CN104706730A - 五味子在抑制ras原癌基因过表达中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及五味子在抑制ras原癌基因过表达中的应用，具体讲的是五味子在制备抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤药物中的应用。研究表明约90%胰腺癌、50%结肠癌、30%-40%肺腺癌及5%-40%的白血病是由于ras原癌基因过表达造成的，Ras蛋白已成为公认的筛选抗相关恶性肿瘤药物的靶标。动物实验表明五味子可特异性下调ras原癌基因突变后所致的过表达，而不作用于野生型ras原癌基因，因此毒性低。本发明提供了一种五味子的新用途，可在制备抗肿瘤（由ras原癌基因过表达所致肿瘤）药物中应用。
Description
技术领域
本发明具体涉及五味子在抑制ras原癌基因过表达中的应用，属于中药领域。
背景技术
五味子Schisandra chinensis是落叶木质藤本，性温，味甘，微酸，具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心等功效，是常用中药之一。五味子具有广泛的药理作用，例如强心，抗肝损伤，镇静安定，抗肿瘤，免疫调节等作用。
约30%的人类肿瘤是由于ras原癌基因突变后过度激活导致Ras蛋白表达水平增高造成的。若Ras蛋白持续处于活化状态，可与下游的效应蛋白结合，将信号传递到下游信号元件，引起细胞的异常增殖，导致肿瘤的发生。研究表明约90%胰腺癌、50%结肠癌、30%-40%肺腺癌及5%-40%的白血病是由于ras基因的过度激活造成的。
因此，以Ras蛋白和Ras蛋白所调控的信号通路为靶标的肿瘤治疗在治疗由ras原癌基因突变所导致的肿瘤中具有非常重要的价值，Ras已成为公认的筛选抗相关恶性肿瘤药物的靶标。如2005年 12月 20日美国 FDA 批准的晚期肾细胞癌治疗药物Nexavar, 其直接靶标就Ras信号途径，可抑制 Raf/MEK /ERK信号传导通路，直接抑制肿瘤生长。
迄今为止，没有文献报道过五味子能够抑制ras原癌基因的过表达，市场上也没有以五味子为原料的药物，能够专性抑制由ras原癌基因过表达导致的肿瘤。
发明内容
本发明的目的是提供一种五味子的新用途，特别是五味子在抑制ras原癌基因过表达中的应用。
另一个目的是提供一种五味子在制备抗肿瘤药物中的新用途，其所述的肿瘤是由ras原癌基因过表达导致的。
由于ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码保守的Ras蛋白，它与人类的Ras蛋白相比具有83%的同源性。如果ras突变，在秀丽隐杆线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致肿瘤的发生。因此，模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）Ras/MAPK信号通路过度激活型突变体被作为受试群体广泛应用于筛选抑制ras原癌基因通路过度激活的抗肿瘤药物。因此，本实验采用了一株秀丽隐杆线虫突变株作为评估抑制ras原癌基因通路过度激活药物的模型，并得出了五味子对ras原癌基因过表达有明显下调作用、具有抑制ras原癌基因通路过度激活的结论。
本发明的有益效果在于: 本发明提供了一种五味子的新用途，拓宽了五味子的用药范围；五味子对ras原癌基因过表达有明显下调作用，可以专性抑制 ras原癌基因的过表达，而不是直接抑制细胞的增殖分化，即五味子起作用是 ras通路机制依赖地，而非广泛的细胞毒作用；且五味子无细胞毒性，仅仅作用于过度激活表达的Ras蛋白，不作用于野生型的Ras蛋白。今后我们有望将五味子应用在抗肿瘤药物的制备中，其中，所述肿瘤是由ras原癌基因的过表达导致的，从而为此类肿瘤患者提供更好的治疗，为一些疑难癌症的治疗提供新的途径。
以下提供具体实施例以实现本发明所述的五味子在制备由ras原癌基因过度表达所致的抗肿瘤药物中的应用，但不限于这些实施例。
具体实施方式
实施例一五味子药液的制备
五味子来源：购自兰州黄河药市。
称取五味子9g；先用蒸馏水浸泡20分钟，然后文火煮沸，煎煮30min，定容，离心，弃去沉淀，将上清无菌过滤，置4℃冰箱待用，使用时稀释不同的浓度。
实施例一五味子药液对秀丽隐杆线虫MT2124（let-60过度激活突变）的作用
Ras是一种小分子蛋白，参与调控动物发育过程中的很多重要环节。ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码保守的Ras蛋白，它与人类的Ras蛋白相比具有83%的同源性。如果ras突变，在秀丽隐杆线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致肿瘤的发生。因此，模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）Ras/MAPK信号通路过度激活型突变体被作为肿瘤模型广泛应用于筛选抑制原癌基因ras通路过度激活的抗肿瘤药物。
MT2124是let-60/ras过度激活的秀丽隐杆线虫，会产生多阴门的表型。将药液稀释一定的浓度，作用于秀丽隐杆线虫MT2124，如果能够抑制受试线虫群体多阴门产生个体的比例，而只有一个真阴门的野生型线虫个体比例上升，则说明药物作用于ras通路，下调了该通路的过度激活，具有抗肿瘤活性。群体中野生型线虫的比例越高，则药物作用效果越显著。如以突变体比例表示则相反，其中，野生型比例（%）=100%-突变体比例（%）
实验材料：秀丽隐杆线虫MT2124，基因型：let-60(n1046) IV，购自CGC（Caenorhabditis Genetics Center）；大肠杆菌OP50（尿嘧啶渗漏突变株），作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC（Caenorhabditis Genetics Center）。
试剂制备：
1.NGM板的制备
| 成分 | 含量 |
| NaCl | 3.00g |
| K2HPO4 | 2.34g |
| KH2PO4 | 17.23g |
| 蛋白胨 | 2.50g |
| 琼脂 | 17.00g |
| H2O | 1000ml |
固体NGM培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min,在无菌操作台下加入5mg/ml胆固醇1ml，1M MgSO4 1ml,1M CaCl2 1ml,摇匀，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约20ml/板。静置等待培养基凝固，备用。
2.M9缓冲液的制备：
| 成分 | 含量 |
| Na2HPO4 | 6.00g |
| KH2PO4 | 3.00g |
| NaCl | 5.00g |
| 1M MgSO4 | 1.00ml |
| H2O | 1000ml |
3.S液的制备：
| 名称 | 成分 | 含量 |
| S液配方： | NaCl | 5.85g |
| K2HPO4 | 1.00g | |
| KH2PO4 | 6.00g | |
| H2O | 1000ml |
具体实验步骤：
线虫的培养：将线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然后将放在20℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。
线虫同步化：用M9缓冲液将平板上的线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm/ min离心3min，去除上清；加入裂解液（终浓度：3.2% NaClO和1M NaOH）；在涡旋仪上震荡7min，使线虫的虫体破裂释放卵；4000rpm/ min离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的线虫卵；M9缓冲液冲洗两次，加入1ml M9缓冲液，置于20℃培养箱中孵化48小时。
药物作用：将中药复方原液稀释一定的浓度，同步化后的线虫稀释到80条/20μl左右，在96孔板中，每个孔中加S液120μl，虫液20μl，10mg/ml的大肠杆菌OP50 20μl，5mg/ml的胆固醇20μl，合适稀释的药液20μl，每个浓度设置五个平行。空白对照组不加药液，将药液换成S液。20℃恒温培养至线虫成熟，在显微镜下检测线虫的野生型比例。结果如下表所示：
表1五味子药液不同浓度下对秀丽隐杆线虫MT2124野生型比例的影响
注：* 与空白组比较 P＜0.05
从上表可以看出，五味子可以使秀丽隐杆线虫MT2124的野生型比例显著增加，并呈浓度依赖关系，说明五味子可抑制ras原癌基因过表达，使突变体变为野生型。同时在实验过程中，秀丽隐杆线虫的数量并未减少，说明五味子毒性低，并不会引起秀丽隐杆线虫的死亡。
实施例三五味子对秀丽隐杆线虫MT8189（lin-15突变失活）的作用
实验材料：秀丽隐杆线虫MT8189，多阴门表型，基因型:lin-15b(n765)X，购自CGC（Caenorhabditis Genetics Center）；大肠杆菌OP50（尿嘧啶渗漏突变株），作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC（Caenorhabditis Genetics Center）。
具体实验步骤：同实施例二。
表2 五味子对秀丽隐杆线虫MT8189（lin-15突变失活）的作用
秀丽隐杆线虫中，在lin-15(n765)X位于ras的上游，正常情况下抑制ras基因的表达，MT8189线虫株系中该基因失活导致线虫呈多产卵器表型。
如表所示，五味子不能抑制lin-15(n765)X的多阴门表型，根据遗传上位的原则，五味子既然可逆转其下游的let60/ras原癌基因过度激活导致的多阴门表型，那么也抑制MT8189的多阴门表型，但本实验中未观察到预期结果，即五味子不能抑制let60/ras上游基因lin-15(n765)X的多阴门表型。这可能是由于lin-15(n765)X线虫中包含的是野生型let60/ras拷贝，五味子仅仅对过表达的let60/ras起作用，对野生型let60/ras不敏感，即五味子仅仅作用于过度激活的Ras蛋白，对野生型Ras蛋白不敏感，这说明五味子仅仅作用于ras过度激活的引起肿瘤细胞，而不作用于正常的细胞。
实施例四五味子对秀丽隐杆线虫CB1275（lin-1突变失活）的作用
实验材料：秀丽隐杆线虫基因型：lin-1(e1275) IV来源于CGC（Caenorhabditis Genetics Center）；大肠杆菌OP50（尿嘧啶渗漏突变株），作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC。
具体实验步骤：同实施例二。
表3五味子对秀丽隐杆线虫CB1275（lin-1突变失活）的作用
lin-1是ras下游的一个基因，是可被MAPK磷酸化的核转录因子，是阴门发育的负调节因子，调节let-60下游的阴门发育的信号通路。lin-1突变失活后，线虫为多阴门表型。由于lin-1为核转录因子，调节阴门细胞发育的过程。若药物对该基因失活突变的多阴门表型具显著的抑制作用，则说明药物可直接抑制阴门前体细胞的发育，阻止其形成多阴门而呈非特异的细胞毒作用。
本实施例的结果是CB1275株系线虫的多阴门表型未受到五味子的影响，这表明药物作用于ras信号通路可抑制ras过度激活形成的假阴门，不能抑制lin-1突变失活形成的假阴门表型，说明五味子作用于ras而不作用于lin-1，证明药物下调了ras的过度激活而不是直接抑制了细胞的增殖起作用的，即五味子起作用是 ras通路机制依赖，而非广泛的细胞毒作用。
以上实施例的动物实验表明，本发明所涉及的具有抗肿瘤活性的五味子对ras原癌基因突变所致的过度激活具有明显的下调作用，而不作用于野生型ras原癌基因，因此毒性低，说明五味子适于在制备抗相关恶性肿瘤药物中应用，有望开发成新一代的治疗ras原癌基因突变引起的相关恶性肿瘤的药物制剂。
Claims (2)
1.五味子在抑制ras原癌基因过表达中的应用。
2.五味子在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤是由ras原癌基因过表达导致的。
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| CN201310688566.3A CN104706730A (zh) | 2013-12-17 | 2013-12-17 | 五味子在抑制ras原癌基因过表达中的应用 |
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| CN102085256A (zh) * | 2010-12-30 | 2011-06-08 | 香港生命信息康复院有限公司 | 具抗癌功效的免疫调节口服液制剂及其主要成分制造方法 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 吴海星等: "五味子乙素抗肿瘤的多种作用机制", 《吉林医药学院学报》 * |
| 黄红兵: "《抗肿瘤中药临床应用于图谱》", 31 January 2008, 广东科技出版社 * |
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