CN104707135A - 重组蛋白疫苗、含编码该重组蛋白疫苗的基因的重组表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组蛋白疫苗，该重组蛋白疫苗含EB病毒核抗原1（EBNA1）的抗原表位，以及人类疱疹病毒糖蛋白的抗原表位，该融合蛋白不仅能够有效激活特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，直接抑制表达EBNA1，发挥EB病毒相关肿瘤的治疗效果；还能通过疱疹病毒糖蛋白直接阻断免疫抑制途径，提高调节性T细胞的活性；因此，本发明提供的重组蛋白疫苗能更全面、多途径预防或治疗EB病毒感染及其相关的疾病和肿瘤；本发明还提供了含编码该重组蛋白疫苗的基因的重组表达载体和该重组蛋白疫苗的应用。

Description

重组蛋白疫苗、含编码该重组蛋白疫苗的基因的重组表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组蛋白疫苗含编码该重组蛋白疫苗的基因的重组表达载体及其应用。

背景技术

EB病毒（Epstein-Barr Virus,EBV）是一种含172kb DNA基因组的人类γ疱疹病毒，被世界卫生组织归为第一类致瘤病毒，在人群中感染非常普遍，90%以上的个体在4岁以前就已经感染EB病毒，但不引起症状，能够在B淋巴细胞中建立潜伏感染，刺激细胞增殖和转化。EB病毒与多种疾病的发生有关，如鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、胃癌、获得性免疫缺陷综合症相关的中枢神经系统淋巴瘤等。

截止目前的研究进展，EB病毒核抗原1（EBNA1）是病毒编码的DNA结合蛋白，是病毒DNA复制、病毒基因维持终生感染和B淋巴细胞永生化过程中唯一必需的病毒蛋白；此外，EB病毒核抗原1是唯一在所有类型EB病毒感染细胞核和EB病毒相关肿瘤组织中一贯表达的病毒蛋白。在EB病毒潜伏感染中起多项重要作用，包括招募病毒复制所需的细胞蛋白和酶到病毒DNA复制起点、激活病毒潜伏期基因转录和协调持续感染过程中的DNA复制等。最新研究表明，EB病毒核抗原1显性抑制和EB病毒核抗原1siRNA（RNA干扰）都能抑制感染细胞的病毒复制并防止EB病毒相关肿瘤的增殖。

单纯疱疹病毒（HSV）糖蛋白gD是病毒囊膜的结构成分，也是病毒进入宿主细胞必不可少的结构。糖蛋白与单纯疱疹病毒进入调解分子结合，能够阻断T细胞激活过程中的免疫抑制信号，激活T淋巴细胞，可以明显提高CD4和CD8T细胞对抗原的反应功能。

目前，EBV特异性抗原肽疫苗是肿瘤疫苗研究领域的热点，主要针对在EB病毒感染或潜伏期中特异性的靶点，如gp350、LMP1、LMP2和EBNA3A等，研发针对这些靶点的疫苗，通过抑制表达相应的蛋白以达到治疗EB病毒相关肿瘤的目的，但是，现有研究中的疫苗仅以单一EB病毒蛋白为靶抗原，并且大部分靶抗原仅在病毒感染的特定时期表达，不能全面、有效地抗EB病毒感染、消除EB病毒及其相关的疾病和肿瘤。

因此，相比针对单一靶点治疗，有必要提供一种多靶点、多途径预防EB病毒感染、消除EB病毒及其相关疾病和肿瘤的疫苗。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种重组蛋白疫苗，该重组蛋白疫苗含EB病毒核抗原1（EBNA1）的抗原表位，以及人类疱疹病毒糖蛋白的抗原表位，，该融合蛋白不仅能够有效激活特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，直接抑制表达EBNA1，发挥EB病毒相关肿瘤的治疗效果；还能通过疱疹病毒糖蛋白直接阻断免疫抑制途径，提高调节性T细胞的活性；因此，本发明提供的重组蛋白疫苗能更全面、多途径预防或治疗EB病毒感染及其相关的疾病和肿瘤；本发明还提供了含编码该重组蛋白疫苗的基因的重组表达载体和该重组蛋白疫苗的应用。

第一方面，本发明提供了一种重组蛋白疫苗，所述重组蛋白疫苗包括EB病毒核抗原1的抗原表位，以及人类疱疹病毒糖蛋白的抗原表位。

优选地，所述EB病毒核抗原1的抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述人类疱疹病毒糖蛋白为人类疱疹病毒1型糖蛋白、人类疱疹病毒2型糖蛋白、人类疱疹病毒3型糖蛋白、人类疱疹病毒4型糖蛋白、人类疱疹病毒5型糖蛋白、人类疱疹病毒6型糖蛋白、人类疱疹病毒7型糖蛋白或人类疱疹病毒8型糖蛋白。

优选地，所述人类疱疹病毒1型糖蛋白的抗原表位选自如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的一种。

优选地，所述重组蛋白疫苗的氨基酸序列的N端到C端由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示序列依次排列组成。

进一步优选地，编码所述SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的碱基序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

本发明提供的重组蛋白疫苗含EB病毒核抗原1（EBNA1）的抗原表位，以及人类疱疹病毒I型糖蛋白的抗原表位，能同时表达含有EBNA1抗原表位以及疱疹病毒糖蛋白抗原表位的融合蛋白，该融合蛋白不仅能够通过EBNA1的抗原表位有效激活特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，抑制表达EBNA1肿瘤细胞的分裂和增殖，发挥EB病毒相关肿瘤的治疗效果；还能通过疱疹病毒糖蛋白的抗原表位与肿瘤坏死因子家族成员BTLA竞争结合单纯疱疹病毒进入调解分子（HVEM），BTLA-HVEM作为免疫抑制通路的一部分抑制B淋巴细胞和T淋巴细胞的活化；疱疹病毒糖蛋白能够阻断BTLA结合到HVEM，阻断免疫抑制途径，提高调节性T细胞的活性，通过多途径协同预防或治疗EB病毒感染、消除EB病毒及其相关的疾病和肿瘤。

第二方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有编码如第一方面所述的重组蛋白疫苗的核苷酸序列。

优选地，所述表达载体为原核表达载体或真核表达载体。

进一步优选地，所述原核表达载体为pET-28a(+)、pET-32a(+)。

进一步优选地，所述真核表达载体为pCDNA3.1、p3x-FLAG-myc。

第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：

（1）、PCR扩增得到编码EB病毒核抗原EBNA1的抗原表位的基因，其中，所述PCR的上游引物和下游引物的基因序列分别如EBNA1-F和EBNA1-R所示：

EBNA1-F:5’-ATGTCTGACGAGGGGCCAGG-3’

EBAN1-R:5’-CTCCTGCCCTTCCTCACCCT-3’；

（2）、提供或制备两对PCR引物，其中，第一对PCR引物的上游引物和下游引物基因序列分别如gD-UpF和gD-UpR-EBNA1所示：

gD-UpF:5’-GGAATTCCATGGGTCCGCGGCAAATATGC-3’

gD-UpR-EBNA1:5’-CCTGGCCCCTCGTCAGACATGGGCCCGTGCCACCCGGCGAT-3’

所述下游引物gD-UpR-EBNA1中的序列

CCTGGCCCCTCGTCAGACAT与步骤（1）所得编码EBNA1抗原表位基因的一条链的5’端序列特异性互补；

第二对PCR引物的上游引物和下游引物基因序列分别如gD-DnF-EBNA1和gD-DnR所示：

gD-DnF-EBNA1:5’-AGGGTGAGGAAGGGCAGGAGAAGGCCCCATACACGAGCAC-3’

gD-DnR:5’-AAATATGCGGCCGCGTTGTTCGGGGTGG-3’

其中，所述上游引物gD-DnF-EBNA1中的序列

AGGGTGAGGAAGGGCAGGAG与步骤（1）所得编码EBNA1抗原表位基因的另一条链的5’端序列特异性互补；

采用所述第一对PCR引物和第二对PCR引物分别扩增得到编码人类疱疹病毒1型糖蛋白HSV-gD抗原表位基因的两个片段；

（3）、利用重叠PCR技术，将步骤（1）扩增得到的编码EBNA1抗原表位的基因和步骤（2）扩增得到的编码HSV-gD抗原表位的基因的两个片段在无引物条件下，运行3～5个PCR循环，得到编码重组蛋白疫苗的融合基因，所述融合基因为在编码HSV-gD抗原表位的基因中插入编码EBNA1抗原表位的基因；

（4）、以步骤（2）所述gD-UpF和gD-DnR为PCR引物，以步骤（3）得到融合基因为PCR模板进行PCR反应扩增融合基因；

（5）、将扩增后的融合基因插入到表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体，所述重组表达载体含有编码重组蛋白疫苗的核苷酸序列。

其中，所述EBNA1-F、EBNA1-R、gD-UpF、gD-UpR-EBNA1、gD-DnF-EBNA1和gD-DnR的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

优选地，所述步骤（5）中，所述表达载体为原核表达载体或真核表达载体。

进一步优选地，所述原核表达载体为pET-28a(+)、pET-32a(+)。

进一步优选地，所述真核表达载体为pCDNA3.1、p3x-FLAG-CMV。

优选地，所述步骤（5）中，所述将扩增后的融合基因插入到表达载体的多克隆位点的步骤中，所述多克隆位点为pET-28a(+)载体的EcoR I和Not I酶切位点。

在本发明的优选方式中，通过分别设计特异性引物EBNA1-F和EBNA1-R、gD-UpF和gD-UpR-EBNA1、gD-DnF-EBNA1和gD-DnR，利用PCR技术扩增得到编码EB病毒核抗原1的基因序列和两段编码糖蛋白gD不同区段的基因序列；再利用重叠PCR技术，通过设计的特定引物序列，优选gD-UpF和gD-DnR，将编码EB病毒核抗原1的基因序列链接至两段编码糖蛋白gD不同区段的基因序列中间，形成融合基因gD-ENBA1，该gD-ENBA1融合基因包括依次连接的编码第一HSV-gD抗原表位的基因、编码EBNA1抗原表位的基因和编码第二HSV-gD抗原表位的基因；再将上述融合基因序列链接至表达载体上，优选为pET-28a(+)，得到重组表达载体pET-28a-gDEBNA1。

将本发明的重组表达载体pET28a-gDEBNA1质粒转入大肠杆菌，可表达得到重组蛋白疫苗。

第四方面，本发明提供了一种含有如第二方面所述的重组表达载体的宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞为BL21、DH5α或CHO。

第五方面，本发明提供了如第一方面所述的重组蛋白疫苗、如第二方面所述的重组表达载体、如第四方面所述的宿主细胞在制备预防或治疗EB病毒感染的药物中的应用。

本发明提供了的重组蛋白疫苗及其制备方法和应用具有如下有益效果：

（1）本发明提供的重组蛋白疫苗，不仅能够通过EBNA1的抗原表位有效激活特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应；还能通过疱疹病毒糖蛋白的抗原表位直接阻断免疫抑制途径，提高调节性T细胞的活性；

（2）其次，相比单一靶点治疗，本发明提供的重组蛋白疫苗能更全面、多途径预防EB病毒感染、消除EB病毒及其相关的疾病和肿瘤，利于疫苗在临床中的实际应用；

（3）此外，本发明还提供了含编码该重组蛋白疫苗的基因的重组表达载体和该重组蛋白疫苗的应用。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的gD-EBNA1融合基因的具体构建流程图；

图2为本发明实施例1制得的重组表达载体pET28a-gD-EBNA1进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例1制得的重组表达载体pET28a-gD-EBNA1的质粒图谱；

图4为本发明实施例2纯化的gD-EBNA1融合蛋白的Western Blot图。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor）。所用引物及DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。

本发明实施例所使用的质粒载体pET-28a(+)、所使用的菌株DH5α均购自invitrogen公司，所使用的试剂均为市售商品。

实施例1

一种含有编码如权利要求1～5所述的重组蛋白疫苗的核苷酸序列重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：

（1）EB病毒核抗原1基因序列的克隆

以提取的EBV基因组为模板，采用引物：上游引物EBNA1-F:5’-ATGTCTGACGAGGGGCCAGG-3’（SEQ ID No7）和下游引物EBAN1-R:5’-CTCCTGCCCTTCCTCACCCT-3’（SEQ ID No.8）PCR扩增EBNA1，扩增条件为：

PCR反应体系为（100μl）：5╳Buffer20μl、dNTP mix8μl、DNA6μl、Taq酶1μl、引物混合物4μl、双蒸水61μl；

反应参数为：95℃2min、95℃15s、68℃15s、72℃3min共35个循环，最后再72℃延伸8min。

然后采用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，所得序列如SEQ ID NO.1所示。

（2）单纯疱疹病毒糖蛋白基因序列的克隆

以提取的HSV基因组为模板，分别采用两对引物：

第一对：上游引物

gD-UpF:5’-GGAATTCCATGGGTCCGCGGCAAATATGC-3’（SEQ IDNo.9）和下游引物

gD-UpR-EBNA1:5’-CCTGGCCCCTCGTCAGACATGGGCCCGTGCCACCCGGCGAT-3’（SEQ ID No.10）

第二对：上游引物

gD-DnF-EBNA1:5’-AGGGTGAGGAAGGGCAGGAGAAGGCCCCATACACGAGCAC-3’（SEQ ID No.11）和下游引物

gD-DnR:5’-AAATATGCGGCCGCGTTGTTCGGGGTGG-3’（SEQ IDNo.12）

PCR扩增两段编码糖蛋白不同区段的基因序列，分别为HSV-gD第1-249位氨基酸片段的编码基因序列和HSV-gD第250-319位氨基酸片段的编码基因序列；扩增条件为：

PCR反应体系为（100μl）：5╳Buffer20μl、dNTP mix8μl、DNA4μl、Taq酶1μl、引物混合物8μl、双蒸水59μl;

反应参数为：95℃2min、95℃15s、57℃15s、72℃3min共35个循环，最后再72℃延伸8min。

然后采用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，所得序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

（3）EB病毒核抗原1和单纯疱疹病毒糖蛋白融合基因的克隆

以gD-UpF和gD-DnR为引物，利用重叠PCR技术将步骤（1）得到的编码EBNA1的基因序列SEQ ID NO.1和步骤（2）得到的两段编码糖蛋白不同区段的基因序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3形成融合基因gD-EBNA1；步骤如下：

PCR反应体系为：5╳Buffer20μl、dNTP mix8μl、DNA4μl、双蒸水59μl、Taq酶1μl、引物混合物8μl；

反应参数为：95℃2min、95℃15s、57℃15s、72℃3min，先在未加Taq酶和引物混合物的体系条件下运行3个循环，然后添加Taq酶和引物gD-UpF和gD-DnR的混合物，再进行35个循环，最后再72℃延伸8min。

再采用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，所得序列即为gD-EBNA1融合基因的序列，该序列由SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示序列依次排列组成（如SEQ ID NO:13所示）。融合基因的具体构建流程见图1。

（4）含gD-EBNA1融合基因的重组表达载体pET28a-gD-EBNA1的构建

1.gD-EBNA1融合基因和pET28a(+)质粒的双酶切；

取pET28a(+)质粒，将步骤（3）所扩增得到的gD-EBNA1融合基因和pET28a(+)质粒利用相同的酶分别进行酶切反应，酶切体系分别如下：

2.gD-EBNA1融合基因和pET28a(+)质粒的连接；

将步骤1所得双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，将酶切后的gD-EBNA1融合基因同pET28a(+)质粒进行连接，22℃连接1h，连接反应体系如下：

3.酶切以及测序鉴定

将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含Kan的LB固体平板培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落培养后提取质粒并酶切鉴定，酶切体系如下：

37℃酶切4小时，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，酶切后的琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，在图2中，泳道1为未酶切的重组质粒pET28a-gD-EBNA1，泳道2～3为构建的表达载体pET28a-gD-EBNA1进行双酶切（NotⅠ和EcoRⅠ）结果，泳道4为DNA分子量marker（1kb(Dye Plus),TAKARA公司），其中，泳道2～3在2208bp左右具有明显条带，该条带大小与gD-EBNA1融合基因的大小一致，表明gD-EBNA1成功构建到载体上；

将鉴定的阳性克隆进行测序，阳性克隆的载体命名为pET28a-gD-EBNA1（7550bp），该pET28a-gD-EBNA1的质粒图谱如图3所示。

实施例2

本实施例提供了一种重组蛋白疫苗的表达和纯化的方法，包括如下步骤：

（1）His-Tag标签在大肠杆菌E.Coli中的表达

按实验室分子克隆常规方法将pET28a-gD-EBNA1质粒转化到BL21表达菌中，得到E.Coli-pET28a-gDEBNA1菌种；

在5ml含50mg/L Kan的LB液体培养基中，按1：50接种E.Coli-pET28a-gDEBNA1菌液，37℃，220rpm振荡培养过夜；次日接种培养过夜的菌液至含50mg/L Kan的新LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养至OD600=0.6～0.8；每管分别加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，28℃诱导表达；分别在诱导2、4和6小时后收集菌液，4℃，12000g高速离心收集菌体；加入2ml磷酸缓冲液重悬洗涤菌体，然后4℃，12000g离心10min，弃上清；重复洗涤菌体一次，加入1ml PBS缓冲液重悬菌体。超声破碎细胞后，12000g离心10min，取上清即为gD-EBNA1融合蛋白粗提液，根据融合蛋白标签His-Tag采用WesternBlot分析并鉴定上清液中gD-EBNA1融合蛋白的表达，SDS-PAGE电泳及Western Blot方法参照分子克隆实验指南进行，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，浓缩胶80V恒压，分离胶120V恒压跑约2小时；在转膜缓冲液体系下100V恒压，转膜90分钟，经封闭后加入辣根过氧化物酶标记的抗His-Tag抗体进行Western Blot鉴定；

（2）gD-EBNA1融合蛋白的纯化

采用步骤（1）所述方法，得到gD-EBNA1融合蛋白粗提液，采用镍柱亲和层析法初步纯化，方法按说明书（GE公司）进行；纯化蛋白经超滤浓缩、过滤除菌后-80℃保存；

对纯化后gD-EBNA1融合蛋白进行Western Blot鉴定，SDS-PAGE电泳方法如步骤（1）所述，纯化前后的融合蛋白表达Western Blot结果见图4。在图4中，泳道1和泳道2分别为纯化前和纯化后融合蛋白条带，条带大小为86kD，与包含gD-EBNA1融合基因编码蛋白及载体标签的融合蛋白大小一致，表明目的融合蛋白gD-EBNA1表达和纯化成功。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述重组蛋白疫苗包括EB病毒核抗原1的抗原表位，以及人类疱疹病毒糖蛋白的抗原表位。

2.如权利要求1所述的一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述EB病毒核抗原1的抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1所述的一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述人类疱疹病毒糖蛋白为人类疱疹病毒1型糖蛋白、人类疱疹病毒2型糖蛋白、人类疱疹病毒3型糖蛋白、人类疱疹病毒4型糖蛋白、人类疱疹病毒5型糖蛋白、人类疱疹病毒6型糖蛋白、人类疱疹病毒7型糖蛋白或人类疱疹病毒8型糖蛋白。

4.如权利要求3所述的一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述人类疱疹病毒1型糖蛋白的抗原表位选自如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的一种。

5.如权利要求1所述的一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述重组蛋白疫苗的氨基酸序列的N端到C端由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1和SEQID NO:3所示序列依次排列组成。

6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有编码如权利要求1所述的重组蛋白疫苗的核苷酸序列。

7.如权利要求6所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）、PCR扩增得到编码EB病毒核抗原1EBNA1的抗原表位的基因，其中，所述PCR的上游引物和下游引物的基因序列分别如EBNA1-F和EBNA1-R所示：

EBNA1-F:5’-ATGTCTGACGAGGGGCCAGG-3’

EBAN1-R:5’-CTCCTGCCCTTCCTCACCCT-3’；

（2）、提供或制备两对PCR引物，其中，第一对PCR引物的上游引物和下游引物基因序列分别如gD-UpF和gD-UpR-EBNA1所示：

gD-UpF:5’-GGAATTCCATGGGTCCGCGGCAAATATGC-3’

gD-UpR-EBNA1:5’-CCTGGCCCCTCGTCAGACATGGGCCCGTGCCACCCGGCGAT-3’

所述下游引物gD-UpR-EBNA1中的序列

CCTGGCCCCTCGTCAGACAT与步骤（1）所得编码EBNA1抗原表位基因的一条链的5’端序列特异性互补；

第二对PCR引物的上游引物和下游引物基因序列分别如gD-DnF-EBNA1和gD-DnR所示：

gD-DnF-EBNA1:5’-AGGGTGAGGAAGGGCAGGAGAAGGCCCCATACACGAGCAC-3’

gD-DnR:5’-AAATATGCGGCCGCGTTGTTCGGGGTGG-3’

其中，所述上游引物gD-DnF-EBNA1中的序列

AGGGTGAGGAAGGGCAGGAG与步骤（1）所得编码EBNA1抗原表位基因的另一条链的5’端序列特异性互补；

采用所述第一对PCR引物和第二对PCR引物分别扩增得到编码人类疱疹病毒1型糖蛋白HSV-gD抗原表位基因的两个片段；

（3）、利用重叠PCR技术，将步骤（1）扩增得到的编码EBNA1抗原表位的基因和步骤（2）扩增得到的编码HSV-gD抗原表位的基因的两个片段在无引物条件下，运行3～5个PCR循环，得到编码重组蛋白疫苗的融合基因，所述融合基因为在编码HSV-gD抗原表位的基因中插入编码EBNA1抗原表位的基因；

（4）、以步骤（2）所述gD-UpF和gD-DnR为PCR引物，以步骤（3）得到融合基因为PCR模板进行PCR反应扩增融合基因；

（5）、将扩增后的融合基因插入到表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体，所述重组表达载体含有编码重组蛋白疫苗的核苷酸序列。

8.如权利要求7所述的一种重组表达载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，所述表达载体为原核表达载体或真核表达载体。

9.含有如权利要求6所述的重组表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为BL21、DH5α或CHO。

10.如权利要求1所述的重组蛋白疫苗、如权利要求6所述的重组表达载体或如权利要求9所述的宿主细胞在制备预防或治疗EB病毒感染的药物中的应用。