CN104717978A - 动脉炎病毒蛋白和表达机制 - Google Patents

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Abstract

本发明发现和表征了一种新的动脉炎病毒蛋白(nsp2TF)，所述动脉炎病毒蛋白的表达依赖于位于nsp2编码区中一位点处的-2核糖体移码。在包括PRRSV、LDV和SHFV在内的动脉炎病毒中，nsp2TF的独特TF结构域的编码区与编码nsp2的跨膜区的ORF1a的部分重叠。影响nsp2TF表达的突变损害PRRSV复制，并且导致较小的噬斑表型。本文提供表现出降低的nsp2TF翻译和/或一种或多种下游产物的翻译被改变的动脉炎病毒，其中nsp2TF功能降低和/或不存在的动脉炎病毒，以及包含所述动脉炎病毒的疫苗。本文还提供诊断方法，用于鉴定抑制-2移码的化合物的方法，以及利用-2移码的真核系统的基因表达工具。

Description

动脉炎病毒蛋白和表达机制
序列表
本申请包含已随本文提交的序列表，并且其整体援引加入本文。
发明背景
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是全世界经济上最重要的猪疾病。其特征在于母猪的晚期繁殖失败和新生猪的严重肺炎。PRRS的病原体，PRRS病毒(PRRSV)是一种小的包膜病毒，其包含单一正链RNA基因组。PRRSV是Nidovirales目中动脉炎病毒科的成员。动脉炎病毒科还包括马动脉炎病毒(EAV)、乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)和猴出血热病毒(SHFV)。
PRRSV可以分为两种主要基因型：I型(也称作欧洲基因型)和II型(也称作北美基因型)。最近在中国和其他亚洲国家出现的高致病性变体(HP-PRRSV)源自II型基因型的病毒。
PRRSV基因组的长度为约15kb，并且包含至少10个开放阅读框。基因组的3'端编码4种膜相关糖蛋白(GP2a、GP3、GP4和GP5；表达自sgmRNA 2-5)、3种未糖基化的膜蛋白(E、ORF5a和M；表达自sg mRNA 2、5和6)和核壳蛋白(N；表达自sg mRNA 7)(de Boon et al.,1991；Meulenberget al.,1993,1995；Snijder et al.,1999；Wu et al.,2001,2005；Firth et al.,2011；Johnson et al.,2011)。
PRRSV复制酶基因ORF1a和ORF1b位于基因组的5'-段，代表近75％的病毒基因组。ORF1a和ORF1b编码两种长复制酶多聚蛋白pp1a和pp1ab，其蛋白水解加工为(至少)14种非结构蛋白(nsp)产物(Ziebuhr et al.,2000；Fang and Snijder,2010)。在这些产物中，nsp2是最大的切割产物，其通过上游nsp1β对nsp1β/2位点的自身蛋白水解活性以及木瓜蛋白酶样蛋白酶PLP2对位于nsp2的N-端结构域中的nsp2/3位点的切割来释放(Snijder et al.,1995)。
目前，对于治疗或预防PRRSV感染没有有效的治疗或疫苗。PRRS单独对美国养猪业的影响是每年损失约$600,000,000，并且在全世界是这个量的几倍。需要基本知识、抗病毒策略和工具，以便通过控制和/或消除PRRS来减少动物痛苦以及对生产者和社会的经济损失。
发明概述
申请人已发现并表征了一个保守开放阅读框(TF ORF)，其与编码动脉炎病毒PRRSV、LDV和SHFV中nsp2的大约C-端三分之一的复制酶ORF1a区重叠。申请人还已鉴定了一种新的动脉炎病毒蛋白nsp2TF，其独特的C-端结构域(TF结构域)由TF ORF编码。此外，他们已发现高效的-2程序性核糖体移码(PRF)在真核生物系统中天然用作基因表达机制，并且特别地，-2PRF用来表达动脉炎病毒TF ORF。
本发明提供一种动脉炎病毒，其包含编码ORF1a或其功能性部分的核酸，其中所述核酸包含至少一个突变，导致与所述动脉炎病毒的野生型相比，在被所述动脉炎病毒感染的细胞中nsp2TF的翻译降低和/或翻译自所述核酸的一种或多种下游产物的翻译被改变。本发明的动脉炎病毒任选地包括干扰位于编码nsp2蛋白的核酸序列中的-2移码位点处的-2核糖体移码的突变。本发明的动脉炎病毒任选地在移码位点GGU(U/C)U(U/C)U和/或保守的CCCANCUCC基序中包含至少一个突变。本发明的动脉炎病毒任选地在编码nsp1β蛋白的核酸序列中包括一个或多个突变，其导致降低的-2核糖体移码。
本发明进一步提供一种动脉炎病毒，其中与所述动脉炎病毒的野生型相比，在被本发明的动脉炎病毒感染的细胞中，nsp2TF功能降低和/或不存在。先前提到的动脉炎病毒任选地包含编码ORF1a或其功能性部分的核酸，其中编码的nsp2TF氨基酸序列的TF结构域改变、截短或不存在。本发明的动脉炎病毒任选地包含改变的TF结构域的氨基酸序列，其中翻译所述氨基酸，并且任选地提供在野生型动脉炎病毒中不存在、但不损害ORF1a的蛋白或表位。本发明提供的一些动脉炎病毒可以自主复制。本发明的任何动脉炎病毒可以为PRRSV，包括但不限于1型(欧洲基因型)PRRSV、2型(北美基因型)PRRSV、亚洲变体或它们的组合，或者乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)或猴出血热病毒(SHFV)。本发明还提供编码本文提供的任何动脉炎病毒的RNA或cDNA载体。
本发明还提供疫苗或免疫原性组合物，其包含本发明的任何动脉炎病毒、上述cDNA或它们的组合物，以及任选存在的药学可接受的载体或稀释剂。还提供本发明的疫苗或免疫原性组合物，其还包含佐剂、赋形剂或它们的组合。本发明提供在个体中诱导对动脉炎病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的本发明的组合物。所述个体可以为动物，包括但不限于哺乳动物、人和猪。
本发明提供分离的或重组的蛋白，其包含全长或部分动脉炎病毒TF结构域蛋白，优选包含如SEQ ID NO:36、45和46-67、91和76-91中任一个所示的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:36、45和46-67、91和76-91中任一个至少70％相同的氨基酸。
本发明提供分离的或重组的蛋白，其包含TF结构域，优选包含如SEQID NO:61所示的氨基酸序列或者包含与其中的识别表位SEQ ID NO:63、64和65至少70％相同的氨基酸序列。此外，本发明提供一种分离的或重组的抗体，其能够特异性地结合至动脉炎病毒nsp2TF蛋白的TF结构域或本发明的蛋白。
本发明提供一种检测生物学样品中动脉炎病毒抗体的存在的方法，所述方法包括使生物学样品与一定量的TF结构域蛋白抗原或其部分接触；利用检测系统检测是否存在TF结构域抗原和抗体之间复合物；以及确定是否存在TF结构域抗原和抗体之间复合物，其中复合物的存在表示对动脉炎病毒的免疫应答。
本发明提供的另一种方法是确定生物学样品是否包含针对动脉炎病毒的抗体的方法，其中所述方法包括检测生物学样品中TF-结构域特异性抗体的存在。
本发明提供一种区分感染野生型动脉炎病毒和/或用未修饰的动脉炎病毒株免疫接种的个体与用本发明的疫苗免疫接种的个体的方法，其中所述方法包括提供来自受试个体的样品，定性、定量或者定性且定量地确定样品中是否存在在位于TF ORF的5’端的-2移码位点处影响-2核糖体移码的突变，或者是否存在对TF-结构域编码区的修饰；和/或确定样品中抗疫苗特异性的免疫原性表位的抗体的存在；和/或确定样品中抗所述野生型或未修饰的动脉炎病毒表达的表位的抗体的存在，所述表位在疫苗中不存在。
还提供一种分型生物学样品中的动脉炎病毒的方法，其中所述方法包括确定位于编码nsp2蛋白的核酸序列中的-2移码位点的存在和/或序列；和/或确定动脉炎病毒中TF结构域-编码区的存在和/或序列。本发明还提供核酸，其包含与编码蛋白的核酸序列可操作连接的动脉炎病毒-2移码位点，其中所述蛋白不是动脉炎病毒蛋白，所述核酸还包含位于所述-2移码位点5’的核糖体翻译起始密码子。本发明的核酸中的动脉炎病毒-2移码位点可以包含序列GGU(U/C)U(U/C)U和/或下游CCCANCUCC序列。此外，本发明提供一种表达系统，其包含本发明的核酸之一，其中所述表达系统任选地进一步包含nsp1β或其功能性部分。
本发明提供一种确定物质是否能够干扰位于TF ORF的5’端的-2移码位点处的核糖体移码的方法，其中所述方法包括提供许可在所述位点处发生移码的翻译系统，其具有与所述位点可操作连接的编码遗传标记或报告物的核酸，使所述翻译系统与所述物质接触，温育所述翻译系统和物质混合物以允许翻译所述核酸；以及确定是否存在所述核酸编码的翻译产物。所述翻译产物可以是完整的翻译产物，或者其可以是部分翻译产物。上文提供的本发明的方法的翻译系统可以包含动脉炎病毒nsp1β蛋白或其功能性部分和/或是细胞。上文提供的本发明的方法的物质可以选自反义DNA、反义RNA、siRNA、微RNA、核酸类似物、肽、化合物或小分子，或者它们的组合。
本发明还提供药物组合物，其包含有效量的能够干扰动脉炎病毒中的-2移码的物质，以及任选存在的药学可接受的载体或稀释剂。本发明还提供一种治疗被动脉炎病毒感染的动物的方法，所述方法包括向所述动物给药有效量的本发明的药物组合物。
本发明额外地提供表达盒，其包含与异源启动子可操作连接的编码动脉炎病毒nsp2TF蛋白的核酸。本发明提供包含本发明的表达盒的细胞。本发明的细胞任选地包含整合入所述细胞染色体的表达盒。本发明的任何细胞还可以包含如本发明提供的任何动脉炎病毒或者本发明的cDNA。本发明提供包含本发明的细胞的动脉炎病毒包装细胞系。本发明还提供包含本发明的细胞的nsp2TF-表达稳定细胞系。此外，本发明提供的细胞系的细胞从异源启动子表达nsp2TF。
本发明提供本文所述诊断方法的试剂盒。本发明提供分离的nsp2TF蛋白，以及包含TF结构域的免疫原性表位的蛋白和肽，或者编码这样的蛋白或肽的任何核糖核酸。本发明还提供制备本文所述蛋白和肽的免疫原性组合物的方法。所述表位优选长度为1-500个氨基酸，或者优选长度为1-10个氨基酸，或者优选长度为10-15个氨基酸，或者优选长度为15-20个氨基酸，或者优选长度为20-25个氨基酸，或者优选长度为20-50个氨基酸，或者优选长度为50-75个氨基酸，或者优选长度为75-150个氨基酸，或者优选长度为150-250个氨基酸，或者优选长度为250-350个氨基酸，或者优选长度为350-500个氨基酸，或者更大。所述表位可以优选长度为150-275个氨基酸，或者优选长度为155-250个氨基酸，或者优选长度为160-240个氨基酸。
申请人已发现高效的PRRSV-2移码取决于至少两个RNA序列(实际的移码位点和保守的下游CCCANCUCC序列)和nsp1β的存在。申请人意外地发现部分或完全防止-2移码的突变和/或nsp2TF的表达损害PRRSV复制并导致较小的噬斑表型。本文提供新的动脉炎病毒，包括LDV、SHFV和PRRS病毒，其表现出受损的生长表型，具有较低的感染子代滴度和减小的噬斑大小。本文还提供新的动脉炎病毒的敲除突变体，包括LDV、SHFV和PRRSV，其允许nsp3-12表达的有效上调并提供有效工具以调控病毒RNA合成。
本发明提供一种动脉炎病毒，其在ORF1a中包含一个或多个突变或者突变的组合，其中所述动脉炎病毒中-2移码的水平和nsp2TF蛋白的表达水平改变。本发明还提供一种动脉炎病毒，其在ORF1a中包含突变或突变的组合，其中nsp2TF蛋白改变。根据本发明的一实施方案，所述动脉炎病毒中的突变可以包含导致提前终止密码子的缺失或取代，或者可以在TF编码区中包含一个或多个终止密码子的插入，导致nsp2TF蛋白的截短。还根据本发明，ORF1a中的突变可以出现在TF结构域的编码区和/或移码位点。
本发明的动脉炎病毒中的突变可以在编码nsp1β蛋白的核酸序列中包含缺失和/或突变。本发明提供一种动脉炎病毒，其在ORF1a中包含一个或多个突变，其中所述动脉炎病毒中nsp2TF蛋白的表达水平降低。本发明还提供一种动脉炎病毒，其在ORF1a中包含一个或多个突变，导致nsp2TF的TF结构域改变、截短或不存在。
本发明的动脉炎病毒可以是任何动脉炎病毒，包括但不限于PRRSV，包括但不限于1型(欧洲基因型)PRRSV和2型(北美基因型)PRRSV、亚洲变体或它们的组合。本发明的动脉炎病毒可以是任何动脉炎病毒，包括但不限于乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)或猴出血热病毒(SHFV)。本发明的动脉炎病毒还可以包含遗传标记，包括但不限于改变或缺失TF结构域或nsp2TF氨基酸序列中的特异性序列的突变。
本发明提供疫苗和/或免疫原性组合物，其包含一种或多种本发明的动脉炎病毒，以及药学可接受的载体和/或稀释剂。本发明提供在对动脉炎病毒感染敏感的动物中诱导针对动脉炎病毒的免疫应答的方法，其中所述方法包括给药有效量的组合物，所述组合物包含一种或多种本发明的疫苗或免疫原性组合物，其中诱导所述动物中的免疫应答。疫苗组合物和免疫原性组合物可以用于任何动物，包括但不限于哺乳动物、人和猪。
本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的抑制动脉炎病毒中的-2移码机制的抑制剂，以及药学可接受的载体或稀释剂。所述抑制剂可以选自反义DNA、反义RNA、siRNA和微RNA、核酸类似物、肽、和小分子、化合物，或者它们的组合。核酸类似物可以选自锁核酸、morphilino寡核苷酸、肽核酸或本领域技术人员已知的其他类似物。
本发明提供治疗被动脉炎病毒感染的动物的方法，所述方法包括向所述动物给药有效量的一种或多种本发明的药物组合物。
本发明还提供控制一种或多种所关注的基因的表达的表达系统，包括将来自动脉炎病毒的一个或多个移码信号以及编码一个或多个所关注的基因的一个或多个核酸分子插入核酸构建体。本发明的表达系统还提供将一个或多个移码刺激物插入核酸构建体，其中移码信号为G_GUU_UUU、G_GUC_UCU、G_AUU_UUU、G_GUU_UUC、CCCANCUCC或它们的组合。
本发明提供动脉炎病毒敲除突变体用于疫苗或遗传表达系统，其中编码nsp2TF的TF结构域或其功能性部分的动脉炎病毒核酸在病毒基因组中已完全或部分失活。
本发明提供检测生物学样品中动脉炎病毒抗体的存在的体外方法，其中使生物学样品与一定量的作为抗原的nsp2TF的TF结构域或其部分接触，并且利用检测系统检测是否存在TF结构域抗原和抗体之间复合物，其中只有在生物学样品包含抗原的抗体时，TF结构域抗原和抗体之间的复合物会出现，并且其中复合物的存在表示对动脉炎病毒的免疫应答。
本发明提供SEQ ID NO:1-26、35-36、45、46-67、68-75和76-97。本发明提供构建体pL1a(SEQ ID NO:1)、pLnsp2-8(SEQ ID NO:2)、pLnsp1-2(SEQ ID NO:3)、pLnsp1β-2(SEQ ID NO:4)、pLnsp1βcc-2(SEQ ID NO:5)、pLnsp2(SEQ ID NO:6)、pLnsp1-3(SEQ ID NO:7)、pLnsp1β-3(SEQ IDNO:8)、pLnsp2-3(SEQ ID NO:9)、pLnsp2-3-IFC(SEQ ID NO:10)、pLnsp1β(SEQ ID NO:11)、pL1a-IFC(SEQ ID NO:12)、pL1a-KO1(SEQ ID NO:13)、pL1a-KO2(SEQ ID NO:15)、pL1a-SS(SEQ ID NO:17)、pL1a-CC1(SEQ IDNO:18)、pL1a-CC2(SEQ ID NO:20)、pSD01-08-IFC(SEQ ID NO:22)、pSD01-KO1(SEQ ID NO:25)、pSD01KO2(SEQ ID NO:26)、pSD01-08-KO1(SEQID 92)pSD01-08-KO2(SEQ ID NO:93)pSD01-08-KO3(SEQ ID NO:94)、pSD95-21-KO1(SEQ ID NO:95)、pSD95-21-KO2(SEQ ID NO:96)和pSD95-21-KO3(SEQ ID NO:97)，与其至少70％相同的序列，或者它们以整体、部分或者其任何组合或片段的形式在本发明的任何方法、表达系统和组合物中的用途，包括但不限于疫苗和免疫原性组合物。
附图说明
以下图片形成本说明书的部分，并且包括以下图片以进一步证实本发明的某些实施方案或各方面。在某些情况下，本发明的实施方案可以参考附图联合本文所示的详细描述来最佳理解。描述和附图可以突出本发明的某一具体实例或某一方面。但是，本领域技术人员会理解实例或方面的部分可以与本发明的其他实例或方面联用。
图1.动脉炎病毒基因组组织和表达机制。(A)～15kb PRRSV基因组的图。两个长5'-端复制酶ORF编码非结构多聚蛋白，而至少8个较短的3'ORF编码结构蛋白。3'ORF翻译自一组嵌套的3'-共末端的亚基因组mRNA，其中2个是双顺反的。ORF1a和ORF1b翻译自基因组RNA，其中ORF1b的翻译取决于ORF1a末端的+1程序性核糖体移码(PRF)，获得pp1ab复制酶多聚蛋白。新描述的TF ORF在-2阅读框中与ORF1a的中心区重叠，并且通过-2PRF获取。nsp2/nsp2TF中的结构域注释为PLP2(木瓜蛋白酶样蛋白酶)、HVR(高变区)、TM/TM((推定的TM结构域)和C(Cys-丰富的结构域)。NCBI RefSeq NC_001961显示nsp2-相关产物的预测大小，并且分离物SD01-08(GenBank#DQ489311)用于本研究。(B)PRRSV ORF1a的生物信息学分析。第1和2幅利用25-密码子滑动窗口示出在212PRRSV序列的比对中ORF1a-框架同义位点处的保守。第2幅示出在同义位点处观察到的取代的数量比在空的中性进化模型下预测的数量的比值，而第1幅示出相应的p-值。在整个TF ORF中总结，相应的p-值为5.7x 10-65。为了将保守统计作图至比对中的特定序列的坐标上，移除所选参考序列(viz.NC_001961)中所有具有缺口的比对柱(注意原始比对在TF ORF本身内是不含缺口的)。第3-5幅示出3种可能的阅读框中终止密码子(三角形)的位置，以及全部212个比对的序列中的比对缺口(矩形)。注意TF区中+1阅读框中保守的终止密码子不存在。(C)3个SHFV序列的比对中终止密码子的位置。垂直线指示G_GU(U/C)_U(U/C)U基序的位置。注意对于紧接在这个位点之后的220个密码子，+1阅读框中保守的终止密码子不存在。
图2.在移码位点处和附近的核苷酸序列。(A)来自代表性动脉炎病毒的序列(Genbank登录号：NC_001639–LDV(SEQ ID NO:27)；NC_001961–基因型II NCBI PRRSV Ref Seq(SEQ ID NO:28)；JX258843-基因型II PRRSV分离株SD23983(SEQ ID NO:29)；DQ489311–基因型IPRRSV分离株SD01-08(SEQ ID NO:30)；NC_003092–SHFV(SEQ IDNO:31)；HQ845737-8–SHFV毒株krc1(SEQ ID NO:32)和krc2(SEQ IDNO:33)。提出的移码位点(在SD01-08和SD23983中证实)高亮显示，并且显示SHFV分离株krc1-2中的核苷酸变化。高度保守的下游CCCANCUCC基序高亮显示。空格分开ORF1a密码子。右边显示-2框TF ORF的长度。(B)用来研究TF表达和功能的突变体的综述。非-WT核苷酸高亮显示。WT；IFC–读框内对照；KO1–敲除1(TF中的提前终止密码子)；KO2–敲除2(提前终止密码子和破坏的移码盒)；SS–移动位点突变体；CC1和CC2–破坏的CCCANCUCC基序。(C)用来研究TF表达和功能的突变体的综述。(D)用来研究TF表达和功能的突变体的综述。
图3.PRRSV-感染的细胞中nsp2TF表达的免疫沉淀和蛋白印迹分析。用欧洲基因型(EU)PRRSV分离株SD01-08(图A和B)或北美基因型(NA)PRRSV分离株SD23983(C)感染MARC-145细胞。将感染或模拟感染的细胞裂解物用nsp2-特异性mAb免疫沉淀(IP)。将免疫沉淀的蛋白通过SDS-PAGE分离并用考马斯蓝染色(A)。通过蛋白印迹(WB)分析特异性病毒蛋白的表达(B和C)。将每张膜用如每张图底部所示的特异性mAb或pAb探测。显示分子量标记和(推定的)PRRSV蛋白的位置。
图4.通过免疫荧光显微术检测PRRSV-感染的细胞中的nsp2TF蛋白表达，还说明nsp2和nsp2TF靶向PRRSV-感染的细胞中不同的细胞内位置。将MARC-145细胞用PRRSV SD01-08感染并固定在18hpi。将细胞用nsp2TF-特异性兔抗血清(A)和识别PRRSV nsp2的mAb(B)双重染色。DyLight 549-标记的山羊抗兔IgG(A，荧光)和FITC-缀合的山羊抗小鼠抗体(B，荧光)用作二抗。将细胞核用DAPI染色(C，蓝色荧光)。D：A、B和C的合并图片。将样本在Zeiss LSM510共聚焦显微镜上成像。在每张图像中显示通过核的0.8μm切片。
图5.纯化自用基因型I PRRSV分离株SD01-08感染的细胞的nsp2TF的质谱分析。(图5A)移动位点G_GUU_UUU附近的核苷酸序列，具有全部3种阅读框的概念氨基酸翻译。-2移码的产物以灰色显示(SEQ IDNO:68,69)。通过质谱分析检测覆盖这些氨基酸的3种胰蛋白酶肽(SEQ IDNO:70、71、72)。跨越移动位点的下划线的肽(SEQ ID NO:83)与-2移码相容，但不与+1移码相容。程式化的P-和A-位点tRNA说明移码之前和之后预期的密码子:反密码子双链(还参见正文)。在真核生物中，预期GUU由缬氨酸tRNA与反密码子5'-IAC-3'(I＝肌苷)解码，但是其还可能由缬氨酸tRNA与反密码子5'-ncm5UAC-3'(ncm5U＝5-氨甲酰基甲基尿苷(carbamoylmethyluridine))解码。缬氨酸反密码子通过示意图中的3'-CA*-5'显示。(图5B)nsp2TF的完整氨基酸序列(SEQ ID NO:45)。通过质谱分析法鉴定的肽以灰色显示(SEQ ID NO:46-60和66)。由-2阅读框编码的C-端169aa(SEQ ID NO:61)高亮显示，而N-端713aa(SEQ ID NO:62)与nsp2共享。(mAb 36-19、58-64和pAb-TF识别的表位按顺序下划线显示，分别为SEQID NO:63、64和65)。黑色下划线显示突变体KO1的提前终止密码子的位置(图2B)。(图5C)移码肽LMTWVFLK的串联质谱鉴定自凝胶切片(顶部)和合成肽(底部)。
图6.纯化自用基因型II PRRSV分离株SD23983感染的细胞的nsp2TF的质谱分析。(A)将PRRSV-感染或模拟感染的MARC-145细胞裂解物用nsp2-特异性的mAb 140-68免疫沉淀。将免疫沉淀的蛋白通过SDS-PAGE分离并用考马斯蓝染色。显示分子量标记和(推定的)PRRSV蛋白的位置。(B)nsp2TF的完整氨基酸序列(SEQ ID NO:76)。通过质谱分析法鉴定的肽以灰色显示(SEQ ID NO:77-90)。跨越移码位点的肽高亮显示(SEQID NO:91)。
图7.nsp2-相关产物和nsp2TF突变体的放射免疫沉淀分析。将新合成的蛋白用35S代谢标记，并且将细胞裂解物用mAb58-46或pAb-TF免疫沉淀。将免疫沉淀的蛋白通过SDS-PAGE分离并通过放射自显影术可视化。SDS-PAGE期间使用的分子量标记和nsp2-相关产物的位置在每幅的侧面指示。(A)PRRSV-感染的MARC-145细胞的脉冲追踪实验。标记蛋白合成1hr.，并且追踪如图上所示的各种肽。C0h道用来在nsp2、nsp2TF和nsp2N的量的基础上估计移码效率，导致估计的-2和-1移码的效率分别为20％和8％。(B)重组痘苗病毒/T7聚合酶系统中ORFla表达的分析。将RK-13细胞模拟转染或用pLla质粒DNA转染。将蛋白分析标记30min并追踪长达2hr。(C)重组痘苗病毒/T7RNA聚合酶表达系统中nsp2TF突变体的分析。利用表达全长ORF1a多聚蛋白的pL1a骨架构建每个突变体。将RK-13细胞用如图顶部所示的每个构建体的质粒DNA转染。箭头指向来自突变体KO1的C-端截短的nsp2TF产物。
图8.利用重组痘苗病毒/T7RNA聚合酶表达系统分析N-或C-端ORF1a截短，显示PRRSV中的高效-2移码需要nsp1β。将RK-13细胞模拟转染或用如每幅图顶部所示的pL-nsp构建体转染。代谢标记之后，将表达产物用所示特异性抗体免疫沉淀。Ab mAb58-46和pAbnsp2-3识别nsp2和nsp2TF，而pAb-TF识别nsp2TF。将免疫沉淀的蛋白通过SDS-PAGE分离并通过放射自显影术可视化。nsp2和nsp2TF的位置在每幅图的左侧指示。99kDa：表达99kDa标记蛋白的对照构建体。pLnsp2-3-IFC：仅表达nsp2TF的读框内对照构建体。
图9.(A)nsp1β编码区的核苷酸和氨基酸序列比对(顶部序列：野生型核苷酸；野生型下的序列：pLnsp1βcc-2中突变的核苷酸；核苷酸以下：氨基酸)SEQ ID NO:34,35,36。(B-C)通过反式nsp1β表达刺激核糖体移码。将RK-13细胞用表达单独的nsp1β和nsp2(B,pLnsp2/1β)或者nsp1β-2融合蛋白(C,pLnsp1β-2和pLnsp1βcc-2)的质粒DNA共转染。质粒pLnsp1βcc-2包含合成的nsp1β编码序列，几乎每个密码子均同义突变(但是避免稀有密码子)。包括表达WT nsp2(pLnsp2)和nsp2TF(pL1a-IFC)的质粒作为对照。利用mAb36-19将细胞裂解物免疫共沉淀，并且通过蛋白印迹分析蛋白表达。如图侧面所示，将膜用nsp1β、nsp2和/或nsp2TF(在图中称作“TF”)的Ab探测。抗β-微管蛋白抗体用来检测β-微管蛋白的表达作为上样对照。
图10.nsp1β的表面可接近性预测和序列比对。(A)Emini表面可接近性预测；用灰框高亮显示的峰显示最高表面可接近性值。(B)来自代表性I型和II型PRRSV毒株的nsp1β的氨基酸序列比对。比对上显示的PRRSVnsp1β的二级结构元件是基于II型PRRSV XH-GD毒株的晶体结构(Xue etal.,2010)。高度保守的基序GKYLQRRLQ在框中高亮显示。顶部的氨基酸数字指在XH-GD毒株的nsp1β序列中的残基位置。图中所示的序列来自GenBank：GU737264(07V063)、GU067771(Amervac PRRS)、GU047344(BJEU06-1)、AY366525(EuroPPRSV)、EU076704(HKEU16)、FJ349261(KNU-07)、M96262(LV；Lelystad病毒)、GU047345(NMEU09-1)、DQ489311(SD01-08)、GQ461593(SHE)、EU624117(XH-GD)、EU708726(JX143)、AY424271(JA142)、DQ988080(Ingelvac ATP)、AF325691(NVSL)、AF494042(P129)、EF536003(VR2332)、EF488739(MN184)、AF066183.4(RespPRRSMLV)、KC469618(SD95-21)、EF112445(JXA1)、AY032626(CH-1a)、EU807840(CH-1R)、DQ779791(Prime Pac)、AF176348(PA8)、AF184212(SP).SEQ ID NO:64-150)
图11.利用重组痘苗病毒/T7RNA聚合酶表达系统分析nsp1βGKYLQRRLQ基序中的突变。将HEK 293T细胞(2x106)用重组痘苗病毒感染，然后模拟感染或者用表达来自I型PRRSV(EU)或2型PRRSV(NA)的nsp1β-2(或其突变体)的质粒DNA以1hpi感染。24小时温育之后，将蛋白用mAb58-46免疫沉淀并通过SDS-PAGE分析。大小标记和nsp2-相关产物在每张图的侧面指示。
图12.PRRSV nsp1β中RNA结合位点的预测。利用bioinfo.ggc.org/bindn的BindN软件万维网分析1型PRRSV SD01-08或2型PRRSV SD95-21的nsp1β氨基酸序列。文本行下的“+”符号表示预测的RNA-结合氨基酸，而“-”符号表示非结合氨基酸。行下的数字表示可信度，从水平0(最低)至水平9(最高)。用序列上的条突出GKYLQRRLQ基序。右上幅显示nsp1β晶体结构；注意蛋白表面上暴露的GKYLQRRLQ基序。SEQ ID NO:151和152。
图13.来自PRRSV、LDV和SHFV的nsp1β的氨基酸序列比对。通过ENDscript程序产生图。比对顶部显示的PRRSV nsp1β的二级结构元件是基于II型PRRSV XH-GD毒株的晶体结构(Xue et al.,2010)。图中所示的序列来自UniProt。保守基序GKYLQRRLQ(SEQ ID NO:158)高亮显示。缩写：hyd–亲水性；acc–晶体接触；a–蛋白和2个GLC分子之间的接触，以及晶体接触。SEQ ID NO:148-157
图14.WT PRRSV和nsp2TF敲除突变体的生长特征的比较。(A-B).来自1型PRRSV(A)和2型PRRSV(B)的nsp2TF敲除病毒和WT病毒的噬斑形态学。将汇合的MARC-145细胞单层用WT或重组病毒的10-倍系列稀释液感染。感染后2h，去除细胞培养上清并施用琼脂覆盖。在37℃下温育5天(1型病毒)或3天(2型病毒)之后检测噬斑，并且用0.1％结晶紫染色。(C-D).与来自1型PRRSV(C)和2型PRRSV(D)的WT病毒比较的nsp2TF敲除病毒的生长动力学。将MARC-145细胞用0.1MOI的每种病毒感染，并且在MARC-145细胞中通过荧光聚焦测定确定在12、24、36、48、60和72hpi下产生的病毒的量。所示结果是来自3个重复的平均值，并且病毒滴度表示为荧光聚集单位/毫升(FFU/ml)的数量。
图15.nsp2TF敲除突变对PRRSV的deISGylation能力的影响。将MARC-145细胞用0.1MOI的野生型PRRSV或nsp2TF敲除突变体感染。包括模拟感染的细胞作为对照。感染后24h，用1,000U/ml的IFN-α刺激细胞。(A)在刺激后12h收获细胞并通过免疫印迹进行分析。通过抗ISG15多克隆抗血清检测游离和缀合形式的ISG15。MAb 123-128用来检测nsp1β的表达。抗β-微管蛋白抗体用来检测β-微管蛋白的表达(上样对照)。(B)用35S 1h代谢标记之后，将nsp2-相关产物用mAb140-68免疫沉淀。将沉淀的蛋白通过SDS/PAGE分析并通过放射自显影术检测。
图16.nsp2TF敲除突变对PRRSV的去泛素化能力的影响。将HEK-293T细胞用表达HA-标记的泛素的质粒以及野生型PRRSV或nsp2TF敲除突变体的全长cDNA克隆共转染。在转染36h将细胞裂解，并且利用抗HA mAb通过蛋白印迹进行分析。MAb 123-128用来检测nsp1β的表达。抗β-微管蛋白抗体用来检测β-微管蛋白的表达(上样对照)。
图17.来自用野生型PRRSV攻击的未免疫和免疫的猪的病毒载量和总肺病理学的比较。如黑色垂直虚线所示，在28dpv攻击猪。(A)通过实时RT-PCR定量的Log病毒载量(RNA拷贝数/ml)。(B)在攻击后13天未免疫接种和免疫接种的猪的组之间总肺病变评分的比较。肺病变评分是基于评价每个肺叶中的肺炎百分比，然后整个肺相加来赋值的。数据点显示为总肺病变评分的平均百分比。
图18.来自用nsp2TF敲除突变体或野生型病毒免疫接种的猪的活化的PBMC中免疫标记基因表达的比较。在7dpv收获PBMC并在培养中用突变体病毒、亲代病毒或培养基刺激。刺激后24h收获细胞培养上清。通过Luminex荧光微球免疫测定确定细胞因子蛋白IFN-a(A)或IL-8(B)表达。利用5-参数logistic回归曲线插入每个数据点，并且显示为与猪的阴性对照组相比的平均荧光单位的倍数变化(n＝3)。
图19.用nsp2TF敲除突变体或野生型病毒免疫接种的猪中的免疫应答。(A)通过IDEXXPRRSV ELISA 3XR试剂盒测量的PRRSV-特异性血清抗体。认为大于0.4的S/P比值为阳性。(B)通过荧光聚焦中和测定确定的血清中和抗体反应。结果解释为病毒感染的90％减少，并且中和抗体滴度表示为平均值(n＝5)且在log2规模上表达。野生型病毒用于病毒中和测定。
发明详述
定义
如本文所用，列举的术语具有以下含义。本说明书中使用的所有其他术语和短语具有如本领域技术人员理解的普通含义。这类普通含义可以参考技术词典获得，如Hawley’s Condensed Chemical Dictionary 14th Edition,by R.J.Lewis,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,2001。
在本说明书中提到“一个实施方案”、“一实施方案”等，表示所述实施方案可以包括特定方面、特性、结构、部分或特征，但是不必每个实施方案均包括该方面、特性、结构、部分或特征。此外，这类短语可以但不必指本说明书的其他部分中提到的相同实施方案。而且，当连同实施方案描述特定方面、特性、结构、部分或特征时，影响或连接这个方面、特性、结构、部分或特征与其他实施方案(无论是否明确描述)在本领域技术人员的知识内。
单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个”包括复数指代，除非上下文另有明确指定。还应当注意权利要求可以起草为排除任何任选存在的元素。因此，这种陈述旨在用作使用专有术语的前提基础，如“唯一”、“仅”等，连同权利要求元素的陈述或使用“否定”限制。
术语“和/或”表示项目的任一个，项目的任何组合，或者这个项目相关的所有项目。本领域技术人员容易理解短语“一个或多个”，特别是在其使用的上下文中阅读时。
术语“约”可以指指定值的例如±5％、±10％、±20％或±25％的变化。例如，在一些实施方案中，“约50”百分比可以具有45-55百分比的变化。对于整数范围，在范围的每一端，术语“约”可以包括大于和/或小于所列整数的一个或两个整数。除非在本文中另有说明，术语“约”意图包括在单独的成分、组合物或实施方案的功能性方面等同的接近所列范围的值，例如重量百分比。
技术人员会理解，所有数字，包括表示成分的数量，特性如分子量、反应条件等的那些数字均为近似值，并且理解为在所有情况下任选地由术语“约”修饰。这些值可以变化，取决于本领域技术人员利用本文描述的教导试图获得的期望特性。还应当理解这类值固有地包含在它们各自的测试测量中发现的标准差必然导致的可变性。
本领域技术人员会理解，为了任何或所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文列举的所有范围还涵盖任何和所有可能的亚范围及其亚范围的组合，以及组成该范围的单独的值，特别是整数值。列举的范围包括该范围内的每个具体值、整数、小数或特性。任何所列的范围可以容易地识别为充分描述并使得能够将相同范围分为至少相等的两半、三分之一、四分之一、五分之一或十分之一。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以容易地分为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。
本领域技术人员还会理解，所有语言如“多达”、“至少”、“大于”、“少于”、“多于”、“或更多”等包括所列的数字，并且这类术语指如上文讨论的随后可以分解为亚范围的范围。以相同的方式，本文所列的所有比值还包括落在较广比值内的所有亚比值。
本领域技术人员还会容易地认识到当成员以普通方式分组在一起时，如在Markush组中，本发明不仅涵盖作为整体列出的整个组，而且还单独涵盖组的每个成员以及主组的所有可能的亚组。此外，为了所有目的，本发明不仅涵盖主组，而且还涵盖缺少一个或多个组成员的主组。因此本发明设想明确排除所列组的任何一个或多个成员。因此，限制性条件可以应用于任何公开的类别或实施方案，从而可以从这类类别或实施方案排除任何一个或多个列举的元素、类别或实施方案，例如，用于明确的负限制。
术语“接触”指触摸、使得接触或者使得邻近或接近的动作，包括在细胞或分子水平，例如，在溶液中、反应混合物中、体外或体内进行生理反应、化学反应或物理反应。
“有效量”指有效治疗疾病、病症和/或疾病状况的量，或者带来所列效应如赋予免疫力或防止疾病发生的量。例如，有效的量可以是有效减少治疗的疾病状况或症状的发展或严重程度的量。确定治疗有效量在本领域技术人员的能力之内，特别是根据本文提供的详细公开。术语“有效量”意图包括例如有效治疗或预防疾病或病症，或者有效治疗宿主中疾病或病症的症状的本文所述化合物的量，或者本文所述化合物或组合物的组合的量。因此，“有效量”一般表示提供期望效果的量。
术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”包括(i)防止疾病、病理或医疗状况发生(例如，预防)；(ii)抑制疾病、病理或医疗状况或者阻止其发展；(iii)缓解疾病、病理或医疗状况；和/或(iv)减少与疾病、病理或医疗状况相关的症状。因此，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”延伸至预防，并且包括防止(prevent)、防止(prevention)、防止(preventing)、降低、停止或逆转治疗的疾病状况或症状的发展或严重程度。因此，适当时，术语“治疗”包括医疗、兽医、治疗和/或预防性给药。
术语“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”和“抑制(inhibition)”指减慢、中止、逆转疾病、感染、疾病状况或细胞组的生长或发展。例如与不存在治疗或接触时发生的生长或发展相比，抑制可以大于约20％、40％、60％、80％、90％、95％或99％。
如本文所用，术语“疫苗”指刺激宿主对病原体的免疫性的组合物。宿主免疫应答包含抗体(体液免疫应答)，以及先天和细胞介导的免疫应答，如产生细胞因子。因此疫苗可以保护个体免于疾病或者减少个体中疾病的影响。疫苗可以通过针注射(包括但不限于肌肉内、皮内或皮下)、通过口或通过气雾剂(包括但不限于鼻内递送)或者通过本领域技术人员已知的其他方式给药。
疫苗可以是任何数量的疫苗类型之一，包括但不限于活的减毒病毒(MLV)疫苗、灭活疫苗、类毒素疫苗、缀合疫苗、DNA或RNA疫苗、标记疫苗、重组细菌或病毒载体疫苗以及亚单位疫苗，其可以在任何地方包含1-20或更多个抗原。
减毒疫苗或修饰的活病毒疫苗是这样的疫苗，其中通过化学或物理过程或者通过遗传修饰将活病毒减弱，以便产生免疫应答而不引起疾病的严重影响。灭活疫苗(inactivated vaccine)或灭活疫苗(killed vaccine)是制备自已通过物理或化学过程杀死的病毒或细菌的疫苗。这些杀死的生物体不可以引起疾病。
如本文所用，“免疫”指人或动物受到保护免于疾病的过程。这个术语常与免疫接种或接种可交换地使用。
“联合疫苗”是包含在单一剂量中给药的两种或更多种疫苗的疫苗。
如本文所用，术语“抗原”指能够引起或诱导或刺激免疫应答，和/或特异性地与B和/或T细胞反应的物质。此外，如本文所用，抗原可以是细胞、细菌或病毒颗粒，或者它们的部分，或者免疫原性的合成、重组或天然存在蛋白或肽，或者它们的部分。抗原可以是病毒或细菌来源的，或者可以是对于生物系统是外源材料的物质。抗原可以称作免疫原。抗原还可以是病毒外壳的组分，或者完整或部分形式的病毒蛋白，或者病毒遗传物质，其中实际的病毒是疾病的病原体。
如本文所用，单词“减弱”定义为包括但不限于抑制、削弱、降低、损害、减少和下降。
如本文所用，单词“佐剂”定义为包括但不限于添加至疫苗组合物以增加个体对疫苗的免疫应答的物质(例如铝盐)。
如本文所用，“免疫原性”指包括抗原在内的物质诱导免疫应答的能力。
如本文所用，术语“动物”指任何生物界，包括但不限于动物界的成员，包括多细胞生物，以及通常不同于植物的单细胞生物，不同之处在于1)具有细胞但没有细胞壁，2)缺少叶绿素和光合作用的能力，3)需要更复杂的食物原料，例如蛋白质，4)组织至更大程度的复杂性，以及5)具有自发运动和对刺激快速运动反应的能力。如本文所用，术语动物还指任何动物界大区划或亚界，以及它们下的主要类别，包括但不限于：脊椎动物门，包括哺乳纲或哺乳动物，包括鸟纲或鸟、爬行纲、两栖纲、鱼纲或鱼、Marsipobranchiata(脊椎动物门)；以及狭心纲(头索动物门)。被囊动物亚门，包括樽海鞘纲，以及Ascidioidea或海鞘。有铰纲或Annulosa，包括昆虫纲、多足纲、Malacapoda、蛛形纲、海蛛纲、肢口纲、甲壳纲(节肢动物门)；以及环节动物门、Gehyrea(Anarthropoda)。蠕虫或蠕形动物，包括轮虫、毛颚动物门、线虫目、棘头虫纲、纽形动物门、涡虫纲、吸虫纲、绦虫纲、Mesozea、拟软体动物，包括腕足动物门和苔藓动物门。软体动物门，包括头足纲、腹足纲、翼足目、掘足纲、瓣鳃纲或无头纲。棘皮动物门，包括海参纲、海胆纲、Asterioidea、蛇尾纲和海百合纲。腔肠动物门，包括珊瑚虫纲或珊瑚虫、栉水母门以及水螅纲或水母。Spongiozoa或多孔动物门，包括海绵。原生动物，包括纤毛虫纲和根足亚纲。如本文所用，术语动物还指以下非限制性实例：人、灵长类、狗、猫、奶牛、羔羊、猪、阉猪、家禽、马、母马、骡子、公驴、母驴、雄马驹、小牛、一岁家畜、公牛、牛、绵羊、山羊、美洲驼、野牛、水牛、羔羊、小山羊、小猪、母鸡、小鸡、火鸡、鸭、鹅、鸵鸟、其他鸟类或家禽、兔、野兔、豚鼠、仓鼠、大鼠、其他啮齿动物、鱼和其他水生动物，以及两栖动物。如本文所用，术语“动物”额外地指转基因动物。
如本文所用，哺乳动物包括灵长类、人、啮齿动物、犬、猫、牛、羊、马、猪、山羊、牛等。
如本文所用，术语“病毒”指不能在宿主细胞外复制或繁殖的亚显微感染性物质。其是非细胞的。其由蛋白外壳和任选存在的膜壳包围的DNA或RNA核心组成。
如本文所用，短语“RNA病毒”一般指包含RNA作为其遗传物质的病毒。信使RNA(mRNA)是携带蛋白合成的遗传编码信息的RNA分子。RNA病毒可以根据它们RNA的意义或极性进一步分类为负义RNA病毒、正义RNA病毒和双链RNA病毒。负义病毒RNA与mRNA相似，因此可以在病毒感染时通过宿主细胞立即翻译。这类病毒需要RNA依赖性RNA-聚合酶来复制它们的RNA，但是动物细胞看来不具有合适的酶。因此，这种类型的动物RNA病毒需要编码RNA依赖性RNA聚合酶。
如本文所用，术语“表位”指在动物中具有抗原或免疫原活性的多肽或蛋白的位点或片段。具有免疫原活性的表位是在动物中引起抗体应答的多肽或蛋白的位点或片段。具有抗原活性的表位是如通过本领域技术人员公知的任何方法，例如通过免疫测定确定的抗体免疫特异性结合的多肽或蛋白的位点或片段。
如本文所用，在蛋白物质的上下文中，术语“片段”指包含氨基酸序列的肽或多肽，所述氨基酸序列具有肽、多肽或蛋白的氨基酸序列的至少2个连续氨基酸残基、至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、至少250个连续氨基酸残基、至少300个连续氨基酸残基、至少300个连续氨基酸残基、至少500个连续氨基酸残基、至少750个连续氨基酸残基、至少1000个连续氨基酸，或者6-75个连续氨基酸残基、25-150个连续氨基酸残基、或25-300个连续氨基酸残基。
如本文所用，在核酸的上下文中，术语“片段”指包含核酸序列的核酸，所述核酸序列具有编码肽、多肽或蛋白的核酸序列的至少2个连续核苷酸、至少5个连续核苷酸、至少10个连续核苷酸、至少15个连续核苷酸、至少20个连续核苷酸、至少25个连续核苷酸、至少30个连续核苷酸、至少35个连续核苷酸、至少40个连续核苷酸、至少50个连续核苷酸、至少60个连续核苷酸、至少70个连续核苷酸、至少连续80个核苷酸、至少90个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸、至少125个连续核苷酸、至少150个连续核苷酸、至少175个核苷酸、至少200个连续核苷酸、至少250个连续核苷酸、至少300个连续核苷酸、至少350个连续核苷酸、至少380个连续核苷酸，或者8-75个连续核苷酸、25-150个连续核苷酸、或25-300个连续核苷酸。
如本文所用，术语“感染”表示细胞或个体中病毒的侵入和存在。在一实施方案中，感染是“主动”感染，即其中病毒在细胞或个体中复制的感染。这样的感染的特征在于病毒从病毒最初感染的细胞、组织和/或器官扩散至其他细胞、组织和/或器官。感染还可以是潜伏性感染，即其中病毒不复制的感染。在一实施方案中，感染指细胞或个体中病毒的存在或者通过病毒侵入细胞或个体所致的病理状态。
如本文所用，在病毒的上下文中，术语“分离”指源自单一亲代病毒的病毒。病毒可以利用本领域技术人员已知的常规方法分离，包括但不限于那些基于噬斑纯化和有限稀释的方法。
如本文所用，在除蛋白物质或核酸以外的化合物的上下文中，术语“分离”指在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品的化合物。短语“基本上不含化学前体或其他化学品”包括制备具有少于约30％、25％、20％、10％、5％或1％(干重)的化学前体或其他化学品的化合物。在一具体实施方案中，化合物约60％，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％或99％不含不同化合物。在另一具体实施方案中，本文公开的化合物是分离的。如本文所用，在蛋白物质(例如，蛋白、多肽或肽)的上下文中，术语“分离”指这样的蛋白物质，其基本上不含细胞物质或者不污染来自其源自的细胞或组织来源的蛋白，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。
短语“基本上不含细胞物质”包括制备蛋白物质，其中所述蛋白物质分离自其分离或重组产生的细胞的细胞组分。因此，基本上不含细胞物质的蛋白物质包括制备蛋白物质，其具有少于约30％、25％、20％、15％、10％或5％(干重)的污染蛋白(例如，异源蛋白、多肽或肽)。当蛋白物质重组产生时，其还优选基本上不含培养基，即培养基少于蛋白制品体积的约20％、15％、10％或5％。当蛋白物质通过化学合成产生时，其优选基本上不含化学前体或其他化学品，即其分离自参与蛋白物质合成的化学前体或其他化学品。因此，这类蛋白物质的制品具有少于约30％、20％、10％、5％(干重)的除所关注的蛋白物质以外的化学前体或化合物。在一具体实施方案中，本文公开的蛋白物质是分离的。
如本文所用，术语“小分子”和类似术语包括但不限于肽、肽模拟物(peptidomimetic)、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、具有少于约10,000克/摩尔的分子量的其他有机和无机化合物(即，包括heterorganic和有机金属化合物)、具有少于约5,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物、具有少于约1,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物、具有少于约500克/摩尔的分子量的有机或无机化合物、具有少于约100克/摩尔的分子量的有机或无机化合物，以及这类化合物的盐、酯和其他药学可接受的形式。还涵盖这类化合物的盐、酯和其他药学可接受的形式。
如本文所用，术语“疗法(therapies)”和“疗法(therapy)”可以指任何方案、方法、组合物、制剂和/或物质，其可以用于预防、治疗、处理和/或改善疾病状况(例如，病毒感染或者与其相关的疾病状况或症状，或者疾病状况，其中减毒病毒可以用作载体以诱导对与该疾病状况相关的特定抗原的免疫应答)。在某些实施方案中，术语“疗法(therapies)”和“疗法(therapy)”指本领域技术人员已知的生物疗法，支持性疗法，和/或可用于治疗、处理、预防和/或改善疾病状况(例如，病毒感染或者与其相关的疾病状况或症状，或者疾病状况，其中减毒病毒可以用作载体以诱导对与该疾病状况相关的特定抗原的免疫应答)的其他疗法。在一实施方案中，疗法为减毒病毒或灭活病毒突变体。
如本文所用，短语“野生型病毒”指流行的、自然循环并产生典型的疾病爆发的病毒类型。
如本文所用，短语“检测系统”指本领域公知的用于确定蛋白存在的测定、方案或方法。可用于本发明的方法的检测系统的实例包括但不限于免疫测定，包括荧光、酶、放射和磁性；吸光度测定、比色测定；显微术；蛋白免疫染色；免疫沉淀；免疫电泳；免疫印迹；蛋白印迹；以及分光光度法。
可以利用本领域技术人员已知的遗传工程技术将突变工程化入本发明的病毒。
如本文所用，“TF ORF”指转换框架(transframe)开放阅读框。
如本文所用，nsp2指非结构蛋白2，其是pp1a和pp1b的蛋白酶切割产生的至少13种功能性非结构蛋白(nsp)之一。pp1a和pp1b是动脉炎病毒的大复制酶前体蛋白，其合成自基因组mRNA模板。
如本文所用，nsp2TF指通过本文所述的-2移码机制产生的转换框架蛋白。Nsp2TF由所有动脉炎病毒编码，除了EAV。
如本文所用，短语“-2移码”和“+1/-2移码”可以交换使用。
如本文所用，“猪繁殖与呼吸综合征病毒”或“PRRSV”指引起疾病PRRS、PEARS、SIRS、MSD和/或PIP(术语“PIP”现在看来是不受欢迎的)的病毒，包括PRRSV的Iowa毒株、在美国发现的其他PRRSV毒株(例如，VR 2332)、在加拿大发现的PRRSV毒株(例如，IAF-exp91)、在欧洲发现的PRRSV毒株(例如，Lelystad病毒，PRRSV-10)以及可能已出现和将来会出现的与这些病毒密切相关的变体。
未受影响的猪是尚未暴露于猪繁殖与呼吸系统疾病传染性物质，或者已经暴露于猪繁殖与呼吸系统传染性物质如PRRSV但尚未表现出该疾病的症状的猪。受影响的猪是表现出PRRS的症状或者从其可以分离PRRSV的猪。
如本文所用，“核酸”或“多核苷酸”指任何长度的包含嘌呤和嘧啶的聚合物，多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸或者混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。这包括单链和双链分子，即cDNA、mRNA、DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂化物，以及通过将碱缀合至氨基酸骨架形成的“蛋白核酸”(PNA)。这还包括含有修饰的碱基的核酸。
“载体”是用于将核酸转移入宿主细胞的任何方式。载体可以是另一DNA片段可以连接以带来所连接片段的复制的复制子。“复制子”是任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)，其功能为体内DNA复制的自主单元，即能够在其自身的控制下复制。术语“载体”包括用于在体外、离体或体内将核酸引入细胞的病毒和非病毒方式。病毒载体包括甲病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒、痘病毒、杆状病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、埃巴病毒和腺病毒载体。非病毒载体包括但不限于质粒、染色体、带电荷的脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白复合物以及生物聚合物。除了核酸，载体还可以包含一个或多个调控区，和/或可用于选择、测量和监测核酸转移结果(转移至哪个组织、表达的持续时间等)的选择标记。
“盒”指可以在特定限制性位点插入载体的DNA片段。DNA片段编码所关注的多肽，并且设计盒和限制性位点以确保盒插入正确的阅读框用于转录和翻译。
当这样的DNA已引入细胞时，细胞已被外源或异源DNA“转染”。
当转染的DNA引起表型变化时，细胞已被外源或异源DNA“转化”。转化DNA可以整合(共价连接)入组成细胞基因组的染色体DNA。
“核酸分子”指单链形式或双链螺旋的核糖核苷酸(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷酸(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或者它们的任何磷酸酯类似物如硫代硫酸酯和硫酯。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子仅指分子的一级和二级结构，并不将其限制于任何特定的三级形式。因此，这个术语包括在线性或环状DNA分子(例如，限制性片段)、质粒和染色体中发现的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构中，序列在本文中可以根据正常惯例描述，仅给出沿DNA的非转录链的5'至3'方向的序列(即，具有与mRNA同源序列的链)。“重组DNA分子”是已进行分子生物学操作的DNA分子。
如本文所用，“多肽”一般指具有超过8个氨基酸的肽和蛋白。
“保守修饰的变体”用于氨基酸和核酸序列。关于特定核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本上相同的序列。因为遗传编码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定多肽。例如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG全部编码氨基酸精氨酸。因此，在通过密码子指定精氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述的任何相应的密码子而不改变编码的多肽。这类核酸变化为“沉默取代”或“沉默变化”，其为“保守修饰的变化”的一个种类。本文所述的编码多肽的每个多核苷酸序列还描述每个可能的沉默变化，除非另有说明。因此，沉默取代是编码氨基酸的每个核酸序列的隐含特征。技术人员会认识到可以通过标准技术修饰核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)以获得功能上相同的分子。在一些实施方案中，优选优化编码PAD的核苷酸序列用于在用来产生酶的特定宿主细胞(例如，酵母、哺乳动物、植物、真菌等)中表达。
对于氨基酸序列，技术人员会认识到在编码的序列中改变、添加或缺失单一氨基酸或一小部分氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列的单独取代、缺失或添加是在本文中称作“变体”的“保守修饰的变体”，其中改变导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。参见例如，Davis et al.,“Basic Methods in MolecularBiology”Appleton&Lange,Norwalk,Connecticut(1994)。这类保守修饰的变体除本发明的多态变体、种间同系物和等位基因之外，并且不排除本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。
以下8组每个包含互相保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton,1984,Proteins)。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“相同性”指如利用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法用下文所述的默认参数测量的，或者通过手动比对和肉眼观察测量的，相同或者具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列(即，当在比较窗口或指定区域中比较并比对最大对应性时，在指定区域中(例如，PRRSV的nsp2TF蛋白的表位中)，约70％相同性，优选75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性)。则表示这类序列“基本上相同”。这个定义还指测试序列的互补物。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。如下文所述，优选算法可以导致缺口等。优选地，相同性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域中，或者更优选长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域中，或者更优选所述两个或更多个核酸或多肽序列的整个长度中。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果必要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定可选参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列相同性。
如本文所用，“比较窗口”包括引用选自20-600，通常约50-约200，更通常约100-约150的连续位置数量的任一个的片段，其中可以在将两个序列优化比对之后，将序列与相同连续位置数量的参考序列进行比较。比对序列用于比较的方法是本领域公知的。用于比较的序列的最佳比对可以这样进行，例如通过Smith&Waterman,1991,Adv.Appi.Math.2:482的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman,1988,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin GeneticsSoftware Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者通过手动比对和肉眼观察(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.1995supplement)。
适合确定百分比序列相同性和序列相似性的算法的另一实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.,1977,Nuc.AcidsRes.25:3389-3402和Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215:403-410。进行BLAST分析的软件可通过ncbi.nlm.nih.gov/)的美国国家生物技术信息中心万维网公开获得。这个算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，其匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称作邻近字评分阈值(上文Altschul et al.)。这些初始的邻近字命中用作开始搜索以发现更长的包含它们的HSP的种子。字命中沿每个序列的两个方向延伸，只要累积的比对评分可以增加。对于核苷酸序列，利用参数M(匹配残基对的奖励评分；通常>0)和N(错配残基的处罚评分；通常<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，评分矩阵用来计算累积评分。在以下情况时每个方向的字命中延伸停止：累积的比对评分从其达到的最大值减少数量X；由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积评分变为0或以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3、和期望值(E)10、和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比对(B)50、预期值(E)10、M＝5、N＝-4、和两条链的比较作为默认值。
BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见例如，Karlin&Altschul,1993,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的相似性的一个度量是最小总概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总概率小于约0.2，更优选小于0.01，并且最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
如下文所述，两个核酸序列或多肽基本上相同的指示是第一核酸编码的多肽与针对第二核酸编码的多肽产生的抗体免疫交叉反应。因此，例如，当两个肽的不同之处仅为保守取代时，多肽通常与第二多肽基本上相同。如下文所述，两个核酸序列基本上相同的另一指示是两个分子或它们的互补物在严格条件下互相杂交。两个核酸序列基本上相同的另一指示是相同引物可以用来扩增所述序列。
除非另有说明，“抗原决定簇”是能够在特定动物或物种中引起免疫应答的分子。抗原决定簇包括蛋白分子，即可以包括其他部分(例如，糖部分，如聚糖，和/或脂质部分)的多氨基酸序列、多肽、片段、衍生物或变体。
本发明的抗原决定簇还可以是异源的，包括来自其他病毒、PRRSV毒株或家族的中和表位的抗原决定簇，其与应答于本发明的2TF而产生的抗体或抗血清有交叉反应，例如，针对包含SEQ ID NO:63、64和65异源二聚体或者与其至少70％相同的序列的表位的抗体，这些表位能够在特定动物如猪中引起免疫应答。
短语“生物学样品”指通常包含抗体或病毒颗粒的哺乳动物(例如，猪、兔、马)的流体或组织。这类组分是本领域已知的，并且包括但不限于血液，血浆，血清，脊髓液，淋巴液，呼吸道、肠道或泌尿生殖道的分泌物，泪液、唾液、乳汁、白细胞以及骨髓瘤。
如本文所用，抗体在与本领域内认可一致的术语中定义：它们是通过哺乳动物生物体对抗原攻击应答产生的多亚基蛋白。本发明的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，以及这类抗体的片段，包括但不限于Fab或F(ab')hd2，以及Fv片段。
如本文所用，在结合至抗原决定簇的抗体的上下文中，术语“特异性的”或“特异性”或它们的语法变化指抗体对抗原决定簇的结合强度。抗原与抗原决定簇结合蛋白解离的平衡常数(KD)是抗原决定簇与抗原结合蛋白上的抗原结合位点之间结合强度的度量：低KD值表示抗原决定簇与抗体之间的强结合强度。作为另一种选择，亲和力还可以表示为亲和常数(KA)，其为1/KD)。通常，抗体会以10-5-10-12摩尔/升或更少，并且优选10-7-10-12摩尔/升或更少，并且更优选10-8-10-12摩尔/升的解离常数(即以105-1012升/摩尔或更多，并且优选107-1012升/摩尔或更多，并且更优选108-1012升/摩尔的结合常数(KA))结合至它们的抗原决定簇。一般认为大于10-4mol/升的KD值表示非特异性结合。优选地，本发明的抗体会以少于500nM，优选少于200nM，更优选少于10nM，如少于500pM的亲和力结合至期望的抗原决定簇。抗体对抗原决定簇的特异性结合可以以已知的任何合适的方式确定，包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定，以及本领域已知的它们的不同变体。
如本文所用，术语“灭活”表示包含不能复制和/或生长的传染性生物体的疫苗。
如本文所用，术语“PRRSV”指属于动脉炎病毒科内的动脉炎病毒属中的物种PRRSV的所有病毒。
如本文所用，术语“保护(protecting)”、“保护(protection)”、“保护性免疫”或“保护性免疫应答”旨在表示宿主猪对本发明的疫苗或多肽产生主动免疫应答，从而在随后暴露于病毒或致命的病毒攻击时，猪能够对抗感染。因此，保护性免疫应答会降低宿主猪中来自随后暴露于病毒的发病率和死亡率的发生率。本领域技术人员会理解在商业猪背景中，保护性免疫应答的产生可以通过评价免疫接种对群整体的影响来评价，例如，在少数免疫接种的猪中仍可以有发病率和死亡率。此外，保护还包括与未受保护的相似猪中通常由分离株引起的那些变化或症状相比(即，相对于适当的对照)，任何严重或组织病理学变化(例如，肺病变)和/或PPRS疾病的症状的严重程度减轻。因此，保护性免疫应答会减少PRRSV的症状，包括但不限于PRRS的临床表现或症状的减少，包括与对照猪相比体重减轻、体重增加减少、嗜睡、呼吸窘迫、“thumping”(用力呼气)、发热、被毛粗糙、打喷嚏、咳嗽、眼部浮肿、结膜炎、肉眼病变、显微肺病变、心肌炎、淋巴腺炎、脑炎和鼻炎。
如本文所用，术语“活病毒”指保留感染适当个体的能力的病毒(与灭活(杀死的)或亚基疫苗相反)。
如本文所用，“免疫有效量”指有效减少、消除、治疗、预防或控制PRRSV感染、疾病、病症或疾病状况的症状的量。
动脉炎病毒
Nidovirales目目前包含冠状病毒科(Coronaviridae)、Roniviridae和动脉炎病毒科(de Groot et al.,2012；Gorbalenya et al.,2006)。后者包括马动脉炎病毒(EAV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)和猴出血热病毒(SHFV)，其中EAV和PRRSV是经济上重要的兽医病原体(Snijder and Meulenberg,1998；Snijder and Spaan,2007)。Nidovirus采用正极性的单链、多顺反子RNA基因组，其指导复制复合物亚基的合成，包括RNA-依赖性RNA聚合酶和解旋酶。应当注意到一些冠状病毒如SARS-冠状病毒感染人。
动脉炎病毒是小的包膜病毒，其包含正极性的单链RNA基因组(denBoon et al.,1991；Meulenberg et al.,1993)。动脉炎病毒的基因组大约13-至16-kb。动脉炎病毒感染的结果是广泛的，包括无症状、持续性或急性感染，以及流产或致命的出血热。
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是全世界经济上重要的猪疾病。其特征在于母猪的晚期繁殖失败和新生猪的严重肺炎。PRRS的病原是本文中称作PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)的小的包膜病毒。PRRSV包含单链的正链RNA基因组。
正链RNA病毒中的基因组组织和基因表达
病毒完全依赖于宿主细胞，为了核糖体和翻译机制的其他组分用于它们的蛋白合成。在真核生物中，翻译起始主要依赖于mRNA的5'-依赖性扫描，期间在具有起始因子的复合物中，小核糖体亚基首先结合至5'帽结构并以5'至3'方向扫描，直至其遇到第一个合适的起始密码子，在这个点翻译开始(Jackson 2010)。结果，绝大多数的细胞mRNA基本上是单顺反子的，虽然在翻译非常短的ORF之后可以发生有效的重新起始。
在真核生物中细胞翻译机制基本上仅解码mRNA的最5'-端长开放阅读框(ORF)这一事实对非片段的RNA病毒施加了非常大的约束，其必须表达许多酶促和结构蛋白以完成它们的复制周期。克服这个限制的策略包括产生功能性单顺反子亚基因组mRNA、产生随后通过病毒和/或宿主编码的蛋白酶切割的前体多聚蛋白，以及使用非经典的翻译机制(如内部核糖体进入，遗漏扫描、核糖体移码和终止密码子通读(Firth&Brierley,2012))，通过所述策略可以从多顺反子mRNA翻译额外的ORF。非经典的翻译机制允许正链RNA病毒从有限数量的转录本表达多个蛋白，调控基因表达，以及另外操作宿主细胞翻译机制用于它们自己特殊需要。这些机制可以在基因组组织、翻译、多聚蛋白前体的翻译后加工和额外的亚基因组mRNA合成的水平操作。
包括具有目前已知最大的基因组的RNA病毒的Nidovirales目的成员利用许多这些策略(包括多聚蛋白表达、多个亚基因组RNA的合成、核糖体移码和遗漏扫描；图1A)以组织目前描述的最复杂的RNA病毒复制周期之一(Perlman et al.,2009；Masters,2006；Fang&Snijder,2010；Gorbalenya etal.,2006)。
动脉炎病毒的复制酶基因由2个长开放阅读框(ORF)ORF1a和ORF1b组成，其占据5'-端四分之三的基因组。ORF1a和ORF1b编码两个大复制酶前体多聚蛋白pp1a和转换框架融合物pp1ab，后者的表达取决于短ORF1a/ORF1b重叠区域中的-1核糖体移码(den Boon et al.,1991)。这种-1核糖体移码机制在Nidovirales目的所有成员中是保守的。
它们合成自基因组mRNA模板之后，通过4个(PRRSV/LDV)或3个(EAV)ORF1a编码的蛋白酶结构域指导的复杂的蛋白水解级联将pp1a和pp1ab加工为功能性非结构蛋白(nsp)(Ziebuhr et al.,2000；Fang and Snijder,2010)。pp1a和pp1ab的蛋白酶切割产生至少13种功能性非结构蛋白(nsp)，称作nsp1-nsp12，nsp1和nsp7区域均内部切割，分别产生nsp1α/nsp1β(PRRSV/LDV)和nsp7α/nsp7β(Ziebuhr et al.,2000；Fang and Snijder,2010)。
动脉炎病毒基因组的3'-端区域包含至少8个编码病毒结构蛋白的基因，所述病毒结构蛋白翻译自一组5'-和3'-共末端嵌套的亚基因组mRNA(在Pasternak et al.,2006中综述)。除了最小的mRNA，亚基因组mRNA在结构上是多顺反子的，但是通常仅它们的5'-端ORF翻译。已知的例外为mRNA 2和5，它们均为双顺反子的。
核糖体移码
包括Nidovirales目目前所有成员(Brierley et al.,1989；den Boon et al.,1991)在内的各种病毒的基因组具有诱导一部分翻译核糖体移码-1nt并继续翻译可选阅读框的序列(Brierley et al.,2010；Miller&Giedroc,2010)。当功能上重要时，这个过程称作-1程序性核糖体移码(-1PRF)。
真核-1移码位点通常由与共有基序X_XXY_YYZ相符的“滑动”七核苷酸组成，其中XXX通常表示任何3个相同的核苷酸(虽然已发现某些例外)，YYY严格地表示AAA或UUU，Z表示A、C或U，并且下划线分开0-框架密码子(Brierley et al.,1992)。这之后一般是刺激元件，其包含稳定的RNA二级结构，如假结或茎-环，在移动位点的下游5-9nt开始(Brierley et al.,2010；Miller&Giedroc,2010)。
相比之下，-2PRF显然非常罕见，并且直至申请人的发现，关于潜在的移动位点或刺激元件已知的非常少。在申请人的发现之前，在真核系统中有非常少的功能天然利用-2移码的实例。在不同动物和真菌中，细胞基因抗酶的表达包括+1移码(Ivanov&Atkins,2009)。但是，当哺乳动物抗酶在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中人工表达时，全长抗酶产物通过-2移码表达(Matsufuji et al.,1996)。这里刺激元件包含与移动位点3'邻近的终止密码子(UGC_UCC_uga)和3'-近端RNA假结结构。-2移码翻译阅读CSPD，并且认为移码主要包括GC_UCC上的P-位点滑动与空的A-位点。
在原核系统中，相对低效(约2.2％)的-2移码用于噬菌体Mu中gpGT尾装配蛋白的表达，虽然大部分通过移码表达gpGT的dsDNA噬菌体看来利用-1移码来代替(Xu et al.,2004)。
序列分析强烈建议CC_CUU_UUU上的-2移码用于阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)病毒1(TVV1；Su&Tai,1996；Goodman et al.,2011)中Gag-Pol的表达。但是，对于其他totivirids，TVV1中的移码可能相对低效，因为病毒粒子中的Gag-Pol:Gag比例极低(例如1-2％；Dinman et al.,1991；Liu et al.,1998)，这与本文所述的对PRRSV-2PRF的研究中观察到的更高效率形成鲜明对比(图7)。
以前尚未描述-2PRF的高效天然利用，直至申请人的发现。申请人已证实猪的经济上最重要的病原体之一PRRSV利用这种机制产生nsp2-相关的转换框架蛋白nsp2TF。生物信息学分析强烈建议这样的nsp2TF产物是由所有动脉炎病毒编码的，除了引人注目的例外EAV，其中ORF1a的相关区域基本上较小，并且具有显著差异。
申请人利用nsp2-和nsp2TF-特异性Ab在多个独立的免疫测定中实验证实病毒感染的细胞中nsp2TF的高效表达。申请人还通过纯化自感染细胞的蛋白的质谱分析证实nsp2TF的表达以及移码的确切位点和方向。申请人发现、鉴定并表征了与WT病毒的不同之处在于2个和9个核苷酸取代(关于ORF1a全部同义)的2个nsp2TF敲除突变体；两者均表现出残缺的较小的噬斑大小表型以及降低的感染子代滴度，这证实在培养细胞中，nsp2TF在病毒复制中的重要作用。
虽然典型的-1移码位点(X_XXY_YYZ)允许在P-和A-位点密码子:反密码子重新配对，仅在摇摆位置具有错配，但是申请人发现对于G_GUU_UUU上的-2移码不是这样，其中仅在A-位点中保持完美的重新配对(图5A)。在不同的动脉炎病毒序列中，七核苷酸之前的核苷酸通常为G或A；因此如果双链体形成，则移码后的P-位点反密码子:密码子双链体可以在多个位置具有错配。但是，虽然通过翻译核糖体严格监测A-位点双链体的完整性(Demeshkina et al.,2012)，但是并未这样严格监测P-位点双链体，并且甚至对于-1移码，允许经典XXX上的许多变化，包括UCC、GGA、GUU和GGU(Melian et al.,2010；Firth et al.,2010；den Boon et al.,1991；Loughran et al.,2011)。TVV1中潜在的-2移码位点(CC_CUU_UUU)以及SHFV分离株HQ845737和HQ845738中推测的-2移码位点(G_GUC_UCU)也与在A-位点中完美的重新配对但在P-位点中重新配对的潜力减少的主题一致。
除了少数例外，真核-1移码由3'-端RNA二级结构刺激，对ORF1a/ORF1b也广泛记录。
1PRF在动脉炎病毒和所有其他Nidovirus中保守(Brierley et al.,1989；den Boon et al.,1991；Brierley et al.,2010)。这类结构对于-2移码的刺激是否足够和/或必要仍需要确定。
但是，申请人的结果表明PRRSV和其他动脉炎病毒中的-2移码可以通过一级结构元件刺激来代替，所述一级结构元件包括与移动位点分开10nt的高度保守的下游CCCANCUCC基序。非结构化的3'序列也参与酵母中的+1移码刺激(Guarraia et al.,2007)和Semliki Forest甲病毒中的-1移码刺激(Chung et al.,2010)。
申请人在他们的分析中观察了各种nsp2-相关蛋白。在以前的利用基因型II PRRSV分离株VR2332的研究中也观察到相似的现象，其中推测这类nsp2-相关产物源自使用可选的N-和/或C-端切割位点(Han et al.,2010)。这些产物中至少一种看来对应于nsp2TF，虽然一些其他产物看来源自在图7中的脉冲追踪实验中观察到的翻译后修饰。
此外，G_GUU_UUU基序还是合适的-1移码的移动位点(Loughran et al.,2011)，并且观察到可能的-1移码产物(nsp2N)(图3&7)。在大多数PRRSV序列中(205/212，包括分离株SD01-08)，这样的移码会导致在-1框架终止密码子立即终止(在不同PRRSV分离株中全部表示G_GUU_UUU_ga、G_GUU_UUU_ag和G_GUU_UUU_aa)。
nsp2N条带的质谱分析法鉴定了对应于预测的-1移码产物的C-端的肽，虽然形式上这样的肽还可以源自nsp2或nsp2TF在这个位置的内部切割。在表达其中移码位点突变的SS突变体时未观察到这个蛋白的事实进一步支持鉴定nsp2N条带为-1移码产物。会继续研究各种nsp2-相关产物的性质和翻译后修饰，但是迄今为止积累的数据毫无疑问，高效-2PRF发生，并且可能在相同核苷酸序列伴随有较低水平的-1移码。
动脉炎病毒pp1a和pp1ab复制酶多聚蛋白合成之间的平衡由(另一)核糖体移码事件-1PRF(图1A)调控，导致估计的约4:1的pp1a:pp1ab比例(denBoon et al.,1991)。现在显然不同非结构蛋白的表达水平受到高效-2PRF和-1PRF的进一步影响以产生nsp2TF和(推测的)nsp2N，导致一系列更复杂的比例。在ORF1a的5’端AUG密码子起始并翻译nsp1α/nsp1β的核糖体中，～20％会继续合成nsp2TF，～8％继续合成nsp2N，而其他～72％合成nsp2-nsp8，并且仅～14％翻译ORF1b-编码的蛋白nsp9-nsp12，包括病毒RNA聚合酶(nsp9)和解旋酶(nsp10)。
β逆转录病毒和δ逆转录病毒在它们的Gag-Pro-Pol多聚蛋白的表达中也采用2个核糖体移码(均为-1PRF)(Jacks et al.,1987；Moore et al.,1987)。在β逆转录病毒和δ逆转录病毒中，Gag、Pro和Pol为连续的末端重叠的ORF，并且与动脉炎病毒相比，聚合酶通过移码两次的核糖体翻译。相似地，在许多其他RNA病毒中，聚合酶(一般需要比复制复合物的某些其他组分低很多的量)通过各种机制以较低水平产生，如终止密码子通读或相对低效翻译的基因组片段，或者例如通过降解或在包含体中隔离来去除过量的聚合酶(在Ahlquist,2006中综述)。
PRRSV nsp2是最大的复制酶切割产物，通常由1060-1196个氨基酸组成，这取决于分离株。其通过靶向nsp1β/2位点的nsp1β中的上游木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLPβ)的自身蛋白水解活性(den Boon et al.1995)，以及位于nsp2的N-端结构域中的蛋白酶PLP2切割nsp2/3位点(Snijder et al.,1995)来释放。Nsp2为多结构域和多功能蛋白。
除了切割nsp2/3位点，在加工ORF1a编码的多肽的C-端部分期间nsp2的功能为nsp4丝氨酸蛋白酶(SP)的辅因子(Wassenaar et al.,1997)。nsp2而不是nsp2TF的C-端结构域是未知功能的高度保守的富含Cys的结构域(Snijder et al.,1994)。此外，预测nsp2为多次跨越的跨膜或TM蛋白，并且参与推测搭建病毒复制复合物的装配的膜复制结构的形成(Knoops 2012；Pedersen et al.,1999)。
除了在病毒复制中的这些重要作用，最近的研究还表明nsp2参与病毒发病机理。具体地，已报道PLP2结构域具有去泛素化和deISGylating活性(Frias-Staheli,et al.,2007；Makarova et al.,2000；van Kasteren,et al.,2011；Sun et al.,2010,2012)。这些活性的生物学意义通过PLP2抑制I型干扰素(IFN)活化并拮抗ISG15的抗病毒作用的能力来证实。最后，认为看来对于PRRSV复制较不必要或不必要的nsp2的某些区域在体内调节宿主免疫应答中起作用(Chen et al.,2010；Sun et al.,2012)。
nsp2TF蛋白增加基因组的这个区域中编码的(潜在)功能的复杂性。nsp2TF蛋白是重要蛋白这一事实通过其在4种远亲动脉炎病毒的3种中保守以及申请人的反向遗传学研究证实。移码信号正好位于编码预测的nsp2TM结构域的区域上游。因此，nsp2和nsp2TF共享PLP2结构域和nsp2的“高变区”，但是两个蛋白具有不同的C-端片段。nsp2TF的C-端区域比nsp2的短(在PRRSV SD01-08中短177aa)，但是像nsp2，包含许多预测的TM区域。
编码nsp2的核酸序列中的-2移码位点由7个连续的核苷酸编码，其中前5个在编码nsp2TF编码区的TF编码部分的第一个氨基酸的核苷酸之前，而最后2个编码nsp2TF编码区的TF编码部分的第一个氨基酸的密码子的前2个核苷酸。
来自申请人的反向遗传性分析的结果表明，虽然nsp2TF对于病毒的生存力不是必要的，但是其对于最大病毒适应度是必要的。如本文提供的实验中证实的，当nsp2TF表达敲除(突变体KO2)或产生C-端截短的nsp2TF(突变体KO1)时，申请人发现病毒显然是残缺的，表现出这样的表型，其特征在于较低滴度的感染子代和减小的噬斑大小。
申请人利用破坏性最小的方法设计KO1突变体，仅将2个终止密码子引入TF ORF，而移码事件本身基本上不受影响(图7C)。因此预期KO1保持全长nsp2和nsp2TF/nsp2N移码产物之间天然比例。但是，如申请人所示，病毒的操作导致残缺的表型。这强调了对全长nsp2TF表达的需要。
申请人设计KO2突变体以完全敲除移码信号并仅表达nsp2。在申请人的实验中，KO2表现出受损最严重的生长表型。申请人的突变体KO2不表达nsp2TF，这足以损害病毒复制(如KO1突变体所证实的)。预期敲除移码信号还会上调所有下游nsp(nsp3-12)的表达，这可能扰乱小心平衡的不同nsp的表达水平。pp1a和pp1ab合成的水平看来受到严格控制，并且扰乱这种平衡产生各种后果。后果包括对通过nsp4复制酶蛋白水解加工(还利用nsp2作为辅因子)、复制复合物的形成、或者RdRp和解旋酶表达的上调的影响，全部均各自具有直接或间接影响病毒RNA合成的潜力。
市场上有几种利用灭活PRRS病毒或修饰的活病毒(MLV)的疫苗。目前可获得的疫苗一般有效针对同源毒株，但是关于疫苗安全以及保护对抗本领域中广泛的异源PRRSV分离株仍不断有问题(et al.,1997；Mengeling,2005)。实验PRRS疫苗(DNA、亚基和肽疫苗)(Huang et al.,2009；Kimman et al.,2009；Li et al.,2009；Wang et al.,2009)通常未产生足够的保护性免疫，并且这类疫苗是否可以比现有的MLV和灭活疫苗更有效还有待确定。因此，对比目前可获得的更有效的疫苗有显著需求。
目前疫苗的另一缺点是免疫接种的猪不可以与已从自然感染恢复的猪区分。遗传标记的疫苗会允许区分免疫接种和自然感染的猪，并且对于PRRS控制和根除程序是有价值的(Fang et al.,2008)。
为了其在PRRS疫苗开发中的潜在应用，申请人研究了nsp2区域。申请人鉴定-2PRF和nsp2区域中的重叠ORF对用于PRRS疫苗的新病毒的合理设计具有重要影响。PRRSV基因组的nsp2-编码区中核酸序列的操作可能无意地影响nsp2TF和所有下游复制酶亚基的完整性和/或表达水平，这可能对病毒复制具有削弱影响。另一方面，申请人发现这样的操作在修饰的活病毒疫苗设计中的用途。实际上，可以使用突变体如KO1和KO2以及进一步开发，用于修饰的活病毒疫苗。
由于其高度免疫原性的性质，还已研究nsp2区域用于诊断测定开发(Johnson et al.,2007；Brown et al.,2009)。序列分析显示nsp2TF的C-端区域包含预测的B细胞表位(Hopp and Woods,1983；Larsen et al.,2006)。这通过利用预测的位于蛋白3'端的B细胞表位CPKGVVTSVGESV产生nsp2TF-特异性的兔抗血清进一步支持。
申请人发现并表征nsp2TF为使用nsp2TF作为病毒的新抗原和/或诊断测定开发的潜在靶标提供了基础。此外，KO1或KO2突变体中引入的突变、截短或缺失为基于KO1或KO2的标记疫苗提供独特的标记(区域)同伴诊断测定。
除了其在疾病控制中的应用，移码机制本身在生物技术开发中具有重要应用，特别是因为很少高效且可诱导的移码信号是已知的。高效且可诱导的移码信号允许双顺反子构建体中第二基因的高效受控的表达。正如申请人发现的，TF表达依赖于移动位点下游的RNA序列基序(CCCANCUCC)、nsp1β-编码序列以及移动位点下游的保守RNA序列的存在。移码可以通过反式表达的nsp1β刺激，因此nsp1β(连同CCCANCUCC基序)或其部分可以用作分子开关以激活和失活期望基因的表达。
申请人已发现并鉴定动脉炎病毒基因组中存在的额外的编码序列，其蛋白产物nsp2TF在PRRSV复制中起作用。nsp2TF蛋白本身及其表达机制(-2PRF)在生物技术开发和疾病控制中具有重要应用。
申请人已鉴定一种新的动脉炎病毒蛋白，并且证实-2移码在功能上用作真核系统中的基因表达机制。
申请人的数据显示动脉炎病毒复制酶蛋白的表达受到两个不同的核糖体移码事件的影响，因此3个区域nsp1/2、nsp3-8和nsp9-12全部以不同水平表达。
申请人已发现新的核糖体移码事件，其在PRRS病毒的ORF1a的nsp2-编码部分的翻译期间发生。这个移码事件在ORF1a的中心区域中发生，并且包括保守的可选ORF。申请人已发现并表征了保守的可选ORF(称为TF)，其在大部分动脉炎病毒中编码并重叠ORF1a的部分，所述ORF1a的部分编码推定的nsp2的跨膜结构域(在本文中称作“TM”)，包括PRRSV(1型和II型)、LDV和SHFV的基因型。
申请人已发现相对于ORF1a，这个保守的可选ORF(TF)在-2阅读框中，并且通过-2PRF与nsp2的N-端部分翻译为转换框架融合物(nsp2TF)。申请人显示在保守的G_GUU_UUU基序发生的-2PRF以大约20％的效率这样进行。
申请人鉴定了所得的转换框架蛋白(称为nsp2TF)，并且在PRRSV-感染的细胞中利用nsp2TF-特异性抗体证实其表达通过-2PRF发生。TF结构域由独特的169-aa C-端区域组成，由TF ORF编码，融合至nsp2的N-端65-72％(取决于具体的毒株)。结果，nsp2和nsp2TF的N-端片段相同，而与nsp2相比，nsp2TF明显较短，并且包含独特的C-端结构域。
申请人的来自PRRSV nsp的质谱分析的数据进一步证实nsp2TF的表达以及移码的位点和方向。申请人的利用移码位点G_GUU_UUU和高度保守的下游CCCAxCUCC基序的位点定向诱变证实高效移码需要这两个元件。申请人进一步提供数据证实高效移码还需要nsp1β区域，并且移码可以通过nsp1β共表达反式激活。
申请人发现部分或完全防止nsp2TF表达的突变损害PRRSV复制，并且导致较小的噬斑表型(50-至100-倍降低的病毒滴度)。因为转移入TF阅读框的所有核糖体不会翻译复制酶基因的下游部分(编码nsp3-nsp12)，-2PRF连同下游ORF1a/ORF1b-1PRF的组合导致这样的表达方案，其中编码nsp1-2、nsp3-8和nsp9-12的3个复制酶基因区域以显著不同的水平各自翻译。因此，申请人发现的-2PRF在调整动脉炎病毒复制复合物的不同组分的表达水平中起着重要作用。
如本文提供的，本发明提供一种动脉炎病毒，其包含编码ORF1a或其功能性部分的核酸，其中所述核酸包含至少一个突变，导致与所述动脉炎病毒的野生型相比，在被所述动脉炎病毒感染的细胞中nsp2TF的翻译降低和/或翻译自所述核酸的一种或多种下游产物的翻译被改变。
在本发明的一实施方案中，动脉炎病毒任选地包括一个或多个突变，其干扰位于编码nsp2的区域中的-2移码位点处的-2核糖体移码。编码nsp2蛋白的核酸序列中的-2移码位点由7个连续的核苷酸组成，其中前5个在编码nsp2TF编码区的TF编码部分的第一个氨基酸的核苷酸之前，而最后2个组成TF ORF编码的第一个氨基酸的密码子的前2个核苷酸。
在另一实施方案中，本发明的动脉炎病毒任选地在移码位点GGU(U/C)U(U/C)U和/或保守的CCCANCUCC基序中包含至少一个突变。本发明的动脉炎病毒任选地在编码nsp1β蛋白编码区的核酸序列中包括一个或多个突变，其导致降低的-2PRF，例如在保守的GKYLQRRLQ基序中。所述一个或多个突变优选包含1型PRRSV的nsp1β中的K130和/或R134残基。所述一个或多个突变对于1型PRRSV，优选包含K130A和/或R134A，而对于II型PRRSV，优选包含K124A和/或R128A。
本发明进一步提供一种动脉炎病毒，其中与所述动脉炎病毒的野生型相比，在被本发明的动脉炎病毒感染的细胞中，nsp2TF功能降低和/或不存在。先前提到的本发明的动脉炎病毒任选地包含编码ORF1a或其功能性部分的核酸，其中nsp2TF氨基酸序列改变、截短或不存在。本发明的动脉炎病毒任选地编码改变的TF结构域的氨基酸序列，其中翻译所述氨基酸序列，并且任选地提供在野生型动脉炎病毒中不存在、但不损害ORF1a阅读框的表位。TF结构域的氨基酸序列优选包含SEQ ID NO:68和69或者与其至少70％相同的序列。
在一实施方案中，本发明的动脉炎病毒可以用来开发成功的标记疫苗，或者确定是否已给予个体包含遗传标记的疫苗。在另一实施方案中，本发明提供的一些动脉炎病毒可以自主复制。本发明的动脉炎病毒可以为PRRSV，包括但不限于1型(欧洲基因型)PRRSV，II型(北美基因型)PRRSV，包括亚洲高度致病性变体，或者它们的组合，或者乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)或猴出血热病毒(SHFV)。
此外，本发明的一实施方案提供编码本文提供的任何动脉炎病毒的RNA或cDNA。本文提供疫苗或免疫原性组合物，其包含本发明的任何动脉炎病毒、上述cDNA或它们的组合物，以及任选存在的药学可接受的载体或稀释剂。在本发明的一实施方案中还提供疫苗或免疫原性组合物，其任选地包含佐剂、赋形剂或它们的组合。
在另一实施方案中，本发明提供在个体中诱导对动脉炎病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的本发明的组合物。所述个体可以为动物。
本发明提供分离的或重组的蛋白，其包含全长或部分动脉炎病毒nsp2TF蛋白，优选包含SEQ ID NO:36、45和76所示的氨基酸序列以及部分序列46-67和77-91，或者与其至少70％相同的序列。如技术人员所知的，所述蛋白优选融合至另一蛋白和/或例如用Myc-标签(例如N-ILKKATAYIL-C、N-EQKLISEEDL-C)、HA-标签(例如N-YPYDVP-C)、His-标签(例如6xHis)、FLAG-标签(例如N-DYKDDDDK-C)、GST标签和/或生物素-标签标记。
此外，在本发明的一实施方案中，提供分离的或重组的抗体，并且所述抗体能够特异性地结合动脉炎病毒nsp2TF蛋白或本发明的蛋白。所述抗体优选结合动脉炎病毒nsp2TF蛋白的TF结构域，或者具有如SEQ IDNO:63、64或65所示的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列的蛋白。
本发明的一实施方案提供一种检测生物学样品中动脉炎病毒抗体的存在的方法，所述方法包括使生物学样品与一定量的nsp2TF抗原或其部分接触；利用检测系统检测是否存在nsp2TF抗原和抗体之间复合物；以及确定是否存在nsp2TF抗原和抗体之间复合物，其中复合物的存在表示对动脉炎病毒的免疫应答。
本发明的另一实施方案提供一种是确定生物学样品是否包含针对动脉炎病毒的抗体的方法，其中所述方法包括检测生物学样品中nsp2TF特异性抗体的存在。
本发明还提供一种区分感染野生型动脉炎病毒和/或用未修饰的动脉炎病毒株免疫接种的个体与用本发明的疫苗免疫接种的个体的方法，其中所述方法包括提供来自受试个体的样品，定性或定量或者定性且定量地确定样品中是否存在在位于编码nsp2TF的核酸序列的5’的-2移码位点处影响-2核糖体移码的突变，或者是否存在对编码nsp2TF的核酸序列的修饰；和/或确定样品中抗疫苗特异性的免疫原性表位的抗体的存在；和/或确定样品中抗所述野生型或未修饰的动脉炎病毒表达的表位的抗体的存在，所述表位在疫苗中不存在。
此外，本发明的一实施方案提供一种分型生物学样品中的动脉炎病毒的方法，其中所述方法包括确定位于编码nsp2蛋白的核酸序列中的-2移码位点的存在和/或序列；和/或确定动脉炎病毒中nsp2TF编码区的存在和/或序列。
本发明的另一实施方案是一种核酸，其包含与编码蛋白的核酸序列可操作连接的动脉炎病毒-2移码位点，其中所述蛋白不是动脉炎病毒蛋白，所述核酸还包含位于所述-2移码位点5’的核糖体翻译起始密码子。本发明的核酸中的动脉炎病毒-2移码可以包含序列GGU(U/C)U(U/C)U和/或CCCANCUCC。此外，本发明提供一种表达系统，其包含本发明的核酸之一，其中所述表达系统任选地进一步包含nsp1β或其功能性部分。
本发明的一实施方案提供一种确定物质是否能够干扰位于编码nsp2蛋白的核酸序列中的-2移码位点处的核糖体移码的方法，其中所述方法包括提供许可在所述位点处发生移码的翻译系统，其具有与所述位点可操作连接的编码遗传标记或报告物的核酸，使所述翻译系统与所述试剂接触，温育所述翻译系统和试剂混合物以允许翻译所述核酸；以及确定是否存在所述核酸编码的部分翻译产物。
在本发明的一实施方案中，上文提供的本发明的方法的翻译系统可以包含动脉炎病毒nsp1β蛋白或其功能性部分和/或是细胞。上文提供的本发明的方法的物质可以选自反义DNA、反义RNA、siRNA、微RNA、核酸类似物、肽或化合物。
在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含有效量的能够干扰动脉炎病毒中的-2移码的物质，以及任选存在的药学可接受的载体或稀释剂。本发明还提供一种治疗被动脉炎病毒感染的动物的方法，所述方法包括向所述动物给药有效量的本发明的药物组合物。
此外，本发明的一实施方案提供表达盒，其包含与异源启动子可操作连接的编码动脉炎病毒nsp2TF蛋白的核酸。本发明还提供包含本发明的表达盒的细胞。本发明的细胞任选地包含整合入所述细胞染色体的表达盒。本发明的任何细胞还可以包含如本发明提供的任何动脉炎病毒或者本发明的cDNA。本发明还提供包含本发明的细胞的动脉炎病毒包装细胞系。本发明还提供包含本发明的细胞的nsp2TF-表达稳定细胞系。此外，本发明提供的细胞系的细胞从异源启动子表达nsp2TF。本发明还提供用于本发明的任何方法的试剂盒。
本发明的一实施方案提供能够诱导或引起针对动脉炎病毒的免疫应答的免疫原性组合物。本发明的组合物可以包含载体，其包含本文所列序列中提供的任何序列中的一个或多个，或者包含构建体pL1a、pLnsp2-8、pLnsp1-2、pLnsp1β-2、pLnsp1βcc-2、pLnsp2、pLnsp1-3、pLnsp1β-3、pLnsp2-3、pLnsp2-3-IFC、pLnsp1β、pL1a-IFC、pL1a-KO1、pL1a-KO2、pL1a-SS、pL1a-CC1、pL1a-CC2、pSD01-08-IFC、pSD0108-KO1、pSD0108-KO2和pLnsp1βcc-2中的一个或多个，或者它们的任何部分、片段或组合，以及药学可接受的载体。
本发明的一实施方案提供在对所述动脉炎病毒(分别为LDV、SHFV或PRRSV)感染敏感的动物中诱导针对包括LDV、SHFV和PRRSV在内的动脉炎病毒的免疫应答的方法，向动物给药有效量的组合物，以及药学可接受的载体，其中所述组合物引起在动物中诱导免疫应答。
本发明的一实施方案提供动脉炎病毒，其在开放阅读框ORF1a中包含一个或多个突变，其中所述突变是这样的，动脉炎病毒中的nsp2TF生成改变、减少或完全消除。
本发明的一实施方案提供检测、鉴定或定量对猪生殖呼吸综合征病毒(PRRSV)的免疫应答的体外方法，所述方法包括使生物学样品与源自PRRSV的非结构蛋白2转换框架蛋白(nsp2TF)抗原接触，其中生物学样品中的抗体结合至nsp2TF抗原，引入检测是否存在nsp2TF抗原和抗体之间复合物的检测系统，以及定量或定性，或者定量和定性确定是否存在nsp2TF抗原和抗体之间复合物，其中复合物的存在表示对PRRSV的免疫应答。
本文所述化合物或组合物治疗或预防由包括但不限于PRRSV的动脉炎病毒引起的疾病的能力可以利用本领域公知的测定来确定。例如，免疫接种方案的设计、评价、数据分析以及免疫应答的定量可以用来确定本发明的化合物治疗或预防由动脉炎病毒引起的疾病的能力。
此外，化合物或组合物治疗或预防由包括但不限于PRRSV的动脉炎病毒引起的疾病的能力可以利用本领域技术人员已知和理解的测试来确定。例如，用于本发明的组合物和方法的合适的测定包括但不限于基于抗体的测定，基于核酸的测定，基于核酸的区别测定，如荧光微球免疫测定和实时RT-PCR。
本发明还提供在ORF1a中包含一个或多个突变的动脉炎病毒，其中动脉炎病毒中表达的nsp2TF蛋白改变、截短或不存在。根据本发明，动脉炎病毒中的突变包含干扰TF编码区的5’端处的-2移码的一个或多个突变和/或169-密码子TF编码区中的突变。TF编码区中的突变可以包含在TF编码区中插入一个或多个终止密码子、取代、缺失或它们的组合。本发明的动脉炎病毒还可以在CCCANCUC基序中包含突变。本发明的动脉炎病毒中的突变可以任选地在编码nsp1β蛋白的核酸序列中包含缺失。
本发明的动脉炎病毒可以是任何动脉炎病毒，包括但不限于PRRSV，包括但不限于1型PRRSV(欧洲基因型)，2型PRRSV(北美基因型)，两种基因型的任何变体，基因型内/之间的重组子和/或它们的组合，或者乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)，或者猴出血热病毒(SHFV)。
本发明的动脉炎病毒还可以包含遗传标记的引入。
本发明提供疫苗组合物，其包含一种或多种本发明的动脉炎病毒，以及药学可接受的载体。本发明还提供免疫原性组合物，其包含一种或多种本发明的动脉炎病毒，以及药学可接受的载体。本发明提供在对动脉炎病毒感染敏感的动物中诱导针对动脉炎病毒的免疫应答的方法，其中所述方法包括给药有效量的组合物，所述组合物包含一种或多种本发明的免疫原性组合物，其中诱导所述动物中的免疫应答。疫苗组合物和免疫原性组合物可以用于任何动物，包括但不限于哺乳动物、人和猪。
本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的抑制性核酸或核酸类似物，其中所述核酸或核酸类似物抑制动脉炎病毒中的-2PRF机制，以及药学可接受的载体和/或稀释剂。本发明的药物组合物可以任选地包含抑制性核酸，所述抑制性核酸选自反义DNA、反义RNA、ad微RNA、锁核酸、肽核酸、morphilino寡核苷酸或其他小分子，或者它们的组合。
本发明提供治疗被动脉炎病毒感染的动物的方法，所述方法包括向所述动物给药有效量的一种或多种本发明的药物组合物。
本发明还提供控制一种或多种外源基因的表达的表达系统，包括将来自动脉炎病毒的一个或多个移码信号以及编码一个或多个外源基因的一个或多个核酸分子插入核酸构建体。本发明的表达系统还提供将一个或多个移码信号插入核酸构建体，其中移码信号为G_GUU_UUU、G_GUC_UCU、G_AUU_UUU、G_GUU_UUC、CCCANCUCC或它们的组合，有或无nsp1β的共表达。
本发明提供动脉炎病毒敲除突变体用于疫苗和遗传表达系统，其中编码nsp2TF或其功能性部分的动脉炎病毒核酸在病毒基因组中已部分失活。本发明还提供动脉炎病毒敲除突变体，其中编码nsp2TF或其功能性部分的动脉炎病毒核酸在病毒基因组中已完全失活。
本发明提供检测生物学样品中动脉炎病毒抗体的存在的体外方法，其中使生物学样品与一定量的源自动脉炎病毒的非结构蛋白2转换框架蛋白(nsp2TF)的抗原接触，并且利用检测系统检测是否存在nsp2TF抗原和抗体之间复合物，其中只有在生物学样品包含抗原的抗体时，nsp2TF抗原和抗体之间的复合物会出现，并且其中复合物的存在表示对动脉炎病毒的免疫应答。
本发明提供一种确定是否存在nsp2TF-相关核酸(包括移码位点、nsp2TF的保守下游序列和整个nsp2TF ORF)的体外方法，其中所述确定是定量的、定性的、或者定量和定性的。
本发明提供疫苗构建体，其中nsp2TF蛋白表达和/或改变。本发明还提供疫苗构建体，其中nsp2TF蛋白表达完全或部分敲除。本发明还提供疫苗构建体，其中nsp2TF蛋白和所有下游非结构蛋白的表达水平均改变，包括但不限于其中nsp2TF蛋白的表达水平降低、升高或增强。本发明还提供疫苗构建体，其中nsp2TF蛋白本身基本上或部分或轻微地改变或增强。如本文提供的本发明的疫苗构建体可以用于任何动脉炎病毒物种。
本发明提供重组病毒，包括但不限于重组动脉炎病毒作为疫苗的用途，其中nsp2TF的表达完全或部分敲除，或者其中nsp2TF和所有下游非结构蛋白的表达均改变。本发明提供重组病毒，包括但不限于重组动脉炎病毒作为疫苗的用途，其中nsp2TF突变、截短或其他改变。
本发明提供重组病毒，包括但不限于重组动脉炎病毒作为疫苗的用途，其中移码效率改变，从而破坏、扰乱或中断复制酶表达的总调控。如本文提供的本发明的重组病毒可以是任何病毒物种。如本文提供的本发明的重组病毒可以是任何动脉炎病毒物种，包括但不限于任何乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)，任何猴出血热病毒(SHFV)，或者任何PRRS病毒物种，包括但不限于1型(欧洲基因型)PRRSV和2型(北美基因型)PRRSV、亚洲变体或它们的组合。
本发明提供分离、纯化的nsp2TF蛋白，以及包含TF结构域的免疫原性表位的蛋白和/或肽，或者编码nsp2TF蛋白或TF结构域的任何核酸，包括核糖核酸。
本发明还提供制备包含分离、纯化的nsp2TF蛋白的免疫原性组合物的方法，以及包含TF结构域的免疫原性表位的蛋白和/或肽，或者编码nsp2TF蛋白或TF结构域的任何核酸，包括核糖核酸，或者它们的组合。本发明提供nsp2TF作为胞内或胞外蛋白，或者作为病毒粒子蛋白引起动物免疫系统中的应答的用途，其中所述动物包括但不限于人和猪。根据本发明，免疫应答可以为但不限于适应性、获得性、体液、细胞介导、先天、被动或主动免疫应答。
本发明提供改变TF结构域的方法，从而nsp2TF蛋白的细胞定位改变，从而nsp2TF蛋白的去泛素化功能受损，并且其中nsp2TF蛋白的去泛素化活性降低或受到抑制。按照本发明，TF结构域的改变可以通过突变、使用小化合物、使用肽或其他公知的改变蛋白结构域的方法进行。
本发明提供nsp2TF在诊断测试中的用途，包括但不限于包含遗传标记的疫苗组合物的诊断测定，所述遗传标记包括但不限于改变或缺失TF编码区或nsp2TF氨基酸序列中的特定序列的突变。
本发明提供nsp2TF蛋白或TF结构域在基于抗体的测定中的用途。本发明还提供TF编码区和/或移码序列在基于核酸的测定中的用途。
本发明提供动脉炎病毒衍生的-2PRF-诱导核酸序列在生物技术应用中的用途，包括但不限于表达蛋白或其他分子的表达盒。进一步提供诱导所关注的蛋白的表达的方法，包括但不限于外源或非原生或异源蛋白或者它们的组合，使用选择的构建体中的一个或多个基于动脉炎病毒的-2PRF诱导核酸序列。用于本发明的基于动脉炎病毒的-2PRF诱导核酸序列可以任选地包括表达nsp1β的核酸序列。本发明提供来自任何动脉炎病毒物种的G_GUU_UUU基序、G_GUC_UCU基序、CCCANCUCC基序和或nsp1β蛋白，或者它们的组合作为基因表达系统中-2移码机制的刺激物和/或诱导物的用途。G_GUU_UUU基序、G_GUC_UCU基序、CCCANCUCC基序和/或nsp1β蛋白，或者它们的组合物可以来自具有-2PRF机制的任何病毒物种，包括但不限于任何动脉炎病毒物种，包括所有目前已知的动脉炎病毒物种，以及任何以后鉴定的具有-2PRF机制的病毒。本发明提供鉴定在任何病毒或任何生物系统中调节、抑制或改变nsp1β介导的移码的化合物的方法。
以下实施例旨在说明以上发明，并且不应当理解为缩小其范围。本领域技术人员会容易地认识到实施例建议可以实施本发明的许多其他方式。应当理解可以进行许多变化和改变，同时保持在本发明的范围内。
实施例
实施例1.来自PRRSV的ORF1a区的计算分析
将GenBank中目前可获得的212个PRRSV分离株的ORF1a序列提取、翻译、比对并回译为核苷酸序列比对。包括通常在pp1a内享有50-55％aa相同性的欧洲(EU；基因型I)和北美(NA；基因型II)分离株。然后，如以前所述，对比对分析ORF1a同义位点处的保守(Firth et al.,2011b)。
方法：
通过对源自GenBank序列NC_001961(PRRSV-NA)、NC_001639(LDV)、NC_003092(SHFV)和NC 002532(EAV)的pp1a肽序列应用NCBItblastn(Altschul et al.,1990)来鉴定完全覆盖ORF1a编码序列的Genbank中的PRRSV、LDV、SHFV和EAV核苷酸序列。
分别检索218、2、3和32个序列，并且用于生物信息学分析的序列的登录号如下：PRRSV(EU基因型)：M96262、AY366525、AY375474、AY588319、DQ489311、DQ864705、EU076704、FJ349261、GQ461593、GU047344、GU047345、GU067771、GU737264、JF276430、JF276431、JF276432、JF276433、JF276434、JF276435、JF802085。
PRRSV(NA基因型)：NC_001961＝AF046869、AB288356、AF066183、AF159149、AF176348、AF184212、AF303354、AF303355、AF303356、AF303357、AF325691、AF331831、AF494042、AY032626、AY150312、AY150564、AY262352、AY424271、AY457635、AY545985、AY585241、AY612613、DQ056373、DQ176019、DQ176020、DQ176021、DQ217415、DQ459471、DQ473474、DQ779791、DQ988080、EF075945、EF112445、EF112446、EF112447、EF153486、EF484031、EF484033、EF488048、EF488739、EF517962、EF532801、EF532802、EF532803、EF532804、EF532805、EF532806、EF532807、EF532808、EF532809、EF532810、EF532811、EF532812、EF532813、EF532814、EF532815、EF532816、EF532817、EF532818、EF532819、EF535999、EF536000、EF536001、EF536002、EF536003、EF635006、EF641008、EU097706、EU097707、EU106888、EU109502、EU109503、EU144079、EU187484、EU200961、EU200962、EU236259、EU262603、EU360128、EU360129、EU360130、EU624117、EU678352、EU708726、EU807840、EU825723、EU825724、EU860248、EU860249、EU864231、EU864232、EU864233、EU880431、EU880432、EU880433、EU880434、EU880435、EU880436、EU880437、EU880438、EU880439、EU880440、EU880441、EU880442、EU880443、EU939312、FJ175687、FJ175688、FJ175689、FJ393456、FJ393457、FJ393458、FJ393459、FJ394029、FJ536165、FJ548851、FJ548852、FJ548853、FJ548854、FJ548855、FJ797690、FJ889129、FJ895329、FJ899592、GQ330474、GQ351601、GQ359108、GQ374441、GQ374442、GQ475526、GQ499193、GQ499194、GQ499195、GQ499196、GQ857656、GU143913、GU168567、GU168568、GU168569、GU169411、GU232735、GU232736、GU232737、GU232738、GU269541、GU454850、GU461292、HM011104、HM016158、HM016159、HM189676、HM214913、HM214914、HM214915、HM853673、HQ233604、HQ233605、HQ315835、HQ315836、HQ315837、HQ401282、HQ416720、HQ699067、HQ843178、HQ843179、HQ843180、HQ843181、JF268672、JF268673、JF268674、JF268675、JF268676、JF268677、JF268678、JF268679、JF268680、JF268681、JF268682、JF268683、JF268684、JF748717、JF748718、JF796180、JF800911、JN256115、JN387271、JN387272、JN387273、JN387274、JN626287、JN662424、U87392。LDV：NC_001639＝U15146、L13298。SHFV：NC_003092＝AF180391、HQ845737、HQ845738。EAV：NC_002532＝X53459、AY349167、AY349168、DQ846750、EU252113、EU252114、EU586273、EU586274、EU586275、GQ903794、GQ903795、GQ903796、GQ903797、GQ903798、GQ903799、GQ903800、GQ903801、GQ903802、GQ903803、GQ903804、GQ903805、GQ903806、GQ903807、GQ903808、GQ903809、GQ903810、GQ903811、JN211316、JN211317、JN211318、JN211319、JN211320。
从随后的分析中去除6个ORF1a缺陷的PRRSV序列。在每组内，利用EMBOSS和Clustal将多聚蛋白-编码序列提取、翻译、比对并回译以产生核苷酸序列比对(Rice et al.,2000；Larkin et al.,2007)。如以前所述计算同义位点保守(Firth et al.,2011b)。
结果：
分析显示在覆盖朝向nsp2-编码序列的3'端的169个密码子的区域中，同义位点保守惊人和高度地统计显著(p<10-64)增加(图1)。在这个区域内，平均同义取代率减少至ORF1a平均值的47％。这类同义位点保守的峰值一般是编码或非编码的功能上重要的重叠元件的指示。
在这种情况下，在所有212个序列中，相对于ORF1a的-1和+2阅读框中终止密码子的位置的检查显示在精确对应于增强保守的区域的区域中，+1阅读框中几乎完全不存在终止密码子。这表明+1阅读框中重叠编码序列作为ORF1a同义位点处增强保守的可能解释。在ORF1a的5'端附近观察到的增强的同义位点保守可能对应于功能上重要的非编码元件，如参与复制和/或亚基因组RNA合成的高级RNA结构(van den Born et al.,2004；Luet al.,2011)。
其他动脉炎病毒物种的基因组的检查进一步显示+1框架ORF与ORF1a的等同区域重叠的证据。目前，可获得3个SHFV序列(Lauck et al.,2011)。因为pp1a内成对aa相同性仅35-37％，这些序列对于同义位点保守分析太多样化。但是，这类多样化序列中的+1框架中220-226个密码子ORF的保守存在本身统计上显著(图1C；p<10-10)。
通过随机改组TF ORF区内的ORF1a-框架密码子柱并计算改组的哪个部分保留+1框架中的开放阅读框来评价3个高度多样化的SHFV序列中长TF ORF(图1C)的保守存在的统计显著性。这个方法控制由于ORF1a-框架氨基酸使用、密码子使用或核苷酸偏好的对于或反对随机长的+1框架ORF的任何偏好，并且还控制系统发育的非独立性。事实上，保留+1框架ORF的随机化的比例太小而难以直接估计(在4000个随机化中0个事件)，因此取而代之从一个或多个序列中包含终止密码子的+1框架比对密码子柱的平均数量(每随机化的比对)来估计(viz.24.70)，假设泊松统计。
利用这种方法，在SHFV比对的这个区域中偶然出现的长+1框架ORF的p-值为1.9×10-11。对于多个测试均未校正SHFV的这个统计(1.9×10-11)或PRRSV的正文中引用的保守统计(1×10-64)；即基本上可以认为测试～200个密码子的保守区域和/或保守ORF的整个基因组(～15,000nt)，并且基本上可以将这样的分析应用于GenBank中所示的～1000个RNA病毒物种，进行总计～25,000个独立测试。因此，p-值应当规模为～25,000(分别给出2.5×10-60和4.8×10-7)，虽然事实上SHFV统计不需要对多个测试的修正，因为SHFV中TF ORF的5'端的位置是已知的先验(其比对至PRRSV中TF ORF的5'端)。
169-密码子ORF还存在于2个公开的LDV序列之一(LDV-P)中，但是在第二个(LDV-C)中，ORF被单个终止密码子中断。为了评价LDV-C序列中测序错误的可能性，我们测序了额外的LDV分离株的相关区域(795nt，包括TF的最后158个密码子，GenBank登录#JX258842)。
新序列与LDV-P和LDV-C均不同(局部83-90％nt相同性)，并且不含LDV-C中存在的TF-框架终止密码子。值得注意的是，在EAV中未发现相应ORF的证据。事实上，在基因组的这个部分中，EAV高度不同于其他动脉炎病毒，并且nsp2区的大小大大减小。
在保守的TF ORF的5'端，有G_GUU_UUU基序(下划线分开ORF1a密码子)存在于206/212个PRRSV序列(4/212具有G_GUU_UUC)、两个LDV序列和一个SHFV序列中。同时，另外两个SHFV序列在相应位置具有G_GUC_UCU。显著地，位置1处的“G”是保守的，尽管相应的ORF1a密码子在不同PRRSV分离株中为CAG(Gln)、UGG(Trp)或CGG(Arg)(图2A)。这个基序可以促进来自ORF1a的-2PRF进入重叠ORF。
但是我们不能预测可能预期存在的令人信服的5-9nt距离的3'RNA二级结构(与-1PRF位点类似)。我们不可以明确排除这样的结构的存在，因为涉及复杂的三级相互作用的长范围碱基对和/或结构难以单独基于计算分析来检测。
我们在G_GUU_UUU序列下游10nt的距离观察到高度保守的CCCANCUCC基序。这个基序存在于LDV、全部3个SHFV序列和211/212个PRRSV序列中。这样高的保守可以反应氨基酸限制(在两个重叠阅读框中)，但是还可以表示移码刺激RNA序列(的部分)。
在PRRSV中，G_GUU_UUU序列处的-2移码会产生转换框架融合蛋白，包含nsp2的N-端65-72％(通常718-849aa，取决于分离株)，融合至重叠ORF编码的169aa(图1A)。现在我们将重叠ORF称作TF，并且我们将预测的转换框架融合蛋白称作nsp2TF。在PRRSV、LDV和SHFV中，nsp2TF比“全长”nsp2短14-19％。在全部3个物种中，TF ORF与编码预测的nsp2的TM结构域的ORF1a部分重叠，并且看来编码包含4个或更多个潜在的TM区的可选TM结构域，这取决于物种和分离株。
实施例2：PRRSV-感染的细胞中nsp2TF蛋白表达的免疫检测
为了证实预测的nsp2TF移码产物的确在病毒感染的细胞中表达，针对基因型I PRRS病毒PRRSV分离株SD01-08的预测的nsp2TF蛋白的C-端肽(CPKGVVTSVGESV)产生多克隆抗体(pAb-TF)(Fang et al.,2006)。我们还使用几种nsp2-特异性单克隆抗体(mAb 36-19和58-46)，它们是以前利用包含SD01-08nsp2的N-端436个残基的抗原产生的(Fang et al.,2006；Li etal.,2012)。因为预测的nsp2TF会与nsp2共享其714个N-端aa(在SD01-08中)，预期这些mAb也识别nsp2TF。
通过免疫沉淀(IP)和蛋白印迹分析对nsp2TF的表达进行分析。将MARC-145细胞用PRRSV分离株SD01-08感染，并且在48hpi收获细胞裂解物。首先利用mAb36-19将PRRSV蛋白免疫沉淀并通过SDS-PAGE分离。对基因型II PRRSV分离株SD23983进行相似的分析，使用这个分离株的nsp2N-端结构域特异性的mAb(140-68和140-43)。利用免疫荧光显微术研究病毒感染的细胞中nsp2TF的亚细胞定位。
方法：
病毒和细胞：将BHK-21、RK-13和MARC-145细胞在包含10％胎牛血清的改良伊格尔培养基(MEM,Invitrogen,CA)中的培养。将细胞维持在37℃与5％CO2下。I型PRRSV分离株(欧洲基因型)SD01-08(GenBank登录#DQ489311；Fang et al.,2006)和II型PRRSV分离株(北美基因型)SD23983(GenBank登录#JX258843)用于这个研究。将产生T7RNA聚合酶的痘苗病毒重组子vTF7-3(Fuerst et al.,1986)在RK-13细胞中增殖。
抗体：如以前所述在我们实验室中制备单克隆抗体mAb36-19、mAb58-46、mAb140-68和mAb148-43(Fang et al.,2006；Li et al.,2012)。这些抗体识别nsp2和nsp2TF的N-端区域。通过用SD01-08的肽(pp1a中的aa 386-821)免疫小鼠来产生MAb 36-19和58-46，同时通过用SD23983的肽(pp1a中的aa 435-514)免疫小鼠来产生mAb 140-68和148-43。利用合成肽CPKGVVTSVGESV(nsp2TF的C-端13aa)通过GenScript产生多克隆抗体pAb-TF。将兔用所述肽免疫，并且从兔免疫血清亲和纯化抗体。
免疫沉淀和SDS-PAGE：将PRRSV-感染的MARC-145细胞的全细胞裂解物悬浮于RIPA缓冲液[TNE缓冲液(100mM NaCl,1mM EDTA,pH 8.0,10mM Tris-HCl,pH 7.5)中0.5％(w/v)去氧胆酸钠、1％SDS和1％(v/w)NP-40]中。为了降低非特异性背景，将细胞裂解物用不含PRRSV特异性抗体的兔免疫前血清或小鼠腹水预清理。将A蛋白-琼脂糖CL-4B珠(Pharmacia Biotech)和nsp2-特异性的mAb添加至预清理的细胞裂解物。
在摇臂平台上于4℃下温育过夜之后，去除上清，并且将A蛋白-琼脂糖珠/抗体/抗原免疫复合物用RIP缓冲液(10mM Tris-HCl、150mM NaCl、1％NP-40、0.5％去氧胆酸钠)洗涤3次并用去离子H2O洗涤3次。然后将样品在96℃下于100μl的2x Laemmli样品缓冲液中煮沸5min，并且通过在6％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上电泳来分离蛋白。
蛋白印迹：通过在具有20％甲醇的Tris-甘氨酸缓冲液中电转移1hr来将通过SDS-PAGE分离的蛋白转移至硝化纤维素膜(Protran)。转移之后，将膜用PBST(0.05％Tween 20制品的1x PBS)和5％脱脂奶粉在4℃下封闭过夜。然后将膜用一级nsp2-和/或nsp2TF-特异性抗体(mAb的1:1000稀释液和pAb-TF的1:250稀释液)在室温下温育1hr.。用PBST洗涤之后，添加IRDye 680-缀合的山羊抗兔抗体和/或IRDye 800CW-缀合的山羊抗小鼠抗体(LI-COR Biosciences,NE)，并且将膜在室温下温育额外的2hr.。利用数字成像系统(Odyssey红外成像系统；LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)在适当的激发波长下进行印迹的成像。
免疫荧光显微术：对于nsp2和TF的细胞内表达的检测，将MARC-145细胞用包含2％马血清的MEM中的MOI 0.1的PRRSV感染。在感染后18h将细胞用1x PBS(pH 7.4)中的4％多聚甲醛固定。在室温下用1x PBS中的0.1％Triton X-100和1％BSA透化15min之后，将细胞用mAb 36-19的一抗(1:1000稀释)或兔抗血清Prot 00A(1:100稀释)在37℃下温育1小时。用1x PBS洗涤3x之后，添加FITC-缀合的山羊抗小鼠抗体(1:100稀释；ICNBiomedicals)或DyLight 549-标记的山羊抗兔IgG(H+L)(1:1000稀释；KPL)作为二抗，并且在37℃下温育1小时。如制造商(Molecular Probes)推荐地进行用DAPI(4’,6’-二氨基-2-苯基吲哚2HCl)核染色。利用Zeiss LSM510共聚焦荧光显微镜用63x物镜将细胞制品成像。用NIH图像/J和AdobePhotoshop 6.0加工图像。
结果：
通过考马斯亮蓝染色检测到具有100-150kDa之间的表观大小的4个高分子量蛋白条带，其中2种最小的产物显然较不丰富。此外，观察到较低分子量的各种产物(图3A)。
为了证实高分子量条带代表nsp2-相关产物，利用nsp2N-端结构域特异性的mAb58-46和nsp2TF-特异性的pAb-TF进行蛋白印迹分析。mAb58-46特异性地识别全部4个高分子量产物(图3B)，表明它们必须共享N-端序列，但是pAb-TF仅识别第二蛋白(标记的nsp2TF)。在利用pAb-TF的蛋白印迹中未检测到第三蛋白(标记的nsp2TF')。这可以是较低丰度的这种蛋白和/或对抗体的较低亲和力的结果，因为在利用pAb-TF的IP中检测到这种产物(见图7)。这种蛋白可以是改变形式的nsp2TF。4种中的最小产物(标记的nsp2N)可以源自在同样保守的G_GUU_UUU基序处的-1移码。这样的移码会导致中间终止，因为有-1/+2框架终止密码子与移动位点相邻(图6)。
对于分离株SD23983，检测到100-150kDa大小范围中的多个产物(图3C)。可用的pAb-TF(针对SD01-08TF产物产生的)不与任何这些条带交叉反应，但是这并不令人惊讶，因为用来产生这种抗体的13-aa肽在基因型II病毒中不保守。
利用免疫荧光显微术进一步证实病毒感染的细胞中nsp2TF的表达。如图4所示，通过pAb-TF特异性地检测到nsp2TF蛋白，并且分布为PRRSV-感染的细胞的核周区周围的尖锐焦点。为了证实pAb-TF特异性地识别nsp2TF，将细胞用nsp2-特异性的mAb36-19双重标记。通过两种抗体检测到相同的病毒感染的细胞簇。但是，用nsp2-特异性的mAb和pAb-TF感染的细胞的免疫荧光标记获得不重叠的标记模式，nsp2mAb标记熟悉的动脉炎病毒复制结构，而pAb-TF染色可选室，表明nsp2和nsp2TF位于不同的细胞室。
实施例3：nsp2TF表达的质谱证实
在生物信息学分析提出移码的位点(G_GUU_UUU)和方向(-2)的同时，进行蛋白序列分析以证实该预测。如上文提供的，将PRRSV SD01-08感染和模拟感染的MARC-145细胞裂解物用抗nsp2mAb36-19免疫沉淀，通过SDS-PAGE分辨，并且用考马斯亮蓝染色(图3A)。将包含推定的nsp2TF条带的凝胶切片切掉，用胰蛋白酶消化，并且通过液相色谱-串联质谱分析法(LC/MS/MS)进行分析。
方法：
质谱分析法：利用特异性抗体从病毒感染的细胞裂解物免疫沉淀nsp2TF蛋白。凝胶电泳之后，将蛋白在异丙醇固定溶液(25％异丙醇/10％乙酸[v/v])中固定30min，然后用考马斯亮蓝G-250(Bio-Rad；10％乙酸中的0.006％[w/v]考马斯亮蓝G-250)染色30min-1h。将G-250染色的凝胶用10％乙酸脱色，直至具有蓝色蛋白条带的透明背景出现。
从凝胶切除相应的nsp2TF蛋白条带，并且将凝胶片用50％乙腈洗涤2x。然后将凝胶片用DTT还原，用碘乙酰胺烷基化，并且利用Proteineer DP消化机器人(Bruker,Bremen,Germany)用胰蛋白酶(Worthington ChemicalCorporation)消化。从凝胶提取胰蛋白酶肽并冷冻干燥。将肽溶于95/3/0.1v/v/v水/乙腈/甲酸中，随后如以前所述，利用a1100HPLC系统(AgilentTechnologies)通过在线nanoHPLC MS/MS进行分析(Meiring et al,2002)。所有柱均内部包装。将肽以10μl/min截留在15-mm柱(100-μm ID；ReproSil-Pur C18-AQ,3μm,Dr.Maisch GmbH)上，并且以150nL/min在0.1％甲酸中的0-30％乙腈的20分钟梯度中洗脱至200mm柱(50-μm ID；ReproSil-Pur C18-AQ,3μm)。将纳米柱的末端拉成尖(ID～5μm)，由此将洗脱液喷入以数据依赖性模式操作，在MS和MS/MS获得之间自动转换的7-特斯拉LTQ-FT Ultra质谱仪(Thermo Electron)。
在FT-ICR中获得全扫描MS谱，具有在靶值3,000,000的25,000的分辨率。然后分离两个最强的离子，用于通过在FT-ICR中于50,000的靶积累值具有50,000的分辨率的所选离子监测扫描来进行精确的质量测量。利用靶值10,000的碰撞诱导的解离将所选离子在线性离子阱中片段化。利用Bioworks版本3.2将原始数据转化为峰列表。用与Bioworks一起提供的Perlscript，dta阈值，将所有单独的数据文件转化为一个Mascot Generic File(MGF)。利用Mascot版本2.2.04(Matrix Science)用以下设置鉴定肽：胰蛋白酶为消化酶，半胱氨酸的carbamidomethyl为固定修饰，并且甲硫氨酸的氧化为可变修饰，2ppm的肽质量公差和0.8Da的MS/MS公差。
结果：
除了nsp2和nsp2TF共享的来自N-端结构域的许多肽，鉴定了4个170aa TF区特异性的肽。所述肽之一LMTWVFLK跨越移码位点本身，并且其序列完全与-2PRF相容(将GUU_UUU解码为VF之后；图5A-B)，但是不与+1PRF相容，所述+1PRF会产生短一个氨基酸的移动位点肽(预测序列LMTWVFK)。
为了证实正确鉴定移码肽，制备合成版本的肽并进行相同的LC/MS/MS分析。合成肽的串联质谱与凝胶片中鉴定的肽相同，证实nsp2TF的确通过G_GUU_UUU基序处的-2PRF进行翻译(图5C)。对PRRSV基因型II分离株SD23983重复分析，对其预测具有不同序列(QVFLTSSPISLFSSHAFSTR)的-2移码胰蛋白酶肽。在从SDS-PAGE凝胶切除的推测的nsp2TF条带的质谱分析中鉴定了这个序列(图6)。
实施例4：移码效率的估计
在脉冲追踪标记实验中研究移码效率以及nsp2和nsp2TF的翻转。将MARC-145细胞用SD01-08病毒感染。在用35S-标记的氨基酸1-h脉冲标记之后，追踪掺入的标记各种时间(长达24h)，并且用nsp2-和nsp2TF-特异性抗体免疫沉淀蛋白。
方法：
放射性标记和放射免疫沉淀(RIP)分析：为了分析感染细胞中的nsp2TF表达，将MARC-145细胞用m.o.i.0.1的PRRSV SD01-08在包含2％FCS的DMEM中感染23.5hr。将细胞用PBS洗涤，然后在不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基(Gibco)中饥饿30min。用包含500μCi[35S]甲硫氨酸/半胱氨酸(5:2)混合物(Perkin-Elmer)/ml的不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基，用1-小时脉冲以24hpi标记蛋白。随后，将细胞用PBS洗涤2次，并且在包含2mM(两者)未标记的甲硫氨酸和半胱氨酸以及2％FCS的DMEM中温育各种追踪时间(长达24hr)。
为了分析ORF1a表达，如以前所述利用痘苗病毒/T7聚合酶表达系统将质粒DNA在RK-13细胞中瞬时表达(Fuerst et al.,1986；Snijder et al.,1994)。在转染之后4hr，将细胞用PBS洗涤，然后在不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中饥饿30min。利用500μCi的[35S]甲硫氨酸/半胱氨酸(5:2)混合物/ml用30-min脉冲标记新合成的蛋白。将细胞温育长达2hr的各种追踪时间。将细胞裂解，并且利用上述Ab如以前所述进行RIP分析(Li et al.,2012)。通过SDS-PAGE分离沉淀的蛋白。将磷成像屏暴露于凝胶，随后利用Typhoon Variable Mode Imager(GE Healthcare)进行扫描。用ImageQuantTL软件(GE Healthcare)进行图像分析和带强度的定量。
结果：
如图7A所示，这个分析显示存在两个较小的产物(标记为nsp2'和nsp2TF')，其具有比nsp2和nsp2TF小约10kDa的表观分子量。其在追踪期间的消失表明nsp2'是nsp2的直接前体，如通过nsp2的轻微大小增加和在凝胶中更异质的迁移(比较C0h与较晚的时间点)观察的，nsp2本身看来也在追踪期间进行进一步的修饰。可能的nsp2TF'的前体状态较不明显，因为这种产物的量在整个追踪期间更稳定或更不稳定，期间nsp2TF和nsp2TF'条带看来还转化为双峰。关于蛋白翻转，在追踪期间，nsp2TF的量比nsp2下降更迅速。这对于推测的-1移码产物nsp2N甚至更明显(见上，图3)，其看来是本文所述的各种nsp2形式中最不稳定的。观察到几个较小的nsp2-特异性产物，包括C0h样品中显著的95-kDa产物。
为了获得最准确的移码效率的评价，我们在脉冲标记(道C0h)之后直接测量了掺入nsp2+nsp2'、nsp2TF+nsp2TF'和nsp2N条带，并且为不同蛋白的甲硫氨酸和半胱氨酸含量修正这些数量。这些测量表明-2和推测的-1移码效率分别为约20％和8％。与观察到的不同产物稳定性组合，这些效率看来一般与蛋白印迹数据一致(图3)，其中由于这些产物相对快速的翻转，nsp2TF和nsp2N，因此移码效率看来没有充分表示。
作为研究移码事件的可选系统，我们采用在RK-13细胞中瞬时表达PRRSV ORFla。构建T7启动子驱动的全长ORF1a表达载体(pL1a)，并且在重组痘苗病毒/T7聚合酶表达系统中监测nsp2、nsp2TF和nsp2N的合成。30-min放射性标记转染细胞中合成的蛋白之后，监测各种产物的命运长达2h(图7B)，这是基于痘苗病毒-诱导的细胞病理学允许的最长时间。除了nsp2'，图7A中描述的产物全部可以鉴定，虽然丰度、表观和稳定性有明显差异。例如，注意在追踪期的晚期nsp2的极度异质性，nsp2TF'的更快的翻转，以及几乎完全缺少未鉴定的95-kDa的nsp2-特异性产物。
这些数据明确证实PRRSV ORF1a序列的翻译足以重现感染细胞中观察到的移码事件。然而，与感染的MARC-145细胞中的实验相比(图7A)，使用不同细胞系、缺少PRRSV复制以及痘苗病毒感染的结果可以在这个表达系统中各自具有受影响的移码效率和各种nsp2-相关产物的命运。
实施例5：G_GUU_UUU和CCCAxCUCC基序对移码的影响
为了研究CCCANCUCC基序(参见上文；图2A)是否在刺激G_GUU_UUU位点处的移码中起作用，我们工程化了两个突变体，其中CCCANCUCC基序被破坏(CC1和CC2；图2B)。
CC1突变在nsp2框架中同义，而CC2突变更彻底地破坏该基序，但是包括关于nsp2不同义的取代。作为对照，构建两个额外的突变体(SS和IFC；图2B)。SS突变体在移动位点中包含两个突变(G_GUU_UUU突变为G_GUA_UUC)，因此预期仅表达nsp2。
为了标记移码产物在凝胶中迁移的位置，构建框内对照IFC，其中将移动位点同义突变，并且插入额外的2nt以迫使表达nsp2TF阅读框(G_GUU_UUU突变为G_GUG_UUC_UU)。预期这个突变体仅产生nsp2TF。将突变体pL1a表达构建体工程化并在重组痘苗病毒/T7聚合酶表达系统中表达，与野生型(WT)对照一起。
方法：
表达全长或部分ORF1a的质粒：为了产生表达质粒pL1a，使用EAVpL1a(Snijder et al.,1994)的质粒。最初，用PRRSV ORF1a(PRRSV SD01-08基因组的aa 1-2379)代替EAV ORF1a序列。该构建体在PRRSV序列的上游包含T7启动子和一个拷贝的脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点。将T7终止子插入PRRSV序列的下游。修饰PRRSV ORF1a以促进克隆和位点定向诱变。引入一组翻译沉默突变C1878至G、A4449至T和C6000至G以失活内部NcoI限制性酶位点。在编码PRRSV ORF1a-特异性残基的序列的上游工程化包含翻译起始密码子的NcoI限制位点(CCATGG)。
利用PRRSV pL1a骨架，通过用在5’和3’端两侧有NcoI和NotI限制性酶位点的引物对RT-PCR扩增相应区域来构建ORF1a的N-或C-端截短体(表1)。用NcoI和NotI限制性酶消化PCR产物，并且连接入用相同限制性酶消化的pL1a质粒。
位点定向诱变：将每个单独的点突变引入表达载体pL1a或PRRSV全长cDNA克隆质粒pSD01-08的nsp2区(Fang et al.,2006)。除了通过合成基因产生的KO2和nsp1βcc-2突变体，所有突变均通过位点定向诱变引入。简单地说，通过将基因组序列(SD01-08基因组的nt 3365-6990)克隆入-Blunt II-载体(Invitrogen)来产生穿梭质粒pTOPO-ES。然后通过Quick-Change位点定向PCR诱变试剂盒(Stratagene)将特定突变引入pTOPO-ES。通过DNA测序验证之后，通过限制性酶EcoRV和SgrAI消化携带特定突变的片段，并且连接入用相同限制性酶消化的pSD01-08或pL1a质粒骨架。
瞬时蛋白表达和放射免疫沉淀(RIP)分析：利用重组痘苗病毒/T7聚合酶表达系统在RK-13细胞中瞬时表达质粒DNA(Fuerst et al.,1986)。利用不含甲硫氨酸的培养基和100μCi的[35S]-甲硫氨酸/ml，在痘苗病毒感染之后5-8h标记转染细胞中合成的蛋白。将细胞裂解，并且如以前所述进行RIP分析(Snijder et al.,1994)。利用TF蛋白特异性的兔抗血清或者识别nsp2和TF蛋白的抗体进行RIP。通过SDS-PAGE分离沉淀的蛋白。将磷成像屏暴露于凝胶，随后利用Typhoon Variable Mode Imager(GE Healthcare)进行扫描。用ImageQuant TL软件(GE Healthcare)进行图像分析和带强度的定量。
结果：
如图7C所示，WT pL1a产生nsp2和nsp2TF，并且通过用pAb-TF进行IP证实后一蛋白的表达。正如预期的，如通过pAb-TF和mAb58-46IFC检测的，IFC突变体仅产生nsp2TF。其中CCCANCUCC基序受到破坏的CC1和CC2突变体产生nsp2，但是未检测到nsp2TF。有趣的是，移动位点突变体SS仍允许少量(但大大降低)的-2移码。这些结果表明WT效率的核糖体移码需要G_GUU_UUU移动位点和下游CCCANCUCC基序。
实施例6：高效移码需要Nsp1β表达
进一步研究-2PRF需要的序列。产生一组具有T7启动子的截短的ORF1a表达构建体(表1)，并且在重组痘苗病毒/T7聚合酶表达系统中测试nsp2和nsp2TF的表达(Fuerst et al.,1986)。放射性标记转染细胞中合成的蛋白之后，利用pAb-TF(识别nsp2TF)或mAb58-64和pAb-nsp2-3(识别nsp2和nsp2TF)通过放射免疫沉淀(RIP)分析nsp2TF和nsp2的表达。为了进一步确定移码刺激是否包括nsp1β蛋白或潜在的RNA序列，我们测试了是否可以反过来通过nsp1β表达诱导移码。
方法：
表达全长或部分ORF1a的质粒：利用PRRSV pL1a骨架，通过用在它们的5’和3’端两侧有NcoI和NotI限制性酶位点的引物对RT-PCR扩增相应区域来构建ORF1a的5’-或3’-端截短(表1)。用NcoI和NotI限制性酶消化PCR产物，并且连接入已用相同限制性酶消化的pL1a质粒。通过同义突变nsp1β-编码区中几乎每个密码子(图9A)，同时保持解码的nsp1β氨基酸序列完全完整来构建质粒pLnsp1βcc-2。改变的nsp1β-编码序列(nsp1βcc)合成为合成基因并与nsp2-编码区融合以产生构建体pLnsp1βcc-2。
瞬时蛋白表达和放射免疫沉淀(RIP)分析：利用重组痘苗病毒/T7聚合酶表达系统在RK-13细胞中瞬时表达质粒DNA(Fuerst et al.,1986)。利用不含甲硫氨酸的培养基和100μCi的[35S]-甲硫氨酸/ml，在痘苗病毒感染之后5-8h标记转染细胞中合成的蛋白。将细胞裂解，并且如以前所述进行RIP分析(Snijder et al.,1994)。利用nsp2TF蛋白特异性的pAb-TF或者识别nsp2和nsp2TF的mAb进行RIP。通过SDS-PAGE分离沉淀的蛋白。将磷成像屏暴露于凝胶，随后利用Typhoon Variable Mode Imager(GE Healthcare)进行扫描。用ImageQuant TL软件(GE Healthcare)进行图像分析和带强度的定量。
结果：
如图8A所示，在来自用全长ORF1a构建体转染的细胞的裂解物中检测到nsp2和nsp2TF，但是在来自用构建体pLnsp2-8和pLnsp2-3转染的细胞的裂解物中几乎检测不到nsp2TF，表明PRF所需的元件位于ORF1a的nsp1-编码区内。产生另一组表达在N-或C-端具有截短的nsp1-3蛋白的构建体。RIP结果显示缺少nsp1α-和/或nsp3-编码区的构建体继续表达与pL1a相同量的nsp2TF。相比之下，缺少nsp1β-编码区的那些构建体产生nsp2，但是未检测到显著量的nsp2TF(图8B)。这表明在nsp2-编码区中约2.5kb下游的G_GUU_UUU基序处的高效核糖体移码需要nsp1β或编码nsp1β的RNA序列。
如图9B所示，在用表达nsp2(pLnsp2)和nsp1β(pLnsp1β)的不同质粒共转染的细胞中也检测到nsp2TF。这表明nsp2TF表达的nsp1β-刺激可以反式操作。为了测试这种影响是否通过nsp1β蛋白而不是编码nsp1β的RNA序列介导，合成几乎每个密码子均同义突变(但是避免稀有密码子)的彻底改变的nsp1β-编码序列，并且将其与nsp2-编码序列融合以产生构建体pLnsp1βcc-2，其表达未改变的nsp1β蛋白序列，但是潜在的编码nsp1β的RNA序列显著改变(图9A)至预期破坏可能参与-2PRF的任何功能上重要的一级或二级RNA结构元件的程度。在痘苗病毒/T7聚合酶表达系统中测试pLnsp1βcc-2的表达。为了比较，在分析中包括WT构建体pLnsp1β-2和框内对照pL1a-IFC(其仅表达nsp1-nsp2TF；见下文)。蛋白印迹分析显示nsp2TF在用pLnsp1βcc-2转染的细胞中高效表达(图9C)，这强烈建议移码刺激包括nsp1β蛋白而不是潜在的RNA序列。
表1：构建体列表
实施例7：Nsp1β中高度保守的GKYLQRRLQ基序对其作为-2PRF的反式激活物的功能至关重要。
我们进一步作图对于其反式激活物功能至关重要的nsp1β中的潜在结构域。构建一组位点特异性的nsp1β突变体(表2)。基于蛋白表面可接近性预测(Emini et al.,1985)、亲水性分析(Hopp&Woods,1981)和nsp1β的晶体结构(Xue et al.,2010)设计它们。诱变靶向预测暴露在蛋白表面上的保守的亲水氨基酸(图10A)。最初利用痘苗病毒/T7聚合酶表达系统检测各种携带双突变的nsp1β-2突变体(表2)。基于生物信息学分析预测GKYLQRRLQ基序中潜在的RNA-结合残基。
表2
方法：
分别从PRRSV SD01-08(EU)和SD95-21(NA)的基因组RNA RT-PCR扩增来自1型PRRSV(SD01-08基因组的763-4559nt)和2型PRRSV(SD95-21基因组的731-4927nt)的nsp1β-2-编码区。将nsp1β-2区的PCR产物克隆入pL1a质粒(Snijder et al.,1994)，命名为pL-EU-nsp1β-2和pL-NA-nsp1β-2。利用QuickChangeTM位点定向诱变试剂盒(Stratagene)，按照制造商的说明书通过位点定向诱变引入特定突变。利用重组痘苗病毒/T7聚合酶表达系统在RK-13细胞中瞬时表达质粒DNA(Fuerst et al.,1986)。通过免疫沉淀和蛋白印迹分析检测转染细胞中合成的蛋白。
利用QuickChangeTM位点定向诱变试剂盒(Stratagene)将干扰nsp2TF表达的K130A和R134A突变引入p3xFLAG-nsp1β的nsp1β区。利用bioinfo.ggc.org/bindn的BindN程序万维网搜索nsp1β中潜在的RNA-结合残基。
结果：
如图11所示，WT nsp1β-2(1型PRRSV)产生nsp2、nsp2TF和nsp2N。E41A/E43A和E68A/E71A突变不影响这些nsp2-相关蛋白的表达。相比之下，在表达K130A/R134A突变体的细胞中未检测到nsp2TF和nsp2N。1型PRRSV的nsp1β中的K130和R134残基对应于2型PRRSV的nsp1β中的K124和R128。我们利用来自2型PRRSV毒株SD95-21的nsp1β-2重复我们的实验。结果与用1型病毒获得的一致。WT nsp1β-2的表达产生相应的移码产物，而在表达K124A/R128A突变体的细胞中未检测到nsp2TF，并且检测到降低水平的nsp2N。
基于公开的来自2型PRRSV的nsp1β的晶体结构(Xue et al.,2010)，K124和R128可能暴露在蛋白表面上(图12)。我们进一步搜索这个区域中潜在的功能性基序，结果显示这两个残基位于基序GKYLQRRLQ(Kolaskar&Tongaonkar,1990)上，与nsp1β的其他区域相比其具有最高的亲水值(图10A)。来自GenBank中可获得的212个PRRSV分离株的nsp1β序列的氨基酸序列比对显示GKYLQRRLQ基序在所有可获得的PRRSV毒株中高度保守，包括1型和2型病毒(图10B)。更有趣的是，不同物种的动脉炎病毒之间nsp1β的氨基酸序列比对显示GKYLQRRLQ基序在LDV和SHFV中也高度保守(图13)。其在4种远亲动脉炎病毒的3种中保守表明GKYLQRRLQ基序在nsp1β功能中的重要作用。(注意第四种动脉炎病毒EAV不表达nsp2TF。)然后，我们使用BindN程序预测nsp1β中的RNA-结合残基。结果显示GKYLQRRLQ基序包含5个(1型病毒)或4个(2型病毒)预测的RNA-结合残基(图12)。
实施例8：在细胞培养物中nsp2TF表达的失活对PRRSV复制的影响
为了研究对于病毒复制，nsp2TF表达和/或一部分核糖体转移出ORF1a是否相关，构建3个突变体以部分或完全敲除nsp2TF表达(KO1、KO2和KO3；图2B和2C)。由于在密码子101和103处将2个终止密码子插入170-密码子TF ORF，KO1突变体产生截短的nsp2TF蛋白。结果，截短的nsp2TF缺少C-端pAb-TF表位。除了将终止密码子引入TF ORF，KO2突变体还包含破坏移码位点和下游CCCANCUCC基序的9个突变。这个突变体旨在完全敲除移码信号，并且预期仅表达nsp2。KO1和KO2与WT病毒的不同之处分别是2个和9个核苷酸取代，它们均不影响nsp2氨基酸序列。KO3包含nsp1β突变K130A/R134A(1型PRRSV)或K124A/R128A(2型PRRSV)。
首先在ORF1a表达系统中测试来自1型PRRSV的这些突变体以证实预期蛋白的合成。随后，将这些突变进一步引入1型(SD01-08)和2型(SD95-21)病毒的全长cDNA克隆。
方法：
位点定向诱变：将每个单独的点突变引入表达载体pL1a的1型PRRSVnsp2区，或者PRRSV全长cDNA克隆质粒pCMV-SD01-08(1型PRRSV，Fang et al.,2006)和pCMV-SD95-21(2型PRRSV，GenBank KC469618)。除了通过基因合成产生的KO2，所有突变均通过位点定向诱变引入。简单地说，通过将基因组序列克隆入-Blunt II-载体(Invitrogen)来产生穿梭质粒pTOPO-ES。然后通过Quick-Change位点定向PCR诱变试剂盒(Stratagene)将特定突变引入pTOPO-ES。通过DNA测序验证之后，通过限制性酶消化携带特定突变的片段，并且将其连入用相同限制性酶消化的相应的质粒骨架。
重组病毒的拯救：将携带全长PRRSV cDNA或其突变体的质粒用来转染BHK-21细胞，利用FuGENE HD试剂(Roche,CA)且按照制造商的说明书。为了拯救病毒，使转染后24-48h获得的细胞培养物上清在MARC-145细胞上传代。在感染后48-72h通过IFA证实感染性病毒的拯救。为了监测引入TF/nsp2区的突变的稳定性，将重组病毒在MARC-145细胞上连续传代20次。利用QiaAmp病毒RNA试剂盒(Qiagen,MD)从用重组病毒的第20代感染的细胞提取RNA。通过RT-PCR扩增包含突变的基因组区，并且在Iowa State University DNA测序设施(Ames,IA)进行测序。
生长动力学和噬斑测定：通过用MOI 0.1的WT病毒、KO1、KO2或KO3突变体的第2代感染MARC-145细胞来检测生长动力学。在感染后12、24、36、48、60和72h(hpi)收集来自感染细胞的上清，并且如以前所述通过荧光聚焦测定确定病毒滴度(Sun et al.,2012)。病毒滴度表示为荧光聚焦单位数/ml(FFU/ml)。通过噬斑测定比较突变体和亲本病毒的噬斑形态学。将6-孔板中汇合的细胞单层用亲本或突变体病毒的10-倍系列稀释液感染。在感染后2h，去除培养基并施用2％琼脂(SeaPlaque Agrose,Lonza,Rockland,ME)覆盖。在37℃下温育4天之后，将细胞用0.1％结晶紫染色。
结果：
首先在ORF1a表达系统中测试1型PRRSV的突变体以证实预期蛋白的合成。事实上，利用pAb-TF不可以检测在TF ORF中包含提前终止密码子的突变体KO1的移码产物，这通过C-端表位区的截短来解释。但是，用mAb58-64进行IP显示截短形式的nsp2TF和nsp2TF'的合成(图7C，箭头)以及全长nsp2和移码产物之间的相似比例。另一方面，发现KO2中引入的突变消除移码，但是同时产生非常大量的全长nsp2(图7C)。如图11(实施例8)所示，引入nsp1β区的K130A/R134A(1型病毒)或K124A/R128A(2型病毒也消除移码。
随后将KO1、KO2和KO3突变转移至两种基因型的PRRSV全长cDNA感染性克隆以确定是否可以获得活的重组病毒。如图14所示，产生一组活的重组病毒，虽然所有突变体均产生比WT病毒明显小的噬斑。生长动力学分析一致地显示在MARC-145细胞中所有突变体均受损，这些突变体的峰值滴度比WT病毒低50-至100-倍。
实施例9：nsp2TF表达的失活对PRRSV的去泛素化和deISGylation能力的影响
如图4所示，在PRRSV-感染的细胞中，发现与全长nsp2相比，nsp2TF靶向至不同的亚细胞位置，可能exocytic途径而不是nsp2位于的修饰的ER膜，并且病毒RNA合成与其相关。结果表明nsp2和nsp2TF可能在病毒复制和/或免疫逃避中具有不同功能。nsp2和nsp2TF蛋白享有共同的N-端PLP2结构域。当在转染细胞中单独表达PLP2结构域时，确定PLP2具有参与拮抗细胞先天免疫应答的去泛素化(de-Ub)和de-ISGylation功能(Sun etal.,2010,2012；van Kasteren et al.,2012,2013)。我们进行了泛素化和ISGylation测定以将KO1、KO2和KO3重组病毒的de-Ub和de-ISGylation能力与WT病毒进行比较。
方法：
ISG15缀合(ISGylation)测定：将MARC-145细胞用PRRSV SD-95-21WT或者nsp2TF敲除突变体KO1、KO2或KO3感染。感染后24h，将细胞用IFN-α刺激。在刺激后12h将细胞单层在Laemmli样品缓冲液中裂解用于蛋白印迹分析。对于ISG15表达的检测，用mAb F-9或兔多克隆抗体H-150(两者均来自Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)探测硝化纤维素膜。mAb M2(Sigma,St.Louis,MO)用来检测Flag-标记的蛋白的表达。
泛素化测定：将BHK-21细胞用0.5μg表达HA-标记的泛素的pcDNA3.1-HA-Ub和2μg包含2型PRRSV SD-95-21的全长cDNA克隆的pCMV-SD95-21转染。利用FuGENE HD试剂(Roche)按照制造商的说明书进行转染。在转染后24h，收获细胞用于蛋白印迹分析。mAb HA-7(Sigma,St.Louis,MO)用来检测HA-标记的蛋白的表达。如以前所述通过mAb22-28检测PRRSV nsp1β的表达(Li et al.,2012)，并且mAb H3(Lambda Biotech,St.Louis,MO)用来检测β-微管蛋白表达。
结果：
ISGylation测定的结果如图15所示。在用WT病毒感染的细胞中观察到ISGylated蛋白的水平明显降低，表明WT病毒具有抵消细胞蛋白的ISGylation的能力(图15A)。相比之下，全部3个突变体KO1、KO2和KO3均几乎丧失它们干扰ISGylation的能力，尽管nsp2TF表达的敲除不影响nsp2的表达水平(图15B)。然后，我们测试了这些nsp2TF敲除突变体的de-Ub能力。将BHK-21细胞用表达HA-标记的泛素的质粒以及包含WTPRRSV的全长cDNA或其突变体的质粒共转染。空质粒载体用作对照。如图16所示，WT PRRSV导致泛素-缀合的蛋白的表达水平降低，而nsp2TF敲除突变体表现出受损的干扰细胞蛋白泛素化的能力。总的来说，这些数据表明nsp2TF对于干扰细胞蛋白ISGylation和泛素化过程很重要。
实施例10：猪攻击模型中nsp2TF敲除突变体的体内表征
在哺乳期猪模型中测试两种重组病毒vSD95-21-KO1和vSD95-21-KO2。通过用同源病毒SD95-21攻击猪来评价nsp2TF-缺陷突变体诱导的保护。实验设计如表3所示。基于肺病变评分的测量以及病毒血症、病毒-中和抗体、先天和细胞免疫细胞因子应答水平的确定来评价保护性免疫的程度。
表3.动物研究的设计(*dpi:免疫后的天数)
组* 疫苗构建体(0dpv) 攻击病毒(28dpv) 血液样品的收集(dpv)
1(n＝5) 模拟 模拟 0,7,14,21,28,31,35,41
2(n＝8) 模拟 SD 95-21 0,7,14,21,28,31,35,41
3(n＝8) 野生型 SD 95-21 0,7,14,21,28,31,35,41
4(n＝8) KO1 SD 95-21 0,7,14,21,28,31,35,41
5(n＝8) KO2 SD 95-21 0,7,14,21,28,31,35,41
*在10dpv将来自组2-5猪的3只猪安乐死以评价急性感染期间的大体病理学。
方法：
动物/攻击组：如表3所示分配动物和攻击组。突变或WT病毒(2ml,1x106FFU/ml)用来免疫猪。细胞培养基用作阴性对照。在免疫接种后10天，将3只猪/组安乐死用于评价急性感染之后的大体病理学。在28dpv用SD95-21病毒(2ml,1x107FFU/ml)攻击剩余的猪(n＝5)，并且在41dpv将猪安乐死。定时采集血液样品(表3)。在尸检期间评价大体肺病变。
病毒载量的定量：对于病毒RNA的检测和病毒载量的确定，利用PCR和病毒滴定检测血清和组织样品。
确定体液、先天和细胞介导的免疫：为了确定疫苗候选物诱导的先天和细胞介导的免疫，分离PBMC并用杀死的攻击病毒抗原、PHA(阳性对照)或细胞培养基(阴性对照)。如我们以前的出版物所述，利用猪细胞因子FMIA分析PBMC培养物上清和血液样品的先天和细胞免疫应答(Invitrogen；Lawson et al.,2010,2012)。如我们以前所述，利用IDEXXPRRS3XR ELISA和病毒-中和测定评价体液抗体应答(Fang et al.,2006,2008；Lawson et al.,2012)。
Nsp2TF敲除突变体在猪中减弱
为了确定这些nsp2表位缺失突变体是否在体内复制，在7-28dpv收集的血清样品用于在MARC-145细胞上病毒分离。从在3、7和14dpv收集的来自第3-5组的猪的血清样品回收病毒，表明在猪中突变病毒的主动复制。通过实时qRT-PCR进一步定量病毒血症的量。所有两个nsp2TF敲除突变体感染的猪均具有比在7dpv用野生型病毒感染的那些猪显著低的病毒载量。在3、14和28dpv，虽然由于猪个体的大变化，病毒载量的平均值没有显著不同，但是与用野生型病毒感染的猪相比，平均病毒载量在所有突变体感染的猪中一致地较低。为了获得急性感染期间的肺病理学，在10dpv将来自第2-5组中的每组的3只猪安乐死。在突变病毒感染的猪中不存在大体肺病变，并且在野生型病毒感染的猪中观察到轻度病变(2-6％)。
Nsp2TF敲除突变体在猪中诱导抗PRRSV攻击的保护
为了研究这些nsp2TF突变体是否能够诱导抗PRRSV攻击的保护，在28dpv用亲代病毒SD95-21攻击第2-5组的猪。与第2组的对照猪相比，在攻击后3和7天(dpc)，在用WT或nsp2TF敲除突变体免疫接种的猪中病毒载量显著降低，同时在用KO1或KO2感染的猪中病毒载量比WT-感染的猪低约10-倍(图17A)。在尸检时(13dpc)，评价肺病理学。在第2组猪(用WT病毒攻击的阴性对照猪)中，可见的大体肺病变很显著，并且影响36-63％的肺表面。相比之下，第3-5组猪具有减少的大体肺病变。与WT-免疫接种的猪相比，在KO1-或KO2-免疫接种的猪中大体肺病变减少约3-或4-倍(图17B)。正如预期的，在阴性对照第1组猪中未观察到显著的肺病变。
因为nsp2TF包含已知参与拮抗先天免疫应答的PLP2结构域，所以我们进一步确定改变的nsp2TF表达是否对宿主免疫应答有影响，所述宿主免疫应答可能有助于如我们在图17中观察到的保护水平。首先，我们在3、7、14、21、28、30、35和41dpv监测来自对照或病毒感染的猪的全血的外周血单核细胞(PBMC)中所选先天和细胞免疫基因的时序表达。进行猪细胞因子FMIA以测量靶细胞因子的蛋白表达水平，包括先天免疫的免疫标记：IL-1β、IL-8、IFN-α、TNF-α、IL-12；Th1免疫：IFN-γ；Th2免疫：IL-4；以及调节T细胞应答：IL-10。FMIA结果显示如对PBMC预期的弱重新刺激应答。但是，在免疫接种后7天，来自KO1和KO2突变体感染的猪的PBMC产生与WT病毒感染的猪相比不同的细胞因子表达模式，IFN-α和IL-8表达的水平显著升高(图18)。
还评价了体液免疫应答。在14dpv，如通过IDEXX ELISA测量的，WT、KO1和KO2组中的所有猪均已血清转化。该结果与这些组的猪中的病毒载量水平的相关性良好。病毒中和(VN)抗体水平的进一步测量显示在KO1突变体感染的猪中，最初在21dpv检测到VN抗体反应。在28dpv，KO1组中的两只猪以及KO2和WT组每个中的一只猪发展了可检测的VN反应。在攻击之后(35dpv)，所有免疫接种的猪均发展了VN反应，并且KO2突变体感染组的猪的平均VN滴度比其他组高。在41dpv，KO1突变体感染组的猪的平均VN滴度在不同猪组中是最高的。但是，由于猪个体之间的大变化以及每个组中有限数量的猪，组之间的差异并不统计显著(图19B)。
实施例11：截短nsp2TF蛋白而不改变重叠nsp2蛋白的氨基酸序列
因为遗传密码的简并性，可以将终止密码子引入nsp2TF蛋白的C-端部分而不改变nsp2蛋白的氨基酸序列。这类截短版本的nsp2TF可能具有不同于全长天然nsp2TF蛋白的生物特性，因此可用于疫苗和诊断的设计。
以下是在-2移码位点下游的nsp2TF编码区部分中单核苷酸突变的非详尽列表，其在nsp2TF中产生终止密码子而不改变重叠nsp2阅读框的氨基酸序列。这个实施例中的参考PRRS毒株为北美(2型)毒株P129-PKC12-FL第52代，其可以在PCT申请WO 2012/063212A1中找到为SEQ ID NO:6。下文引用的核苷酸数字对应于这种病毒的15,450nt基因组序列中的位置。这些突变引起nsp2TF蛋白的提前终止(C-端截短)而不改变nsp2蛋白的长度或氨基酸序列。这种类型的突变可以单独使用。它们还可以两个或更多个联用以确保完全截短，并且大大减少由于病毒复制期间的回复突变而反转为全长nsp2TF蛋白的可能性。
1.将nt 3878从C改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(ACCTCGTCT至ACCTAGTCT)
2.将nt 4022从G改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TCTTGGGTG至TCTTAGGTG)
3.将nt 4079从G改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GGCTGGCTT至GGCTAGCTT)
4.将nt 4091从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(CTGTTGGCC至CTGTAGGCC)
5.将nt 4121从C改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(CAGTCGGCA至CAGTAGGCA)
6.将nt 4184从C改变为G在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TTCTCAAAC至TTCTGAAAC)
7.将nt 4211从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GCCTTGTTG至GCCTAGTTG)
8.将nt 4214从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TTGTTGTGG至TTGTAGTGG)
9.将nt 4217从G改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TTGTGGGCC至TTGTAGGCC)
10.将nt 4226从C改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(CCGTCGGTC至CCGTAGGTC)
11.将nt 4232从C改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GTCTCGGTC至GTCTAGGTC)
12.将nt 4238从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GTCTTGCCA至GTCTAGCCA)
13.将nt 4247从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TTCTTGGCA至TTCTAGGCA)
14.将nt 4259从G改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TACTGGGCG至TACTAGGCG)
15.将nt 4292从T改变为G在nsp2TF中产生TGA终止密码子(TGCTTAGGC至TGCTGAGGC)
16.将nt 4298从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GGCTTGGCA至GGCTAGGCA)
17.将nt 4304从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GCATTGTTG至GCATAGTTG)
18.将nt 4307从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TTGTTGCAG至TTGTAGCAG)
19.将nt 4322从G改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TCTTGGCTG至TCTTAGCTG)
降低nsp2中-2移码事件的效率可以通过如实施例5所述突变移码位点处的保守GGUUUUU基序或移码位点下游的保守CCCANCUCC基序来在毒株P129-PKC12-FL第52代中完成。毒株P129-PKC12-FL第52代中这些基序的序列与图2A中所示的北美PRRS毒株SD23983和SD95-21(分别为GGUUUUU和CCCAUCUCC)的相同。同样地，可以如实施例8所述和图11所示，通过突变nsp1β中的保守GKYLQRRLQ基序来抑制毒株P129-PKC12-FL第52代中nsp2中的-2移码。这个氨基酸序列在毒株P129-PKC12-FL第52代中完全保守。
实施例12：在减毒的中国高致病性PRRS病毒中截短nsp2TF蛋白而不改变重叠nsp2蛋白的氨基酸序列
因为遗传密码的简并性，可以将终止密码子引入nsp2TF蛋白的C-端部分而不改变nsp2蛋白的氨基酸序列。这类截短版本的nsp2TF可能具有不同于全长天然nsp2TF蛋白的生物特性，因此可用于疫苗和诊断的设计。
以下是在-2移码位点下游的nsp2TF编码区部分中单核苷酸突变的非详尽列表，其在nsp2TF中产生终止密码子而不改变重叠nsp2阅读框的氨基酸序列。这个实施例中的参考PRRS毒株为中国“高致病性”(基因型2)毒株TJM-F92(第92代)，其可以在美国专利申请US 2012/0189655中找到为SEQ ID NO:1。下文引用的核苷酸数字对应于这种病毒的14,966nt基因组序列中的位置。这些突变引起nsp2TF蛋白的提前终止(C-端截短)而不改变nsp2蛋白的长度或氨基酸序列。这种类型的突变可以单独使用。它们还可以两个或更多个联用以确保完全截短，并且大大减少由于病毒复制期间的回复突变而反转为全长nsp2TF蛋白的可能性。
20.将nt 3444从C改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GCCTCGTTT至GCCTAGTTT)
21.将nt 3619从C改变为A在nsp2TF中产生TGA终止密码子(TGTGCGAAT至TGTGAGAAT)
22.将nt 3645从G改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GGTTGGCTT至GGTTAGCTT)
23.将nt 3657从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(CTGTTGGTC至CTGTAGGTC)
24.将nt 3687从C改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(CAGTCGGCA至CAGTAGGCA)
25.将nt 3750从C改变为A在nsp2TF中产生TAA终止密码子(TTCTCAAAC至TTCTAAAAC)
26.将nt 3777从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GCCTTGTTG至GCCTAGTTG)
27.将nt 3780从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TTGTTGTGG至TTGTAGTGG)
28.将nt 3783从G改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TTGTGGGCC至TTGTAGGCC)
29.将nt 3792从C改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(CCGTCGGTC至CCGTAGGTC)
30.将nt 3798从C改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GTCTCGGCC至GTCTAGGCC)
31.将nt 3804从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GCCTTGCCA至GCCTAGCCA)
32.将nt 3813从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TTCTTGGCA至TTCTAGGCA)
33.将nt 3825从G改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TACTGGGCG至TACTAGGCG)
34.将nt 3858从T改变为A在nsp2TF中产生TAA终止密码子(TGCTTAGGC至TGCTAAGGC)
35.将nt 3864从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GGCTTGGCA至GGCTAGGCA)
36.将nt 3870从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(GCATTGTTG至GCATAGTTG)
37.将nt 3873从T改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TTGTTGCAG至TTGTAGCAG)
38.将nt 3888从G改变为A在nsp2TF中产生TAG终止密码子(TCTTGGCTG至TCTTAGCTG)
降低nsp2中-2移码事件的效率可以通过如实施例5所述突变移码位点处的保守GGUUUUU基序或移码位点下游的保守CCCANCUCC基序来在毒株TJM-F92第92代中完成。毒株TJM-F92(第92代)中这些基序的序列与图2A中所示的北美PRRS毒株SD23983和SD95-21(分别为GGUUUUU和CCCAUCUCC)的相同。同样地，可以如实施例8所述和图11所示，通过突变nsp1β中的保守GKYLQRRLQ基序来抑制毒株TJM-F92(第92代)中nsp2中的-2移码。这个氨基酸序列在毒株TJM-F92(第92代)中完全保守。
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公开的US专利申请第2010/0136047号整体援引加入本文。
虽然上文参考公开的实施方案和实施例已描述具体实施方案，但是这类实施方案仅为说明性的，并不限制本发明的范围。可以按照本领域的普通技术进行改变和修改而不会在其如下文权利要求书中定义的更广方面中背离本发明。
所有出版物、专利和专利文件均援引加入本文，如同单独援引加入本文。已参考各种具体和优选实施方案和技术描述本发明。但是，应当理解可以进行许多变化和改变，同时保持在本发明的精神和范围内。
序列描述

Claims (33)

1.一种动脉炎病毒，其包含编码ORF1a或其功能性部分的核酸，其中所述核酸包含至少一个突变，导致与所述动脉炎病毒的野生型相比，在被所述动脉炎病毒感染的细胞中nsp2TF的TF结构域的翻译降低和/或翻译自所述核酸的一种或多种下游产物的翻译被改变。
2.权利要求1的动脉炎病毒，其中所述突变干扰位于编码nsp2蛋白的核酸序列中的-2移码位点处的-2核糖体移码。
3.权利要求1或2的动脉炎病毒，其中所述突变中至少一个在移码位点GGU(U/C)U(U/C)U和/或保守CCCANCUCC基序中。
4.权利要求1-3中任一项的动脉炎病毒，其中所述突变中至少一个在编码nsp1β蛋白的核酸序列中，并且导致降低的-2核糖体移码。
5.一种动脉炎病毒，其中与所述动脉炎病毒的野生型相比，在被所述动脉炎病毒感染的细胞中nsp2TF功能降低和/或不存在。
6.权利要求5的动脉炎病毒，其包含编码ORF1a或其功能性部分的核酸，其中所述动脉炎病毒的nsp2TF氨基酸序列改变、截短或不存在。
7.权利要求5或6的动脉炎病毒，其中nsp2TF的TF结构域的氨基酸序列被改变，并且其中所述改变的氨基酸序列任选地提供在野生型动脉炎病毒中不存在且具有免疫原性的表位，并且其中ORF1a的阅读框未受损。
8.权利要求1-7中任一项的自主复制的动脉炎病毒。
9.权利要求1-8的动脉炎病毒，其中所述动脉炎病毒为PRRSV 1型PRRSV(欧洲基因型)、II型PRRSV(北美基因型)或它们的组合。
10.权利要求1-8中任一项的动脉炎病毒，其中所述动脉炎病毒为乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)或猴出血热病毒(SHFV)。
11.编码权利要求1-10中任一项的动脉炎病毒的RNA、DNA或cDNA。
12.一种疫苗或免疫原性组合物，其包含权利要求1-10中任一项的动脉炎病毒，或者权利要求11的RNA或DNA，或者它们的组合，以及药学可接受的载体或稀释剂。
13.权利要求12的疫苗或免疫原性组合物，其包含pL1a(SEQ IDNO:1)、pLnsp2-8(SEQ ID NO:2)、pLnsp1-2(SEQ ID NO:3)、pLnsp1β-2(SEQID NO:4)、pLnsp1βcc-2(SEQ ID NO:5)、pLnsp2(SEQ ID NO:6)、pLnsp1-3(SEQ ID NO:7)、pLnsp1β-3(SEQ ID NO:8)、pLnsp2-3(SEQ ID NO:9)、pLnsp2-3-IFC(SEQ ID NO:10)、pLnsp1β(SEQ ID NO:11)、pL1a-IFC(SEQ IDNO:12)、pL1a-KO1(SEQ ID NO:13)、pL1a-KO2(SEQ ID NO:15)、pL1a-SS(SEQ ID NO:17)、pL1a-CC1(SEQ ID NO:18)、pL1a-CC2(SEQ ID NO:20)、pSD01-08-IFC(SEQ ID NO:22)、pSD01-KO1(SEQ ID NO:25)、pSD01 KO2(SEQ ID NO:26)、pSD01-08-KO1(SEQ ID NO:92)pSD01-08-KO2(SEQ IDNO:93)pSD01-08-KO3(SEQ ID NO:94)、pSD95-21-KO1(SEQ ID NO:95)、pSD95-21-KO2(SEQ ID NO:96)和pSD95-21-KO3(SEQ ID NO:97)。
14.权利要求12或13的疫苗或免疫原性组合物，其中所述组合物还包含佐剂、赋形剂或它们的组合。
15.一种在动物中诱导对动脉炎病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向动物给药有效量的权利要求12-14中任一项的组合物。
16.一种分离的或重组的蛋白，其包含动脉炎病毒nsp2TF蛋白的全长或部分TF结构域。
17.一种分离的或重组的抗体，其能够特异性地结合动脉炎病毒nsp2TF蛋白的TF结构域、权利要求16的蛋白、或者具有SEQ ID NO:63、64或65所示的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列的蛋白。
18.一种区分感染野生型动脉炎病毒和/或用未修饰的动脉炎病毒毒株免疫接种的个体与用权利要求12-14中任一项的疫苗免疫接种的个体的方法，所述方法包括：
a)提供来自所述个体的样品；
b)定性、定量或者定性且定量地确定所述样品中是否存在在位于TFORF的5’端的-2移码位点处影响-2核糖体移码的突变，或者是否存在对TF ORF编码区的修饰，和/或；
c)确定所述样品中抗所述疫苗特异性的免疫原性表位的抗体的存在；和/或，
d)确定所述样品中抗所述野生型或未修饰的动脉炎病毒表达的表位的抗体的存在，所述表位在所述疫苗中不存在。
19.一种分型生物学样品中的动脉炎病毒的方法，所述方法包括：
a)确定位于nsp2蛋白的编码区中的-2移码位点的存在和/或序列；和/或，
b)确定所述动脉炎病毒中nsp2TF编码区的存在和/或序列。
20.一种核酸，其包含与编码蛋白的核酸序列可操作连接的动脉炎病毒-2移码位点，其中所述蛋白不是动脉炎病毒蛋白，所述核酸还包含位于所述-2移码位点5’的核糖体翻译起始密码子。
21.权利要求20的核酸，其中所述动脉炎病毒-2移码位点包含序列GGU(U/C)U(U/C)U和/或CCCANCUCC。
22.权利要求20或21的核酸，其包含：
a)SEQ ID NO:35的核酸序列；
b)编码SEQ ID NO:45、36或76中的一个或多个的氨基酸的核酸；
c)在高严格性条件下杂交至(a)或(b)的核酸序列
d)(a)、(b)或(c)中任一个的功能性片段。
23.一种包含权利要求20-22中任一项的核酸的表达系统，其中所述表达系统还包含nsp1β或其功能性部分。
24.一种确定物质是否能够干扰位于编码nsp2蛋白的核酸序列中的-2移码位点处的核糖体移码的方法，所述方法包括：
a)提供许可在所述位点处发生移码的翻译系统，其具有与所述位点可操作连接的编码遗传标记或报告物的核酸；
b)使所述翻译系统与所述物质接触；
c)温育步骤b)的系统和物质以允许翻译所述核酸；以及
d)确定是否存在所述核酸编码的翻译产物。
25.权利要求24的方法，其中所述翻译系统包含动脉炎病毒nsp1β蛋白或其功能性部分和/或是细胞。
26.权利要求24或25的方法，其中所述物质选自反义DNA、反义RNA、siRNA、微RNA、核酸类似物、肽、小分子或化合物，或者它们的组合。
27.一种药物组合物，其包含有效量的能够干扰动脉炎病毒中的-2移码的物质，以及任选存在的药学可接受的载体或稀释剂。
28.一种治疗被动脉炎病毒感染的动物的方法，所述方法包括向所述动物给药有效量的权利要求27的药物组合物。
29.一种表达盒，其包含与异源启动子可操作连接的编码动脉炎病毒nsp2TF蛋白的核酸。
30.包含权利要求29的表达盒的细胞。
31.权利要求30的细胞，其中所述表达盒整合入所述细胞的染色体。
32.权利要求30或31的细胞，其还包含权利要求1-10中任一项的动脉炎病毒，或者权利要求11的cDNA。
33.包含权利要求30-32中任一项的细胞的动脉炎病毒包装细胞系。
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