CN104745662A

CN104745662A - 一种漆酶-tempo体系氧化壳聚糖制备透明质酸替代物方法

Info

Publication number: CN104745662A
Application number: CN201510196902.1A
Authority: CN
Inventors: 裴继诚; 殷允北
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2015-04-20
Filing date: 2015-04-20
Publication date: 2015-07-01

Abstract

本发明涉及生物催化领域，采用绿色环保的方法制备透明质酸替代物。本发明公开了一种利用漆酶-TEMPO体系氧化壳聚糖制备透明质酸替代物的方法，所述的方法主要包括以下内容：利用双氧水将大分子壳聚糖降解成水溶性低聚壳聚糖；然后利用漆酶-TEMPO体系选择性的将低聚壳聚糖C6羟基氧化成羧基制备透明质酸替代物。制备的透明质酸替代物具有很好的吸湿保湿性能和抗氧化性能。本发明在透明质酸替代物整个生产过程中无危害环境的废气、废液及废固体物产生，且生产成本低、易处理、无毒害，是一种清洁环保的制备方法。

Description

一种漆酶-TEMPO体系氧化壳聚糖制备透明质酸替代物方法

技术领域

本发明涉及生物催化领域，采用绿色环保的方法制备透明质酸替代物。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid)简称HA，是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖通过糖苷键组成的双糖直链大分子多糖。1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离得到的一种直连酸性黏多糖(Weissmann B，Meyer K.The structure of hyalobi-uronic acid and of hyaluronic acid from umbilical cord.J.Journal of the American Chemical Society，1954，76，1753-1757)。目前发现，HA广泛分布于牛眼玻璃体，动物和人体结缔组织的细胞外基质中，其中玻璃体、脐带、关节滑液和鸡冠中含量最高。商品HA一般为其钠盐，即透明质酸钠。目前已广泛用于化妆品，被誉为“理想的天然保湿因子”。HA-Oligo(寡聚透明质酸钠)，是指分子量10KDa以下的透明质酸钠，易于渗透到真皮中，作为化妆品原料可透皮吸收，深层护理肌肤，进入皮肤内部进行深层保湿，无细胞毒性，安全性更高。可作为护肤品、美容产品、清洁产品、发用品的有效添加成分。虽然透明质酸通过微生物发酵法已实现大量生产，但是由于分离较难且用途广泛致使价格依然昂贵。为此，人们不断研究开发与其结构或作用相似的产品。

壳聚糖(chitosan，CS)在自然界中广泛存在的天然高分子多糖，具有良好的生物相容性、抗菌性和生物降解性，它被广泛应用于食品、医药、农业、环保等领域。HA和壳聚糖的主链都是由吡喃环通过醚键连接而成，侧链都含有较多的亲水基团。因此许多研究者对其改性以制备透明质酸替代物，研究者主要通过羧基化壳聚糖、酰化壳聚糖、壳聚糖季铵盐、壳聚糖的接枝共聚的方法制备。但是，目前利用壳聚糖制备透明质酸替代物绝大多数仍处于实验室研究阶段，在实际中的应用还很少，反应成本较高，而且在反应过程中会产生有害物质对环境造成污染。找到一条得率高、副产物少且绿色环保型的制备方法对于拓宽透明质酸替代物的来源、提高壳聚糖的附加值等具有十分重要的意义。

已有学者发现TEMPO-NaBr-NaClO体系可选择性地将壳聚糖中吡喃糖基的C6伯羟基选择性氧化成羧基，壳聚糖氧化产物吸湿保湿性能得到提高(Kato Y，Kaminage J，Matsuo R，et al.TEMPO-mediatedoxidation of chitin and N-acetylated chitosan.J.Carbohydrate Polymers，2004，58(4)：421-426)；漆酶：双氧氧化还原酶，是多铜氧化酶中的一种含铜的糖蛋白氧化酶。漆酶催化机制比较复杂，能够归纳的只有一点，即漆酶催化苯酚类、芳香胺和其他富含电子的底物单电子氧化，同时将氧分子还原成水。已有学者发现漆酶-TEMPO体系可选择性的将纤维素C6羟基氧化成羧基，反应条件温和，操作方便，得率高(Aracri E，VidalT，Ragauskas A J.Wet strength development in sisal cellulose fibers by effect of a laccase-TEMPO treatment.J.Carbohydrate Polymers，2011，84(4)：1384-1390)。TEMPO-NaBr-NaClO体系含有卤代物，易对环境造成污染，而漆酶作为绿色氧化剂，发生反应后唯一的产物就是水，本质上是一种环保型酵素，因此漆酶-TEMPO体系是一种绿色环保体系。另外，水溶性低聚壳聚糖具有显著地吸湿保湿能力(Chang Z，Xiao L.(2011).Moisturizing Property of Oligochitosan and Its Application in Cosmetics.Flavour Fragrance Cosmetics，6，13-16)，因此本专利是首次采用漆酶-TEMPO体系这一绿色环保无污染的方法氧化水溶性低聚壳聚糖制备透明质酸替代物。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种环保低成本的制备透明质酸替代物的方法。

为实现本发明的目的，所采用的技术方案：

将壳聚糖和浓度为6～10％的双氧水按质量比1∶100～1∶300混合，60℃反应3～6小时。加入适量无水乙醇析出低聚壳聚糖，过滤后常温真空干燥，样品密封室温保存。

适量低聚壳聚糖溶于pH 4.8～6.0的缓冲溶液中，添加1％～8％TEMPO和适量漆酶，在30～40℃环境中中通氧反应4～20小时。反应后脱盐，除蛋白，所得固体常温真空干燥，样品密封室温保存。

本发明的有益效果是：

(1)本发明采用过氧化氢降解壳聚糖，主要破坏氨基葡糖之间的醚键，其他结构基本不变。该法降解速度快、成本低、无残毒、后处理方便，易于实现工业化，是一种无污染的环保型生产工艺。

(2)本发明采用漆酶-TEMPO体系氧化水溶性低聚壳聚糖制备透明质酸替代物，该法绿色环保无污染，反应条件温和，易于操作，透明质酸替代物易溶于水，应用范围较广。

附图说明

图1透明质酸替代物、HA-Oligo和低聚壳聚糖在饱和碳酸钠溶液中的吸湿率

图2透明质酸替代物、HA-Oligo和低聚壳聚糖在饱和硫酸铵溶液中的吸湿率

图3透明质酸替代物、HA-Oligo和低聚壳聚糖在干燥硅胶中的保湿率

图4HA-Oligo、低聚壳聚糖和透明质酸替代物的ABTS自由基清除率

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

吸湿性能

室温下，精确称取3份0.5g样品分别加人直径3cm的称量瓶中，将称量瓶放置在干燥器中，干燥器内分别放有碳酸钠饱和溶液(RH＝97％)和硫酸铵饱和溶液(RH＝80％)，每隔12小时称重一次，共检测60小时。根据公式(1)计算吸湿率，取平均值。

吸湿率(％)＝100(Wn-Wo)/W (1)

Wn：样品和称量瓶在硫酸铵饱和溶液和碳酸钾饱和溶液的环境中放置一定时间后总质量

Wo：样品和称量瓶的总质量

W：样品质量

实施例2

保湿性能

室温下，吸湿达到饱和的样品转移到放有硅胶的干燥器中，2、4、6、8、10、12、24h后各称重一次。根据公式(2)计算保湿率，取平均值。

保湿率(％)＝100(Hn-Wo)/W (2)

Hn：样品和称量瓶在硅胶干燥器中放置一定时间后总质量

Wo：样品和称量瓶的总质量

W：样品质量

结果表明透明质酸替代物的吸湿保湿性能得到显著提升，在吸湿保湿方面可替代HA-Oligo。

实施例3

抗氧化性能

配制浓度为2.6mM的过硫酸钾溶液与浓度为7.4mM的ABTS溶液，分别量取2mL混合，在避光处储存12小时，制得ABTS·⁺自由基溶液，然后用无水乙醇稀释50-60倍至734nm处吸光度为0.700±0.025。取2mg试样溶于2mL去离子水中，再与8mL稀释后的自由基溶液发生反应，共进行40min。反应每进行5min对溶液在734nm处的吸光度进行测定。另取2mL去离子水与8mL稀释后的自由基溶液混合，作为空白样。

利用公式(3)计算其自由基消除率，消除率越高，抗氧化性能越强。

自由基消除率(％)＝(A₀-A₁)/A₀×100％ (3)

A₀：空白样吸光度

A₁：反应后吸光度

结果表明透明质酸替代物具有较强的抗氧化性。

Claims

1.一种透明质酸替代物的制备方法，其特征在于，通过漆酶-TEMPO体系氧化壳聚糖制备的透明质酸替代物。

2.根据权利要求1所述的透明质酸替代物的制备方法，其特征在于，将壳聚糖降解成水溶性的低聚壳聚糖，对其进行氧化制备透明质酸替代物。

3.根据权利要求2所述的透明质酸替代物的制备方法，其特征在于，通过漆酶-TEMPO体系氧化水溶性低聚壳聚糖制备透明质酸替代物。

4.根据权利要求1，2，3所述的透明质酸替代物的制备方法，其特征在于，反应温度为30～40℃，维持pH 4.8～6.0，TEMPO用量为1％～8％，反应时间为4～20小时。