CN104736693A - 新型酵母及使用其的乙醇的生产方法 - Google Patents

新型酵母及使用其的乙醇的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种新型酵母及使用其的乙醇的生产方法，该酵母具有在与葡萄糖和木糖的共存下由葡萄糖和木糖在短时间内效率良好地生产乙醇的能力。一种酵母，被命名为间型假丝酵母(Candida intermedia)4-6-4T2,作为FERM BP-11509进行保藏。

Description

新型酵母及使用其的乙醇的生产方法
技术领域
本发明涉及一种新型酵母及使用其的乙醇的生产方法。
背景技术
近年，作为地球变暖的对策，在世界范围内进行大规模的生物乙醇生产。生物乙醇的原料中玉米、甘蔗等可食用的生物质占据多数，在这样的可食用生物质中，作为生物乙醇原料的使用和作为粮食的使用之间的竞争成为问题。
为了回避这一问题，正在寻求由不作为粮食使用的木材、非可食用的草本等纤维素类生物质(特别是从农业残渣、林业残渣等得到的物质)生产乙醇的技术的开发。
上述技术中，将纤维素类生物质所包含的纤维素、半纤维素、属于它们的部分分解物的多糖类进行水解，得到以属于六碳糖的葡萄糖、甘露糖和半乳糖、属于五碳糖的木糖为主成分的糖化液，利用微生物将该糖化液中的糖进行发酵，由此得到乙醇。
作为能够由葡萄糖和甘露糖效率良好地生产乙醇的酵母，已知有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，但是能够由木糖、半乳糖高效地生产乙醇的微生物仅存在少数的种类。
例如，作为不仅能由葡萄糖而且也能由木糖生产乙醇的微生物的为数不多的例子，已知有树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)和嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)(非专利文献1)、间型假丝酵母(Candida intermedia)(非专利文献2)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Yablochkova,EN.,Bolotnikova,OI.,Mikhailova,NP.,Nemova,NN.And Ginak,AI.Applied Biochemistry andMicrobiology,Vol.39,302-306(2003)
非专利文献2:Y.Morikawa,et al.,Biotechnology andBioengineering,Vol:XXVII,509-513(1984)
发明内容
但是，对于非专利文献1中记载的酵母，在源自纤维素类生物质的原料液所含有的葡萄糖和木糖二者的存在下进行乙醇发酵时，由于葡萄糖所致的分解代谢物阻遏，导致在葡萄糖基本完全被消耗之前，木糖基本没有被消耗，因此发酵需要时间，存在乙醇生产能力降低的问题。
此外，对于非专利文献2中记载的酵母，本发明人进行了研究，结果虽然根据制造条件不会发生葡萄糖所致的分解代谢物阻遏，即使在葡萄糖和木糖二者的存在下进行乙醇发酵也有时能由二者进行乙醇发酵，但是存在木糖的消耗效率差，由木糖生产乙醇的能力不充分的问题。
因此，本发明的课题在于提供一种新型酵母及使用其的乙醇的生产方法，该酵母具有在与葡萄糖和木糖共存之下由葡萄糖和木糖短时间内效率良好地生产乙醇的能力。
于是，本发明人进行深入研究，结果发现了特定的酵母具有在与葡萄糖和木糖的共存之下由葡萄糖和木糖短时间内效率良好地生产乙醇的能力，从而完成本发明。
即，本发明提供一种酵母，其被命名为间型假丝酵母(Candidaintermedia)4-6-4T2，作为FERM BP-11509进行保藏。
此外，本发明提供一种乙醇的生产方法，其特征在于，具有使用上述的酵母对原料液体进行发酵的工序，上述原料液体含有选自葡萄糖和木糖中的1种以上的单糖。
本发明的酵母，具有在与葡萄糖和木糖的共存之下由葡萄糖和木糖短时间内效率良好地生产乙醇的能力。此外，如果使用这种酵母，即使在使用含有葡萄糖、木糖的源自纤维素类生物质的原料的情况下，也能够短时间内效率良好地生产乙醇。
因此，根据本发明的乙醇的生产方法，能够使用源自纤维素类生物质的原料在短时间内效率良好地生产乙醇。
附图说明
图1是表示用亲株将葡萄糖和木糖进行发酵时的各成分的经时变化的图。
图2是表示用4-6-4T2株将葡萄糖和木糖发酵时的各成分的经时变化的图。
图3是表示用亲株将木糖发酵时的各成分的经时变化的图。
图4是表示用4-6-4T2株将木糖发酵时的各成分的经时变化的图。具体实施方式
＜酵母＞
本发明的酵母是被命名为间型假丝酵母(Candida intermedia)4-6-4T2，作为FERM BP-11509于平成24年9月20日保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(IPOD)(地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6邮政编码305-8566)的酵母。这种酵母是通过以间型假丝酵母(Candida intermedia)“NBRC10601”作为亲株，按照常规方法进行自然突变，选拔乙醇生产能力比亲株高的株而取得的。应予说明，上述“NBRC10601”是能够从独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(IPOD)得到的酵母。
这样，本发明的酵母具有在与葡萄糖和木糖的共存之下由葡萄糖和木糖在短时间内效率良好地生产乙醇的能力。
其中，与葡萄糖和木糖的共存下是指在至少含有葡萄糖和木糖的原料液体(发酵液)中共存本发明的酵母的情形。以往的酵母，如前文所述木糖的消耗效率不充分，或者虽然具有由葡萄糖或木糖中的任一种生产乙醇的能力，但是在葡萄糖和木糖二者存在的情况下，因分解代谢物阻遏在葡萄糖完全被消耗之前木糖基本没有被消耗，而本发明的酵母，即使在葡萄糖和木糖二者存在的情况下，也具有由这二者在短时间内效率良好地生产乙醇的能力。
此外，本发明的酵母从含有葡萄糖和木糖的原料液体在短时间内效率良好地生产乙醇，但此时基本没有生成作为副产物的木糖醇。此外，本发明的酵母除了具有由这样的糖生产乙醇的能力以外，具有与亲株相同的性质。
＜乙醇生产方法＞
本发明的乙醇的生产方法，其特征在于，具有使用上述的酵母对原料液体进行发酵的工序(以下也称为发酵工序)，所述原料液体含有选自葡萄糖和木糖中的1种以上的单糖。根据这种生产方法，能够在短时间内效率良好地生产乙醇。
酵母的使用量没有特别限制，相对于上述单糖1质量份，通常是0.01～100质量份左右，优选为0.1～10质量份。
此外，作为上述原料液体(例如，糖化液)，优选含有葡萄糖和木糖的原料。此外，除了这些单糖以外也可以含有甘露糖、半乳糖等其它单糖(六碳糖)。由于本发明的生产方法很难受到分解代谢物阻遏的影响，因此根据这种方法，即使与葡萄糖一起含有上述的单糖(木糖、甘露糖、半乳糖)，也能够效率良好地生产乙醇。
此外，上述原料液体含有葡萄糖和木糖时，作为葡萄糖和木糖的含有比率，相对于葡萄糖1质量份，木糖优选为0.1～5质量份，更优选为0.5～3质量份。使用本发明的酵母时，葡萄糖和木糖的含有比率在上述的范围内，与葡萄糖同时地也能够由木糖生产乙醇。此外，原料液体中的葡萄糖含量和木糖含量，分别优选为1～100g/L，更优选为5～50g/L。使用本发明的酵母时，葡萄糖、木糖的含量在这样的范围内也能够生产乙醇。此外，相对于原料液体中含有的糖，葡萄糖的含有比例没有特别限定，优选在原料液体中含有的糖总量中为5～99质量％，更优选为10～70质量％。
此外，作为上述原料液体含有的单糖的总计含量优选为1～100g/L。
此外，用于乙醇生产的原料液体可以是源自动物的原料、源自植物的原料、源自工业废弃物的原料等的任意一个，优选源自植物的原料，从避免作为生物乙醇原料的使用和作为粮食的使用之间的竞争的观点出发，更优选纤维素类生物质的水解产物。其中，纤维素类生物质是指含有纤维素和半纤维素的生物质。这种生物质中的纤维素被水解即得到葡萄糖，另一方面，半纤维素被水解即得到葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖。
作为这种纤维素类生物质，从乙醇生产中经济的优越性的观点出发，优选从农业残渣(稻草、麦草等)、林业残渣(木材等)等得到的物质。
此外，上述原料液体的pH(30℃)优选为3.5～6.5，更优选为4～6，进一步优选为4.5～5.5，特别优选为4.5～5。利用本发明的酵母，即使在这样的低pH区域也能够进行乙醇生产，即使使用含有乙酸等的糖化液(生物质系纤维素的酸水解产物)的情况下也能够生产乙醇。
应予说明，已经报告，在通过使用酸将纤维素类生物质水解而得到的低pH的糖化液中，含有抑制利用微生物进行的乙醇生产的乙酸等抑制物质(Nigam JN.Journal of Applied Microbiology，Vol.90，208-215(2001))，特别是，报告了能够由木糖生产乙醇的微生物在pH5以下这一低pH区域中乙醇发酵被抑制(Palmqvist E.,Hahn-Hagardal B.Bioresource Technology Vol.74,25-33(2000))。
此外，上述生产方法优选在20～35℃，更优选在25～30℃进行。
此外，在上述生产方法中，可以一边使上述酵母在生长条件中生长一边生产乙醇，此外，也可以在静息菌体状态、即将氮源限制在对酵母的生长不充分的程度且在成为乙醇的原料的碳源丰富的条件下，在酵母的生长停止的状态下生产乙醇。其中，从难以受到乙酸、亚硫酸等乙醇生产抑制物的影响的观点出发，优选在静息菌体的状态下生产乙醇。用静息菌体进行生产时，酵母的浓度优选在5～100g/L进行。此外，用静息菌体生产乙醇时，可以不含有氮源、酵母提取物等，优选用磷酸缓冲液、氢氧化钠等调整为上述的pH。应予说明，乙醇的回收，可以用蒸馏等常规的手段进行。
此外，上述生产方法中，从菌体量的观点出发，优选在上述发酵工序之前进行前培养。作为用于这种前培养的培养基，优选含有葡萄糖和选自甘露糖、半乳糖以及木糖的1种以上的糖的培养基。作为这样的培养基，可以使用含有上述纤维素类生物质水解产物的培养基。
此外，作为上述糖的浓度，总计优选为1～100g/L，更优选为10～50g/L。应予说明，选自甘露糖、半乳糖和木糖的1种以上和葡萄糖的含量的比率没有特别限制。
此外，上述前培养中，将纤维素类生物质水解产物作为碳源使用时，这种水解产物的使用量，通常在培养基体积的20体积％以下，优选10体积％以下。应予说明，培养基中含有的其它成分没有特别限定，可举出适宜生长的氨基酸、尿素、蛋白胨、不含氨基酸的含氮碱基等氮源；酵母提取物等。前培养的温度，优选为10℃～37℃，更优选为25℃～30℃。另一方面，pH优选为4～7，更优选为4.5～6.5。此外，前培养优选在有氧条件进行。
实施例
以下，举出实施例对本发明详细说明，本发明不局限于这些实施例。
实施例1
按照以下顺序，以保存于独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(IPOD)的酵母间型假丝酵母(Candida intermedia)“NBRC10601”作为亲株，通过驯化和自然突变取得4-6-4T2株。
首先，将分别含有1质量％葡萄糖和木糖的乙酸水溶液的pH通过氢氧化镁调整为5.0，将该溶液20％和液体培养基(酵母提取物：1％、不含氨基酸的酵母含氮碱基：2％)80％混合。向该混合溶液10mL添加木糖1％,将酵母间型假丝酵母(Candida intermedia)“NBRC10601”以1铂圈进行植菌，在30℃培养3天得到培养液。
接下来，将与上述同样地调整pH为5.0的分别含有1质量％葡萄糖和木糖的乙酸水溶液与液体培养基各以50％混合，向该混合液10mL添加上述培养3天的培养液100μL，进一步培养7天。进而，将与上述同样地调整pH为5.0的分别含有1质量％葡萄糖和木糖的乙酸水溶液80％与培养基20％混合，向该混合液10mL添加上述培养7天的培养液100μL，进一步培养30天，得到驯化株液。
将上述驯化株液稀释1000倍，涂布于YNB琼脂培养基(葡萄糖：5％、酵母提取物：1％、不含氨基酸的酵母含氮碱基：2％、琼脂：2％)的培养基，25℃培养4天后，取得形成集落的株。
将上述取得的株涂布于YNB琼脂培养基(海藻糖：2％、酵母提取物：1％、不含氨基酸的酵母含氮碱基：2％、琼脂：2％)的培养基，25℃培养3天后，确认形成集落，在4℃保管。选拔在4℃扩大的集落，用磷酸缓冲液(木糖：2.5％、KH2PO4：0.1M、pH＝5.0、MgSO4-7H2O：0.006M)实施乙醇生产实验，选拔乙醇生产能力比亲株高的株。
由此选拔作为目标的酵母，将其命名为间型假丝酵母(Candidaintermedia)4-6-4T2株。本菌株保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(IPOD)，其保藏编号是FERM BP-11509。
实施例2
将亲株(NBRC10601株)和4-6-4T2株分别植菌于YNB培养基(葡萄糖：0.5％、木糖：2％、酵母提取物：1％、不含氨基酸的酵母含氮碱基：2％)，在30℃、120rpm进行振荡培养(24～48小时、OD660＝18～25)。培养液1mL中的干燥菌体重量通过凭经验得到以下的关系式(1)算出(根据式(1)，例如，能够算出OD660＝20时的干燥菌体重量相当于0.0062g)。
干燥菌体重量(g/mL)＝0.00032×OD660-0.00017……(1)
为了使菌体量以干燥重量计为2％，对必要量的培养液分别用离心分离(3000rpm，2分钟)进行回收，将向磷酸缓冲液(KH2PO4/K2HPO4：0.01M、pH＝5.0)中混合下述表1～4表示的糖(乙醇原料)而成的发酵用液添加到各自菌体中进行发酵，确认乙醇生产量的经时变化。结果由表1～4和图1～4示出。应予说明，表和图中的G表示葡萄糖，X表示木糖。
[表1]
发酵(h) 乙醇((％)v/v) 木糖醇((％)w/v) G((％)w/v) x((％)w/v)
0 0 0 2.5 2.5
2 1.43 0.04 0 1.71
4 1.43 0.12 0 1.42
12 1.52 0.38 O 0.96
24 1.52 0.41 0 0.81
使用菌体：NBRC10601、糖：G(2.5％)+X(2.5％)
[表2]
发酵(h) 乙醇((％)v/v) 木糖醇((％)w/v) G((％)w/v) X((％)w/v)
0 O 0 2.5 2.5
2 1.04 0.09 0.44 2.00
4 1.60 0.16 0 1.48
12 1.96 0.20 0 0.15
24 2.14 0.22 0 0
使用菌体：4-6-4T2、糖：G(2.5％)+X(2.5％)
[表3]
发酵(h) 乙醇((％)v/v) 木糖醇((％)w/v) X((％)w/v)
0 0 0 5
2 0.25 0.25 3.35
4 0.28 0.38 2.95
12 0.57 0.44 2.13
24 0.80 0.77 1.69
使用菌体：NBRC10601、糖：X(5％)
[表4]
发酵(h) 乙醇((％)v/v) 木糖醇((％)w/v) X((％)w/v)
0 0 0 5
2 0.43 0.06 3.25
4 0.81 0.06 2.16
12 1.42 0.13 0.81
24 1.75 0.15 0.23
使用菌体：4-6-4T2、糖：X(5％)
如表1和图1所示，使用亲株(2％)，将葡萄糖和木糖(分别是2.5％)作为碳源生产乙醇时，在发酵初期葡萄糖和木糖二者被消耗而生产乙醇，然而在将葡萄糖完全消耗时乙醇生产停止，木糖的消耗也基本变为停止状态。因此，可知尽管亲株难以受到葡萄糖所致的分解代谢物阻遏的影响，但是由木糖生产乙醇的能力较低。
与此相对，如表2和图2所示，使用4-6-4T2株(2％)，将葡萄糖和木糖(分别为2.5％)作为碳源生产乙醇时，不仅与亲株同样地在发酵初期葡萄糖和木糖二者被消耗而生产乙醇，而且在葡萄糖消耗之后木糖的消耗以基本没有变化的速度进行，不仅葡萄糖被消耗而且木糖也充分被消耗，伴随该过程乙醇生产量也出现增加。因此可知，4-6-4T2株是从亲株继承了难以受到葡萄糖所致的分解代谢物阻遏的影响的性质，而且由木糖生产乙醇的能力与亲株相比格外提高的株。
此外，如表3和图3所示，使用亲株(2％)，将木糖(5％)作为碳源生产乙醇时，即使发酵24小时仍有30％以上的木糖残存。
与此相对，如表4和图4所示，使用4-6-4T2株(2％)，将木糖(5％)作为碳源生产乙醇时，发酵时间为24小时，90％以上的木糖被消耗，与亲株相比会生产约1.4倍的乙醇。
用4-6-4T2株和亲株由木糖生产乙醇的能力有差异的理由并不明确，但是从上述图1～4推测是由于作为由木糖生产乙醇时的中间代谢物的木糖醇蓄积，因此抑制阻碍了由木糖生产乙醇。
即，将追随使用了上述亲株的发酵的经时变化的图1和3与追随使用了4-6-4T2株的发酵的经时变化的图2和4进行比较，可认为所有亲株中木糖醇的生产量多，伴随该木糖醇的增加，使得木糖消耗降低，乙醇生产有停止的倾向。
可见，通过使用本发明的酵母，能够效率良好地生产乙醇，推测是葡萄糖所致的分解代谢物阻遏的影响较小，同时由于木糖醇的生产被抑制，所以木糖醇所致的乙醇生产率难以受到阻碍也产生了影响。
实施例3
向含有如表5所示的糖的发酵用液(磷酸缓冲液：0.01M、pH5.0)分别添加相当于2％干燥重量的该表所示的酵母，测定12小时后的乙醇生产量(％(v/v))。结果由表5示出。
[表5]
由表5可知，即使使用任意的糖时，4-6-4T2株与亲株、公知酵母相比也显示高的乙醇生产能力。

Claims (5)

1.一种酵母，被命名为间型假丝酵母4-6-4T2，作为FERMBP-11509进行保藏，其中，间型假丝酵母即Candida intermedia。
2.一种乙醇的生产方法，其特征在于，具有下述工序：使用权利要求1所述的酵母将含有选自葡萄糖和木糖中的1种以上的单糖的原料液体进行发酵。
3.根据权利要求2所述的生产方法，其中，作为原料液体，使用含有葡萄糖和木糖的原料液体。
4.根据权利要求2或3所述的生产方法，其中，原料液体的pH是3.5～6.5。
5.根据权利要求2～4中的任一项所述的生产方法，其中，作为原料液体，使用纤维素类生物质的水解产物。
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