0.5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)冲洗一次。对于荧光素酶表达试验，将0.2mL的报告子溶解缓冲液加入各孔中。将在冷冻(-80℃，30分钟)和融化的两次循环后收集的细胞溶解产物通过14000rpm离心5分钟而变得澄清，之后将20微升上清液was与100微升荧光素酶底物混合以使用荧光计(Lumat LB9507，Berthold，德国)来测定相对发光单位(RLU)。针对使用BCA蛋白试验测定的上清液的蛋白浓度来归一化RLU读数，以得到总体荧光素酶表达效率。在所有体外基因表达实验中，裸DNA用作负对照。未修饰的bPEI-2/DNA复合物和未修饰的bPEI-25/DNA复合物用作正对照。这些对照是在最佳N/P比(即对于未修饰的bPEI-2而言N/P为40，对于未修饰的bPEI-25而言N/P为10)下制备的，其引导高基因表达效率且提供接近或高于50％的细胞活力。数据表示为四次重复实验的平均值±标准偏差。
荧光素酶表达结果
图14为比较了10至40N/P的所选的修饰的bPEI-2聚合物的荧光素酶报告基因复合物介导的SK-OV-3细胞中的荧光素酶表达水平的柱状图。比较P7至P10(使用MTC-C2的bPEI-2的伯胺基团的修饰水平为10％、20％、40％和100％)，除了100％(P10)之外，各水平下的修饰的bPEI-2聚合物的荧光素酶表达水平均超过未修饰的bPEI-2对照，其中表达水平比未修饰的bPEI-2对照小2至4个量级。10％修饰水平下的烷基酯链长对表达水平几乎没有影响(比较分别具有乙酯基、辛酯基和十二烷酯基的P7、P1和P2)。使用MTC-C2(乙酯)的修饰水平从10％增加至100％(P7至P10)导致了荧光素酶表达水平在修饰40％以上时迅速降低。向酯链的末端添加苯基脲基团(P3、P4和P5)与非脲对应物(P7、P1和P2)相比增加了荧光素酶表达水平。P3和P4在N/P40下实现了约109.5RLU/mg蛋白的最高表达水平，其比对照未修饰的bPEI-2复合物所获得的表达水平高10倍。10％和40％修饰水平下的MTC-Bn修饰的bPEI-2(分别为P6和P13)也具有高的荧光素酶表达水平。另一方面，10％和40％修饰水平下的TMC修饰的bPEI-2(分别为P11和P14)具有与未修饰的bPEI-2相当或更低的表达水平。10％修饰水平的氯甲酸丁酯(BCF)修饰的bPEI-2(P12)与环状碳酸酯修饰的bPEI-2聚合物相比一般也具有更低的荧光素酶表达水平。
总之，通常使用环状碳酸酯的修饰与使用非环状碳酸酯(即，氯甲酸丁酯)的修饰相比产生更高的表达水平。使用环状碳酸酯，10％至50％、更具体地10％至40％的修饰水平相对于100％修饰水平为有利的。在一些实例中，表达水平超过未修饰的bPEI-2一个量级以上。
在HepG2细胞系中，观察到了相似的趋势(图15)。在该细胞系中，P7、P8、P9、P3和P6为尤其有利的，与未修饰的bPEI-2相比实现了高约1-1.5个量级的荧光素酶表达水平。伯胺基团的高于约40％的MTC-C2修饰水平导致了更低的荧光素酶表达水平。
细胞毒性测试
在SK-OV-3和HepG2细胞上使用标准MTT分析方案来研究聚合物/DNA复合物的细胞毒性。荧光素酶质粒用于复合物形成和两种细胞系的处理。
将HepG2和SK-OV-3细胞以每孔10000个细胞、5000个和16000个细胞的密度分别接种在96孔板上，并且在处理之前使其生长至60％至70％的融合。不同N/P比的聚合物/DNA或聚合物/siRNA复合物是如上述那样在水中制备的。各孔中的细胞随后与生长培养基在37℃下一起孵育4小时，该生长培养基包括10微升聚合物/核酸复合物和100微升新鲜的培养基。孵育之后，用新鲜的生长培养基替换该培养基并且再孵育68小时。随后，将100微升生长培养基和20微升MTT溶液(5mg/mL，在PBS中)加入各孔中，并且将细胞在37℃下孵育4小时。当去除生长培养基时，将各孔中形成的甲躜晶体用150微升DMSO溶解。随后将来自各孔的100微升等份转移至新的96孔板，以使用微板分光光度计测定在550nm和690nm波长下的吸光度。相对细胞活力表示为[(A550-A690)样品/(A550-A690)对照]×100％。数据表示为每个N/P比下至少八次重复实验的平均值±标准偏差。
细胞毒性结果
图16是示出在与N/P比10至40的修饰的bPEI-2聚合物的各种荧光素酶复合物一起孵育之后SK-OV-3细胞的活性的柱状图。还示出了单独的N/P40的未修饰的bPEI-2聚合物的细胞活力。一般而言，在给出的环状碳酸酯系列中，N/P比的增加使各个修饰的bPEI-2聚合物复合物的细胞毒性增加。然而，对于除了P2(使用MTC-C12的10％修饰水平)和P4(使用MTC-PUC8的10％修饰水平)之外的各支化聚胺，SK-OV-3细胞活力保持高于约80％。
图17是示出了与N/P比10至40的修饰的bPEI-2聚合物的各种荧光素酶复合物一起孵育之后HepG2细胞的活性的柱状图。还示出了单独的N/P40的未修饰的bPEI-2聚合物的细胞活力。与上述SK-OV-3细胞相同，在给出的环状碳酸酯系列中，N/P比的增加使各个修饰的bPEI-2聚合物复合物的细胞毒性增加。此处，除了P11(使用TMC的10％修饰水平)之外的各聚合物，在N/P比10至40下，SK-OV-3细胞活力保持高于约80％。
GFP转染效率
使用SK-OV-3细胞和HepG2细胞来研究绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的体外基因转染效率。将SK-OV-3细胞和HepG2细胞以8×104个细胞/500微升/孔的密度接种在24孔板上以用于GFP基因递送。24小时之后，将平板培养基用新鲜的生长培养基替换，随后逐滴加入100微升的多种N/P比的复合物溶液(含有3.5微克GFP质粒DNA)。在4小时孵育之后，通过替换各孔中的培养基来去除游离复合物。在另外68小时孵育之后，将在各孔中的细胞培养基去除，并且将细胞用0.5mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)冲洗一次。
对于GFP蛋白表达分析，将0.3mL胰蛋白酶加入以分离各孔中的细胞。随后加入新鲜的生长培养基(0.3mL)，并且将细胞悬浮液在1500rpm离心5分钟。在FACS缓冲液(用2％牛血清白蛋白补充的PBS)中将再悬浮和离心的细胞-洗涤循环再进行两次。随后使用流式细胞分析仪(FACSCalibur，BD Biosciences，USA)，从10000个事件中测定表达GFP的细胞的百分数，并且结果表示为三次重复试验的均值值±标准偏差。
图18是比较了不同N/P比的修饰的bPEI-2聚合物P3、P6、P7和P9在SK-OV-3细胞中体外GFP基因转染效率的柱状图。对照包括未处理的细胞、单独的GFP基因、未修饰的bPEI-2以及未修饰的bPEI-25。未修饰的bPEI-2在N/P 40下具有约1.7％的峰值效率，而未修饰的bPEI-25在N/P 20下具有约80％的峰值效率。P3和P6在N/P 40下具有约6.2％的峰值效率。
图19是比较了不同N/P比的三种修饰的bPEI-2聚合物P6、P7和P9在HepG细胞中体外GFP基因转染效率的柱状图。对照包括未处理的细胞、单独的GFP基因、未修饰的bPEI-2以及未修饰的bPEI-25。未修饰的bPEI-2，即P6和P7，在N/P 40下具有小于1％的峰值效率，而未修饰的bPEI-25在N/P 20下具有约24％的峰值效率。P9在N/P 40下具有约1.5％的峰值效率。
总结
在一些实例中，bPEI-2的一个伯胺基团的平均修饰足以使SK-OV-3和HepG2细胞中的荧光素酶表达水平增加约十倍，同时保持低细胞毒性。当未修饰的bPEI-2的约10％至约40％的伯胺基团被修饰时，出现修饰的bPEI-2聚合物的高转染效率。修饰的bPEI聚合物的细胞活力大于80％。带着含芳环和/或脲基的侧链酯的环状碳酸酯单体显示出最高的基因表达水平。
修饰的bPEI-2聚合物是稳固(robust)的基因转染剂，能够使用多种修饰基团来递送至各个所测试的细胞类型。转染效率在HepG2和SK-OV-3细胞系中均是明确增加。
值得注意的是，通过仅具有不带电的氨基甲酸酯基团的修饰的bPEI-2聚合物获得了提高的转染效率。修饰的bPEI聚合物无一包含季胺。
修饰的bPEI-2聚合物还可以用作蛋白质和/或药物的递送载体。
本文中所使用的术语是仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明。如本文所使用的，单数形式旨在同时包括复数形式，除非在上下文明确另外指出。还应该理解，术语“包括(comprises)”和/或“包括(comprising)”，当在本说明书中使用时，规定所述特征、整数、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但是不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、要素、组分和/或其组合的存在或添加。当范围用于使用两个数值界限X和Y表示可能的值(例如X ppm至Y ppm的浓度)时，除非另有说明，则该值可以为X、Y或X与Y之间的任何值。
本发明的描述用于例示和描述的目的，但是不旨在以所公开的形式排除或限制本发明。在不背离本发明的范围情况下，许多修改和变体对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施方案是为了最好地解释本发明的原理及其实际应用，以及为了使本领域其他普通技术人员能够理解本发明。

Claims (22)

1.支化聚胺，其包含：
8至12个骨架叔胺基团，18至24个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：
其中：
(n'+q)为等于8至12的数，
通式(2)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接，
L'为包含3至30个碳的二价连接基团，以及
q/(n'+q)×100％等于9％至40％。
2.如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺由n'个伯氮丙啶重复单元、18至24个仲氮丙啶重复单元、8至12个叔氮丙啶重复单元以及q个通式(2)的氨基甲酸酯基团组成。
3.如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺是数均分子量为1600至5000的氨基甲酸酯官能化的支化聚乙烯亚胺。
4.如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺的基因复合物在N/P 10至N/P 50下为非细胞毒性的。
5.如权利要求1所述的支化聚胺，其中L'包含苯基脲部分。
6.如权利要求1所述的支化聚胺，其中q/(n'+q)×100％等于9％至25％。
7.如权利要求1所述的支化聚胺，其中q/(n'+q)×100％等于9％至12％。
8.如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述氨基甲酸酯基团是不带电的。
9.如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺不含季胺基团。
10.支化聚胺，其包含：
8至12个骨架叔胺基团，18至24个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(4)的骨架末端氨基甲酸酯基团：
其中
通式(4)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接，
R1为氢、甲基或乙基，
R2为氢或包含1至27个碳的单价基团，
(n'+q)为等于8至12的数，以及
q/(n'+q)×100％等于9％至40％。
11.如权利要求10所述的支化聚胺，其中R2为酯*-C(＝O)OR3，其中R3包含1至26个碳。
12.方法，其包括：
用环状碳酸酯单体处理包含8至12个伯胺基团、多个仲胺基团和多个叔胺基团的支化第一聚合物而不使所述环状碳酸酯单体聚合，从而形成包含以下的支化聚胺：i)8至12个骨架叔胺基团，ii)18至24个骨架仲胺基团，iii)大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及iv)大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：
其中：
(n'+q)为等于8至12的数，
通式(2)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接，
L'为包含3至30个碳的二价连接基团，以及
q/(n'+q)×100％等于9％至40％。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述环状碳酸酯单体包含一种或多种保护基，并且所述方法还包括从所述支化聚胺选择性地去除所述一种或多种保护基。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述环状碳酸酯为6元环的环状碳酸酯。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述支化第一聚合物为具有由以下组成的骨架的支化聚乙烯亚胺：
25mol％的具有以下结构的伯氮丙啶重复单元
50mol％的具有以下结构的仲氮丙啶重复单元
以及
25mol％的具有以下结构的叔氮丙啶重复单元
其中各星号键表示与所述骨架的另一重复单元的连接点。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述环状碳酸酯单体选自：
及其组合。
17.复合物，其包含：
基因；以及
支化聚胺，其包含8至12个骨架叔胺基团，18至24个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：
其中：
(n'+q)为等于8至12的数，
通式(2)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接，
L'为包含3至30个碳的二价连接基团，以及
q/(n'+q)×100％等于9％至40％。
18.处理细胞的方法，其包括使细胞与权利要求17所述的复合物接触。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞为人类肿瘤细胞。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞为肝癌细胞。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞为卵巢癌细胞。
22.支化聚胺，其具有通式(5)的结构：
其中j、k、m、n'和q表示大于0的摩尔数，j具有35至47的值，k具有8至12的值，m具有18至24的值，(n'+q)具有8至12的值，以及q/(n'+q)×100％具有9％至40％的值，并且各Z'为选自以下的独立部分
及其组合。
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