JP6276274B2 - 生物活性物質の送達のための低分子量分岐ポリアミン - Google Patents
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Description
本発明は、International Business Machines CorporationとAgency For Science, Technology and Researchとの間の共同研究契約の下で行われた。
本発明は、生物活性物質の送達のための低分子量分岐ポリアミン、より具体的には、遺伝子送達のための疎水性カルバメート末端基を含むカルバメート官能化低分子量分岐ポリエチレンイミンに関する。
したがって、約8〜約12個の骨格第3級アミン基、約18〜約24個の骨格第2級アミン基、0を超える正数n'個の骨格終結第1級アミン基、および0を超える正数q個の式(2)
の骨格終結カルバメート基を含む分岐ポリアミンであって、
ここで、
(n'+q)は、約8〜約12に等しい数であり、
式(2)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されており、
L'は、3〜30個の炭素を含む二価連結基であり、かつ
q/(n'+q)×100%は約9%〜約40%に等しい、
前記分岐ポリアミンを開示する。
の骨格終結カルバメート基を含む分岐ポリアミンであって、
ここで、
式(4)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されており、
R1は、水素、メチル、またはエチルであり、
R2は、水素であるか、または1〜27個の炭素を含む一価ラジカルであり、
(n'+q)は、約8〜約12に等しい数であり、かつ
q/(n'+q)×100%は約9%〜約40%に等しい、
前記分岐ポリアミンを開示する。
の骨格終結カルバメート基を含む分岐ポリアミンを形成する工程
を含む方法であって、
ここで、
(n'+q)は、約8〜約12に等しい数であり、
式(2)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されており、
L'は、3〜30個の炭素を含む二価連結基であり、かつ
q/(n'+q)×100%は約9%〜約40%に等しい、
前記方法を開示する。
遺伝子と;
約8〜約12個の骨格第3級アミン基、約18〜約24個の骨格第2級アミン基、0を超える正数n'個の骨格終結第1級アミン基、および0を超える正数q個の式(2)
の骨格終結カルバメート基を含む分岐ポリアミンと
を含む複合体であって、
ここで、
(n'+q)は、約8〜約12に等しい数であり、
式(2)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されており、
L'は、3〜30個の炭素を含む二価連結基であり、かつ
q/(n'+q)×100%は約9%〜約40%に等しい、
前記複合体を開示する。
に記載の構造を有する分岐ポリアミンであって、
ここで、j、k、m、n'およびqは0を超えるモル量を示し、jは約35〜約47の値を有し、kは約8〜約12の値を有し、mは約18〜約24の値を有し、(n'+q)は約8〜約12の値を有し、かつq/(n'+q)×100%は約9%〜約40%の値を有し、かつ各Z'は、
およびそれらの組み合わせからなる群より選択される独立した部分である、
前記分岐ポリアミンを開示する。
約8〜約12個の骨格第3級アミン基、約18〜約24個の骨格第2級アミン基、0を超える正数n'個の骨格終結第1級アミン基、および0を超える正数q個の式(2)
の骨格終結カルバメート基を含む分岐ポリアミンであって、
ここで、
(n'+q)は、約8〜約12に等しい数であり、
式(2)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されており、
L'は、3〜30個の炭素を含む二価連結基であり、かつ
q/(n'+q)×100%は約9%〜約40%に等しい、
前記分岐ポリアミン。
[本発明1002]
n'個の第1級エチレンイミン繰り返し単位、約18〜約24個の第2級エチレンイミン繰り返し単位、約8〜約12個の第3級エチレンイミン繰り返し単位、およびq個の式(2)のカルバメート基から本質的になる、本発明1001の分岐ポリアミン。
[本発明1003]
約1600〜約5000の数平均分子量を有するカルバメート官能化分岐ポリエチレンイミンである、本発明1001の分岐ポリアミン。
[本発明1004]
分岐ポリアミンの遺伝子複合体が、N/P 10〜N/P 50で非細胞毒性である、本発明1001の分岐ポリアミン。
[本発明1005]
L'がフェニル尿素部分を含む、本発明1001の分岐ポリアミン。
[本発明1006]
q/(n'+q)×100%が約9%〜約25%に等しい、本発明1001の分岐ポリアミン。
[本発明1007]
q/(n'+q)×100%が約9%〜約12%に等しい、本発明1001の分岐ポリアミン。
[本発明1008]
カルバメート基が荷電していない、本発明1001の分岐ポリアミン。
[本発明1009]
第4級アミン基を有しない、本発明1001の分岐ポリアミン。
[本発明1010]
約8〜約12個の骨格第3級アミン基、約18〜約24個の骨格第2級アミン基、0を超える正数n'個の骨格終結第1級アミン基、および0を超える正数q個の式(4)
の骨格終結カルバメート基を含む分岐ポリアミンであって、
ここで、
式(4)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されており、
R 1 は、水素、メチル、またはエチルであり、
R 2 は、水素であるか、または1〜27個の炭素を含む一価ラジカルであり、
(n'+q)は、約8〜約12に等しい数であり、かつ
q/(n'+q)×100%は約9%〜約40%に等しい、
前記分岐ポリアミン。
[本発明1011]
R 2 がエステル * -C(=O)OR 3 であり、ここで、R 3 が1〜26個の炭素を含む、本発明1010の分岐ポリアミン。
[本発明1012]
約8〜約12個の第1級アミン基、複数の第2級アミン基、および複数の第3級アミン基を含む分岐第1ポリマーを、環状カーボネートモノマーで、該環状カーボネートモノマーを重合させることなく処理し、それによって、i)約8〜約12個の骨格第3級アミン基、ii)約18〜約24個の骨格第2級アミン基、iii)0を超える正数n'個の骨格終結第1級アミン基、およびiv)0を超える正数q個の式(2)
の骨格終結カルバメート基を含む分岐ポリアミンを形成する工程
を含む方法であって、
ここで、
(n'+q)は、約8〜約12に等しい数であり、
式(2)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されており、
L'は、3〜30個の炭素を含む二価連結基であり、かつ
q/(n'+q)×100%は約9%〜約40%に等しい、
前記方法。
[本発明1013]
環状カーボネートモノマーが1つまたは複数の保護基を含み、かつ方法が、分岐ポリアミンから該1つまたは複数の保護基を選択的に除去する工程をさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
環状カーボネートが6員環環状カーボネートである、本発明1012の方法。
[本発明1015]
分岐第1ポリマーが、
約25 mol%の、構造
を有する第1級エチレンイミン繰り返し単位、
約50 mol%の、構造
を有する第2級エチレンイミン繰り返し単位、および
約25 mol%の、構造
を有する第3級エチレンイミン繰り返し単位
から本質的になる骨格を有する分岐ポリエチレンイミンであり、
ここで、星印の付いた各結合は、骨格の別の繰り返し単位への結合点を示す、
本発明1012の方法。
[本発明1016]
環状カーボネートモノマーが、
およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1012の方法。
[本発明1017]
遺伝子と;
約8〜約12個の骨格第3級アミン基、約18〜約24個の骨格第2級アミン基、0を超える正数n'個の骨格終結第1級アミン基、および0を超える正数q個の式(2)
の骨格終結カルバメート基を含む分岐ポリアミンと
を含む複合体であって、
ここで、
(n'+q)は、約8〜約12に等しい数であり、
式(2)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されており、
L'は、3〜30個の炭素を含む二価連結基であり、かつ
q/(n'+q)×100%は約9%〜約40%に等しい、
前記複合体。
[本発明1018]
細胞を本発明1017の複合体と接触させる工程を含む、細胞を処理する方法。
[本発明1019]
細胞がヒト腫瘍細胞である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
細胞が癌性肝細胞である、本発明1018の方法。
[本発明1021]
細胞が癌性卵巣細胞である、本発明1018の方法。
[本発明1022]
式(5)
に記載の構造を有する分岐ポリアミンであって、
ここで、j、k、m、n'およびqは0を超えるモル量を示し、jは約35〜約47の値を有し、kは約8〜約12の値を有し、mは約18〜約24の値を有し、(n'+q)は約8〜約12の値を有し、かつq/(n'+q)×100%は約9%〜約40%の値を有し、かつ各Z'は、
およびそれらの組み合わせからなる群より選択される独立した部分である、
前記分岐ポリアミン。
本発明の上述および他の特徴および利点は、下記の詳細な説明、図面、および添付の特許請求の範囲から当業者によって認識および理解されるであろう。
遺伝子、タンパク質および/または薬物を含む生物活性物質の送達のための低分子量分岐ポリアミンを開示する。分岐ポリアミンは、1つまたは複数の疎水性環状カーボネート化合物と、約8〜約12個の第1級アミン基、複数の第2級アミン基、および複数の第3級アミン基を含む分岐ポリエチレンイミン(bPEI)とを反応させることによって好ましくは調製される。明確にするために、環状カーボネートモノマーとのカルバメート形成反応のための分岐ポリエチレンイミン出発材料を、以下の説明において非修飾分岐ポリエチレンイミン(「非修飾bPEI」)と称する。反応の生成物は、修飾分岐ポリエチレンイミン(「修飾bPEI」)と称するカルバメート官能化bPEIポリマーである。非修飾bPEIは、約1500〜約2000の数平均分子量(Mn)および約1800〜約4000の重量平均分子量(Mw)を有し得る。より具体的な分岐ポリアミンは、bPEI-2(「非修飾bPEI-2」と称する)を環状カーボネート化合物で処理することによって形成される。カルバメート官能化bPEI-2ポリマーである、得られる分岐ポリアミンは、「修飾bPEI-2」ポリマーと称する。分岐ポリエチレンイミン以外の分岐アミン含有ポリマーが、カルバメート形成反応のために潜在的に使用され得ることが、理解されるべきである(例えば、約8〜約12個の第1級アミン基、複数の第2級アミン基、および複数の第3級アミン基を有する樹枝状アミンポリマー)。
の第1級エチレンイミン繰り返し単位、
約18〜約24個の、構造
の第2級エチレンイミン繰り返し単位、および
約8〜約12個の、構造
の第3級エチレンイミン繰り返し単位から本質的になる構造を有し、存在し得る前述の繰り返し単位のいかなるヒドロ塩(hydrosalt)も除く。上記の繰り返し単位中の星印の付いた各結合は、非修飾bPEIの別の繰り返し単位への結合点を示す。
によって示され、
ここで、j、k、m、およびnは、非修飾bPEI構造のそれぞれの独立した官能基のモルを示し、jは約35〜約47の値を有し、kは約8〜約12の値を有し、mは約18〜約24の値を有し、nは約8〜約20の値を有する。式(1)の表記法によって、角括弧[]の内側で始まり角括弧の外側で終わる、丸括弧()の各セットは、ポリマー鎖ではなく、非修飾bPEIの独立した官能基を囲んでいることが理解されるべきである。下付き文字k、m、n、およびjは、非修飾bPEI構造のそれぞれの独立した官能基の各々のモル量を示す。星印の付いた結合は、角括弧の反対側の星印の付いた結合への結合点を示す。したがって、角括弧の右側の各窒素は、角括弧の左側のエチレン基の炭素へ結合されている。
の骨格終結カルバメート基を含有し、
ここで、式(2)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されており、q/(n'+q)×100%は、約9%〜約40%に等しく、(n'+q)は、約8〜約12に等しい数であり、かつL'は、3〜30個の炭素を含む二価連結基である。ある態様において、L'は非荷電基である。別の態様において、修飾bPEIは第4級アミン基を含まない。
i)0を超える正数n'個の、構造
の骨格終結第1級エチレンイミン繰り返し単位、
ii)約18〜約24個の、構造
の骨格第2級エチレンイミン繰り返し単位、
iii)約8〜約12個の、構造
の骨格第3級エチレンイミン繰り返し単位、および
iv)0を超える正数q個の、式(2)
の骨格終結カルバメート末端基、
ここで、上記の構造中の星印の付いた結合の各々は、分岐ポリアミンの別の繰り返し単位への結合点を示し、q/(n'+q)×100%は約9%〜約40%に等しく、(n'+q)は約8〜約12に等しい数であり、かつL'は、3〜30個の炭素を含む二価連結基である。式(2)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されている。ある態様において、分岐ポリアミンは、第1級エチレンイミン繰り返し単位、第2級エチレンイミン繰り返し単位、第3級エチレンイミン繰り返し単位、およびカルバメート末端基から本質的になる。別の態様において、分岐ポリアミンは、カルバメート官能化bPEI-2(即ち、修飾bPEI-2ポリマー)である。別の態様において、L'は非荷電基である。別の態様において、分岐ポリアミンは第4級アミン基を含まない。
によって示すことができ、
ここで、j、k、m、n'およびqは、式(3)中の丸括弧内に囲まれた独立した官能基の各々の0を超えるモルを示し、jは約35〜約47の値を有し、kは約8〜約12の値を有し、mは約18〜約24の値を有し、(n'+q)は約8〜約12の値を有し、表現(n'+q)/q×100%は約9%〜約40%の値を有する。角括弧および丸括弧を使用する表記法は、式(1)について上述したものと同一の意味を有する。L'は、3〜30個の炭素を含む二価連結基である。
の骨格終結カルバメート基を含む。
式(4)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されており、R1は、水素、メチル、またはエチルであり、かつR2は、水素であるか、または1〜27個の炭素を含む基であり、(n'+q)は約8〜約12の値を有し、かつq/(n'+q)×100%は約9%〜約40%の値を有する。ある態様において、R2はエステル*-C(=O)OR3であり、ここで、R3は1〜26個の炭素を含む。
i)0を超える正数n'個の、構造
の骨格終結第1級エチレンイミン繰り返し単位、
ii)約18〜約24個の、構造
の骨格第2級エチレンイミン繰り返し単位、
iii)約8〜約12個の、構造
の骨格第3級エチレンイミン繰り返し単位、および
iv)0を超える正数q個の、式(4)
の骨格終結カルバメート末端基、
ここで、星印の付いた結合の各々は、分岐ポリアミンの別の繰り返し単位へ連結されており、R1は、水素、メチル、またはエチルであり、かつR2は、水素であるか、または1〜27個の炭素を含む基であり、(n'+q)は約45〜約70の値を有し、かつq/(n'+q)×100%は、約9%〜約40%の値を有する。ある態様において、分岐ポリアミンは、第1級エチレンイミン繰り返し単位、第2級エチレンイミン繰り返し単位、第3級エチレンイミン繰り返し単位、およびカルバメート末端基から本質的になる。別の態様において、分岐ポリアミンはカルバメート官能化bPEI-2である。
に記載の構造を有し、
ここで、j、k、m、n'およびqは0を超えるモル量を示し、jは約35〜約47の値を有する数であり、kは約8〜約12の値を有する数であり、mは約18〜約24の値を有する数であり、(n'+q)は約8〜約12の値を有し、表現(n'+q)/q×100%は約9%〜約40%の値を有し、かつ各Z'は、
およびそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される部分である。
MTC-PUC2(MW 322.3)の合成
1)エタノールアミン(5.0 g, 48.5 mmol, 1 eq)を、撹拌子を備えた乾燥100 mL丸底フラスコ中に置き、乾燥THF (30 mL)を添加した。得られた溶液を氷浴によって0℃まで冷却した。フェニルイソシアネート(5.19 g, 4.74 mL, 43.6 mmol, 0.9当量)および乾燥THF 30 mLを、30分間にわたって滴下漏斗によってエタノールアミン/THF混合物へ滴下した。得られた混合物を周囲温度に加温されるまで置き、さらに16時間撹拌下に置いた。回転蒸発を使用してTHFを除去した。得られた粗生成物を酢酸エチルから再結晶させ、その後、さらに4時間激しく撹拌した。再結晶した固体を濾過によって単離し、酢酸エチルでさらに洗浄し、恒量に達するまで乾燥させ、中間体フェニル尿素エタノール(スキーム1においてn=2)7.0 g(約80%)を得た。
bPEI-2は、1モル= 1800 (Mn)に基づいて、1モル当たり第1級アミン基10個、第2級アミン基20個および第3級アミン基10個を有する。スキーム2に従って、異なる鎖長の疎水性エステル基を有する環状カーボネートモノマーで、bPEI-2を修飾した。
MTC-C8を使用してP1を形成するための手順を示す。グローブボックス中において、MTC-C8 (0.0408 g, 0.15 mmol, MW = 272 g)を、DCM 2 mL中のbPEI-2(0.270 g、1モル = 1800 g = Mnに基づいて0.15 mmol)の溶液へ添加した。bPEI-2:MTC-C8モル供給比は1:1であり、質量供給比は6.6:1であった。反応溶液を1時間撹拌した。ポリマーを無水エーテル中に沈殿させ、回転蒸発によって乾燥させた。ポリマーP1についてのNMRによって判明したモル比は1:1であった。したがって、スキーム2のポリマーP1について、m = 20、q = 1、n' = 9、k = 10、およびj = 43。
実施例12の一般的手順に従って、MTC-C12を用いてポリマーP2を調製した。bPEI-2:MTC-C12モル供給比は1:1であり、質量供給比は5.5:1であった。ポリマーP2についてのNMRによって判明したモル比は1:0.86であった。したがって、スキーム2のポリマーP2について、m = 20、q = 0.86、n' = 9.14、k = 10、およびj = 43。
実施例12の一般的手順を使用して、スキーム3に従って、異なる鎖長の疎水性尿素含有エステル基を有する環状カーボネートモノマーで、bPEI-2を修飾し、分岐ポリアミンP3〜P5を作製した。反応時間は1時間であった。ポリマーを無水エーテル中に沈殿させ、回転蒸発によって乾燥させた。
ポリマーP3について、bPEI-2:MTC-PUC2モル供給比は1:1であり、質量供給比は5.6:1であった。ポリマーP3についてのNMRによって判明したモル比は1:0.9であった。したがって、スキーム3のポリマーP3について、m = 20、q =0.9、n' = 9.1、k = 10、およびj = 43。
ポリマーP4について、bPEI-2:MTC-PUC8モル供給比は1:1であり、質量供給比は4.4:1であった。ポリマーP4についてのNMRによって判明したモル比は1:0.9であった。したがって、スキーム3のポリマーP4について、m = 20、q = 0.9、n' = 9.1、k = 10、およびj = 43。
ポリマーP5について、bPEI-2:MTC-PUC12モル供給比は1:1であり、質量供給比は3.9:1であった。ポリマーP5についてのNMRによって判明したモル比は1:1.1であった。したがって、スキーム3のポリマーP5について、m = 20、q = 1.1、n' = 8.9、k = 10、およびj = 43。
実施例12の一般的手順を使用してスキーム4に従ってMTC-Bn (MW 250)でbPEI-2を修飾し、分岐ポリアミンP6およびP13を作製した。反応時間は1時間であった。ポリマーを無水エーテル中に沈殿させ、回転蒸発によって乾燥させた。
P6の調製について、bPEI-2:MTC-Bnモル供給比は1:1であり、質量供給比は7.2:1であった。P6についてのNMRによって判明したbPEI-2:MTC-Bnモル比は1:1.1であった。したがって、P6についてスキーム4において、m = 20、q = 1.1、n' = 8.9、k = 10、およびj = 43。
P13の調製について、bPEI-2:MTC-Bnモル供給比は1:4であり、質量供給比は1.8:1であった。P13について、NMRによって判明したbPEI-2:MTC-Bnモル比は1:4.7であった。したがって、P13についてスキーム4において、m = 20、q = 4.7、n' = 5.3、k = 10、およびj = 43。
実施例12の一般的手順を使用してスキーム5に従ってMTC-C2でbPEI-2を修飾し、分岐ポリアミンP7〜P10を作製した。反応時間は1時間であった。ポリマーを無水エーテル中に沈殿させ、回転蒸発によって乾燥させた。
P7の調製について、bPEI-2:MTC-C2モル供給比は1:1であり、質量供給比は9.6:1であった。P7についてのNMRによって判明したモル比は1:1であった。したがって、P7についてスキーム5において、m = 20、q = 1、n' = 9、k = 10、およびj = 43。
P8の調製について、bPEI-2:MTC-C2モル供給比は1:2であり、質量供給比は4.8:1であった。P8についてのNMRによって判明したモル比は1:1.8であった。したがって、ポリマーP8についてスキーム5において、m = 20、q = 1、n' = 8.2、k = 10、およびj = 43。
P9の調製について、bPEI-2:MTC-C2モル供給比は1:4であり、質量供給比は2.8:1であった。P9についてのNMRによって判明したモル比は1:4.1であった。したがって、P9についてスキーム5において、m = 20、q = 1、n' = 5.9、k = 10、およびj = 43。
P10の調製について、bPEI-2:MTC-C2モル供給比は1:10であり、質量供給比は0.96:1であった。ポリマーP10についてのNMRによって判明したモル比は1:9.9であった。したがって、ポリマーP10についてスキーム5において、m = 20、q = 1、n' = 0.1、k = 10、およびj = 43。
実施例12の一般的手順を使用してスキーム6に従ってTMCでbPEI-2を修飾し、分岐ポリアミンP11およびP14を作製した。反応時間は1時間であった。ポリマーを無水エーテル中に沈殿させ、回転蒸発によって乾燥させた。
P11の調製について、bPEI-2:TMCモル供給比は1:1であった。P11についてのNMRによって判明したモル比は1:1.2であった。したがって、P11についてスキーム6において、m = 20、q = 1、n' = 8.8、k = 10、およびj = 43。
P14の調製について、bPEI-2:TMCモル供給比は1:4であり、質量供給比は4.4:1であった。ポリマーP14についてのNMRによって判明したモル比は1:4.1であった。したがって、P14についてスキーム6において、m = 20、q = 4.1、n' = 5.9、k = 10、およびj = 43。
実施例12の一般的手順を使用してスキーム7に従ってクロロギ酸ブチル(BCF)でbPEI-2を修飾し、分岐ポリアミンP12を作製した。反応時間は1時間であった。
P12の調製について、bPEI-2:BCFモル供給比は1:1であった。ポリマーP12についてのNMRによって判明したモル比は1:0.9であった。したがって、ポリマーP12についてスキーム7において、m = 20、q = 0.9、n' = 9.1、k = 10、およびj = 43。
b 100%を超える値は、全ての活性第1級アミン部位での反応、ならびに第2級アミン基の反応および/または環状カーボネートモノマーの開環重合を示す。
c 実施例31〜37における10を超える数は、全ての活性第1級アミン部位での反応、ならびに第2級アミン基の反応および/または環状カーボネートモノマーの開環重合を示す。
細胞培養
HepG2およびSK-OV-3細胞をイーグル最小必須培地(MEM、Invitrogen, Singapore;HepG2について)およびRPMI 1640培地(Invitrogen, Singapore;SK-OV-3について)において培養した。両方の培地に、10%ウシ胎仔血清(FBS、Invitrogen, Singapore)、ストレプトマイシン100マイクログラム/mL、ペニシリン100 U/mL、L-グルタミン2 mM、および1 mMピルビン酸ナトリウム(Sigma-Aldrich, Singapore)を補った。MEMに1 mM非必須アミノ酸(Sigma-Aldrich, Singapore)をさらに補った。細胞を5% CO2および95%加湿空気の雰囲気下にて37℃で培養した。90%コンフルエンスに達したら、トリプシン/EDTA媒体を使用して、全ての細胞株を分離した。
修飾bPEI-2ポリマーをDNase/RNaseフリー水およびHPLC水にそれぞれ溶解し、ポリマー水溶液を作った。複合体を形成するために、DNA(GFPレポーター遺伝子またはルシフェラーゼレポーター遺伝子)の等体積の溶液を、ポリマー溶液中へ滴として落とし、約10秒間のボルテックスによる緩やかな撹拌下で、意図したN/P比(ポリマー中の窒素含有量 対 核酸のリン含有量 のモル比)を達成した。混合物を30分間室温で平衡化し、ポリマーおよびDNA分子間の完全な静電的相互作用を可能にし、その後、続いての研究のために使用した。非修飾bPEI-2および非修飾bPEI-25の対照複合体を同様に調製した。
平衡化後のポリマー/DNA複合体の粒子サイズおよびゼータ電位を、散乱角90°にて、658 nmでHe-Neレーザービームを使用する動的光散乱(Brookhaven Instrument Corp., Holtsville, New York, U.S.A.)およびZetasizer (Malvern Instrument Ltd., Worcestershire, UK)によってそれぞれ測定した。粒子サイズおよびゼータ電位測定を、1サンプルにつき3回繰り返し、3リーディングの平均値±標準偏差として報告した。
ポリマー/ルシフェラーゼレポーター遺伝子複合体の様々な調合物を、1〜10または1〜15の範囲内のN/P比で、上述したように調製した。平衡化後、bPEI-2に由来する複合体を0.7%アガロースゲル上で電気泳動させ(electroporate)、bPEI-25で形成された複合体を1%アガロースゲル上で電気泳動させた。アガロースゲルを、アガロース溶液50 mL当たり10 mg/mL臭化エチジウム5マイクロリットルで染色した。ゲルを50分間80 Vで0.5×TBEバッファー中において電気泳動にかけ、次いで、UVイルミネーター(Chemi Genius, Evolve, Singapore)下で分析し、裸のDNAプラスミドに対する複合体化DNAの相対位置を明らかにした。
P7、P8、P9、およびP10は、bPEI-2のMTC-C2修飾レベルシリーズを表す(それぞれ、第1級アミン基の10%、20%、40%および100%修飾)。これらのポリマーおよび非修飾bPEI-2の緩衝能を表7に示す。緩衝能を2〜11のpH範囲にわたって測定した。先ず、ポリマー(窒素原子0.1 mmol)をNaCl溶液(150 mM) 5 mL中に溶解した。0.01 HCl 15 mLを添加し、pHを2まで下げ、次いで、自動滴定装置(Spectralab Instruments)を使用して、溶液を0.01 M NaOHに対して滴定した。緩衝能を、5.1〜7.4のpHにわたってプロトン化されたアミン基のパーセンテージと定義し、以下の式によって計算する:
緩衝能(%) = 100×(ΔVNaOH×0.01 M)/N mol
式中、ΔVNaOHは、pHを5.1から7.4へ増加させるために必要なNaOH (0.01 M)の体積であり、N molは、プロトン化可能なアミンの総モルである。
修飾bPEI-2ポリマーとルシフェラーゼレポーター遺伝子とを用いて調製した複合体のインビトロトランスフェクション効率を、HepG2およびSK-OV-3細胞株を使用して調べた。HepG2細胞を、ルシフェラーゼ遺伝子送達のために8×104細胞/500マイクロリットル/ウェルの密度で24ウェルプレート上へ播種した。SK-OV-3細胞を、ルシフェラーゼ遺伝子送達のために8×104細胞/500マイクロリットル/ウェルの密度で24ウェルプレート上へ播種した。24時間後、プレーティング培地を新鮮な増殖培地で置き換え、続いて、様々なN/P比でルシフェラーゼプラスミドDNA 2.5マイクログラムを含有する複合体溶液50マイクロリットルを滴下した。4時間のインキュベーション後、各ウェル中の培地を置き換えることによって、遊離複合体を除去した。さらに68時間インキュベーションをした後、各ウェル中の細胞培養培地を除去し、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS、pH 7.4)0.5 mLで1回リンスした。ルシフェラーゼ発現アッセイのために、レポーター溶解バッファー0.2 mLを各ウェルへ添加した。凍結(-80℃、30分間)および解凍の2サイクル後に集めた細胞溶解物を、14000 rpmでの5分間の遠心分離によって清澄化し、その後、ルミノメーター(Lumat LB9507, Berthold, Germany)を使用しての相対的光単位(RLU)の測定のために、上清20マイクロリットルをルシフェラーゼ基質100マイクロリットルと混合した。RLUリーディングを、BCAタンパク質アッセイを使用して測定した上清のタンパク質濃度に対して正規化し、全体的なルシフェラーゼ発現効率を得た。全てのインビトロ遺伝子発現実験において、裸のDNAを陰性対照として使用した。非修飾bPEI-2/DNA複合体および非修飾bPEI-25/DNA複合体を陽性対照として使用した。これらの対照を最適なN/P比(即ち、非修飾bPEI-2についてはN/P 40、非修飾bPEI-25についてはN/P 10)で調製し、これらは、高い遺伝子発現効率を誘導したが、50%に近いかまたは50%を超える細胞生存度を提供した。データを、4回反復の平均値±標準偏差として表した。
図14は、N/P 10〜40での、選択した修飾bPEI-2ポリマーのルシフェラーゼレポーター遺伝子複合体によって媒介されたSK-OV-3細胞におけるルシフェラーゼ発現レベルを比較する棒グラフである。P7〜P10(MTC-C2を使用してのbPEI-2の第1級アミン基の10%、20%、40%および100%の修飾レベル)を比較すると、修飾bPEI-2ポリマーのルシフェラーゼ発現レベルは、100%(P10)以外の各レベルで非修飾bPEI-2対照のそれを超え、100%(P10)では、発現レベルは、非修飾bPEI-2対照よりも2〜4桁低かった。修飾レベル10%ではアルキルエステルの鎖長は、発現レベルに対してほとんど影響を有しなかった(エチル、オクチル、およびドデシルエステル基をそれぞれ有する、P7、P1、およびP2を比較)。MTC-C2(エチルエステル)を使用する修飾レベルを10%から100%(P7からP10)へと増加させると、40%を超える修飾で、ルシフェラーゼ発現レベルの急激な減少が生じた。エステル鎖の末端へのフェニル尿素基の付加(P3、P4およびP5)は、非尿素相当物(P7、P1およびP2)と比較してルシフェラーゼ発現レベルを高めた。P3およびP4は、N/P 40で約109.5 RLU/mgタンパク質の最高発現レベルを達成し、これは、対照である非修飾bPEI-2複合体について得られた発現レベルよりも約10倍高い。10%および40%修飾レベルでのMTC-Bn修飾bPEI-2(それぞれ、P6およびP13)も高いルシフェラーゼ発現レベルを有した。他方で、10%および40%修飾レベルでのTMC修飾bPEI-2(それぞれ、P11およびP14)は、非修飾bPEI-2と匹敵するかまたは非修飾bPEI-2よりも低い発現レベルを有した。10%修飾レベルでのクロロギ酸ブチル(BCF)修飾bPEI-2(P12)も、環状カーボネート修飾bPEI-2ポリマーと比較して一般的により低いルシフェラーゼ発現レベルを有した。
SK-OV-3およびHepG2細胞に対して標準MTTアッセイプロトコルを使用して、ポリマー/DNA複合体の細胞毒性を研究した。ルシフェラーゼプラスミドを複合体の形成および両細胞株の処理のために使用した。
図16は、N/P比10〜40での修飾bPEI-2ポリマーの様々なルシフェラーゼレポーター遺伝子複合体とのインキュベーション後のSK-OV-3細胞の生存度を示す棒グラフである。N/P 40での非修飾bPEI-2ポリマーのみについての細胞生存度も示す。一般に、所定の環状カーボネートシリーズ内で、N/P比が増加すると、各修飾bPEI-2ポリマー複合体の細胞毒性は増加した。それにもかかわらず、SK-OV-3細胞生存度は、P2(MTC-C12を使用する10%修飾レベル)およびP4(MTC-PUC8を使用する10%修飾レベル)以外は、各分岐ポリアミンについて約80%超のままであった。
緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子のインビトロ遺伝子トランスフェクション効率を、SK-OV-3細胞およびHepG2細胞を使用して調べた。SK-OV-3細胞およびHepG2細胞を、GFP遺伝子送達のために8×104細胞/500マイクロリットル/ウェルの密度で24ウェルプレート上へ播種した。24時間後、プレーティング培地を新鮮な増殖培地で置き換え、続いて、様々なN/P比での複合体溶液100マイクロリットル(GFPプラスミドDNA 3.5マイクログラムを含有する)を滴下した。4時間のインキュベーション後、各ウェル中の培地を置き換えることによって、遊離複合体を除去した。さらに68時間インキュベーションをした後、各ウェル中の細胞培養培地を除去し、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS、pH 7.4)0.5 mLで1回リンスした。
場合によっては、bPEI-2の1つの第1級アミン基の平均修飾が、低い細胞毒性を維持しながら、SK-OV-3およびHepG2細胞においてルシフェラーゼ発現レベルを約10倍増加させるために十分であった。修飾bPEI-2ポリマーの高いトランスフェクション効率は、非修飾bPEI-2の第1級アミン基のうち約10%〜約40%が修飾された場合に生じた。修飾bPEIポリマーの細胞生存度は80%よりも大きかった。芳香環および/または尿素基を有するペンダントエステルを有する環状カーボネートモノマーは、最も高い遺伝子発現レベルを示した。
Claims (22)
- n'個の第1級エチレンイミン繰り返し単位、約18〜約24個の第2級エチレンイミン繰り返し単位、約8〜約12個の第3級エチレンイミン繰り返し単位、およびq個の式(2)のカルバメート基から本質的になる、請求項1に記載の分岐ポリアミン。
- カルバメート官能化分岐ポリエチレンイミンである、請求項1に記載の分岐ポリアミン。
- 分岐ポリアミンの遺伝子複合体が、N/P 10〜N/P 50で非細胞毒性である、請求項1に記載の分岐ポリアミン。
- L'がフェニル尿素部分を含む、請求項1に記載の分岐ポリアミン。
- q/(n'+q)×100%が約9%〜約25%に等しい、請求項1に記載の分岐ポリアミン。
- q/(n'+q)×100%が約9%〜約12%に等しい、請求項1に記載の分岐ポリアミン。
- カルバメート基が荷電していない、請求項1に記載の分岐ポリアミン。
- 第4級アミン基を有しない、請求項1に記載の分岐ポリアミン。
- 約8〜約12個の骨格第3級アミン基、約18〜約24個の骨格第2級アミン基、0を超える正数n'個の骨格終結第1級アミン基、および0を超える正数q個の式(4)
の骨格終結カルバメート基を含む分岐ポリアミンであって、
ここで、
式(4)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されており、
R1は、水素、メチル、またはエチルであり、
R2は、水素であるか、または1〜27個の炭素を含む一価ラジカルであり、
(n'+q)は、約8〜約12に等しい数であり、
q/(n'+q)×100%は約9%〜約40%に等しく、
前記分岐ポリアミンは、約1600〜約5000の数平均分子量を有する、
前記分岐ポリアミン。 - R2がエステル*-C(=O)OR3であり、ここで、R3が1〜26個の炭素を含む、請求項10に記載の分岐ポリアミン。
- 約8〜約12個の第1級アミン基、複数の第2級アミン基、および複数の第3級アミン基を含む分岐第1ポリマーを、環状カーボネートモノマーで、該環状カーボネートモノマーを重合させることなく処理し、それによって、i)約8〜約12個の骨格第3級アミン基、ii)約18〜約24個の骨格第2級アミン基、iii)0を超える正数n'個の骨格終結第1級アミン基、およびiv)0を超える正数q個の式(2)
の骨格終結カルバメート基を含む分岐ポリアミンを形成する工程
を含む方法であって、
ここで、
(n'+q)は、約8〜約12に等しい数であり、
式(2)の星印の付いた結合は、分岐ポリアミンの骨格窒素へ連結されており、
L'は、3〜30個の炭素を含む二価連結基であり、
q/(n'+q)×100%は約9%〜約40%に等しく、
前記分岐ポリアミンは、約1600〜約5000の数平均分子量を有する、前記方法。 - 環状カーボネートモノマーが1つまたは複数の保護基を含み、かつ方法が、分岐ポリアミンから該1つまたは複数の保護基を選択的に除去する工程をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 環状カーボネートが6員環環状カーボネートである、請求項12に記載の方法。
- 細胞を請求項17に記載の複合体と接触させる工程を含む、細胞を処理する方法。
- 細胞がヒト腫瘍細胞である、請求項18に記載の方法。
- 細胞が癌性肝細胞である、請求項18に記載の方法。
- 細胞が癌性卵巣細胞である、請求項18に記載の方法。
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